CN1088584A - 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 - Google Patents
从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1088584A CN1088584A CN92113640A CN92113640A CN1088584A CN 1088584 A CN1088584 A CN 1088584A CN 92113640 A CN92113640 A CN 92113640A CN 92113640 A CN92113640 A CN 92113640A CN 1088584 A CN1088584 A CN 1088584A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fiberonectin
- body fluid
- production technique
- gelatinum
- sepharose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属生物学医学中提取纤维结合蛋白的生
产工艺。本发明应用单独的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶
活性,并用琼脂糖凝胶白明胶亲和层析技术一步层
析,从人及动物体液(血液、羊水、组织液)中提取可应
用于生物学医学研究、实验、医学临床及化妆美容的
大分子糖蛋白——纤维结合蛋白(Fibronectin,
Fn)。本发明的生产工艺提取纤维结合蛋白,成本低
廉,产品纯度高,生产工艺简单稳定,提取率高。
Description
纤维结合蛋白(Fibronectin,Fn),又名纤维连接蛋白,纤粘素等。文献中也使用以下名称:CIG,anti-gelatin factor,microfibrillar protein,opsonic protein,fibroblast surface antigen(FSA),soluble fibroblast antigen(SF-antigen),galactoprotein a,cell surface protein(CSP),cell attachment factor (CAF),cell spreading factor,large external transformation-sensisive(LEFS)protein,Zeta(Z)等。
纤维结合蛋白是一种高分子量冷凝蛋白,分子量约45K,存在于人及动物的体液(血液、羊水、组织液)及细胞表面及间质中,具有诱导细胞分化、增殖、连接细胞和间质、参与血液凝固、伤口愈合和机体防御等多种功能,是机体的重要组分。
对近20年(1972~1992)国际国内专利文献及科学文献的查新表明,以往已有一些提取纤维结合蛋白的方法(Ruoslahti E等Methods in Enzymol 1982;82:803及Isumera M等 J Biochem 1981;90:1),国外已有二个专利(Ep38462-A,1986;WO63483,1988)。国内尚无与本发明类似的专利申请。
现有的提取纤维结合蛋白的方法在提取中,使用多种大量的蛋白酶抑制剂,同时,采用三步或三步以上的层析步骤,使所用试剂药品增加,成本上升,而且提取手续繁杂,纤维结合蛋白的产生率不高。现有的提取方法局限于血液,原料来源受到限制。
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处,提供一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺。本发明不仅降低了成本,简化了提取步骤,增加了产品的产出率,而且提高了产品的纯度。本发明可广泛应用于人及多种动物的多种体液(包括血液、羊水和组织液),开拓了更广泛更廉价的原料来源。
为了实现上述发明目的,本发明者采取的生产工艺是:(1)获取体液;(2)加入苯甲磺酰氟,低温超速离心;(3)加样于预制好的溴化氰琼脂糖凝胶白明胶层析柱,缓冲液洗脱纤维结合蛋白;(4)提取的纤维结合蛋白过滤、测量、无菌冻干;(5)提取的纤维结合蛋白生物学功能检测。本发明者注意到,纤维结合蛋白在进化过程中表现出很强的稳定性,人及各种动物体液中纤维结合蛋白的结构近似,主要的生物学功能相同。这为本发明的纤维结合蛋白的获取提供了广泛的价廉的原料。本发明根据纤维结合蛋白的分子量、冷凝性质。以及纤维结合蛋白与纤维蛋白、白明胶、原胶元有强烈亲和能力的理化特性,设计了本发明的生产工艺。
首先采集人和多种动物,如牛或马或猪或其他动物的体液,如血液或羊水或组织液,立即加入1/10的3~10%的枸椽钠抗凝(血液),同时用0.1~0.3mol/L的苯甲磺酰氟(市售)抑制蛋白酶活性,保持在0~4℃低温下,并低温超速离心,0±1℃,7,500~25,000 RPM,10~40分钟,取上清液。
上清液加样于缓冲液A(主要含0.5~1mol/L Ttris-HCL,0.1~0.2mol/L PMSF,0.5~5%NaCl(溶液)平衡的白明胶琼脂糖凝胶层析柱上,琼脂糖凝胶和白明胶为市售产品。层析柱预先以溴化氰活化,活化液中主要含四硼酸钠0.1~0.2mol/L,偶联缓冲液主要含乙醇胺0.5~2mol/L,叠氮钠0.1~1mol/L,以上试剂均为市售产品。以ZY-1型紫外分光光度计(280nm)监测,以含脲缓冲液B洗,含脲缓冲液B主要含Tris-HCl 0.5~1mol/L,PMSF 0.1~0.2mol/L,脲3-8mol/L。在两小时中,50ml容积的琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱可以加入350~500ml样品。再用含高浓度Na+的缓冲液B洗下纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0~5℃进行。提取的纤维结合蛋白可达电泳纯,储存于3~8mol/L的脲缓冲液B中。纤维结合蛋白经0.22μm微孔滤膜过滤除菌,用分光光度计测定,280nm处吸收,计算纤维结合蛋白产量,分装,无菌冷冻干燥。
提取的纤维结合蛋白以1~1.5%琼脂糖恒压5~8V/cm电泳,结果呈单一电泳带,证明此提取的纤维结合蛋白纯度达电泳纯,经SDS连续梯度电泳证明其分子量为45K。分别用抗人及抗马、抗牛的纤维结合蛋白血清进行免疫扩散试验,结果抗原抗体间呈现清晰的沉淀线,证明提取物为纤维结合蛋白。应用多种细胞活性实验,包括多种细胞培养、巨噬细胞吞噬活性检测、细胞动态形态计量等方法证明其生物学功能。
本发明生产工艺较现有技术方法简单易行、成本低廉、重复性好、提取率高。血浆纤维结合蛋白提取率为50mg/100ml。
许多研究发现,机体内纤维结合蛋白水平失常,可导致许多疾病发生,如肿瘤、肝脏病、关节病、糖尿病、神经***疾病以及败血症,弥慢性血管内凝血、休克等。纤维结合蛋白还在伤口的愈合中起关键性作用。实验动物模型已证明,纤维结合蛋白在创伤治疗中有明显效果。如Nishida将少量纤维结合蛋白涂于大鼠实验性皮肤伤口表面,伤口愈合速度明显增快。用纤维结合蛋白眼药水滴眼治疗角膜渍疡,用药第二天表皮大量生长,三周后溃疡愈合,无疤痕遗留,也无其他副作用。此外,纤维结合蛋白的凝血作用、治疗弥慢性血管内凝血(DIC)、败血症的作用也非常明显。因此,纤维结合蛋白有巨大的开发利用价值和应用前景。
本发明提取的纤维结合蛋白可作为生物学医学的研究、教学、临床检验的诊断试剂,也可作为细胞培养的重要介质。本发明提取的纤维结合蛋白可用于治疗外伤、烧伤、败血症和肿瘤等疾病,还可用于美容护肤及口腔保健牙膏中等。目前国内尚无纤维蛋白批量生产和出售。
Claims (2)
1、一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺,包括获取体液,蛋白酶抑制及超速低温离心,琼脂糖凝胶白明胶亲和层析,提取的纤维结合蛋白过滤、计量、无菌冻干,及纤维结合蛋白的生物学功能检测,其特征在于:
(1)获取体液后,立即加入1/10的3-10%枸橼酸钠溶液抗凝,同时用0.1~0.3mol/L的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性,并保持在0.4℃,然后在0±1℃,以7,500~25,000转/分的转速,超速离心10~40分钟,取上清液。
(2)将白明胶偶联于溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,活化液主要含0.1~0.2mol/L四硼酸钠,然后用主要含0.5~1mol/L Tris-HCl,0.1~0.2mol/L PMSF和0.5~5%NaCl溶液的缓冲液A平衡琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱。加样品于亲和层析柱。紫外分光光度计监测,用含3~8mol/L脲的缓冲液B洗脱纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0~5℃进行。
2、根据权利要求1所述的一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺,其特征在于:采集人和多种动物,如马或羊或猪或牛的体液,如血液或羊水或组织液作为原料。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN92113640A CN1088584A (zh) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN92113640A CN1088584A (zh) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1088584A true CN1088584A (zh) | 1994-06-29 |
Family
ID=4946538
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN92113640A Pending CN1088584A (zh) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1088584A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7323332B2 (en) | 2002-12-27 | 2008-01-29 | Shimadzu Corporation | Preparation method of insect cell extract solution for cell-free protein synthesis, the insect cell extract solution and cell-free synthesis method of protein using the insect cell extract solution |
CN1697972B (zh) * | 2002-08-13 | 2010-09-29 | N-Dia公司 | 检测***分泌物中羊水的装置和方法 |
CN104984739A (zh) * | 2015-06-17 | 2015-10-21 | 武汉汇研生物科技股份有限公司 | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 |
US11353464B2 (en) | 2013-01-02 | 2022-06-07 | Qiagen Sciences, Llc | Methods for predicting time-to-delivery in pregnant women |
-
1992
- 1992-12-22 CN CN92113640A patent/CN1088584A/zh active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1697972B (zh) * | 2002-08-13 | 2010-09-29 | N-Dia公司 | 检测***分泌物中羊水的装置和方法 |
US7323332B2 (en) | 2002-12-27 | 2008-01-29 | Shimadzu Corporation | Preparation method of insect cell extract solution for cell-free protein synthesis, the insect cell extract solution and cell-free synthesis method of protein using the insect cell extract solution |
CN100462443C (zh) * | 2002-12-27 | 2009-02-18 | 株式会社岛津制作所 | 无细胞蛋白合成所用的昆虫细胞提取液,其制备和应用 |
US7745171B2 (en) | 2002-12-27 | 2010-06-29 | Shimadzu Corporation | Cell-free protein synthesis method using insect cell extract solution |
US11353464B2 (en) | 2013-01-02 | 2022-06-07 | Qiagen Sciences, Llc | Methods for predicting time-to-delivery in pregnant women |
CN104984739A (zh) * | 2015-06-17 | 2015-10-21 | 武汉汇研生物科技股份有限公司 | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 |
CN104984739B (zh) * | 2015-06-17 | 2018-01-16 | 武汉汇研生物科技股份有限公司 | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE60222457T2 (de) | Vorrichtung zur kontrollierten enzymatischen entfernung und wiedergewinnung von gewebe | |
CN108186548A (zh) | 一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法 | |
US4341764A (en) | Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor | |
CN108721200A (zh) | 一种人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法及应用 | |
CN110339147A (zh) | 一种皮肤外用组合物及其用途 | |
CH665356A5 (de) | Pharmazeutische formulierung. | |
DE68918246T2 (de) | Verbindungen zur Verhinderung von Thrombose. | |
IT1275556B (it) | Procedimento ed impianto per la disidratazione di foraggio, particolarmente per la disidratazione dell'erba medica | |
CN114392276B (zh) | 改进的抗衰老脐带干细胞制备的抗衰老的药物 | |
CN102318816A (zh) | 一种羊胎素的提取工艺 | |
US4455300A (en) | Fibronectin compositions | |
CN1088584A (zh) | 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 | |
US7645740B2 (en) | Peptide sequence found in Laminin 5 for treating skin impairments | |
JPS62236499A (ja) | 生物学的に活性なポリペプチド、それらの製造方法ならびにそれらを含有する組成物 | |
CN106420392A (zh) | 一种具有凝冻状态的胶原蛋白凝露 | |
CN102020710B (zh) | 人表皮生长因子一个新的突变体en-46 | |
US20200354431A1 (en) | Mutable collagenous tissue from echinoderms | |
DE1442134C3 (de) | In vivo antikoagulierend wirkendes und defibrinierendes Enzym | |
US20210393501A1 (en) | Preparation method and application of recombinant mutant collagenase | |
CN101299991A (zh) | 成纤维细胞激活剂及成纤维细胞活化方法、胶原合成促进剂及胶原合成促进方法、以及皮肤老化预防剂及皮肤老化预防方法 | |
CN105411874A (zh) | 一种鸡胚活性肽及其制备方法与应用 | |
KR101780643B1 (ko) | 효소분해를 이용한 헤파린의 정제 방법 | |
WO2000039290A2 (de) | Pharmazeutische formulierung enthaltend ein hyaluronsäure-spaltendes enzym mikrobieller herkunft | |
CN109097325A (zh) | 一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法 | |
CN105457102B (zh) | 复合生物活性因子的提纯浓缩方法及浓缩液 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |