CN108883208A - 用于治疗1型糖尿病的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及硅烷化的羟丙甲基纤维素(Si‑HPMC)包封的产胰岛素细胞用于治疗1型糖尿病的用途。还提供了用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的方法和试剂盒。

Description

用于治疗1型糖尿病的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞
相关申请
本申请要求2016年11月10日提交的欧洲专利申请号EP 15 193 861.0的优先权，其全文通过引用并入本文。
背景技术
1型糖尿病(又名1型糖尿症)通常在儿童期发生，它是一种病因未知的严重的慢性疾病。它的特征在于胰腺中生产胰岛素的β细胞的自身免疫性破坏。随后胰岛素的缺乏导致血和尿葡萄糖增加。整体而言，1型糖尿病影响全世界1500-3000万人(世界卫生组织)。在许多国家中，儿童期发作的糖尿病的发生率正在升高(Patterson等,DiabetesRes.Clin.Pract.,2014,103:161-175；Tamayo等,Diabetes Res.Clin.Pract.,2014,103:206-217)，其中每年估计有80,000个儿童患上该疾病。对1型糖尿病患者的生存必不可少的胰岛素疗法必须无限期地继续且包括多次每日注射。除胰岛素疗法之外，饮食管理是重要的。未治疗或管理差的糖尿病可引起许多并发症，包括严重的长期并发症，其包括心脏病、中风、肾衰竭、足部溃疡、眼损伤和昏迷。在一些1型糖尿病患者(例如患有脆性1型糖尿病的患者中，血糖水平严重不稳定，这导致生活被打断、经常复发和/或延长的住院治疗)中，并发症也可能由过度治疗引起的低血糖造成。
胰岛素注射的一种选择性治疗方法是皮下植入胰岛素泵。已经表明，与多次每日注射或标准的连续皮下胰岛素输注相比，与实时连续葡萄糖监控相结合的胰岛素泵疗法(称为传感器增强泵(SAP)疗法)在患有1型糖尿病的成人中改进代谢控制并降低低血糖率(Deiss等,Diabetes Care,2006,29:2730-2732；O'Connell等,Diabetologia,2009,52:1250-1257；Raccah等,Diabetes Diabetes Care,2009,32:2245-2250；Battelino等,Diabetologia,2012,55:3155-3162)。尽管在大的糖尿病中心频繁使用，连续葡萄糖监控不常用于儿科患者(Klonoff等,J.Clin.Endocrinol.Metab.,2011,96:2968-2979；Phillip等,Pediatr.Diabetes,2012,13:215-228)。一个原因是缺乏基础设施和能够教导患者及其家庭有效使用该技术的人员(Tumminia等,Patient Prefer Adherence,2015,9:1263-1270；Joshi等,Curr.Diab.Rep.,2015,15:81)。为减轻1型糖尿病患者及其家庭的负担，正在稳步发展所谓的“人工胰腺”，这可能最终是完全自动化的闭环胰岛素输送***(例如由Medtronic、Abbott、Dexcom等开发的***)，该输送***将连续葡萄糖传感器与胰岛素输注泵(或胰岛素贴剂泵)结合，并使用经验证的数学算法来驱动连续的胰岛素输注。
外源胰岛素的另一个选择是胰岛的同种异体移植。Edmonton草案已经表明胰岛移植以恢复患者血糖正常的可行性和成功(Shapiro等,N.Engl.J.Med.,2000,343:230-238)。然而，尝试补充耗尽的β细胞储备的这种方法被以下所限制：质量足够的人体器官短缺、每个患者需要多个供体、胰岛产量不一致、需要免疫抑制治疗，以及由此产生的有害副作用。无免疫抑制的包封猪或同种异体胰岛的微创皮下移植似乎是当今成熟的疗法(Dufrane等,Transplantation,2006,81:1345-1353；Elliott等,Xenotransplantation,2007,14:157-161；Zimmermann等,Curr.Diab.Rep.,2007,7:314-320；Dufrane等,WorldJ.Gastroenterol.,2012,18:6885-6893；Sakata等,World J.Gastroenterol.,2012,3:19-26；O'Sullivan等,Endocr.Rev.,2011,32:827-844；Ramesh等,Curr.Diabetes Rev.,2013,9:294-311；Sharp等,Adv.Drug Deliv.Rev.,2014,67-68:35-73；Zhu等,Front Surg.,2014,1:7；Zhu等,J.Zhejiang Univ.Sci.B,2015,16:329-343)。在包封中，细胞被包封入生物相容性基质内，所述生物相容性基质的主要作用是在胞外基质旁边产生针对免疫细胞和细胞毒素分子的屏障，从而避免排斥，同时仍然允许氧、微量和大量营养素和激素的主动扩散。然而，一些最后的障碍持续阻碍了这种细胞疗法的优化和持久的功效。尤其是，用于胰岛包封的标准聚合物藻酸盐具有若干缺点：它难以纯化和灭菌，它可能是免疫原性的，它形成不稳定的、可逆的、可以离解且要求侵入性移植的水凝胶。侵入性移植涉及外科手术行为，除普遍的手术并发症之外，其增加炎症反应和排斥风险。
因此，本领域仍然持续需要可以满足将胰岛移植建立为简单、安全和成功的1型糖尿病疗法的希望的新策略。
发明简述
本发明人发现，硅烷化的羟丙甲基纤维素(Si-HPMC)是包封产胰岛素细胞例如新生猪胰岛和鼠源β细胞的方便的聚合物。事实上，Si-HPMC表现出若干优点：它是生物相容的且易于灭菌，且其自网格化形成稳定的共价键。此外，它在生理学pH和温度下自交联(或自网格化)，这允许在自交联前通过皮下注射Si-HPMC来无创施用包封的胰岛。本发明人表明，鼠源包封胰腺的假胰岛能够在免疫缺陷的NOD小鼠(高剂量链脲菌素)和免疫活性的C57BI/6小鼠(低剂量链脲菌素)中调节链脲菌素诱导的糖尿病。发现Si-HPMC水凝胶能保持鼠源胰腺的假胰岛和猪胰岛存活且体外分泌胰岛素分别大于250天和70天。他们还观察到，Si-HPMC水凝胶可以通过人巨噬细胞和NOD脾细胞体外阻止猪胰岛诱导的IL-6分泌。这些结果为1型糖尿病的实际的、有前途的细胞治疗开辟了道路。
因此，本发明提供用于治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞。例如，1型糖尿病患者可以患有脆性糖尿病。
在某些实施方式中，用于本发明实践的Si-HPMC具有以下简化式：
(HPMC)-O-CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH3)3-Si(O-Na+)3 (I)
在某些实施方式中，用于本发明实践的产胰岛素细胞是分离的同种异体胰岛或分离的异种胰岛。
在某些实施方式中，用于本发明实践的产胰岛素细胞是选自胰腺β细胞、胰腺β样细胞及其任何组合的分离细胞。胰腺β细胞可通过分化胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、多能间充质基质细胞、管细胞、肝细胞或α细胞获得。
在本发明的某些实施方式中，将产胰岛素细胞微包封入Si-HPMC微珠、Si-HPMC微胶囊或Si-HPMC微球中。
在其他实施方式中，将产胰岛素细胞大包封入Si-HPMC水凝胶中。
在本发明的某些实施方式中，将产胰岛素细胞与至少一种治疗化合物一起包封入Si-HPMC中。
在某些实施方式中，治疗1型糖尿病包括以下之一：皮下注射Si-HPMC包封的产胰岛素细胞、肌肉注射Si-HPMC包封的产胰岛素细胞、将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞植入腹膜腔、肠系膜、网膜或肾囊。
在某些实施方式中，治疗1型糖尿病进一步包括向患者施用胰岛素疗法。
另一方面，本发明提供用于治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞。
本发明还提供用于治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的试剂盒，所述试剂盒包含：如本文所述的Si-HPMC；产胰岛素细胞；和将产胰岛素细胞包封入Si-HPMC的说明书。
在相关方面，本发明提供一种治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞。
本发明的这些和其他目的、优点和特征对于理解以下优选实施方式的详细说明的本领域技术人员而言将变得明显。
定义
贯穿说明书，使用以下段落中定义的若干术语。
如本文所使用，术语“生物材料”是指意欲与生物流体或组织接触(例如通过植入或移植入受试者)的材料。期望生物材料与生理环境诱导最小反应。如果置于生理环境后，炎症反应最少，没有过敏反应迹象，且在生物材料表面上细胞生长最少，则生物材料被认为是“生物相容的”。一旦植入/移植入宿主哺乳动物，生物相容的材料例如水凝胶不会引起足以对水凝胶的功能产生有害影响的宿主反应；这种宿主反应包括在水凝胶上或周围形成纤维化结构、免疫排斥水凝胶或从水凝胶释放毒性或热解的化合物到周围的宿主组织和/或流体。
如本文所使用，术语“水凝胶”是指交联的亲水聚合物的三维网络。网络为基本上由水组成的凝胶形式，优选但不限于，凝胶是大于90％的水。交联的水凝胶也可以被认为是固体，因为它们在无明显施加的剪切应力的情况下不流动或变形。
如本文所使用，术语“包封”具有本领域理解的含义，是指将一个或多个细胞包含、固定和/或捕获于通过物理屏障(即降低或控制所述结构的渗透性的屏障)界定的三维结构(例如胶囊、水凝胶等...)内。在本发明实践中，包封可通过微包封或通过大包封进行。如本领域已知，在微包封方法中，将较小的细胞团单独捕获于它自己的球形聚合物胶囊(直径例如为约0.3mm-约2mm)或聚合物层中。在大包封方法中，将细胞装入两个或更多个选择性渗透平片膜之间或装入半渗透中空纤维的腔内或装入水凝胶内。大包封需要捕获大量细胞并允许细胞易于植入和去除。相反，微包封的细胞在移植后不能复原。本领域技术人员了解细胞微包封和细胞大包封的意思(Uludag等,Advanced Drug Delivery Reviews,2000,42:29-64)。尤其是，本领域技术人员了解细胞微包封装置包括但不限于直径为约0.3mm-约2mm的球形胶囊(通常称为微胶囊)、微珠和其中细胞团的表面被膜包围的保形涂层。本领域技术人员了解，与微胶囊相比，大胶囊是大的多的装置，且通常具有平面或圆柱形的几何性状和较小的表面积体积比。因此，本领域技术人员了解，大包封装置包括但不限于平片膜(其由两个平面的膜组成，所述两个平面的膜附着于间隔元件的两侧以产生内室或包封室)和中空纤维膜(其利用预先形成的其中细胞被注入内腔并随后密封末端的中空纤维膜)。
如本文所使用，术语“细胞”是指各种形式的细胞，包括但不限于组织中保留的细胞、细胞簇(例如胰岛或其部分)和单独分离的细胞。
当在本文用来指细胞时，术语“分离的”是指借助于其来源或操作从至少一些组分分离的细胞，它们和所述至少一些组分天然相关或在初始获得或制备时它们和所述至少一些组分相关。
如本文所使用，术语“受试者”是指可能发展1型糖尿病，但可以患有或不患有所述疾病的人或其他哺乳动物(例如灵长类动物、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、兔等)。非人受试者可以是转基因的或以其他方式改造的动物。在本发明的许多实施方式中，受试者是人。在这种实施方式中，所述受试者通常称为“个体”或“患者”。术语“受试者”、“个体”和“患者”不指定特定年龄，因此涵盖新生儿、儿童、少年和成人。术语“患者”更具体地是指患有疾病(例如1型糖尿病)的个体。
本文中的术语“治疗”用于表征目的在于以下的方法或过程：(1)延迟或预防疾病或病症(这里指1型糖尿病)的发作；(2)减缓或停止所述疾病或病症的症状的进展、加重或恶化；(3)带来所述疾病或病症的症状的改善；或(4)治愈所述疾病或病症。可在所述疾病或病症开始后施用治疗以起到治疗作用。或者，可在所述疾病或病症发作之前施用治疗以起到预防或预防性作用。在这种情况下，使用术语“预防”。
如本文所使用，术语“治疗有效量”是指足以实现其预定目的(例如，细胞、组织、***或受试者中期望的生物或医学反应)的治疗剂或其组合物的任何量。例如，在本发明的某些实施方式中，目的可以是：恢复和/或保持1型糖尿病患者的血糖正常。
术语“血糖正常”和“血糖量正常”在本文可互换使用。它们具有其本领域理解的含义，是指具有正常的(即健康的)血糖浓度的状态。术语“低血糖”是指低于正常的血糖状态，术语“高血糖”是指高于正常的血糖状态。
如本文提及数值所使用的术语“约”和“大约”通常包括落入数值任一方向的10％范围(大于或小于所述数值)的数值，除非另有说明或从上下文中明显可见(除了该数值将超过可能值的100％的情况)。
发明详述
如上所述，Si-HPMC在本文中被描述为用于包封产胰岛素细胞的有利的聚合物，且本发明涉及Si-HPMC包封的产胰岛素细胞在管理1型糖尿病，尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者的血糖正常的用途。
I-用于包封产胰岛素细胞的Si-HPMC
A.硅烷化的羟丙甲基纤维素(Si-HPMC)
如本文所使用，术语“Si-HPMC”是指硅烷化的(即甲硅烷化的)羟丙甲基纤维素(HPMC)，尤其是指Guicheux教授和Weiss教授团队开发的硅烷化的HPMC(Laboratoire d'Ingenierie Osteo-Articulaire et Dentaire,LIOAD,Nantes,France)。
已经发现该聚合物(Si-HPMC)作为生物相容材料的若干应用。事实上，它已经用于软骨细胞(Vinatier等,Biomaterials,2005,26:6643-6651)；生骨细胞(Trojani等,Biomaterials,2005,26:5509-5517)；和人脂肪来源的间充质干细胞(Merceron等,CellTransplant,2011,20:1575-1588；Porton等,PLoS One,2013,8(4):e62368)的三维培养。发现它是用于基于人鼻软骨细胞的软骨工程的合适支架(Vinatier等,J.Biomed.MaterRes.A,2007,80:66-74)和用于转移关节软骨缺陷中自体同源的鼻软骨细胞的合适的可注射的水凝胶(Vinatier等,Biotechnol.Bioeng.,2009,102:1259-1267)。它已经用作与载荷有未分化骨髓基质细胞的磷酸钙结合的复合材料，用于异位成骨(Trojani等,Biomaterials,2006,27:3256-3264)。Si-HPMC还与氨基多糖样海洋胞外多糖结合，用于骨和软骨组织工程(Rederstorff等,Acta Biomater.,2011,7(5):2119-2130)。已经表明，心肌内递送接种间充质干细胞的Si-HPMC水凝胶能在心肌梗塞后保护心脏功能并减少心室重构(Mathieu等,PLoS One,2012,7(12):e51991)。
Guicheux教授和Weiss教授团队开发的用于本发明实践的Si-HPMC是由接枝有硅烷基的羟丙甲基纤维素组成的可注射的自固化(或自硬化)聚合物，当pH降低时，所述硅烷基允许在HPMC链之间形成共价键(见下文)。Si-HPMC已例如描述于WO 2005/044326、U.S.专利申请号U.S.2007/021289、U.S.专利申请号2010/080836和U.S.专利申请号US 2014/016775。已经研究其流变学和胶凝性质(Fatimi等,Biomaterials,2008,29(5):533-543；Fatimi等,Acta Biomateriala,2009,5(9):3423-3432,Mathieu等,PLoS One,2012,7(12):e51991)。
更具体地，用于本发明实践的Si-HPMC由简式为(HPMC)-O-X-Si(OZ)3的聚合物组成，所述聚合物可通过HPMC与式Si(OZ)3化合物的反应获得，其中X表示卤素原子或烃基，尤其是包含环氧基官能团的C2-C20烃基，和其中Z选自氢原子、碱金属和烷基，尤其是C1-C5烷基。
在某些优选的实施方式中，式Si(OZ)3化合物是(3-缩水甘油基丙基)三甲氧基硅烷，其具有下式：
在碱性介质中，通过打开环氧化物将3-缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷接枝在HPMC上，并水解甲氧基硅烷基以产生简式(I)的Si-HPMC：
(HPMC)-O-CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH3)3-Si(O-Na+)3 (I)
在本发明实践中，可使用任何适合的方法制备Si-HPMC。然而，在某些优选的实施方式中，Si-HPMC具有简式(I)且如之前所述制备(Fatimi等,Biomaterials,2008,29:533-543；Vinatier等,Biomaterials,2005,26:6643-6651)。简言之，起始HPMC是EA4 Premium(来自陶氏化学公司，Mw＝290,000g/mol，其中甲氧基含量是29％，羟丙基含量是9.7％，相当于平均取代度(DS)为1.9，平均分子取代度为0.23)。HPMC上的硅烷接枝包括HPMC的羟基官能团和硅烷的环氧基之间的Williamson反应。如Vinatier等所述(Biomaterials,2005,26:6643-6651)，通过在异种介质中将14.24％的3-缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷接枝在HPMC( EA4 Premium)上来合成Si-HPMC。
在将它用于根据本发明的治疗之前，Si-HPMC可以粉末形式储存。或者，在pH大于或等于约12.4的水溶液中稳定的Si-HPMC可以储存于碱性氢氧化钠溶液中(pH>12.4)。
B.产胰岛素细胞
如本文所使用，术语“产胰岛素细胞”是指能生产胰岛素的任何细胞。
在某些实施方式中，用于本发明实践的产胰岛素细胞是分离的胰岛细胞。人胰腺体积的大约百分之一由郎格罕氏岛(或“胰岛”)组成，其分散在整个外分泌胰腺。每个胰岛包含生产胰岛素的β细胞以及包含胰高血糖素的α细胞、分泌抑生长素的δ细胞和包含胰多肽的细胞(PP细胞)。大部分胰岛细胞是生产胰岛素的β细胞。使用特定表面抗原的表达来测定细胞是否是胰腺β细胞。例如，胰腺β细胞表达葡萄糖转运蛋白、Glut-1和/或Glut-2。或者，使用特定转录因子的表达来测定细胞是否是胰腺β细胞。例如，β细胞高度表达转录因子Pdx1、Nkx6.1、MafA和PaxA。最后，可以使用电子显微镜观察来确定非典型的β-细胞超微结构。
用于本发明实践的胰岛细胞可以是同种异体的胰岛细胞或异种的胰岛细胞。如本文所使用，术语“同种异体”和“异种”具有其本领域理解的含义。当用于指细胞时，术语“同种异体”是指细胞不是从它们待递送的受试者获得，而是从与待治疗患者相同物种的供体获得。当用于指细胞时，术语“异种”是指细胞从与待递送细胞的患者物种不同的供体物种获得。
如本领域已知，由于猪胰岛的巨大可利用性、与人胰岛的生理学相似性，包括猪胰岛素在糖尿病患者中的经受时间考验的使用和遗传改造供体来源的能力，从猪获得的胰岛已经显示出作为人胰岛的替代物。许多研究成功表明，使用猪胰岛在非人灵长类动物中实现糖尿病的逆转(由Van der Windt等,Diabetes,2012,61:3046-3055综述)。若干团队已经报告了在人中移植猪胰岛(Groth等,Lancet,1994,344:1402-1404；Elliott等,Xenotransplantation,2007,14:157-161；Valdes-Gonzales等,Clin.Exp.Immunol.2010,162:537-542；Elliot,Curr.Opin.Organ Transplant,2011,16:195-200；Elliot等,Xenotransplantation,2013,20:49)，尽管迄今为止结果大部分是未成功的。正在测试改进移植存活率的各种技术，例如微包封(Dufrane等,Transplantation,2010,90:1054-1062)和与Sertoli细胞共同培养(Isaac等,Transplant.Proa,2005,37:487-488)。已经产生具有各种遗传改造的猪以抵抗胰岛移植的免疫介导的排斥(Van der Windt等,Diabetes,2012,61:3046-3055；Phelps等,Science,2003,299:411-414；Yares等,Xenotransplantation,2007,14:428；Van der Windt等,Am.J.Transplant.,2009,9:2716-2726；Thompson等,Am.J.Transplant,2011,11:2593-2602)，并研究了若干免疫抑制的方案以减少胰岛移植排斥(Van der Windt等,Am.J.Transplant.,2009,9:2716-2726；Hering等,Nature Med.,2006,12:301-303；Cardona等,Nature Med.,2006,12:304-306；Cardona等,Am.J.Transplant.,2007,7:2260-2268；Thompson等,Am.J.Transplant,2011,11:947-957)。因此，胰岛异种移植领域的研究表明，它可以转化为常规临床护理。
用于本发明实践的胰岛可利用任何适合的方法分离。分离活的胰岛细胞的方法是本领域已知的(例如参见Field等,Transplantation,1996,61:1554；Linetsky等,Diabetes,1997,46:1120)。例如，可以根据本领域已知的方法从成年猪胰腺、新生猪胰腺或胎猪胰腺收获猪胰岛或胰岛细胞(例如参见，Swanson等,Human Immunology,2011,62:739-749；Casu等,Diabetologia,2008,51:120-129；Cantorovich等,Xenotransplantation,2002,9:25-35；Groth等,J.Mol.Med.,1999,77:153-154；Korbutt等,J.Clin.Invest.,1996,97:2119-2129)。例如，可以根据本领域已知的方法从人尸体胰腺分离人胰岛(例如参见Shapiro等,N.Engl.J.Med.,2000,343:230-238；Lablanche等,Diabetes Care,2015,38:1714-1722)。
可以通过切碎、修整、粉碎和/或酶促消化(例如胶原酶消化)来分离新鲜胰腺组织。然后通过洗涤、过滤、离心和/或挑选过程将胰岛与污染细胞和材料分离。用于分离和纯化胰岛细胞的方法和仪器描述于美国专利号5,447,863、5,322,790、5,273,904和4,868,121中。在包封之前，分离的胰腺细胞可任选使用本领域已知的培养胰岛细胞的任何适合的方法培养(例如参见美国专利号5,821,121)。可以在有助于去除抗原成分的条件下，在培养基中培养分离的细胞。
包封之前，可以培养分离的胰岛。可根据已知的细胞培养技术在包含促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的试剂的培养基中培养胰岛至少3小时，或更优选12-36小时，例如诸如18-24小时，所述试剂例如：抗氧化剂(例如噻硫酮或谷胱甘肽类似物、谷胱甘肽单酯和N-乙酰半胱胺酸和/或超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、维生素E、Trolox、硫辛酸、拉扎洛依、丁羟基大茴香醚(BHA)、维生素K等)、抗细胞因子(例如二甲基硫脲、西替沃酮、普伐他汀钠、L-NG-单甲基精氨酸、乳铁传递蛋白、4-甲基强的松龙等)、抗内毒素(例如L-NG-单甲基精氨酸、乳铁传递蛋白、N-乙酰半胱胺酸、腺苷受体拮抗剂例如下胺茶碱(茶碱)和抗脂多糖化合物例如棘霉素等)和抗生素(例如青霉素、四环素、头孢菌素、大环内酯、β-内酰胺和氨基糖苷类；这种适合的抗生素的实例包括链霉素和两性霉素B)。
可以在包封之前评估分离的胰腺β细胞的活力和功能性。例如，可通过静态孵育测试评估猪胰岛细胞的胰岛功能(例如参见Cantarovich等,Xenotransplantation,2002,9:23-35)。
如本文所使用，术语“产胰岛素细胞”还指分泌胰岛素的从胰腺祖细胞或其前体分化的细胞。产胰岛素细胞包括胰腺β细胞和胰腺β样细胞(即胰岛素阳性的内分泌细胞)，其以组成型或诱导型方式合成(即转录胰岛素基因、翻译胰岛素原mRNA和将胰岛素原mRNA变为胰岛素蛋白质)、表达(即表现胰岛素基因携带的表型性状)或分泌(即将胰岛素释放入细胞间隙)胰岛素。“胰腺β样细胞”定义为通过从胰腺祖细胞或其前体分化而制备的细胞，且其表达内源性功能化胰腺β细胞的胰岛素表达量的至少15％，或内源性胰腺β细胞分泌的胰岛素的量的至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或大于100％，例如至少约1.5倍、或至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或大于约5倍，或者显示内源性胰腺β细胞的至少一种或至少两种特征，例如但不限于，响应葡萄糖的胰岛素分泌和表达β细胞标志物，例如诸如c肽、Pdx1和Glut-1和/或Glut-2。
因此，在某些实施方式中，用于本发明实践的产胰岛素细胞是源自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或多能间充质基质细胞的胰腺β细胞或胰腺β样细胞。
胚胎干细胞(ESC)具有与其他潜在来源相比的若干优点，因为它们是现成可用的、高度可扩增的、且可分化为β细胞(Mfopou等,Diabetes,2010,59:2094-2101)。许多研究表明Pdx1+或内分泌细胞从ESC衍生，且一些团队已经产生分泌胰岛素或C肽的细胞(Soria等,Diabetes,2000,49:157-162；Mao等,Biomaterials,2009,30:1706-1714；Zhang等,CellRes.,2009,19:429-438)。
诱导的多能干细胞(iPSC)是用于胰岛移植研究的另一种重要的干细胞来源。它们具有允许产生可能对治疗有用的自体同源的细胞的独特性质(Takahashi,Cell.2007,131:861-872)。体外已经表明iPSC分化β细胞的可能性，并证实了部分葡萄糖反应性C肽的释放(Zhang等,Cell Res.,2009,19:429-438；Tateishi等,J Biol Chem.,2008,283:31601-31607；Maehr等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2009,106:15768-15773)。此外，最近的研究强调了小鼠(Alipio等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,107:13426-13431)和猕猴(Zhu等,Diabetologia,2011,54:2325-2336)iPSC在体外分化并移植入糖尿病小鼠模型后逆转高血糖的潜力。还在具有体外衍生自人多能干细胞的产胰岛素细胞的小鼠中观察到糖尿病的逆转(Rezania等,Nature Biotechnology,2014,32:1121-1133)。
多能间充质基质细胞(MSC)容易从许多组织来源分离，是体外高度可扩增的、抗低温贮藏且具有分化成许多不同谱系的潜力。已经报道了移植入STZ糖尿病大鼠后分化为胰岛素+细胞的人MSC在没有免疫抑制的情况下逆转了糖尿病(Chao等,PloS One,2008,3:el451)。不同的MSC来源例如脐带血、脂肪组织和骨髓已经用于制备产胰岛素细胞(Chao等,PloS One,2008,3:el451；Kajiyama等,Int.J.Dev.Biol.,2010,54:699-705；Xie等,Differentiation,2009,77:483-491；Allahverdi等,Cell J.,2015,17:231-242)。
除所有上述提及的细胞类型之外，已经表明胰腺上皮细胞例如导管细胞(Seaberg等,Nature Biotechnol.,2004,22:1115-1124；Bonner-Weir等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:7999-8004；Gao等,Diabetes,2003,52:2007-2015,Hao等,Nature Med,2006,12:310-316)、肝细胞(Ferber等,Nature Med.,2000,6:568-572；Sapir等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102:7964-7969；Kaneto等,Diabetes,2005,54:1009-1022)和甚至α细胞(Collombat等,Cell,2009,138:449-462；Thorel等,Nature,2010,464:1149-1154；Gianani等,Semin Immunopathol.,2011,33:23-27)能够在适当的条件下分化成胰腺β细胞(Lysy等,Stem Cells Transl.Med.,2012,1:150-159)。
C.制备Si-HPMC包封的产胰岛素细胞
可以使用本领域已知的任何适合的大包封或微包封技术将产胰岛素细胞包封在Si-HPMC中(由Uludag等,Drug Delivery Reviews,2000,42:29-64综述)。包封的目的在于用材料屏障包围一个产胰岛素细胞或一组产胰岛素细胞从而保护移植的包封的细胞免受宿主免疫排斥。Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的制备方法不是限制因素，只要它允许当引入患者时细胞仍然是活的且正常起作用。
利用Si-HPMC包封利用了随pH变化的Si-HPMC的胶凝性质。
如上所述，Si-HPMC是由接枝有硅烷基的羟丙甲基纤维素组成的自硬化(或自固化)聚合物，当pH降低时，所述硅烷基允许在HPMC链之间形成共价键(见下文)。同时，Si-HPMC在pH大于或等于12.4的水溶液中稳定，溶液的酸化引起粘度逐步增加并形成水凝胶。凝胶化pH为7-12，取决于期望的交联速率。这种物理现象伴随Si-HPMC通过(i)将硅醇盐基(-Si(O-Na+)3)转化为硅烷醇基(-Si(OH)3)的交联，然后通过(ii)一个Si-HPMC分子的第一硅烷醇基与不同Si-HPMC分子的第二硅烷醇基缩合和/或一个Si-HPMC分子的硅烷醇基与不同Si-HPMC分子的HPMC链的羟基缩合来形成三维网络。可以选择条件(特别是pH和温度)以控制Si-HPMC的交联速率(Bourges等,Adv.Colloid Interface Sci.2002,99:215-228)。
通常，将产胰岛素细胞微包封和大包封在Si-HPMC中将包括一个步骤：将细胞加入粘性液体形式的Si-HPMC溶液中。这种Si-HPMC粘性液体可如之前所述获得(Fatimi等,Biomaterials,2008,29:533-543；Vinatier等,Biomaterials,2005,26:6643-6651)。简言之，在室温下将Si-HPMC粉末(3％w/v)溶于0.2M NaOH(3％)，持续搅拌48小时。然后可以将溶液灭菌，例如通过蒸汽(121℃，20分钟)。最后，为允许形成网状水凝胶，将溶液与0.5倍体积的0.26M HEPES缓冲液混合。最终产物是pH 7.4的粘性液体，其允许细胞加入。如本领域技术人员所承认，可以容易地设计该方法的变体。
例如，Si-HPMC粘性液体可如之前所述或如以下实施例所述获得。简言之，将Si-HPMC溶于0.2M NaOH水溶液(30.9mg/mL,pH>12.5)，然后在0.09M NaOHaq中用分子量截止值6-8kDa进行2次透析，以从Si-HPMC粉末去除任何非接枝的3-缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷。然后通过互相连接两个注射器，将一个luer接口注射器中包含的一倍体积的Si-HPMC碱性溶液与另一个luer接口注射器中的0.5倍体积的酸性缓冲溶液混合，从而获得水凝胶前体溶液。pH3.2的酸性缓冲溶液可通过将6.2g的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES≥99.5％)、1.8g的NaCl(≥99％)和60mL的0.1M HCl水溶液(HCl 37wt％)混合来制备。用去离子水将体积调节至100mL以使最终pH为7.4。然后该混合物在30-40分钟是可注射的，直到到达胶凝点。利用同样的方法，胰岛或细胞胰岛的悬浮液(i)可在交联前添加到第三luer接口注射器中并与Si-HPMC的最终粘性溶液连接，或(ii)可在交联前引入Si-HPMC的最终粘性溶液，如本文所述。
在某些实施方式中，将产胰岛素细胞微包封在Si-HPMC中。微包封允许单个或一组产胰岛素细胞经由球形液滴/珠或多层***与宿主***免疫分离。这种包封形式由于易于生产、机械稳定性、大的表面积体积比和优化的扩散能力在过去的三十年中已被最深入地研究。在早期研究中微球尺寸为600-800μm；然而，最近的制造技术允许制备350-500μm微球。然而，微球、微胶囊或微珠可小于350μm和大于800μm。
将产胰岛素细胞微包封在Si-HPMC中通常包括三个步骤：将产胰岛素细胞加入Si-HPMC粘性溶液内(以预凝胶形式)；将细胞分散为小液滴，从而产生微胶囊；和利用适当pH的生物缓冲液通过交联(或自网格化)Si-HPMC来稳定液滴。适合的生物缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液(PBS，磷酸盐缓冲盐水)、HEPES和TRIS缓冲液。也可以使用本领域技术人员已知的任何生物培养基，例如DMEM培养基或α-MEM培养基(α最低必需培养基)。在37℃、5％CO2和定期更新培养基的孵育器中，包含产胰岛素细胞的Si-HPMC微胶囊可以在(生理学pH(7.4)和温度(37℃))培养条件下储存短至数小时，长至数天。
可以利用本领域已知的任何适合的方法使悬浮在可胶凝介质(即Si-HPMC)中的细胞形成液滴，包括但不限于乳化(例如美国专利号4,352,883)、从针挤出(例如美国专利号4,407,957；Nigam等,Biotechnology Techniques,1988,2:271-276)、使用喷雾面条(spraynoodle)(Plunkett等,Laboratory Investigation,1990,62:510-517)或使用针和脉冲静电电压(例如美国专利号4,789,550和5,656,468)。
在某些实施方式中，将产胰岛素细胞大包封在Si-HPMC中。与微包封相反，大包封将较大量的产胰岛素细胞包封入可以肉眼可见地处理的较大装置或水凝胶中。如果有害事件(例如感染)发生，大包封的胰岛容易取出，且如果功能随时间衰退，大包封的胰岛容易替换。
在某些实施方式中，包含产胰岛素细胞的水凝胶在体外(离体)制备然后原样引入患者体内。将产胰岛素细胞包封入Si-HPMC水凝胶可通过以下进行：将产胰岛素细胞与Si-HPMC的粘性溶液(预凝胶形式)混合或合并；并利用生物缓冲液(如上所述)诱导pH降低(其导致Si-HPMC的交联)，从而形成其中捕获产胰岛素细胞的水凝胶。
在其他实施方式中，包含产胰岛素细胞的最终水凝胶在体内产生(即在患者体内)。更具体地，将产胰岛素细胞在体外(离体)与Si-HPMC的粘性溶液(预凝胶形式)混合或合并，并将粘性溶液注入患者，其中在生理学pH下，Si-HPMC经历自网格化，从而形成包含产胰岛素细胞的水凝胶。
D.其他治疗化合物
在某些实施方式中，产胰岛素细胞是Si-HPMC胶囊或水凝胶中唯一的“治疗活性”成分。
在其他实施方式中，Si-HPMC包封的产胰岛素细胞进一步包含至少一种治疗化合物。
治疗化合物可以是胰岛素敏感性增强剂、葡萄糖吸收抑制剂、双胍、胰岛素分泌增强剂、胰岛素制剂、胰高血糖素受体拮抗剂、胰岛素受体激酶刺激剂、三肽基肽酶II抑制剂、二肽基肽酶IV抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B抑制剂、糖原磷酸化酶抑制剂、葡萄糖-6-磷酸酶抑制剂、果糖-二磷酸酶抑制剂、丙酮酸脱氢酶抑制剂、肝糖异生抑制剂、D-牛肝菌醇、糖原合酶激酶-3抑制剂、胰高血糖素样肽-1、胰高血糖素样肽-1类似物、胰高血糖素样肽-1激动剂、淀粉不溶素、淀粉不溶素类似物、淀粉不溶素激动剂、醛糖还原酶抑制剂、晚期糖基化终产物形成抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、γ氨基丁酸受体拮抗体、钠通道拮抗剂、转录因子NF-κΒ抑制剂、脂质过氧化物酶抑制剂、N-乙酰化-α-连接的-酸-二肽酶抑制剂、***-I、血小板衍生的生长因子、血小板衍生的生长因子类似物、表皮生长因子、神经生长因子、肉碱衍生物、尿苷、5-羟基-1-甲基海胆素、EGB-761、比莫氯酚、舒洛地特、Y-128、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂、苯氧酸衍生物、β3-肾上腺素能受体激动剂、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶抑制剂、probcol、甲状腺激素受体激动剂、胆固醇吸收抑制剂、脂肪酶抑制剂、微粒体甘油三酯转移蛋白抑制剂、脂氧化酶抑制剂、肉毒碱棕榈酰基转移酶抑制剂、鲨烯合成酶抑制剂、低密度脂蛋白受体增强剂、烟酸衍生物、胆汁酸螯合剂、钠/胆汁酸共转运抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、食欲抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、中性肽链内切酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗体、内皮肽转化酶抑制剂、内皮肽受体拮抗体、利尿剂、钙拮抗剂、血管舒张抗高血压药、交感神经阻断剂、中枢作用抗高血压药、α2-肾上腺素能受体激动剂、抗血小板剂、尿酸合成抑制剂、促尿酸尿剂、尿碱化剂、氧载体或其任何组合。
II-Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途
A.适应症
Si-HPMC包封的产胰岛素细胞可用于治疗诊断患有1型糖尿病的患者。患者优选是人，且可以是儿童、少年或成人。
可使用临床用于诊断1型糖尿病的任何方法来诊断1型糖尿病。世界卫生组织将糖尿病的诊断值定义为空腹血糖浓度7.0mmol/1(126mg/dl)及以上(全血6.1mmol/1或110mg/dl)，或2小时葡萄糖水平11.1mmol/L或更高(200mg/dL或更高)。其他暗示或指示糖尿病的值包括动脉压升高至140/90mm Hg或更高；血浆甘油三酯升高(1.7mmol/L；150mg/dL)和/或低HDL-胆固醇(男性：低于0.9mmol/L,35mg/dl；女性：低于1.0mmol/L,39mg/dL)；向心性肥胖(男性：腰臀比高于0.90；女性：腰臀比高于0.85)和/或体重指数超过30kg/m2；微量白蛋白尿，其中尿白蛋白***率为20μg/min或更高，或白蛋白：肌酸酐比率为30mg/g或更高)。
在某些实施方式中，患者已经诊断患有脆性1型糖尿病。术语“脆性1型糖尿病”、“脆性1型糖尿症”和“不稳定性1型糖尿病”在本文可互换使用。它们是指控制1型糖尿病尤其困难。几乎所有的糖尿病患者经历血糖水平波动，其比非糖尿病患者更大且更不可预测。当这些波动变得不能忍受且引起患者生活的中断和/或延长的住院治疗时，这个人被标记为患有不稳定或脆性糖尿病。
或者，Si-HPMC包封的产胰岛素细胞可用于治疗诊断患有1型前驱糖尿病(即1型糖尿病发作之前)，尤其当葡萄糖耐量试验显示开始反常的患者。
B.Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的施用
根据本发明的治疗方法包括向1型糖尿病患者施用Si-HPMC包封的产胰岛素细胞。术语“施用”、“引入”和“移植”在本文可互换使用。它们是指将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞通过导致包封细胞的位置处于期望位点且其中至少一部分移植的包封细胞仍然是活的方法或途径置入受试者。患者施用后的活性时期可以短至数小时(例如12小时、24小时)到数天(例如2天、3天、5天、10天、20天、30天或大于30天)，到长至数月(例如3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月)或数年(例如2年、3年、4年、5年或大于5年)。
可以将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞引入患者体内的任何适当的位点。理想地，移植位点应允许组织的快速血管新生以保持移植和血管再形成之间的缺血期尽可能短。已被认为是可能的胰岛移植位点的血管外位点包括但不限于胰腺(Stagner等,Journal of thePancreas,2007,8:628-636)、胃黏膜下层(Caiazzo等,Transplant Proa,2007,39:2620-2623)、横纹肌(Svensson等,Cell Transplant,2011,20:783-788)、腹膜(Fritschy等,Transplantation,1991,52:777-783)、网膜(Ao等,Transplantation,1993,56:524-529)、骨髓(Cantarelli等,Blood,2009,114:4566-4574)、肾囊(Carlsson等,Transplantation,2000,69:761-766)、***(Komori等,Nature Biotechnol.,2012,30:976-983)、脾(Kaufman等,Transplantation,1990,50:385-391)和一些免疫调节位点(Cantarelli等,Curr.Diab.Rep.,2011,11:364-374)例如眼前房、睾丸和胸腺。
在本发明的某些实施方式中，通过将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞皮下注射到1型糖尿病患者来施用。已经通过在皮下组织中移植包封的胰岛证实了糖尿病小鼠和非人灵长类动物中的血糖量正常(Dufrane等,Transplantation,2010,90:1054-1062；Kawakami等,Pancreas,2001,23:375-381；Wang等,Transplantation,2002,73:122-129；Wang等,Transplantation,2003,76:29-296)。已经报告了将包封的胰岛皮下移植到1型糖尿病患者的临床试验(Sharp等,Diabetes,1994,43:1167-1170；和Clinical Islet TransplantProgram with Sernova's Cell Pouch)。
在本发明的某些实施方式中，将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞肌内施用到1型糖尿病患者。肌内移植已经到达胰岛自体移植的临床阶段(Chri staffers son等,Diabetes,2010,59:2569-2578)。
在本发明的某些实施方式中，将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞植入1型糖尿病患者的腹膜腔。术语“腹膜腔”是指壁层腹膜和脏层腹膜(将腹腔中的器官与腹壁分离的两层膜)之间的空间。已经报告了将包封的胰岛皮下移植到1型糖尿病患者的临床试验(Soon-Shiong等,The Lancet,1994,343:950-951；Scharp等,Diabetes,1994,43:1167-1170；Calafiore等,Diabetes Care,2006,29:137-138；Tuch等,Diabetes Care,2009,32:1887-1889；和目前由Amcyte,Inc.,Novocell,Inc.(ViaCyte,Inc.)和Living CellTechnologies(LCT)进行的临床试验)。
在本发明的某些实施方式中，将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞植入1型糖尿病患者的肠系膜。如本文所使用，术语“肠系膜”是指产生于腹膜后腔并粘附于肠道的膜组织皱襞。已经通过在肠系膜中移植包封的胰岛证实了糖尿病小鼠中的血糖量正常(Vernon等,CellTransplant,2012,21(10):10.3727/096368912X636786；Rogers等,Am.J.Pathol.,2010,177:854-864)。
在本发明的某些实施方式中，将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞植入1型糖尿病患者的网膜，例如植入邻近于肠系膜上动脉束的网膜，或植入网膜袋。如本文所使用，术语“网膜”是指围绕腹部器官的腹膜层。已经通过在网膜中移植包封的胰岛证实了糖尿病小鼠中的血糖量正常(Kobayashi等,Cell Transplant,2006,15:359-365)。
在本发明的某些实施方式中，将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞植入1型糖尿病患者的肾囊。术语“肾囊”和“肾脏囊”在本文可互换使用，且是指围绕肾脏并覆盖在肾周脂肪组织厚层中的坚韧的纤维层。已经通过在肾囊中移植包封的胰岛证实了糖尿病小鼠中的血糖量正常(Dufrane等,Transplantation,2006,81:1345-1353)。
在某些优选的实施方式中，将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞通过皮下或肌内植入。肌肉和皮下组织表现出若干优点：与其他位点例如腹膜内器官相比，它们比较容易接近。因此如有必要或期望，包封细胞可以容易地移植和去除。
取决于患者体内的位点，Si-HPMC包封的产胰岛素细胞将使用包括但不限于以下的任何各种方法来实现：通过注射、通过局部输注、通过导管的方式、通过手术植入等。
通常，Si-HPMC包封的产胰岛素细胞将以治疗有效量，即足以实现其预定目的：即恢复和/或保持1型糖尿病患者的血糖正常的量施用。国际胰岛移植登记处推荐每公斤接受者体重移植至少6000个胰岛当量以实现血糖正常。在2000年，埃德蒙顿草案介绍了移植程序的若干改变并推荐每公斤接受者体重移植11000个胰岛当量的平均胰岛块。然而，对本领域技术人员显而易见的是，待移植的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的数量取决于包封细胞在体内响应葡萄糖刺激提供胰岛素的能力。因此，待施用的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的准确数量将在各个受试者之间不同，不仅取决于年龄、性别、重量和患者所遭受的血糖水平波动的严重程度，而且取决于Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的功效、使用(或不使用)伴随疗法(例如外源胰岛素疗法)及其他临床因素。这些因素可在治疗期间由主治医师容易地确定。
根据本发明的治疗的效果可利用本领域已知的用于诊断1型糖尿病的任何分析和测试来监控，尤其通过评估血糖浓度。
C.疗法组合
在某些实施方式中，Si-HPMC包封的产胰岛素细胞是向1型糖尿病患者施用以调节血糖过多的唯一治疗剂。在其他实施方式中。Si-HPMC包封的产胰岛素细胞与胰岛素疗法组合使用。组合允许施用较轻的胰岛素疗法和对血糖(过高和/或过低)的更好调节。
在某些实施方式中，Si-HPMC包封的产胰岛素细胞与免疫抑制治疗组合施用。然而，在其他实施方式中，移植的1型糖尿病患者不施用伴随的免疫抑制治疗。
III–试剂盒
另一方面，本发明提供包含用于进行根据本发明的治疗方法的材料的试剂盒。用于进行本发明治疗方法的材料和试剂可以一起装配在试剂盒中。在某些实施方式中，本发明试剂盒包含Si-HPMC(例如以粉末形式或在pH>12.4以水溶液形式)和产胰岛素细胞，以及将产胰岛素细胞包封入Si-HPMC中的说明书和向1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者施用包封细胞的说明书。在其他实施方式中，本发明试剂盒包含Si-HPMC包封的产胰岛素细胞和向1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者施用的说明书。
取决于程序，试剂盒可进一步包含一个或多个：洗涤缓冲液和/或试剂、溶解缓冲液和/或试剂、凝胶缓冲液和/或试剂等。试剂盒可以包括使用这些缓冲液和试剂以进行程序的不同步骤的方案。
试剂可以固体(例如冻干)或液体形式供应。本发明试剂盒可任选包含不同的容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)用于各单独的缓冲液和/或试剂。各组分将通常适于在其各自容器中等分或以浓缩形式提供。也可以提供适于进行所公开方法的某些步骤的其他容器。试剂盒的单个容器优选保持密封以用于商业销售。
根据本发明的试剂盒可以进一步包含用于根据本发明方法使用试剂盒的说明书。用于根据本发明方法使用试剂盒的说明书可以包括用于进行大包封的说明书、用于进行微包封的说明书、用于向1型糖尿病患者施用/注射/移植的说明书等。
在某些实施方式中，根据本发明的试剂盒可以包含用于向患者施用包封细胞的装置(例如注射器和针***)。
任选与容器相关的可以是以管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式放入的告知单或包装，所述告知单反映机构对用于人施用的制造、使用或销售的批准。
标识符例如条形码、无线电频率、ID标签等可以存在于试剂盒中或试剂盒上。例如为了质量控制、库存控制、工作站之间的轨迹移动等目的，可以使用标识符来唯一地鉴定试剂盒。
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应该以任何方式解释为对本发明范围的限制。
附图说明
图1.分离后在皮氏培养皿中培养7天的非包封的新生猪胰岛的动力学。(A)通过培养第3天、第5天和第7天IEQ占第1天IEQ的百分比计算的胰岛当量数(平均IEQ(胰岛当量)±SEM)。(B)培养1、3、5或7天后，在基础培养基(黑色)、20mM葡萄糖(灰色)或20mM葡萄糖+10mM茶碱(白色)中培养2小时的幼猪胰岛的胰岛素单位生产率(平均q胰岛素±SEM)(n＝8)。*p<0.05。
图2.分离后在水凝胶中包封6周的新生猪胰岛的动力学。(A)活力染色(钙黄绿素，绿色，用于活胰岛和乙锭同型二聚体，红色，用于死胰岛)。(B)Si-HPMC(黑色，n＝6)或藻酸盐(灰色，n＝3)包封的新生胰岛的基础胰岛素单位生产率(平均q胰岛素±SEM)。*p<0.05。Si-HPMC将培养物中新生猪胰岛的活力和功能维持至少42天-即，6周(测试的最大值：72天)。
图3.在微板培养9个月的Si-HPMC包封的假胰岛Min6的动力学。(A)培养1、3或6个月后的活力染色(钙黄绿素，绿色，用于活胰岛和乙锭同型二聚体，红色，用于死胰岛)。(B)基础胰岛素单位生产率(平均q胰岛素±SEM)(n＝3)。Ns:没有显著差异。
图4.响应刺激的胰岛素生产。(A)在基础培养基或20mM葡萄糖+10mM茶碱(G+T)中培养的Si-HPMC(黑色圆)或藻酸盐(黑色方块)包封的培养2天的新生猪胰岛的胰岛素单位生产率(q胰岛素)。(B)胰岛素生产3小时的曲线下面积(平均AUC±SEM)，包括Si-HPMC(黑色，n＝6)或藻酸盐(灰色，n＝3)中包封的新生猪胰岛的1小时的G+T刺激。*p<0.05，**p<0.005，ns：没有显著差异。
图5.Si-HPMC包封的假胰岛Min6响应刺激的胰岛素生产。(A)在基础培养基或20mM葡萄糖+10mM茶碱(G+T)中培养1个月(黑色圆)、3个月(黑色方块)和9个月(黑色三角形)后的胰岛素单位生产率(q胰岛素)。(B)胰岛素生产3小时的曲线下面积(平均AUC±SEM)，包括1小时的G+T刺激(n＝3)。Ns：没有显著差异。
图6.移植到链脲菌素-诱导的糖尿病(A)NOD NSG免疫缺陷小鼠(STZ高剂量,n＝4)和(B)免疫活性C57BI/6小鼠(STZ低剂量,n＝4)中的在Si-HPMC水凝胶中皮下大包封的假胰岛MIN6(500IEQ)。箭头代表涉及小鼠的移植物移出时间。
图7.小鼠完整脾细胞或人巨噬细胞培养基中的IL-6分泌(平均IL-6量±SEM)，所述小鼠完整脾细胞或人巨噬细胞(A)单独培养(黑色，n＝4)、与Si-HPMC(浅灰，n＝4)或藻酸盐(深灰，n＝2)一起培养36小时，和(B)与LPS(10ng/mL)(n＝4)一起培养6小时。
图8.(A)小鼠完整脾细胞(n＝3)或(B)人巨噬细胞(n＝2)培养基中的IL-6分泌(平均IL-6量±SEM)，所述小鼠完整脾细胞或人巨噬细胞单独(黑色)或与未包封的(白色)、包封于Si-HPMC(浅灰)或藻酸盐(深灰)的新生猪胰岛共培养36小时。*p<0.05，ns：没有显著差异。
图9.小鼠完整脾细胞培养基中的IL-6分泌(平均IL-6百分比/Ct-±SEM)，所述小鼠完整脾细胞单独(Ct-，黑色)或与未包封(白色)、或包封于Si-HPMC(灰色)(n＝2)的幼猪胰岛转孔共培养48小时。
具体实施方式
以下实施例描述制备和实施本发明的一些优选模式。然而，应理解实施例仅用于说明性目的而不意欲限制本发明范围。此外，除非实施例中的描述用过去时态呈现，否则，文本与说明书其余部分一样，并不意欲表明确实进行了实验或确实获得了数据。
材料和方法
伦理
动物的所有护理和实验根据相关的法国指南(Decret 2001-464 of May 29 2001和Decret 2013-118 of February 1,2013)进行。将小鼠置于ONIRIS啮齿动物设施(协议号：44 266)的特定的不含病原体的环境中，备有灭菌自来水和食物。所有的动物试验经卢瓦尔动物实验伦理委员会批准(批准号：01074.01/02)。进行所有努力以将痛苦最小化。
细胞
新生猪胰岛(NPI)。从INRA(Saint Gilles,France)购买尤卡坦半岛新生猪。从1-14天大的雌性或雄性尤卡坦半岛新生猪(1-2公斤体重)获得胰腺。将小猪用Isofluran麻醉并在完全放血后进行开腹术。小猪的止痛包括术前服用布托啡诺和咪达***，和每次手术施用氯仿***。然后将胰脏从周围组织中小心地分离出来并置于补充有10mM Hepes、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(HBSS缓冲液)的冷HBSS中。如Korbutt等所描述(J.Clin.Invest.,1996,97:2119-2129)进行新生猪胰岛的分离和培养。简言之，用剪刀将胰脏切成1-2mm3小片并洗涤，然后用2.5mg/mL胶原酶(Sigma-Aldrich)消化并在37℃的振摇水浴中温和搅拌14-16分钟。用尼龙筛网(500μm)过滤消化物，并在补充有10mM Hepes、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和0.5％BSA的HBSS中洗涤四次，然后置于包含补充有10mM葡萄糖(Sigma-Aldrich)、50mM IBMX(Sigma-Aldrich)、5g/L BSA(Sigma-Aldrich)、2mM L-谷氨酰胺(Dutsher)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Dutsher)的Ham's F10(Dutscher)的非细胞培养基处理的皮氏培养皿(Dutscher)中。将培养皿保持于37℃的湿润空气(5％CO2,95％空气)中，并在分离后第一天更换培养基，此后每隔一天更换培养基。一旦包封于水凝胶中(见下文)，在补充有10mM葡萄糖、50mM IBMX、2mMl-谷氨酰胺、10mM烟酰胺、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％猪血清的Ham's F10中培养NPI。
MIN6假胰岛(PI)。MIN6鼠胰岛素细胞由Pr.Jun-ichi Miyazaki(OsakaUniversity Medical School,Japan)友情提供。选择低传代(5-10)MIN6细胞以形成PI。在包含25mM葡萄糖且补充有10％热灭活牛血清(Invitrogen,Carlsbad,USA)、1％青霉素/链霉素/新霉素混合物(PAA)和50μΜ巯基酚(Sigma-Aldrich)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM,Dutsher)中培养MIN6细胞。通过以下制备MIN6PI：在37℃的湿润空气(5％CO2,95％空气)中，在50mL腔室RCCS生物反应器(Synthecon,Houston,USA)接种106个细胞/mL4天，并在未处理皮氏培养皿中接种3天。
胰岛当量计算。测定胰岛当量以将胰岛相对于其体积的数量标准化。根据国际胰岛移植协会第二次大会设定的标准(Ricordi等,Acta Diabetol.Lat,1990,27:185-195)，一个IEQ等于150μm直径的胰岛。每次计数使用50μL的三个样品。
将NPI和PI大包封于Si-HPMC和藻酸盐水凝胶
大胶囊中的目标胰岛浓度为2500胰岛当量(IEQ)/mL。由LIOAD(Laboratoire d'Ingenierie Osteo-Articulaire et Dentaire-UMR_S 791,Nantes,France)提供3％(w/v)硅烷化的羟丙甲基纤维素(Si-HPMC)。利用两个通过luer接口连接的注射器以2:1(v:v)的比例混合Si-HPMC和酸缓冲液，以分别获得最终2％(w/v)水凝胶(Bourges等,Adv.ColloidInterface Sci.,2002,99:215-228)。凝胶化(预凝胶)10分钟后，利用锥形的0-200μL圆锥体将胰岛(体积为20μL)滴入200μL水凝胶内。然后通过23量规针挤出，将胰岛包埋入水凝胶内。将200μL凝胶和胰岛混合物置于48孔TCPS平板以获得体外Si-HPMC胰岛大胶囊。在37℃孵育60分钟后添加生长培养基。
利用来自Novamatrix(Sandvika,Norway)的临床级低粘度、高葡糖醛酸盐藻酸钠(PRONOVA UP LVG)制备藻酸盐大胶囊。通过将藻酸钠在4℃温和搅拌过夜以2.2％(w/v)溶于0.9％NaCl(w/v；Sigma-Aldrich)，然后用0.2μΜ过滤(Millipore,Darmstadt,Germany)灭菌。在0.9％NaCl中洗涤NPI和PI三次，并以1:8(v:v)的比例悬浮于藻酸钙2.2％溶液中。利用注射器泵，通过23量规针挤出到100mM CaCl2(Sigma-Aldrich)凝胶化浴10分钟获得大球。然后在两次0.9％NaCl水浴10分钟和在培养基中依次洗涤大球。所得大球的平均直径为2mm。通过将200μL的凝胶和胰岛混合物滴入48孔平板获得大胶囊，然后用围绕且覆盖胶囊的100mM CaCl2溶液孵育20分钟。胶凝后，去除CaCl2并在0.9％NaCl(两次20分钟浴)和培养基中依次洗涤大胶囊。
将包封的NPI或PI保持于37℃的湿润空气(5％CO2,95％空气)中，并且每2到3天更换培养基。
NPI和PI的体外活力
利用LIVE/DEAD试剂盒(钙黄绿素AM和溴化乙锭(EthD-1))根据制造商建议(LifeTechnologies,Carlsbad,USA)评估包封和未包封的NPI和PI的活力。测试前，将未包封细胞在D-PBS(Sigma Aldrich)中洗涤一次，并将包封细胞在D-PBS中洗涤三次15分钟。将浓度分别为4μΜ和2μΜ的EthD-1和钙黄绿素AM探针孵育30-60分钟。
NPI和PI的体外功能
葡萄糖-刺激的胰岛素分泌(GSIR)。分别通过静态或静态/动态法评估未包封或包封胰岛响应急性葡萄糖±茶碱(胰岛素分泌的增效剂)的释放胰岛素的能力。基础培养基(B)由补充有2.8mM葡萄糖(PAA)、2mM L-谷氨酰胺和5g/L BSA(Sigma-Aldrich)的RPMI(PAA)组成。葡萄糖刺激的培养基(G)和葡萄糖加上茶碱培养基(G+T)是分别补充有20mM葡萄糖和20mM葡萄糖±10mM茶碱(Sigma-Aldrich)的基础培养基。如Korbutt等所描述(J.Clin.Invest.,1996,97:2119-2129)，通过在B、G或G+T培养基中孵育50胰岛当量(IEQ)(之前在基础培养基中洗涤)2小时来评估未包封胰岛的静态GSIR。然后通过离心分离组织和培养基，并分析它们各自的胰岛素含量。静态/动态法用于评估包封胰岛(500IEQ/200μL水凝胶)的GSIR。首先，将包封胰岛在基础培养基的5次连续孵育中洗涤30分钟。然后，通过在400μL的基础培养基(2次)、葡萄糖加上茶碱(2次)和基础培养基(3次)中依次孵育包封胰岛30分钟来评估胰岛素的基础产量和刺激产量。
培养物中包封胰岛的基础胰岛素分泌。每周，最后一次更换培养基24小时后从包封胰岛收集培养基的上清液，以分析培养物中包封胰岛的胰岛素基础产量。
胰岛素分析和结果计算。通过ELISA(Mercodia,Uppsala,Sweeden)分析胰岛素。利用以下方程计算胰岛素(ins)的单位生产率(q)，其中X是IEQ的量，t是生产时间：
(以pg/1000IEQ/h表示)
水凝胶的免疫生物相容性和免疫保护
用鼠脾细胞和人巨噬细胞孵育胰岛。将未包封或包封胰岛与人巨噬细胞或鼠脾细胞共培养。人单核细胞购自CIC(Centre d'Investigation Clinique,Nantes,France)。通过体外分化在皮氏培养皿(106个细胞/cm2)的RPMI 1640中培养6天的单核细胞获得人巨噬细胞，所述RPMI1640补充有10％FCS(v/v)、2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100mg/mL链霉素和104U/mL的rhM-CSF(重组巨噬细胞-集落刺激因子，R&D Systems,Abingdon,UK)。通过酸性蛋白酶(Sigma-Aldrich)去除巨噬细胞并以4xl04个细胞/孔铺板于48孔平板的500μL完全培养基中。通过温和地机械破坏脾，将脾细胞与NOD/ShiLTJ小鼠分离、通过70μm筛、随后裂解红细胞。对于细胞因子分泌分析，在500或1000μL补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素、100mg/mL链霉素的RPM500 1640培养基中，分别将脾细胞以2xl05个细胞/孔铺板于48孔平板或以4xl05个细胞/孔铺板于24孔平板。
细胞因子分泌。40±2小时后收集所有培养基并储存于-20℃的温度下。用CBA测试(Becton Dickinson,Franklin Lakes,USA)或ELISA测试(Bio-techne,Menneapolis,USA)进行TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-12或IL-10定量(FACS Aria,BD Bioscience)。
将包封的MIN6假胰岛(PI)移植入链脲菌素诱导的糖尿病免疫缺陷NSG和免疫活性的C57BI/6小鼠中。
使用6到12周龄的雌性小鼠。NOD scidγ免疫缺陷(NSG)小鼠购自Charles RiverLaboratories(Lyon,France)。移植前5天，通过单次腹膜内注射高剂量的150mg/kg体重链脲霉素(Sigma Aldrich；新溶于柠檬酸盐缓冲液)使得禁食小鼠患上糖尿病。C57B1/6小鼠获自Janvier Labs(Le Genest Saint Isle,France)。移植前40天，通过五次腹膜内注射(每天一次)低剂量的50mg/kg体重链脲霉素(Sigma Aldrich；新溶于柠檬酸盐缓冲液)使得C57B1/6小鼠患上糖尿病。利用Glucotrend/Accu-Check(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)监控血糖。血样从尾部静脉获得。当两次连续监控的血糖高于13.5mmol/L时，诊断为糖尿病。注射当天，利用异氟烷麻醉接受的动物。如上所述，将500IEQ包封入200μL的Si-HPMC水凝胶中。预胶凝10分钟后，将Si-HPMC包封的胰岛皮下注射到麻醉小鼠的右侧。然后从一些小鼠去除SiHPMC的大胶囊。为此，用异氟烷麻醉小鼠并用丁丙诺啡进行止痛。
统计分析。数据表示为独立观察的平均值±SEM。利用附图图例所示的Prism(GraphPad Software,Inc.)和统计检验进行统计分析。
结果
缺乏包封的特征在于体外培养的新生猪胰岛的活力快速降低(参见图1(A))，Si-HPMC包封允许新生猪胰岛存活超过42天(参见图2(A),测试的最大值：72天)。体外培养长达9个月的鼠胰腺假胰岛(Min6)中也观察到相同结果(参见图3(A))。
就包封胰岛的体外功能性而言：发现当包封于Si-HPMC中时，新生猪胰岛体外分泌的胰岛素的基础量高于包封于藻酸盐(临床等级GMP Novamatrix)(参见图2(B),p<0.05)。新生猪胰岛的胰岛素体外分泌不受葡萄糖刺激(参见图1(B))。这一结果是预期的，因为已知新生猪胰岛在功能上是不成熟的。然而，如所预期的(Korbutt等,J.Clin.Invest.,1996,97:2119-2129)，观察到新生猪胰岛的胰岛素体外分泌被葡萄糖与茶碱(一种增效剂)的组合刺激(参见图1(B),p<0.05)。刺激剂(葡萄糖+茶碱)和胰岛素本身扩散通过水凝胶如藻酸盐的延迟使得胰岛素分泌刺激测试更加困难。为了解决该技术问题(这是包封固有的)，本发明人开发了免疫分泌的“动态”测试(图4(A))。如果在培养开始时发现用葡萄糖和茶碱刺激后分泌的胰岛素的量在使用藻酸盐的情况下高于(p<0.05)使用Si-HPMC，后面反之亦然(参见图4(B))。在鼠假胰岛情况下，发现用Si-HPMC包封后的整个体外培养保持基础的胰岛素分泌(在量上高得多)(参见图3(B)，测试的最大值：9个月)。对于刺激的胰岛素分泌也是如此(参见图5)。
Si-HPMC在生理学pH和温度下自网格化(或自交叉)的能力允许利用简单的注射器和针***(23G x 1)在聚合前将其皮下注射。利用这种施用途径，本发明人表明，包封于Si-HPMC的鼠胰腺假胰岛可以治疗免疫缺陷NOD小鼠(参见图6(A))和免疫活性C57BI/6小鼠(参见图6(B))中的链脲菌素(STZ)诱导的糖尿病。发现高剂量注射STZ化学上破坏胰腺中所有的产胰岛素细胞。相反，重复注射低剂量STZ导致胰腺中部分和有限的产胰岛素细胞的化学破坏，通过胰岛素细胞释放自身抗原导致自身免疫糖尿病(Weide等,Diabetes,1991,40:1157-1162；Rossini等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74:2485-2489)。手术去除包含胰腺假胰岛的水凝胶导致血糖快速增加，表明糖尿病校正事实上是由于大包封的胰岛而不是其他因素(例如胰腺中产胰岛素细胞的再生或从皮下水凝胶逸出的假胰岛或MIN6细胞的作用)。
为了测试Si-HPMC作为生物人工胰腺的生物免疫相容性，本发明人评估了IL-6(由巨噬细胞和树突状细胞分泌的促炎性细胞因子)的分泌。与本身通过人巨噬细胞和鼠脾细胞诱导分泌IL-6的藻酸盐相反，发现Si-HPMC对诱导IL-6分泌没有影响(参见图7(A))。LPS用作阳性对照，允许评估测试细胞的功能性(参见图7(B))。
发现Si-HPMC保护胰岛不被免疫***的细胞识别，从而赋予包封胰岛有效的免疫保护。事实上，如图8所示，Si-HPMC阻止由与猪胰岛接触诱导的人巨噬细胞和通过鼠脾细胞体外分泌IL-6。相反，藻酸盐本身具有诱导IL-6分泌的能力(参见上文)。此外，Si-HPMC限制通过包封胰岛释放的可溶性因子诱导的免疫细胞的IL-6分泌(在转孔中的共培养测试，参见图9)。
产胰岛素细胞的Si-HPMC包封的长期持久性和功效尚未被证实。以上所报告的所有实验使用包含最终浓度为2％(w/v)的Si-HPMC的标准制剂来制备水凝胶。如本领域技术人员承认，可以修改和优化Si-HPMC的最终浓度以发现扩散、活力、稳定性和持久性之间的最佳折中。较低浓度的Si-HPMC(例如约1.5％、约1％或约0.5％)和较高浓度的Si-HPMC(例如约2.5％、约3％、约4％或约5％)可用于调节水凝胶的密度和其持久性，同时仍然允许胰岛素和葡萄糖的扩散并保持活力。

Claims (15)

1.Si-HPMC包封的产胰岛素细胞用于治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的用途。
2.根据权利要求1所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中Si-HPMC具有以下简化式：
(HPMC)-O-CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH3)3-Si(O-Na+)3 (I)。
3.根据权利要求1或2所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述产胰岛素细胞是分离的同种异体胰岛或分离的异种胰岛。
4.根据权利要求1或2所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述产胰岛素细胞是选自胰腺β细胞、胰腺β样细胞及其任何组合的分离细胞。
5.根据权利要求4所述的Si-HPMC-包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述胰腺β样细胞通过分化胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、多能间充质基质细胞、管细胞、肝细胞或α细胞获得。
6.根据权利要求1-5任一项所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述产胰岛素细胞被微包封入Si-HPMC微珠、Si-HPMC微球或Si-HPMC微胶囊中。
7.根据权利要求1-5任一项所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述产胰岛素细胞被大包封入Si-HPMC水凝胶中。
8.根据权利要求1-7任一项所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述产胰岛素细胞与至少一种治疗化合物一起被包封入Si-HPMC中。
9.根据权利要求1-8任一项所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中所述1型糖尿病患者患有脆性糖尿病。
10.根据权利要求1-9任一项所述的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞的用途，其中治疗1型糖尿病包括以下之一：皮下注射Si-HPMC包封的产胰岛素细胞、肌肉注射Si-HPMC包封的产胰岛素细胞、将Si-HPMC包封的产胰岛素细胞植入腹膜腔、肠系膜、网膜或肾囊。
11.用于治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-10任一项所定义的Si-HPMC包封的产胰岛素细胞。
12.用于治疗1型糖尿病、尤其用于恢复和/或保持1型糖尿病患者或1型前驱糖尿病患者的血糖正常的试剂盒，所述试剂盒包含：
-Si-HPMC；
-产胰岛素细胞；和
-将产胰岛素细胞包封入Si-HPMC的说明书。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中Si-HPMC具有以下简化式：
(HPMC)-O-CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH3)3-Si(O-Na+)3 (I)。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述产胰岛素细胞是选自同种异体胰岛、异种胰岛、同种异体胰腺β细胞、异种胰腺β细胞、胰腺β样细胞及其任何组合的分离细胞，其中所述胰腺β样细胞通过分化胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、多能间充质基质细胞、管细胞、肝细胞或α细胞获得。
15.根据权利要求12-14任一项所述的试剂盒，进一步包括用于进行1型糖尿病治疗的说明书。
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