CN108866147B - 一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法 - Google Patents

一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，特点是：制备细胞形变培养板；将培养的细胞用显微镜进行观测，确认生长状态良好，然后对培养的细胞经胰酶消化处理后离心，弃去上层的原有培养基；用新培养基重悬稀释细胞，取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板中继续培养，培养的细胞在细胞形变培养板中依照细胞活性不同产生不同形变；根据需要在不同时间使用显微镜观测同一细胞的形态变化，并记录观测结果，分析得到细胞活性；优点是：本发明的方法操作简单快捷，能够持续、动态、直观地监测细胞在不同时间段内的形变及活性特性。

Description

一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术应用领域，尤其涉及一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法。
背景技术
细胞活性，是判断体外培养细胞在例如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等一些条件下是否能正常生长的重要指标。细胞活性的检测是进行相关科学研究的常用手段，更是体外筛选抗肿瘤药物和临床肿瘤药敏试验的重要方法之一。目前常用的细胞活性检测方法有很多，如有染色法，克隆(集落)形成法、比色法、放射性同位素掺入法等。
染色法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，分为化学染色法和荧光染色法，即利用死细胞和活细胞对染料不同的亲和力，检查细胞活性，染色后在光学或荧光显微镜下即可观察到结果。但化学染色法如若染色时间太长，活细胞也会被染色，干扰对结果的判定，而且化学染色过程中细胞没有被固定，形态也不清晰。而荧光染色法的荧光染料一般都有一定的毒性，影响操作者健康。
克隆(集落)形成法是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续***增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析。常见的方法有平板克隆形成试验、软琼脂形成试验等。这种方法常见于抗肿瘤药物敏感性试验、肿瘤放射性生物学等试验中。但是该方法较为繁琐并耗时，不适合同时监测大量样本，而且在手动计数过程中带有非常大的不确定性，特别是当形成的细胞克隆大小差异较大时，很难得到更有效、精准的数据。
比色法中常用的有MTT比色法、XTT比色法和CCK-8法。MTT比色法原理是活细胞内的线粒体中的琥珀脱氢酶可以将外观呈淡黄色的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]还原成蓝紫色结晶，并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。二甲亚砜能溶解细胞中紫色结晶，溶液深浅与细胞中的结晶含量成正比，用酶标仪测定OD值即可判断细胞活性。但MTT染色法不太适合悬浮细胞，因为在溶解紫色结晶之前，需将培养基吸出，这一步容易造成结晶流失，而导致实验结果偏差。XTT染色法和CKK-8染色法是在MTT染色法基础上优化而来的方法，XTT和CKK-8都是新合同的四唑氮衍生物，与MTT属于同类物质，它们都能被活细胞中的线粒体脱氢酶降解而产生棕黄色水溶性物质，能直接通过光谱吸收测定OD值，进而推测细胞的活性。与MTT法比较而言，XTT和CKK-8法不需要使用裂解液溶解沉淀，对贴壁和悬浮生长的细胞均适用。但缺点是成本较高，而且XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用，而CKK-8的颜色与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加，从而造成检测结果的偏差。
放射性同位素掺入法是通过测定细胞中DNA或蛋白质的合成代谢状态来判断细胞的活性。检测蛋白质合成一般用放射性核素35S-甲硫氨酸标记，检测DNA复制一般用3H-TdR标记。将放射性同位素加入细胞培养液后可被活细胞吸收，细胞增殖越多，所掺入的放射性同位素量越大。当细胞通过液体闪烁计数仪时，通过检测放射性强度就可以反映出细胞活性。该方法检测结果较为准确，但由于需要用到特定的液体闪烁计数仪，设备价格高，原料成本高，且放射性核素易造成环境污染。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明提供一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，该方法操作简单快捷，能够持续、动态、直观地监测细胞在不同时间段内的形变及活性特性。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，包括以下步骤：
①制备细胞形变培养板；
②将培养的细胞用显微镜进行观测，确认生长状态良好，去除原培养基，然后对培养的细胞经胰酶消化处理后加入新培养基终止消化，150～250g离心力条件下离心2～5min，弃去上层的培养基；
③用新培养基重悬稀释细胞，取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板中继续培养，培养的细胞在细胞形变培养板中依照细胞活性不同产生不同形变；
④根据需要在不同时间使用显微镜观测同一细胞的形态变化，并记录观测结果；
⑤随着时间推移，若观测到的该细胞在细胞形变培养板中生长，则判断该细胞具备活性，根据其在细胞形变培养板中形变的程度、方向和速度，得到该细胞的活跃程度；若观测到的该细胞在细胞形变培养板中萎缩或者无变化，则判断该细胞失去活性或者活性较差。
在一些实施方式中，所述的细胞形变培养板包括基板，所述的基板的上表面涂布有一层厚度均匀的弹性复合材料层，所述的弹性复合材料层上开设有若干个均匀排列的细胞形变培养孔。由此，细胞形变培养孔具有一定的形变能力，为细胞在培养过程中发生生长形态的变化提供基础。
在一些实施方式中，所述的弹性复合材料层的厚度为5～10μm，所述的细胞形变培养孔的深度小于等于所述的弹性复合材料层的厚度，由此具有较优的效果。
在一些实施方式中，所述的弹性复合材料层的材质为聚二甲基硅氧烷或水凝胶。
在一些实施方式中，所述的细胞形变培养孔的形状选自以下至少一种：圆型、米字型和X型。
在一些实施方式中，所述的细胞形变培养孔的形状为X型或米字型，所述的细胞形变培养孔包括中心部和连通所述的中心部并向外延伸的多个形变端部。由此能更明显地展示形变情况，进一步有利于观察。
在一些实施方式中，所述的步骤③中取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板中继续培养具体包括：取单个细胞放入细胞形变培养孔的中心部，然后往细胞形变培养孔中加入一定体积的新培养基直至将细胞形变培养孔填充满。
在一些实施方式中，所述的步骤⑤中该细胞在细胞形变培养板中生长具体包括：该细胞由细胞形变培养孔的中心部不断膨胀延伸至多个形变端部；该细胞在细胞形变培养板中萎缩具体包括：该细胞由充满细胞形变培养孔的多个形变端部不断萎缩至中心部，或在多个形变端部中的延伸距离变短。
在一些实施方式中，所述的步骤②中培养的细胞包括：贴壁细胞和非贴壁细胞。
在一些实施方式中，所述的步骤②之前还包括对培养的细胞进行荧光染色的步骤。
与现有技术相比，本发明的优点在于：利用特殊结构的细胞形变培养板和培养孔，通过观察细胞在培养孔中的形态变化即可判断细胞的活性。与其他传统的细胞活性检测方法相比，具有操作简单快捷，无毒副作用，检测结果形象直观，能够实现对同一个细胞在不同培养时间段内的细胞形变和细胞活性的动态监测过程。为检测细胞体外培养生长状态、肿瘤药物体外筛选、肿瘤药物临床药敏试验提供新的研究方法。
附图说明
图1为本发明一实施方式的细胞形变培养板的结构示意图；
图2为培养的细胞在细胞形变培养孔中的状态示意图；
图3为实施例四中实验组细胞在第1天和第3天的显微镜观测图；
图4为实施例五中第1组细胞在加药前和加药后的显微镜观测图。
其中，细胞形变培养板1，基板11，弹性复合材料层12，细胞形变培养孔13，中心部14，形变端部15。
具体实施方式
以下结合附图对本发明一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
实施例一
一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，包括以下步骤：
①制备细胞形变培养板1；
②将培养的细胞用显微镜进行观测，确认生长状态良好，去除原培养基，然后对培养的细胞经胰酶消化处理后加入新培养基终止消化，200g离心力下离心3min，弃去上层的培养基；
③用新培养基重悬稀释细胞，取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板1中继续培养，培养的细胞在细胞形变培养板1中依照细胞活性不同产生不同形变；
④根据需要在不同时间使用显微镜观测同一细胞的形态变化，并记录观测结果；
⑤细胞的形变及力学与细胞生理如活性等有较强的相关性，随着时间推移，若观测到的该细胞在细胞形变培养板1中生长，则判断该细胞具备活性，根据其在细胞形变培养板1中形变的程度、方向和速度，得到该细胞的活跃程度；若观测到的该细胞在细胞形变培养板1中萎缩或者无变化，则判断该细胞失去活性或者活性较差。
本实施例中，细胞形变培养板1包括基板11，基板11的上表面涂布有一层厚度均匀的弹性复合材料层12，弹性复合材料层12上开设有若干个均匀排列的细胞形变培养孔13。由此，细胞形变培养孔13具有一定的形变能力，为细胞在培养过程中发生生长形态的变化提供基础。
本实施例中，弹性复合材料层12的厚度为8μm，细胞形变培养孔13的深度略小于弹性复合材料层12的厚度，由此具有较优的效果。在其他实施例中，弹性复合材料层12的厚度可以为5μm、10μm。
本实施例中，弹性复合材料层12的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，在其他实施例中，弹性复合材料层12的材质可以选用水凝胶(hydrogel)等材料。
本实施例中，细胞形变培养孔13的形状为X型或米字型，在其他实施例中，细胞形变培养孔13的形状可以为圆型。细胞形变培养孔13包括中心部14和连通中心部并向外延伸的多个形变端部15。由此能更明显地展示形变情况，进一步有利于观察。
本实施例中，步骤③中取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板中继续培养具体包括：取单个细胞放入细胞形变培养孔的中心部，然后往细胞形变培养孔中加入一定体积的新培养基直至将细胞形变培养孔填充满。
本实施例中，步骤⑤中该细胞在细胞形变培养板中生长具体包括：该细胞由细胞形变培养孔的中心部不断膨胀延伸至多个形变端部；该细胞在细胞形变培养板中萎缩具体包括：该细胞由充满细胞形变培养孔的多个形变端部不断萎缩至中心部，或在多个形变端部中的延伸距离变短。
本实施例中，步骤②中培养的细胞包括：贴壁细胞和非贴壁细胞。本发明方法适用性广泛，对贴壁细胞和悬浮细胞等均适用。
本实施例中，步骤②之前还包括对培养的细胞进行荧光染色的步骤。由此能够更清晰地观测结果。
实施例二
其余与实施例一相同，不同之处在于：②150g离心力下离心5min，弃去上层的培养基；
实施例三
其余与实施例一相同，不同之处在于：②250g离心力下离心2min，弃去上层的培养基；
实施例四
为了便于展示细胞在细胞形变培养板内培养过程中形态的变化，我们以转染表达绿色荧光蛋白的血管平滑肌细胞为例，取其中的单细胞于细胞形变培养板中培养，显微镜下观察随培养时间不同其细胞形态的变化。
实验方法：
(1)血管平滑肌细胞的绿色荧光蛋白基因转染：①将绿色荧光蛋白基因克隆重组到真核表达载体上，将血管平滑肌细胞经培养到覆盖培养皿60—80％；②在真核表达重组载体中加入脂质体，室温孵育15Min，同时更换新鲜的血管平滑肌细胞培养基；③将重组表达载体和脂质体混合物加入细胞培养皿中，轻轻晃动培养皿混匀，37℃孵育6小时；④孵育后更换转染培养基，加入新鲜的生长培养基，37℃培养24小时后加入抗生素进行筛选培养。
(2)筛选的转染细胞进行扩大培养到细胞覆盖培养皿60—80％，然后弃去全部培养基，加入1ml胰酶37℃消化2min后吸取细胞悬浮液，4000rmp离心3min弃上清。
(3)用新培养基重悬稀释细胞，取单个转染的血管平滑肌细胞放入细胞形变培养板的培养孔中继续培养，作为实验组；取另一部分转染的血管平滑肌细胞放入普通细胞培养板中继续培养，作为对照组；实验组和对照组的培养环境和培养条件相同。
(4)在培养第1天，将实验组和对照组中的转染血管平滑肌细胞分别放至光学显微镜下观察细胞的形态，记录结果；在培养第3天，将实验组的同个细胞放至光学显微镜下观察细胞的形态，由于普通培养板(对照组)中的细胞只能作单次观察，因此另取对照组中的单个转染血管平滑肌细胞放至光学显微镜下观察细胞的形态，并记录结果。
实验结果：
观测结果显示普通细胞培养板(对照组)中培养的转染血管平滑肌细胞随着培养时间增加不断增殖，逐渐铺满培养板。细胞形变培养板(实验组)中培养的转染血管平滑肌细胞同样随时间增加，其体积在培养孔中不断膨胀，从第1天集中在培养孔的中心位置到第3天不断向“X型”培养孔的形变端部延伸，如图3所示。实验结果表明无论是在实验组中还是在对照组中，转染的血管平滑肌细胞都在不断生长增殖，本发明的细胞形变培养板在表现细胞形变和细胞活性方面的作用与对照组一致，此外本发明还具有操作简单快捷，能够对同一个细胞在不同培养时间段内的细胞形变过程和细胞活性实现动态监测的优点。
实施例五
在本实施例中，我们以肺癌肿瘤细胞系A549细胞作为药敏试验对象，以卡铂(CAB)作为实验用抗肿瘤药物，对照传统的MTT染色法说明本发明方法在细胞形变和细胞活性的动态监测上的可行性和有效性。
实验方法：
(1)先将卡铂用磷酸缓冲液(PBS)进行稀释制备成卡铂母液，保存备用。
(2)A549细胞复苏：将A549细胞在培养皿中培养至铺满培养皿大约80％时弃去全部培养基，加入1ml胰酶37℃消化2min后吸取细胞悬浮液，4000rmp离心3min后，弃上清。
(3)第1组(细胞形变培养板组)：用新培养基重悬稀释细胞至浓度为105个/ml，取100个单细胞分别放入细胞形变培养板的100个培养孔中，37℃继续培养，本实施例中选用100孔细胞形变培养板和X型培养孔，但不限于此；
另取一块96孔普通培养板，在其上划分3个实验区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，实验区域Ⅰ包含6个平行孔，实验区域Ⅱ包含6个平行孔，实验区域Ⅲ包含1个平行孔；
第2组(普通培养板加药组)：各取单细胞和200μL细胞悬浮液于实验区域Ⅰ的6个平行培养孔中，37℃继续培养；
第3组(普通培养板对照组)：各取单细胞和200μL细胞悬浮液于实验区域Ⅱ的6个平行培养孔中，37℃继续培养；
第4组(普通培养板空白组)：仅取无细胞的200μL细胞悬浮液于实验区域Ⅲ的1个平行培养孔中，37℃继续培养。
(4)用新鲜培养基将卡铂母液稀释成浓度为3×10-5nmol/L的药液培养基；
(5)用光学显微镜观察第1组的细胞形态并记录，显示为第1组加药前的结果，然后将培养孔中的培养基完全弃去，全部换成含卡铂浓度为3×10-5nmol/L的药液培养基继续培养；
同时用光学显微镜观察第2组、第3组、第4组，待细胞铺满各培养孔后将第2组、第3组、第4组中的培养基完全弃去，然后在第2组与第4组各培养孔中加入200μL含卡铂浓度为3×10-5nmol/L的药液培养基，在第3组各培养孔中加入200μL不含卡铂的新鲜培养基，继续培养。
(6)培养24小时后，在光学显微镜下观察第1组细胞形变培养板内细胞的形态并记录；
同时分别向第2组、第3组、第4组的各孔中加入20μL浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养4小时，吸取培养基，加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，放入自动酶联免疫仪中，以第4组作为空白对照，分别测定第2组和第3组各孔的吸光值(OD值)，然后分别计算第2组和第3组的平均OD值。
实验结果：
经测得96孔普通培养板上第3组6个孔的平均OD值为0.618，第2组6个孔的平均OD值为0.237，由此可见由于药物的作用，第2组加药后的细胞有一部分发生了凋亡。通过对细胞形变培养板内细胞形态的观察，如图4所示，细胞同样由加药前充满整个培养孔到不断萎缩，反映出细胞不断凋亡的过程，与96孔普通培养板中经MTT染色的细胞表现一致。但本发明所述检测方法的操作更简便，检测更直观，且无需多次取样，能够对同一个细胞的细胞形变和细胞活性实现动态的、持续的观测。
值得注意的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此限定本发明的专利保护范围，本发明还可以对上述各种零部件的构造进行材料和结构的改进，或者是采用技术等同物进行替换。故凡运用本发明的说明书及图示内容所作的等效结构变化，或直接或间接运用于其他相关技术领域均同理皆包含于本发明所涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于包括以下步骤：
①制备细胞形变培养板；
②将培养的细胞用显微镜进行观测，确认生长状态良好，去除原培养基，然后对培养的细胞经胰酶消化处理后加入新培养基终止消化，150～250g离心力条件下离心2～5min，弃去上层的培养基；
③用新培养基重悬稀释细胞，取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板中继续培养，培养的细胞在细胞形变培养板中依照细胞活性不同产生不同形变；
④根据需要在不同时间使用显微镜观测同一细胞的形态变化，并记录观测结果；
⑤随着时间推移，若观测到的该细胞在细胞形变培养板中生长，则判断该细胞具备活性，根据其在细胞形变培养板中形变的程度、方向和速度，得到该细胞的活跃程度；若观测到的该细胞在细胞形变培养板中萎缩或者无变化，则判断该细胞失去活性或者活性较差；
所述的细胞形变培养板包括基板，所述的基板的上表面涂布有一层厚度均匀的弹性复合材料层，所述的弹性复合材料层上开设有若干个均匀排列的细胞形变培养孔；
所述的细胞形变培养孔的形状选自以下至少一种：米字型和X型。
2.根据权利要求1所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的弹性复合材料层的厚度为5～10μm，所述的细胞形变培养孔的深度小于等于所述的弹性复合材料层的厚度。
3.根据权利要求1或2所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的弹性复合材料层的材质为聚二甲基硅氧烷或水凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的细胞形变培养孔包括中心部和连通所述的中心部并向外延伸的多个形变端部。
5.根据权利要求4所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的步骤③中取单个细胞和一定体积的新培养基，转移至细胞形变培养板中继续培养具体包括：取单个细胞放入细胞形变培养孔的中心部，然后往细胞形变培养孔中加入一定体积的新培养基直至将细胞形变培养孔填充满。
6.根据权利要求5所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的步骤⑤中该细胞在细胞形变培养板中生长具体包括：该细胞由细胞形变培养孔的中心部不断膨胀延伸至多个形变端部；该细胞在细胞形变培养板中萎缩具体包括：该细胞由充满细胞形变培养孔的多个形变端部不断萎缩至中心部，或在多个形变端部中的延伸距离变短。
7.根据权利要求1所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的步骤②中培养的细胞包括：贴壁细胞和非贴壁细胞。
8.根据权利要求1所述的一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法，其特征在于所述的步骤②之前还包括对培养的细胞进行荧光染色的步骤。
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