CN108841783A - 一种含环黄芪醇的髓核细胞抗衰老抗凋亡培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及椎间盘组织工程及再生领域，特别涉及一种含有环黄芪醇，特别是不含细胞因子的培养基用于髓核细胞培养，发挥抗衰老和抗凋亡作用的应用。

Description

一种含环黄芪醇的髓核细胞抗衰老抗凋亡培养基

技术领域

本发明涉及椎间盘组织工程及再生领域，特别涉及一种含有环黄芪醇，特别是不含细胞因子的培养基用于髓核细胞培养，发挥抗衰老和抗凋亡作用的应用。

背景技术

椎间盘主要由髓核、纤维环和软骨终板组成。髓核是椎间盘中含水量最高的组织，髓核细胞分泌的细胞外基质可形成胶冻样结构，使得髓核组织可以承受椎体的各种压力。在某些病理情况下，椎间盘可发生退变，进而导致下腰痛。目前针对椎间盘退变尚无有效治疗手段，采用组织工程手段构建人工椎间盘、以及异体移植椎间盘细胞是新兴的椎间盘退变行之有效的治疗方式。

构建组织工程椎间盘或异体椎间盘细胞移植都需要用到种子细胞，特别是髓核细胞。传统的髓核细胞培养条件都是采用高糖培养基，因为高糖培养环境有助于细胞快速扩增；但是高糖培养基同时可引发髓核细胞衰老和凋亡，而衰老、凋亡的髓核细胞在进一步应用过程中会严重影响修复效果。因此，需要开发行之有效的方法防止髓核细胞培养过程中的衰老和凋亡；但是目前尚无抗髓核细胞凋亡、衰老的培养基。

中国专利CN106754683A公开了一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基。该培养基应用于人脐带/脂肪间充质干细胞，而髓核细胞具有与干细胞完全不同的生物学特性和功能，因此该培养基不能应用于髓核细胞体外抗衰老、凋亡培养；另外，该培养基成分含有TGF-beta等11种细胞因子，以及硫辛酸等9中化学小分子，成分复杂、价格昂贵。

发明内容

本发明提出一种含环黄芪醇(Cycloastragenol，CAG)，特别是不含细胞因子的髓核细胞抗衰老抗凋亡的培养基，解决了现有技术中用于培养髓核细胞的高糖培养基易引起髓核细胞衰老、凋亡的问题。

本发明提供一种培养基，所述培养基包括高糖型基础培养基和环黄芪醇。

优选的，所述高糖型基础培养基为液体；

优选的，所述高糖型基础培养基选自DMEM培养基、F12培养基、DMEM/F12培养基或RPMI 1640培养基；

优选的，所述环黄芪醇在培养基中的浓度为0.01-10μM；

更优选的，所述环黄芪醇在培养基中的浓度为1-10μM；

优选的，所述培养基不含细胞因子。

进一步地，本发明还提供一种增加髓核细胞的TERT表达和端粒长度的方法，所述方法包括将髓核细胞用环黄芪醇溶液处理；

优选的，所述髓核细胞因高糖环境导致TERT表达减少和端粒长度缩短；

优选的，所述环黄芪醇溶液的浓度为0.01-10μM；

更优选的，所述环黄芪醇溶液的浓度为1-10μM；

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种含环黄芪醇，特别是不含细胞因子的髓核细胞培养基，解决了现有技术中用于培养髓核细胞的高糖培养基易引起髓核细胞衰老、凋亡的问题，防止了培养过程中髓核细胞的衰老与凋亡，并有效改善髓核细胞的生长状态。

附图说明

图1为高浓度葡萄糖影响髓核细胞(NP细胞)存活率图，其中：

图1a为用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞24小时后的细胞计数试剂盒(CCK-8)检测结果。

图1b为用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞48小时后的细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测结果。

图1c为用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞72小时后的细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测结果。

图1d为用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞96小时后的细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测结果。

图2为高浓度葡萄糖对NP细胞端粒酶逆转录酶(TERT)表达和端粒长度的影响图，其中：

图2a为Western印迹检测对照组5.5mM，以及12.5、25、50、100和200mM高浓度葡萄糖组中TERT的蛋白质表达。以及使用α-tubulin蛋白作为加载对照并进行条带密度标准化。

图2b为通过RT-qPCR测量对照组5.5mM，以及12.5、25、50、100和200mM高浓度葡萄糖组中TERT的mRNA表达，其中β-actin作为管家基因用于标准化。

图2c为通过使用qPCR方法评估相对端粒长度，其中36B4是用于标准化的单拷贝基因。使用标准方法Cawthon检查端粒长度。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。

图3为高浓度葡萄糖对髓核细胞凋亡和衰老的影响图，其中：

图3a为用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞48小时后Western印迹检测凋亡相关蛋白C-C3，BAX和BCL-2的蛋白质含量并定量。

图3b为用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞48小时后流式细胞检测FITC-Annexin-V。

图3c为在用不同浓度的葡萄糖处理髓核细胞48小时后进行衰老相关SA-β-gal染色：原始放大倍数×100，比例尺：50μm。

图3d为用不同浓度的葡萄糖处理48小时的髓核细胞的衰老相关蛋白p16的蛋白质含量Western印迹检测及定量。图中的数据表示平均值±标准差，治疗组与对照组之间的显著差异表示为**P<0.01，*P<0.05，n＝3。

图4为环黄芪醇对髓核细胞的细胞毒性检测图，其中：用CCK8法检测环黄芪醇(Cycloastragenol，CAG)对髓核细胞活力的影响。所呈现的值是平均值±标准差，实验重复3次。与对照组相比*P<0.05，****P<0.0005。

图5为环黄芪醇对高糖条件髓核细胞活力的影响图，其中：

图5a为CCK 8所测定的细胞活力表明，CAG显著改善高糖(highglucose,HG)条件下髓核细胞的细胞活力。

图5b为CAG处理后高糖刺激细胞的形态学结果。高糖处理条件：25mM葡萄糖浓度刺激细胞24h；比例尺：100μm。

图6为环黄芪醇对高糖条件下细胞端粒酶逆转录酶(TERT)表达和端粒长度的影响，其中：

图6a为Western印迹检测环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞TERT的蛋白质表达的作用。使用α-tubulin作为加载对照和条带密度标准化。

图6b为通过RT-qPCR检测环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞TERT的mRNA表达的作用，用β-Actin作为管家基因进行标准化。

图6c为通过qPCR方法评估环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞的相对端粒长度，其中36B4是用于标准化的单拷贝基因。图中的数据表示平均值±标准差，治疗组与对照组之间的显著差异表示为**P<0.01，*P<0.05，n＝3。

图7：环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞凋亡和衰老的影响，其中：

图7a为Western印迹检测环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞凋亡相关蛋白C-C3，BAX和BCL-2的蛋白质含量。

图7b为流式细胞检测环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞的FITC-Annexin-V的结果。

图7c为Western印迹检测环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞衰老相关蛋白p16的蛋白质含量。

图7d为SA-β-gal染色检测环黄芪醇对高糖条件下髓核细胞衰老的作用。原始放大倍数×100，比例尺：50μm。图中的数据表示平均值±标准差，治疗组与对照组之间的显著差异表示为**P<0.01，*P<0.05，n＝3。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

髓核细胞分离和培养

从2-3周龄任一性别的SD大鼠幼鼠的尾椎间盘收集凝胶状组织(髓核)。将NP组织在0.2％II型胶原酶(Sigma)中于37℃消化4小时。用PBS洗涤两次后，将消化的组织转移至含有15％胎牛血清(FBS；Gibco，Invitrogen，Grand Island，NY)，1g/L(5.5mM)葡萄糖和1％抗生素(100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的DMEM(Gibco，Invitrogen，Grand Island，NY)培养基中，并置于37℃的5％CO₂培养箱中。混合后，将细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Invitrogen)胰蛋白酶消化后传代并以适当的密度重新植入10cm培养板中。我们在实验中使用了前三代细胞。

实施例2

细胞给药方案

将D-葡萄糖(Sigma Aldrich)加入到DMEM(低糖)中，然后通过无菌0.45μm PVDF膜过滤器(Merck Millipore)过滤，500mM浓度葡萄糖作为储备液用于后续实验。然后将原液在完全培养基中稀释以获得所需浓度的葡萄糖(5.5-200mM)。以不同剂量和时间的葡萄糖处理细胞。为了研究CAG对实验组的影响，将它们以500mM的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)中，然后用细胞培养基适当稀释(最终DMSO浓度<1％)。所有实验至少重复3次。

实施例3

细胞活力测定

将NP细胞接种在96孔板(5000个细胞/孔)，温育48小时。贴壁后，通过置换含有0％FBS的培养基12小时使细胞饥饿。随后，用不断增加的葡萄糖浓度和时间的DMEM(15％FBS)处理NP细胞或按不同时间段增加药物浓度。然后用PBS洗涤细胞后，每孔加入100μl含有10μl CCK8的DMEM。然后将平板温育约1小时。根据试剂盒的方案使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)溶液(CCK-8，DojindoLaboratories，Japan)测定细胞的存活力。使用酶标仪在450nm测量孔的光密度。

实施例4

Western印迹分析

将细胞用1mM PMSF(苯基甲磺酰氟，Beyotime)在冰冷的RIPA上裂解。通过BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime)测量样品的蛋白质浓度。在12-15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离含有40分离蛋白质的样品，并转移至聚偏二氟乙烯二氟化物膜(Millipore，USA)，然后用5％脱脂牛奶或BSA封闭。之后，用p16(1：500)，C-C3(1：1000)，BAX(1：1000)，Bcl-2(1：1000)，α-tubulin(1：1000)和TERT(1：1000)的一抗，4℃过夜，然后与各自的二抗在室温下孵育2小时。最后，使用Image Lab3.0软件(Bio-Rad)对这些条带的强度进行量化。

实施例5

PCR分析

使用TRIzol试剂(Invitrogen)获得总RNA提取物，并使用提取物总RNA合成cDNA(TaKaRa，日本)。使用SYBR Green***(Bio-Rad，Hercules，USA)进行qPCR。cDNA样品的扩增在CFX96实时PCR***(Bio-Rad)上进行。第1步：95℃变性3分钟。第2步：95℃5秒，60℃45秒，进行40个循环。最后熔解曲线分析：65℃，然后95℃和5℃，每次5秒。目标基因的相对定量针对β-actin基因进行标准化，并且使用2^-ΔΔCq方法将靶基因与来自对照样品的每个相应靶基因进行比较。表1列出了TERT和β-actin的引物。

DNA提取用来自Qiagen(Hilden，德国)的DNeasy试剂盒。在使用制造商的方案从细胞提取DNA之后，然后使用如上所述相同的方案进行qPCR和数据分析。表2列出了端粒和36B4的引物。

表1 β-actin及TERT引物序列

表2端粒及36B4引物序列

实施例6

SA-β-gal染色

将细胞接种在6孔或12孔板中48小时。然后将细胞用PBS洗涤两次，在室温下用0.2％戊二醛固定10分钟。接着将细胞用X-gal染色溶液在pH 6.0下染色过夜。第二天使用倒置Olympus IX71显微镜捕获图像，并量化SA-β-gal，阳性细胞的百分比用于统计分析。

实施例7

Annexin-V FITC和碘化丙啶流式细胞术

如制造商的方案中所述，用Annexin-V凋亡检测试剂盒(B&D，Franklin Lake，NJ，USA)检测细胞凋亡。简言之，细胞在6孔板中以2×10^5个细胞/mL的密度接种并进行相应的处理。之后，收集来自每个孔的大约10^6个细胞，洗涤并重悬于含有5μL Annexin-VFITC和5μL碘化丙啶(PI)缓冲液中在黑暗中作用30分钟。使用流式细胞仪(BECKMAN COULTER，Brea，CA，USA)分析细胞。细胞的总凋亡率计算为在右下和右上象限中观察到的比例的百分比。

以上实施例，所有的实验至少重复三次。结果表示为平均值±标准差。结果统计分析使用SPSS统计软件程序20.0进行处理。数据通过单因素方差分析(ANOVA)进行分析，然后进行Tukey检验以比较对照组和治疗组。P值<0.05被认为是具有统计学意义。

实施例8

高浓度葡萄糖抑制髓核细胞的细胞活性

为了研究在原代髓核细胞中高浓度葡萄糖诱导的细胞毒性的作用，我们用不同剂量和时间的葡萄糖处理NPs。使用细胞计数试剂盒-8(CCK8)测定法在各种浓度(5.5、12.5、25、50、100和200mM)下测定葡萄糖对NP的细胞毒性作用24-96小时。如图1所示，高糖对NP细胞有明显的细胞毒性作用，特别是在高剂量时(图1)(P<0.05-0.0001)。

实施例9

高浓度葡萄糖抑制髓核细胞TERT表达和端粒长度

髓核细胞用不同浓度葡萄糖(5.5、12.5、25、50、100和200mM)处理48小时后通过Western印迹检测到的TERT。如图2a所示，TERT在所有葡萄糖浓度中以浓度依赖性方式显著降低(P<0.05-0.0001)。同时，如图2b所示，RT-qPCR结果显示TERT的mRNA表达也以浓度依赖性方式下降(P<0.0005)。此外，如图2c所示，通过使用Cawthon的qPCR方法检测的端粒长度也以浓度依赖性方式下降(P<0.05-0.0005)。这些数据表明，高浓度葡萄糖可减少TERT表达和缩短端粒长度。

实施例10

高浓度葡萄糖促进髓核细胞的凋亡和衰老

用不同浓度(5.5，12.5，25，50，100和200mM)的葡萄糖处理髓核细胞48小时后，通过蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白，即：C-C3，BAX和Bcl-2。如图3a所示，C-C3和BAX蛋白表达增加，而Bcl-2以葡萄糖浓度的浓度依赖性方式显著降低(P<0.05-0.0001)。同时，如图3b所示，由Annexin-V检测的FITC百分比以浓度依赖性方式显著增加(P<0.0005)。以上结果提示，高浓度葡萄糖可促进髓核细胞凋亡。

图3c中β-gal染色显示高浓度葡萄糖处理后细胞β-gal染色阳性率增加(P<0.005-0.001)；此外，在图3d中，作为衰老标志物的p-16的表达也以浓度依赖性方式增加(P<0.005-0.0001)。以上结果提示，高浓度葡萄糖可促进髓核细胞衰老。

实施例11

环黄芪醇对髓核细胞的细胞毒性作用

我们以不同剂量的CAG处理髓核细胞，并使用细胞计数试剂盒(CCK8)测定法在各种浓度(0.01、0.1、0.5、1、3、5、10、50和100μM,)下测定CAG对髓核细胞的毒性作用。如图4所示，药物在NP细胞上的高剂量(即50和100μM)存在显著的细胞毒性作用(图4)(分别为P<0.0005和0.05)。

实施例12

环黄芪醇在高糖条件下提高细胞活力

使用细胞计数试剂盒(CCK8)测定法在HG处理48小时后测定细胞活力。如图5a所示，未处理组(DMSO HG)和处理组(CAG)之间存在显著差异。用HG处理后，细胞活力下降，但CAG对HG诱导的细胞死亡显示出明显的保护作用(图5a)(P<0.05-0.01)。

此外，NP细胞的大小和形状不同，用HG(25mM)处理时，细胞质和细胞器显得粗糙；但是加了CAG之后，它们可以在一定程度上逆转这种现象。(图5b)。

实施例13

环黄芪醇在高糖条件下可增加NP细胞的TERT表达和端粒长度

为了研究CAG对高糖条件下TERT产生的作用，将25mM的高葡萄糖(HG)浓度处理的NP细胞以1、3、5和10μM浓度的CAG处理24小时。如图6a中所示，在HG条件下TERT表达显著降低，而在药物治疗组中TERT表达恢复(P<0.05-0.01)。同时，如图6b所示，RT-qPCR中TERT的mRNA表达在HG条件下也显著降低，而在药物处理组中显著增加，特别是在1和3μM浓度下(P<0.05)。此外，如图6c所示，通过使用Cawthon方法测定的端粒长度在HG条件下也显著降低，而在CAG作用组中显著增加，尤其是在1和3μM浓度下(P<0.05)。以上这些数据表明，CAG通过增加TERT表达和延长端粒长度在HG诱导的细胞损伤中起保护作用。

实施例14

环黄芪醇抑制高糖条件下的细胞凋亡和衰老

为了研究CAG对HG条件下的细胞凋亡和衰老的作用，将25mM的高葡萄糖(HG)浓度处理的NP细胞以1、3、5和10μM浓度用CAG处理24小时。图7a显示在单纯HG条件下C-C3和BAX蛋白质增加而Bcl-2显著降低，CAG作用后显著逆转以上蛋白的表达。药物治疗组与单纯HG治疗组比较，具有显著性差异(P<0.01-0.001)。同时，如图7b所示，通过Annexin-V检测的细胞凋亡百分比在单纯HG的情况下显著增加，而药物处理组中的百分比降低(P<0.05-0.01)。此外，在图7c中，作为衰老标志物的p-16的表达在单纯HG的条件下显著增加，而药物处理组中的表达降低(P<0.0005)。图7d中的β-gal染色也显示相同的现象(P<0.001)。以上结果显示，环黄芪醇可显著抑制高糖条件下的髓核细胞的凋亡和衰老。

以上对本发明做了详尽的描述，但本发明不限于上述的实施例。凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院

<120> 一种含环黄芪醇的髓核细胞抗衰老抗凋亡培养基

<130> 2018

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

ccgcgagtac aaccttcttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

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<400> 3

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<210> 4

<211> 20

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<213> 人工合成()

<400> 4

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<210> 5

<211> 37

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<213> 人工合成()

<400> 5

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<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

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<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

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<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

cagccagtgg gaaggtgtag tca 23

Claims (10)

1.一种培养基，所述培养基包括高糖型基础培养基和环黄芪醇。

2.如权利要求1所述的培养基，所述高糖型基础培养基为液体。

3.如权利要求1或2所述的培养基，所述高糖型基础培养基选自DMEM培养基、F12培养基、DMEM/F12培养基或RPMI 1640培养基。

4.如权利要求1-3所述的培养基，所述环黄芪醇在培养基中的浓度为0.01-10μM。

5.如权利要求4所述的培养基，所述环黄芪醇在培养基中的浓度为1-10μM。

6.如权利要求1-5所述的培养基，所述培养基不含细胞因子。

7.一种增加髓核细胞的TERT表达和端粒长度的方法，所述方法包括将髓核细胞用环黄芪醇溶液处理。

8.如权利要求7所述的方法，所述髓核细胞因高糖环境导致TERT表达减少和端粒长度缩短。

9.如权利要求7所述的方法，所述环黄芪醇溶液的浓度为0.01-10μM。

10.如权利要求7所述的方法，所述环黄芪醇溶液的浓度为1-10μM。