CN108866002A - 用于sost蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于SOST蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用。细胞株是稳定表达wnt1蛋白基因、LRP受体基因以及荧光素酶基因的HEK293细胞，该细胞株可用于SOST蛋白或抗体活性的评估或筛选。本发明公开的细胞株可以稳定传代，其荧光强度较高，而且SOST蛋白对wnt1蛋白的抑制活性IC50较低，且检测窗口较大，可以更好的体现不同SOST抗体的生物学活性，提高稳定性，减少变异系数。在SOST蛋白或抗体活性的评估和/或筛选中具有快速、灵敏及稳定的优点。

Description

用于SOST蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于SOST蛋白或抗体筛选的细胞株、该细胞株的制备方法、包含该细胞株的制剂以及细胞株或制剂在SOST蛋白或抗体筛选中的应用。
背景技术
硬骨素蛋白(Sclerostin，SOST)由SOST基因编码，其为213个氨基酸的分泌糖蛋白。硬骨素是含胱氨酸纽结(cystine-knot)因子超家族的成员，与DAN/Cerberus蛋白质家族相关，通过抑制骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)与受体的结合直接干扰BMP信号，并因此干扰BMP信号级联。由于硬骨素是骨形成的骨细胞特异性负调节物，这使得其成为用于骨质疏松症治疗的有吸引力的药物靶。Amgen在开发用于骨质疏松症治疗的针对硬骨素蛋白的抗体，已向FDA提交上市申请，Novartis和Eli Lily也在开发硬骨素阻断抗体，目前处于临床2期。
硬骨素通过结合至低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/LRP6)以及Frizzled受体作为典型的Wnt信号的负调控因子起作用。经典Wnt通路描述Wnt蛋白与细胞表面LRP/Frizzled受体家族结合后的一系列反应，包括胞内蛋白Dishevelled(Dsh)的激活及最终细胞核内β-catenin水平的变化。Dishevelled是细胞膜相关Wnt受体复合物的关键成分，它与Wnt结合后被激活，并抑制下游蛋白质复合物，包括axin、GSK-3与APC蛋白。axin/GSK-3/APC复合体可促进细胞内信号分子β-catenin的降解。当“β-catenin降解复合物”被抑制后，胞浆内的β-catenin得以稳定存在，部分β-catenin进入细胞核与TCF-LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达。β-catenin作为一种多功能的蛋白质，广泛存在于各种类型的细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞中，在参与这些细胞的增殖、分化和凋亡等方面发挥了重要的调节作用。Wnt/β-catenin途径的激活是间叶细胞分化为骨骼和脂肪细胞，以及成骨细胞和软骨细胞的分化所必需的。在调控骨量中β-catenin发挥了重要作用，通过增加骨保护素(OPG)的表达，从而提高了OPG与核因子-κB配体受体激活剂(RANKL)的比例，其净效果是减少破骨细胞的生成。硬化蛋白SOST是LRP5/LRP6复合物的配体，阻止了受体与Wnt的结合，从而阻断了Wnt/β-catenin信号通路。GSK-3β顺利与多蛋白复合物结合，促使β-catenin的磷酸化，导致其最终降解。
现有的用报告基因检测SOST抗体筛选的方法中，通常把特定顺式反应元件和萤火虫荧光素酶报告基因(Luciferase)进行串联表达，通过检测报告基因的表达水平的变化，反映该顺式元件的变化。据文献报道(Ettenberg,S.A.,Charlat,O.,Daley,M.P.,Liu,S.,Vincent,K.J.,&Stuart,D.D.,et al.(2010).Inhibition of tumorigenesis driven bydifferent wnt proteins requires blockade of distinct ligand-binding regionsby lrp6antibodies.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,107(35),15473.Verena,B.,Maarten,V.D.,Stella,W.,Katharina,V.P.,Eva-Maria,M.,&Peter,T.D.,et al.(2014).Mutational analysis ofsclerostin shows importance of the flexible loop and the cystine-knot forwnt-signaling inhibition.Plos One,8(11),e81710.)，通过瞬时转染wnt1与TCF-LEF双荧光素酶报告基因质粒，可以检测SOST抑制wnt信号的活性。其中双荧光素酶报告基因质粒包含1个介导信号通路的TCF-LEF的荧光素酶报告基因质粒以及1个作为内参平抑每次瞬时转染效率的海肾荧光素酶报告基因质粒。其通过wnt报告基因瞬时测试法检测SOST的抗体，但该方法是通过瞬时转染细胞的方式获得测试用细胞株。瞬时转染的细胞中，外源基因不会整合到细胞的基因组中，其不参加复制并在细胞***过程丢失，但外源基因表达的时间有限，通常仅持续几天，因此每次使用细胞时均需要进行瞬时转染，所以变异系数大，而且极为不快速和方便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种稳定、长期表达wnt1蛋白基因、LRP6受体基因以及荧光素酶基因、可用于SOST蛋白或抗体活性筛选的细胞株，以及提供一种快速、灵敏且稳定地评价SOST蛋白或抗体生物学活性的方法。并提供该细胞株的制备方法以及该细胞株在SOST蛋白或抗体活性评估或筛选中的应用。此外，还提供一种包含该细胞株的制剂。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：提供了一种用于SOST蛋白或抗体评估和/或筛选的细胞株，其是稳定表达wnt1蛋白基因、LRP受体基因以及荧光素酶基因的HEK293细胞。
根据本发明，所述的“稳定表达”是指细胞株中能较长时间，一般至少传代20代以内能表达外源基因，且表达量无明显衰退。
较佳地，该细胞株共转染有所述wnt1蛋白基因的质粒1、包含所述LRP受体基因的质粒2以及包含荧光素酶基因的质粒3。
其中，所述wnt1蛋白可以选择rmwnt1蛋白，所述LRP6受体优选hLRP6(人LRP6受体)，所述荧光素酶优选连接有TCF-LEF元件的luc2P。
其中，各所述质粒可以自行构建，若有的话也可以购买现有商业化质粒。本发明所述质粒1可以选用现有商业质粒rmwnt1-pCMV6-Kan/Neo；所述的质粒3选用现有商业质粒pGL4.49[luc2P/TCF-LEF/Hygro]；所述质粒2中的LRP受体为hLRP6(人LRP6，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，其质粒骨架优选pCDNA3.1/Hygro(-)。
较佳的，该细胞株表达的相对荧光强度RLU至少为100,000，优选在100,000～500,000，更优选180,000～250,000；所述SOST蛋白对本发明细胞株表达wnt1蛋白的抑制活性IC50不高于110nM，一般在25～110nM，更常见在26～45nM；在本发明一较佳实施例中，所述的细胞株的相对荧光强度RLU为248,000，所述的抑制活性IC50为43nM。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：提供了该细胞株的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备含有LRP受体基因的质粒；
(2)将步骤(1)中的质粒和含有wnt1蛋白基因的质粒、以及含有荧光素酶基因的质粒用脂质体共转染HEK293细胞。
根据本发明，所述的“共转染”是指对HEK293细胞同时转染不同的质粒，使其同时整合至细胞的基因组中，通过抗生素加压筛选使转染的质粒的蛋白稳定表达。
较佳地，脂质体为Lipofectamine2000；较佳地，将共转染HEK293细胞种板后，还加入抗生素加压筛选；更佳地，抗生素为潮霉素(Hygromycin)和遗传霉素(Geneticin G418)；最佳地，潮霉素的终浓度为300μg/ml，和遗传霉素的终浓度为400μg/ml。
较佳地，三种质粒的用量比为1:1:1，Lipofectamine2000的用量为2.8μg/反应；更佳地，所述的种板的时间为2天和/或加压筛选的时间为2～3周；最佳地，加压筛选的时间为3周。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：提供SOST蛋白或抗体活性的评估或筛选方法，其包括以下步骤：
(1)梯度稀释待测SOST蛋白；或者梯度稀释待测抗体，加入一定浓度的SOST抗体孵育；
(2)再和如权利要求1-3任一项所述的细胞株共培养；
(3)然后加入荧光素酶检测试剂，避光、室温反应后读数；
(4)根据读数判断SOST蛋白或抗体活性值。
较佳地，所述待测SOST蛋白浓度为4.5μM～80pM；待测抗体的浓度为850nM～1nM；所述孵育的温度为37℃，时间为1小时；共培养细胞株数量为每反应2×104个；共培养的温度为37℃，时间为18-20小时；和/或，避光室温反应的时间为15分钟。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：细胞株在SOST蛋白或抗体活性评估或筛选中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：包含该细胞株的制剂。较佳地，该制剂为SOST蛋白或抗体检测制剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明细胞株为用于SOST抗体筛选的稳定传代的细胞株，其稳定表达wnt1和LRP6，同时稳定表达荧光素酶报告基因质粒，该细胞株表达的荧光强度高(≥100,000)而且SOST蛋白对wnt1蛋白的抑制活性IC50低(≤110nM)，且抗体的检测窗口较大(>2.15)，可以更好的体现不同SOST抗体的生物学活性，提高稳定性，减少变异系数。将该细胞株用于SOST蛋白或抗体生物学活性的评估和/或筛选，可以简化实验的步骤、加快实验的进程并且增加了灵敏度和实验的稳定性，为筛选高活性的抗体及研究SOST抗体的活性奠定基础。
附图说明
图1为共转染质粒图谱，其中1A.hLRP6-pcDNA3.1/Hygro：hLRP6受体的真核表达载体图谱；1B.pGL4.49[luc2P/TCF-LEF/Hygro]：含有TCF-LEF元件的荧光素酶报告基因表达载体图谱；1C.rmwnt1-pCMV6-Kan/Neo：rmwnt1的真核表达载体图谱。
图2为不同的细胞株组成型wnt信号报告基因的表达。
图3为生物学活性检测用细胞株的筛选，其中3A.SOST对组成型表达信号的抑制活性剂量依赖效应曲线；3B.Romosozumab标准抗体在W18、W45及W60细胞株中生物学活性剂量依赖效应曲线。
图4为候选抗体生物学活性的检测。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
核苷酸如SEQ ID NO.1所示的hLRP6的基因，其委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，基因两端分别加入Nhe I和Hind III位点，连接到pUC57中，获得质粒hLRP6-pUC57。通过Nhe I和Hind III(购自TaKaRa)对hLRP6-pUC57进行双酶切，与相同酶切的表达载体pcDNA3.1/Hygro(-)(购自Invitrogen)进行连接，测序鉴定正确后用于细胞转染实验。
pGL4.49[luc2P/TCF-LEF/Hygro]是含有TCF-LEF元件的报告基因质粒，购买自Promega公司。
rmwnt1-pCMV6-Kan/Neo用于wnt1蛋白的表达，购买自OriGene Technologies。
HEK293细胞株购自中科院细胞库，SOST蛋白购自R&D systems。
实施例1
稳定表达的HEK293细胞株的制备
1.1 HEK293抗生素筛选浓度的确定
对HEK293细胞在转染前进行剂量-反应分析来确定潮霉素(Hygromycin，购自Generay)和遗传霉素(G418，购自A.G.Scientific)的最适筛选浓度。配制细胞生长的完全培养基：在无酚红DMEM中添加10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(均购自Gibco)，在24孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液(1×103个细胞/ml)，每孔中再加入900μl的完全培养基，即设立每孔100个细胞的种板条件；依次加入50mg/ml的Hygromycin溶液得到终浓度分别为0、50、100、200、300、400、500、600、700、800μg/ml的完全培养基，或100mg/ml的G418溶液得到终浓度分别为0、50、100、200、300、400、500、600、700、800μg/ml的完全培养基，各浓度3个复孔。将培养板放入37℃-5％CO2培养箱静置培养，每3-4天用含相应浓度Hygromycin或G418的新鲜完全培养基更换旧培养基，10-15天后细胞全部死亡的最小浓度作为稳转筛选的最佳浓度。结果：13天后24孔板中的细胞在Hygromycin终浓度300μg/ml压力下，细胞几乎全部死亡，即HEK293筛选压力为Hygromycin：300μg/ml；在G418终浓度400μg/ml压力下，细胞几乎全部死亡，即HEK293筛选压力为G418：400μg/ml。
1.2 HEK293细胞的转染
A.HEK293细胞共转染rmwnt1、hLRP6和TCF-LEF-luc2P
HEK293细胞培养于含10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的无酚红DMEM中，培养条件为37℃-5％CO2培养箱。以3.5×105个细胞/ml密度接种于24孔培养板，每孔接种0.5ml。种板24小时后，采用脂质体Lipofectamine2000(Lifetech)共转染质粒，按照hLRP6-pcDNA3.1/Hygro：pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]：rmwnt1-pCMV6-Kan/Neo＝0.27μg：0.27μg：0.27μg的比例，以及2.8μl/孔的Lipofectamine2000的参数进行转染。转染复合物与细胞共孵育4-6小时后更换新鲜培养基，次日以有限稀释法把转染细胞接种96孔培养板，种板2天后加入Hygromycin(终浓度：300μg/ml)和G418(终浓度：400μg/ml)加压筛选2-3周。静置培养，逐步扩增至24孔板、T25培养瓶。
B.对比细胞株：HEK293细胞共转染rmwnt1和TCF-LEF-luc2P
根据上述实施例A部分的方法，用HEK293细胞共转染rmwnt1和TCF-LEF-luc2P，以检测HEK393细胞自带的LRP6受体和rmwnt1的配合效果。
1.3稳定表达的HEK293细胞株的筛选
胰酶-0.25％EDTA处理待筛选的转染细胞，新鲜培养基重悬后，计数后以2×104个细胞/孔的密度种板于白色不透明96孔培养板，每个待筛选的细胞株以及空细胞HEK293各种2复孔。37℃孵育18-20个小时后，用Steady Glo Luciferase Assay System(Promega，E2520)检测，每孔加入100μl的检测试剂Steady Glo Luciferase Assay System，避光室温反应15分钟后置于SpectraMax L酶标仪检测读数。
共获得21株稳定转染的HEK293细胞株，该等细胞株组成性表达wnt信号，表现为产生稳定的荧光信号。比较不同细胞株产生的荧光信号，即相对荧光单位(RelativeLuciferase Unit)，见图2。其中W45产生最高的荧光信号(RLU>500,000)，W41-43、W48、W60产生中等强度的荧光信号，W18、W23、W28、W40、W36、W44、W55、W58产生较低但可检测的荧光信号(RLU≤100,000)。其中，W18RLU＝35,100，W41RLU＝182,500，W42RLU＝278,541，W43RLU＝239,202，W48RLU＝264,279，且W60RLU＝248,000。
1.2中B部分构建的对比细胞株，用上述同样方法处理后，避光室温反应15分钟后置于SpectraMax L酶标仪检测读数，但荧光信号低于检测限，说明rmwnt1蛋白无法和HEK293细胞结合，必需引入hLRP6整合到HEK293细胞中才能和rmwnt1结合。
实施例2
稳定表达rmwnt1、hLRP6、TCF-LEF-luc2的HEK293细胞株的功能评价
实施例1制备的稳定产生荧光信号的细胞株，分别选取高荧光信号、中等荧光信号、低荧光信号的细胞株W45、W60、W18进行功能学评价。
2.1 SOST(硬骨素蛋白)半数抑制浓度的测定
胰酶-0.25％EDTA处理待筛选的稳转细胞，新鲜培养基重悬后，计数后以2×104个细胞/孔的密度种板于白色不透明96孔培养板，每个待筛选的细胞株(W18、W45、W60)分别各种16个孔，与梯度浓度稀释的SOST溶液(4.5μM～80pM)进行孵育，37℃孵育18-20个小时后，每孔加入100μl的Steady Glo Luciferase Assay System检测试剂，避光室温反应15分钟后置于SpectraMax L酶标仪检测读数。比较不同细胞株产生的平均荧光强度(MeanValue)，计算荧光素酶的相对活性(Relative Luciferase Activity，即RLA)。RLA＝(RLU(梯度浓度的SOST反应均值))/(RLU(组成型Wnt信号均值))，利用SoftMax软件分析数据，以SOST的浓度作为x轴,对应的RLA值作为y轴，采用四参数方程模型拟合SOST在4.5μM～80pM的浓度范围内剂量依赖效应曲线，见图3A。SOST对W18细胞株组成型表达Wnt信号的抑制活性IC50＝26nM；SOST对W45细胞株组成型表达Wnt信号的抑制活性IC50＝110nM；SOST对W60细胞株组成型表达Wnt信号的抑制活性IC50＝43nM。
2.2 SOST标准抗体量效关系的测定
Romosozumab标准抗体的制备：参照专利US7,592,429B2，全基因合成经优化的核苷酸序列的全长重链和轻链(重链氨基酸序列参见US7,592,429B2中的SEQ ID NO：145，轻链氨基酸序列则为US7,592,429B2中的SEQ ID NO：141)后，通过HindIII和EcoRI构建到真核表达载体pcDNA3.1/Zeo+(购自Lifetech)。采用ExpiCHOS瞬时转染***(购自Gibco)，对Romosozumab的轻链和重链进行共转染。转染细胞的起始密度为5×106个细胞/ml，在250ml的摇瓶(购自NUNC)中37℃-5％CO2培养箱，140转/分培养一天。1000转/分，对细胞离心5分钟后，加入50ml新鲜培养基ExpiCHO Expression Medium重悬至1×107个细胞/ml的密度，活力大于等于95％，此时细胞可用于瞬转表达目的蛋白。瞬时转染的轻链和重链质粒各取20μg，加入OptiproSFM(购自Gibco)至终体积4ml。取转染试剂ExpiFectamine CHOTansfectamine 160μl用OptiproSFM(购自Gibco)稀释至4ml终体积，加入至4ml的质粒混悬液，混匀后室温孵育5分钟后，加入到准备好的细胞悬液中，37℃-5％CO2培养箱，140转/分进行培养。
标准抗体采用亲和填料Mabselect(购自GE)捕获，纯化过程中使用含有2M Urea洗涤，并在pH3.5环境下洗脱。在洗脱样品中加入高浓度制剂缓冲液，调整制剂pH并除菌过滤，获得最终的制剂。制剂体系为：50mM PB，100mM NaCl，pH7.0，蛋白浓度3.35mg/ml。纯化的抗体可用于后续实验。
W18、W45及W60细胞株计数后以2×104个细胞/孔的密度种板于白色不透明96孔培养板，Romosozumab标准抗体以无酚红DMEM溶液(含10％FBS)进行梯度浓度稀释(W18抗体浓度范围500nM-0.6nM，W45抗体浓度范围2000nM-2.5nM，W60抗体浓度范围850nM～1nM)分别与57nM、245nM和100nM的SOST中和孵育，37℃孵育1个小时后，加入到96孔培养板的细胞中，37℃孵育18-20个小时后。按照试剂盒的说明每孔加入100μl的Steady Glo LuciferaseAssay System检测试剂，避光室温反应15分钟后置于SpectraMax L酶标仪检测读数。比较不同细胞株产生的平均荧光强度(MeanValue)，计算荧光素酶的相对活性(RLA)。四参数方程模型拟合Romosozumab剂量依赖效应曲线，见图3B。W60细胞株在检测抗体筛选时，四参数方程拟合曲线的量效曲线窗口较大。其中W18的检测窗口为3.39，W45的检测窗口为2.15，而W60的检测窗口为4.35。检测窗口较大，可以更好的体现不同SOST抗体的生物学活性，提高稳定性，减少变异系数。
经SOST蛋白、SOST蛋白标准抗体的功能学评价，发现表达中等荧光强度的细胞株，如W60最适合本发明的筛选，其检测SOST抑制wnt信号的活性曲线拟合较优。SOST低浓度时，wnt信号的恢复较好。
实施例3新制备的SOST蛋白抗体候选物的筛选
用传统杂交瘤技术制备SOST蛋白抗体，得到H102、H106、H109、H207、H208共5株(抗体可商购于药明生物公司；也可自行制备，制备方法参考Ozato Ket al.,Hybridoma celllines secreting monoclonal antibodies to mouse h-2and ia antigens，Journal ofImmunology,1980，124(2),533-540；及Goding JW,Antibody production by hybridomas,Journal of Immunological Methods,1980,39(4),285-308.)，用不与SOST结合的抗体IgG作为阴性对照，用实施例2的功能学评价方法对SOST蛋白抗体进行活性评价。
对候选抗体进行梯度浓度(850nM～1nM)的稀释后分别与100nM的SOST，37℃中和孵育1个小时，加入到预先种板的W60细胞中，每个浓度2复孔处理，中和孵育结束后，每孔加入100μl的检测试剂Steady Glo Luciferase Assay System，避光室温反应15分钟后读数。比较不同细胞株产生的平均荧光强度(MeanValue)，计算荧光素酶的相对活性(RLA)。四参数方程模型拟合剂量依赖效应曲线，见图4。不同的候选抗体通过梯度浓度稀释，与SOST进行中和反应后作用于本发明稳转细胞株，荧光素酶的表达反映抗体的活性程度。以抗体浓度为X轴，荧光素酶的相对活性RLA为Y轴，四参数方程拟合曲线的IC50比较抗体的活性，曲线的斜率反映出候选抗体作用方式的不同。
本发明稳转细胞株可用于检测不同活性程度的SOST蛋白和SOST的抗体。同理，不同浓度的SOST与wnt1蛋白竞争结合至稳转细胞株表面受体，从而对经典wnt信号转导产生影响，通过检测荧光素酶的表达反映SOST蛋白或SOST抗体的活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海复旦张江生物医药股份有限公司
<120> 用于SOST蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用
<130> P1710536C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4842
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(4842)
<223> hLRP6
<400> 1
atg ggg gcc gtc ctg agg agc ctc ctg gcc tgc agc ttc tgt gtg ctc 48
Met Gly Ala Val Leu Arg Ser Leu Leu Ala Cys Ser Phe Cys Val Leu
1 5 10 15
ctg aga gcg gcc cct ttg ttg ctt tat gca aac aga cgg gac ttg cga 96
Leu Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Asn Arg Arg Asp Leu Arg
20 25 30
ttg gtt gat gct aca aat ggc aaa gag aat gct acg att gta gtt gga 144
Leu Val Asp Ala Thr Asn Gly Lys Glu Asn Ala Thr Ile Val Val Gly
35 40 45
ggc ttg gag gat gca gct gcg gtg gac ttt gtg ttt agt cat ggc ttg 192
Gly Leu Glu Asp Ala Ala Ala Val Asp Phe Val Phe Ser His Gly Leu
50 55 60
ata tac tgg agt gat gtc agc gaa gaa gcc att aaa cga aca gaa ttt 240
Ile Tyr Trp Ser Asp Val Ser Glu Glu Ala Ile Lys Arg Thr Glu Phe
65 70 75 80
aac aaa act gag agt gtg cag aat gtt gtt gtt tct gga tta ttg tcc 288
Asn Lys Thr Glu Ser Val Gln Asn Val Val Val Ser Gly Leu Leu Ser
85 90 95
ccc gat ggg ctg gca tgt gat tgg ctt gga gaa aaa ttg tac tgg aca 336
Pro Asp Gly Leu Ala Cys Asp Trp Leu Gly Glu Lys Leu Tyr Trp Thr
100 105 110
gat tct gaa act aat cgg att gaa gtt tct aat tta gat gga tct tta 384
Asp Ser Glu Thr Asn Arg Ile Glu Val Ser Asn Leu Asp Gly Ser Leu
115 120 125
cga aaa gtt tta ttt tgg caa gag ttg gat caa ccc aga gct att gcc 432
Arg Lys Val Leu Phe Trp Gln Glu Leu Asp Gln Pro Arg Ala Ile Ala
130 135 140
tta gat cct tca agt ggg ttc atg tac tgg aca gac tgg gga gaa gtg 480
Leu Asp Pro Ser Ser Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Val
145 150 155 160
cca aag ata gaa cgt gct gga atg gat ggt tca agt cgc ttc att ata 528
Pro Lys Ile Glu Arg Ala Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Phe Ile Ile
165 170 175
ata aac agt gaa att tac tgg cca aat gga ctg act ttg gat tat gaa 576
Ile Asn Ser Glu Ile Tyr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Glu
180 185 190
gaa caa aag ctt tat tgg gca gat gca aaa ctt aat ttc atc cac aaa 624
Glu Gln Lys Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Lys Leu Asn Phe Ile His Lys
195 200 205
tca aat ctg gat gga aca aat cgg cag gca gtg gtt aaa ggt tcc ctt 672
Ser Asn Leu Asp Gly Thr Asn Arg Gln Ala Val Val Lys Gly Ser Leu
210 215 220
cca cat cct ttt gcc ttg acg tta ttt gag gac ata ttg tac tgg act 720
Pro His Pro Phe Ala Leu Thr Leu Phe Glu Asp Ile Leu Tyr Trp Thr
225 230 235 240
gac tgg agc aca cac tcc att ttg gct tgc aac aag tat act ggt gag 768
Asp Trp Ser Thr His Ser Ile Leu Ala Cys Asn Lys Tyr Thr Gly Glu
245 250 255
ggt ctg cgt gaa atc cat tct gac atc ttc tct ccc atg gat ata cat 816
Gly Leu Arg Glu Ile His Ser Asp Ile Phe Ser Pro Met Asp Ile His
260 265 270
gcc ttc agc caa cag agg cag cca aat gcc aca aat cca tgt gga att 864
Ala Phe Ser Gln Gln Arg Gln Pro Asn Ala Thr Asn Pro Cys Gly Ile
275 280 285
gac aat ggg ggt tgt tcc cat ttg tgt ttg atg tct cca gtc aag cct 912
Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Met Ser Pro Val Lys Pro
290 295 300
ttt tat cag tgt gct tgc ccc act ggg gtc aaa ctc ctg gag aat gga 960
Phe Tyr Gln Cys Ala Cys Pro Thr Gly Val Lys Leu Leu Glu Asn Gly
305 310 315 320
aaa acc tgc aaa gat ggt gcc aca gaa tta ttg ctt tta gct cga agg 1008
Lys Thr Cys Lys Asp Gly Ala Thr Glu Leu Leu Leu Leu Ala Arg Arg
325 330 335
aca gac ttg aga cgc att tct ttg gat aca cca gat ttt aca gac att 1056
Thr Asp Leu Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp Ile
340 345 350
gtt ctg cag tta gaa gac atc cgt cat gcc att gcc ata gat tac gat 1104
Val Leu Gln Leu Glu Asp Ile Arg His Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Asp
355 360 365
cct gtg gaa ggc tac atc tac tgg act gat gat gaa gtg agg gcc ata 1152
Pro Val Glu Gly Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala Ile
370 375 380
cgc cgt tca ttt ata gat gga tct ggc agt cag ttt gtg gtc act gct 1200
Arg Arg Ser Phe Ile Asp Gly Ser Gly Ser Gln Phe Val Val Thr Ala
385 390 395 400
caa att gcc cat cct gat ggt att gct gtg gac tgg gtt gca cga aat 1248
Gln Ile Ala His Pro Asp Gly Ile Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn
405 410 415
ctt tat tgg aca gac act ggc act gat cga ata gaa gtg aca agg ctc 1296
Leu Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asp Arg Ile Glu Val Thr Arg Leu
420 425 430
aat ggg acc atg agg aag atc ttg att tca gag gac tta gag gaa ccc 1344
Asn Gly Thr Met Arg Lys Ile Leu Ile Ser Glu Asp Leu Glu Glu Pro
435 440 445
cgg gct att gtg tta gat ccc atg gtt ggg tac atg tat tgg act gac 1392
Arg Ala Ile Val Leu Asp Pro Met Val Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp
450 455 460
tgg gga gaa att ccg aaa att gag cga gca gct ctg gat ggt tct gac 1440
Trp Gly Glu Ile Pro Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Ser Asp
465 470 475 480
cgt gta gta ttg gtt aac act tct ctt ggt tgg cca aat ggt tta gcc 1488
Arg Val Val Leu Val Asn Thr Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala
485 490 495
ttg gat tat gat gaa ggc aaa ata tac tgg gga gat gcc aaa aca gac 1536
Leu Asp Tyr Asp Glu Gly Lys Ile Tyr Trp Gly Asp Ala Lys Thr Asp
500 505 510
aag att gag gtt atg aat act gat ggc act ggg aga cga gta cta gtg 1584
Lys Ile Glu Val Met Asn Thr Asp Gly Thr Gly Arg Arg Val Leu Val
515 520 525
gaa gac aaa att cct cac ata ttt gga ttt act ttg ttg ggt gac tat 1632
Glu Asp Lys Ile Pro His Ile Phe Gly Phe Thr Leu Leu Gly Asp Tyr
530 535 540
gtt tac tgg act gac tgg cag agg cgt agc att gaa aga gtt cat aaa 1680
Val Tyr Trp Thr Asp Trp Gln Arg Arg Ser Ile Glu Arg Val His Lys
545 550 555 560
cga agt gca gag agg gaa gtg atc ata gat cag ctg cct gac ctc atg 1728
Arg Ser Ala Glu Arg Glu Val Ile Ile Asp Gln Leu Pro Asp Leu Met
565 570 575
ggc cta aag gct aca aat gtt cat cga gtg att ggt tcc aac ccc tgt 1776
Gly Leu Lys Ala Thr Asn Val His Arg Val Ile Gly Ser Asn Pro Cys
580 585 590
gct gag gaa aac ggg gga tgt agc cat ctc tgc ctc tat aga cct cag 1824
Ala Glu Glu Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Tyr Arg Pro Gln
595 600 605
ggc ctt cgc tgt gct tgc cct att ggc ttt gaa ctc atc agt gac atg 1872
Gly Leu Arg Cys Ala Cys Pro Ile Gly Phe Glu Leu Ile Ser Asp Met
610 615 620
aag acc tgc att gtc cca gag gct ttc ctt ttg ttt tca cgg aga gca 1920
Lys Thr Cys Ile Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Phe Ser Arg Arg Ala
625 630 635 640
gat atc aga cga att tct ctg gaa aca aac aat aat aat gtg gct att 1968
Asp Ile Arg Arg Ile Ser Leu Glu Thr Asn Asn Asn Asn Val Ala Ile
645 650 655
cca ctc act ggt gtc aaa gaa gct tct gct ttg gat ttt gat gtg aca 2016
Pro Leu Thr Gly Val Lys Glu Ala Ser Ala Leu Asp Phe Asp Val Thr
660 665 670
gac aac cga att tat tgg act gat ata tca ctc aag acc atc agc aga 2064
Asp Asn Arg Ile Tyr Trp Thr Asp Ile Ser Leu Lys Thr Ile Ser Arg
675 680 685
gcc ttt atg aat ggc agt gca ctg gaa cat gtg gta gaa ttc ggc tta 2112
Ala Phe Met Asn Gly Ser Ala Leu Glu His Val Val Glu Phe Gly Leu
690 695 700
gat tat cca gaa ggc atg gca gta gac tgg ctt ggg aag aac ttg tac 2160
Asp Tyr Pro Glu Gly Met Ala Val Asp Trp Leu Gly Lys Asn Leu Tyr
705 710 715 720
tgg gca gac aca gga acg aat cga att gag gtg tca aag ttg gat ggg 2208
Trp Ala Asp Thr Gly Thr Asn Arg Ile Glu Val Ser Lys Leu Asp Gly
725 730 735
cag cac cga caa gtt ttg gtg tgg aaa gac cta gat agt ccc aga gct 2256
Gln His Arg Gln Val Leu Val Trp Lys Asp Leu Asp Ser Pro Arg Ala
740 745 750
ctc gcg ttg gac cct gcc gaa gga ttt atg tat tgg act gaa tgg ggt 2304
Leu Ala Leu Asp Pro Ala Glu Gly Phe Met Tyr Trp Thr Glu Trp Gly
755 760 765
gga aaa cct aag ata gac aga gct gca atg gat gga agt gaa cgt act 2352
Gly Lys Pro Lys Ile Asp Arg Ala Ala Met Asp Gly Ser Glu Arg Thr
770 775 780
acc tta gtt cca aat gtg ggg cgg gca aac ggc cta act att gat tat 2400
Thr Leu Val Pro Asn Val Gly Arg Ala Asn Gly Leu Thr Ile Asp Tyr
785 790 795 800
gct aaa agg agg ctt tat tgg aca gac ctg gac acc aac tta ata gaa 2448
Ala Lys Arg Arg Leu Tyr Trp Thr Asp Leu Asp Thr Asn Leu Ile Glu
805 810 815
tct tca aat atg ctt ggg ctc aac cgt gaa gtt ata gca gat gac ttg 2496
Ser Ser Asn Met Leu Gly Leu Asn Arg Glu Val Ile Ala Asp Asp Leu
820 825 830
cct cat cct ttt ggc tta act cag tac caa gat tat atc tac tgg acg 2544
Pro His Pro Phe Gly Leu Thr Gln Tyr Gln Asp Tyr Ile Tyr Trp Thr
835 840 845
gac tgg agc cga cgc agc att gag cgt gcc aac aaa acc agt ggc caa 2592
Asp Trp Ser Arg Arg Ser Ile Glu Arg Ala Asn Lys Thr Ser Gly Gln
850 855 860
aac cgc acc atc att cag ggc cat ttg gat tat gtg atg gac atc ctc 2640
Asn Arg Thr Ile Ile Gln Gly His Leu Asp Tyr Val Met Asp Ile Leu
865 870 875 880
gtc ttt cac tca tct cga cag tca ggg tgg aat gaa tgt gct tcc agc 2688
Val Phe His Ser Ser Arg Gln Ser Gly Trp Asn Glu Cys Ala Ser Ser
885 890 895
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Asn Gly His Cys Ser His Leu Cys Leu Ala Val Pro Val Gly Gly Phe
900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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Asn Arg Met Val Ile Asp Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ile Leu Pro
945 950 955 960
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Ile His Ser Leu Arg Asn Val Arg Ala Ile Asp Tyr Asp Pro Leu Asp
965 970 975
aag caa ctc tat tgg att gac tca cga caa aac atg atc cga aag gca 2976
Lys Gln Leu Tyr Trp Ile Asp Ser Arg Gln Asn Met Ile Arg Lys Ala
980 985 990
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Gln Glu Asp Gly Ser Gln Gly Phe Thr Val Val Val Ser Ser Val Pro
995 1000 1005
agt cag aac ctg gaa ata caa ccc tat gac ctc agc att gat att 3069
Ser Gln Asn Leu Glu Ile Gln Pro Tyr Asp Leu Ser Ile Asp Ile
1010 1015 1020
tac agc cgc tac atc tac tgg act tgt gag gct acc aat gtc att 3114
Tyr Ser Arg Tyr Ile Tyr Trp Thr Cys Glu Ala Thr Asn Val Ile
1025 1030 1035
aat gtg aca aga tta gat ggg aga tca gtt gga gtg gtg ctg aaa 3159
Asn Val Thr Arg Leu Asp Gly Arg Ser Val Gly Val Val Leu Lys
1040 1045 1050
ggc gag cag gac aga cct cga gcc gtt gtg gta aac cca gag aaa 3204
Gly Glu Gln Asp Arg Pro Arg Ala Val Val Val Asn Pro Glu Lys
1055 1060 1065
ggg tat atg tat ttt acc aat ctt cag gaa agg tct cct aaa att 3249
Gly Tyr Met Tyr Phe Thr Asn Leu Gln Glu Arg Ser Pro Lys Ile
1070 1075 1080
gaa cgg gct gct ttg gat ggg aca gaa cgg gag gtc ctc ttt ttc 3294
Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Leu Phe Phe
1085 1090 1095
agt ggc tta agt aaa cca att gct tta gcc ctt gat agc agg ctg 3339
Ser Gly Leu Ser Lys Pro Ile Ala Leu Ala Leu Asp Ser Arg Leu
1100 1105 1110
ggc aag ctc ttt tgg gct gat tca gat ctc cgg cga att gaa agc 3384
Gly Lys Leu Phe Trp Ala Asp Ser Asp Leu Arg Arg Ile Glu Ser
1115 1120 1125
agt gat ctc tca ggt gct aac cgg ata gta tta gaa gac tcc aat 3429
Ser Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg Ile Val Leu Glu Asp Ser Asn
1130 1135 1140
atc ttg cag cct gtg gga ctt act gtg ttt gaa aac tgg ctc tat 3474
Ile Leu Gln Pro Val Gly Leu Thr Val Phe Glu Asn Trp Leu Tyr
1145 1150 1155
tgg att gat aaa cag cag caa atg att gaa aaa att gac atg aca 3519
Trp Ile Asp Lys Gln Gln Gln Met Ile Glu Lys Ile Asp Met Thr
1160 1165 1170
ggt cga gag ggt aga acc aaa gtc caa gct cga att gcc cag ctt 3564
Gly Arg Glu Gly Arg Thr Lys Val Gln Ala Arg Ile Ala Gln Leu
1175 1180 1185
agt gac att cat gca gta aag gag ctg aac ctt caa gaa tac aga 3609
Ser Asp Ile His Ala Val Lys Glu Leu Asn Leu Gln Glu Tyr Arg
1190 1195 1200
cag cac cct tgt gct cag gat aat ggt ggc tgt tca cat att tgt 3654
Gln His Pro Cys Ala Gln Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Ile Cys
1205 1210 1215
ctt gta aag ggg gat ggt act aca agg tgt tct tgc ccc atg cac 3699
Leu Val Lys Gly Asp Gly Thr Thr Arg Cys Ser Cys Pro Met His
1220 1225 1230
ctg gtt cta ctt caa gat gag cta tca tgt gga gaa cct cca aca 3744
Leu Val Leu Leu Gln Asp Glu Leu Ser Cys Gly Glu Pro Pro Thr
1235 1240 1245
tgt tct cct cag cag ttt act tgt ttc acg ggg gaa att gac tgt 3789
Cys Ser Pro Gln Gln Phe Thr Cys Phe Thr Gly Glu Ile Asp Cys
1250 1255 1260
atc cct gtg gct tgg cgg tgc gat ggg ttt act gaa tgt gaa gac 3834
Ile Pro Val Ala Trp Arg Cys Asp Gly Phe Thr Glu Cys Glu Asp
1265 1270 1275
cac agt gat gaa ctc aat tgt cct gta tgc tca gag tcc cag ttc 3879
His Ser Asp Glu Leu Asn Cys Pro Val Cys Ser Glu Ser Gln Phe
1280 1285 1290
cag tgt gcc agt ggg cag tgt att gat ggt gcc ctc cga tgc aat 3924
Gln Cys Ala Ser Gly Gln Cys Ile Asp Gly Ala Leu Arg Cys Asn
1295 1300 1305
gga gat gca aac tgc cag gac aaa tca gat gag aag aac tgt gaa 3969
Gly Asp Ala Asn Cys Gln Asp Lys Ser Asp Glu Lys Asn Cys Glu
1310 1315 1320
gtg ctt tgt tta att gat cag ttc cgc tgt gcc aat ggt cag tgc 4014
Val Leu Cys Leu Ile Asp Gln Phe Arg Cys Ala Asn Gly Gln Cys
1325 1330 1335
att gga aag cac aag aag tgt gat cat aat gtg gat tgc agt gac 4059
Ile Gly Lys His Lys Lys Cys Asp His Asn Val Asp Cys Ser Asp
1340 1345 1350
aag tca gat gaa ctg gat tgt tat ccg act gaa gaa cca gca cca 4104
Lys Ser Asp Glu Leu Asp Cys Tyr Pro Thr Glu Glu Pro Ala Pro
1355 1360 1365
cag gcc acc aat aca gtt ggt tct gtt att ggc gta att gtc acc 4149
Gln Ala Thr Asn Thr Val Gly Ser Val Ile Gly Val Ile Val Thr
1370 1375 1380
att ttt gtg tct gga act gta tac ttt atc tgc cag agg atg ttg 4194
Ile Phe Val Ser Gly Thr Val Tyr Phe Ile Cys Gln Arg Met Leu
1385 1390 1395
tgt cca cgt atg aag gga gat ggg gaa act atg act aat gac tat 4239
Cys Pro Arg Met Lys Gly Asp Gly Glu Thr Met Thr Asn Asp Tyr
1400 1405 1410
gta gtt cat gga cca gct tct gtg cct ctt ggt tat gtg cca cac 4284
Val Val His Gly Pro Ala Ser Val Pro Leu Gly Tyr Val Pro His
1415 1420 1425
cca agt tct ttg tca gga tct ctt cca gga atg tct cga ggt aaa 4329
Pro Ser Ser Leu Ser Gly Ser Leu Pro Gly Met Ser Arg Gly Lys
1430 1435 1440
tca atg atc agc tcc ctc agt atc atg ggg gga agc agt gga ccc 4374
Ser Met Ile Ser Ser Leu Ser Ile Met Gly Gly Ser Ser Gly Pro
1445 1450 1455
ccc tat gac cga gcc cat gtt aca gga gca tca tca agt agt tct 4419
Pro Tyr Asp Arg Ala His Val Thr Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ser
1460 1465 1470
tca agc acc aaa ggc act tac ttc cct gca att ttg aac cct cca 4464
Ser Ser Thr Lys Gly Thr Tyr Phe Pro Ala Ile Leu Asn Pro Pro
1475 1480 1485
cca tcc cca gcc aca gag cga tca cat tac act atg gaa ttt gga 4509
Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser His Tyr Thr Met Glu Phe Gly
1490 1495 1500
tat tct tca aac agt cct tcc act cat agg tca tac agc tac agg 4554
Tyr Ser Ser Asn Ser Pro Ser Thr His Arg Ser Tyr Ser Tyr Arg
1505 1510 1515
cca tat agc tac cgg cac ttt gca ccc ccc acc aca ccc tgc agc 4599
Pro Tyr Ser Tyr Arg His Phe Ala Pro Pro Thr Thr Pro Cys Ser
1520 1525 1530
aca gat gtt tgt gac agt gac tat gct cct agt cgg aga atg acc 4644
Thr Asp Val Cys Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Ser Arg Arg Met Thr
1535 1540 1545
tca gtg gca aca gcc aag ggc tat acc agt gac ttg aac tat gat 4689
Ser Val Ala Thr Ala Lys Gly Tyr Thr Ser Asp Leu Asn Tyr Asp
1550 1555 1560
tca gaa cct gtg ccc cca cct ccc aca ccc cga agc caa tac ttg 4734
Ser Glu Pro Val Pro Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Gln Tyr Leu
1565 1570 1575
tca gca gag gag aac tat gaa agc tgc cca cct tct cca tac aca 4779
Ser Ala Glu Glu Asn Tyr Glu Ser Cys Pro Pro Ser Pro Tyr Thr
1580 1585 1590
gag agg agc tat tct cat cac ctc tac cca ccg cca ccc tct ccc 4824
Glu Arg Ser Tyr Ser His His Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Ser Pro
1595 1600 1605
tgt aca gac tcc tcc tga 4842
Cys Thr Asp Ser Ser
1610

Claims (10)

1.一种用于SOST蛋白或抗体评估和/或筛选的细胞株，其特征在于，其是稳定表达wnt1蛋白基因、LRP6受体基因以及荧光素酶基因的HEK293细胞。
2.如权利要求1所述的细胞株，其特征在于，其共转染有所述wnt1蛋白基因的质粒1、包含所述LRP受体基因的质粒2以及包含所述荧光素酶基因的质粒3；较佳地，所述wnt1蛋白是rmwnt1蛋白，所述LRP6受体是hLRP6，所述荧光素酶是连接有TCF-LEF元件的luc2P；更佳地，所述质粒1选用rmwnt1-pCMV6-Kan/Neo；所述质粒2其质粒骨架为pCDNA3.1/Hygro(-)；所述的质粒3选用pGL4.49[luc2P/TCF-LEF/Hygro]。
3.如权利要求1或2所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株其表达的相对荧光强度(RLU)至少为100,000，优选不超过500,000；所述SOST蛋白对细胞株表达wnt1蛋白的抑制活性IC50不高于110nM，优选至少为25nM；更优选地，所述的相对荧光强度RLU为248,000，所述的抑制活性IC50为43nM。
4.如权利要求1-3任一项所述的细胞株的制备方法，其包含以下步骤：
(1)制备含有所述LRP受体基因的质粒；
(2)将步骤(1)中的质粒和含有所述wnt1蛋白基因的质粒、以及含有所述荧光素酶基因的质粒用脂质体共转染HEK293细胞。
5.如权利要求4所述的细胞株的制备方法，其特征在于，所述脂质体为Lipofectamine2000；优选地，将共转染HEK293细胞种板后，还加入抗生素加压筛选；优选地，抗生素为潮霉素和遗传霉素；更优选地，潮霉素的终浓度为300μg/ml，和遗传霉素的终浓度为400μg/ml。
6.如权利要求5所述的细胞株的制备方法，其特征在于，三种所述的质粒用量比为1:1:1、所述的种板的时间为2天和/或加压筛选的时间为2～3周；优选地，加压筛选的时间为3周。
7.一种SOST蛋白或抗体活性的评估或筛选方法，其包括以下步骤：
(1)梯度稀释待测SOST蛋白；或者梯度稀释待测抗体，加入一定浓度的SOST抗体孵育；
(2)再和如权利要求1-3任一项所述的细胞株共培养；
(3)然后加入荧光素酶检测试剂，避光、室温反应后读数；
(4)根据读数判断SOST抗体或蛋白活性值。
8.如权利要求7所述的SOST蛋白或抗体活性的评估或筛选方法，其特征在于，所述待测抗体的浓度为850nM～1nM；所述待测SOST蛋白浓度为4.5μM～80pM；所述孵育的温度为37℃，时间为1小时；所述的共培养细胞株数量为每反应2×104个；共培养的温度为37℃，时间为18～20小时；和/或，所述的避光室温反应时间为15分钟。
9.如权利要求1～3任一项所述的细胞株在SOST蛋白或抗体活性评估或筛选中的应用。
10.一种包含权利要求1～3任一项所述的细胞株的制剂，较佳地，所述制剂为SOST蛋白或抗体检测制剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20090130113A1 (en) * 2007-10-12 2009-05-21 Michaela Kneissel Compositions and methods for use for antibodies against sclerostin

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Title
VERENA BOSCHERT等: "Mutational Analysis of Sclerostin Shows Importance ofthe Flexible Loop and the Cystine-Knot for Wnt-SignalingInhibition", 《PLOS》 *

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