CN108823295A - 一种用于人cyp2c19基因多态性位点检测试剂盒 - Google Patents

一种用于人cyp2c19基因多态性位点检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，试剂盒内包括PCR反应管、野生型对照和阴性对照，经过S1‑S7的检测步骤后可判断样本的人CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因多态性的类型。本发明的试剂盒选取靶序列适宜的区域并设计了高特异性的引物和探针；试剂盒直接采用微量全血扩增，因其用血量少，减少病人的痛苦；免去抽提DNA程序，省时省力，并且大大减少经济支出；试剂盒在反应体系中加入冻干保护剂(海藻糖)，使反应液冻干后可在2‑30℃条件下存储运输。

Description

一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒
技术领域
本发明涉及技术领域，尤其涉及一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒。
背景技术
氯吡格雷是一种噻吩吡啶类前体药物，需要经过肠道吸收及肝脏各种酶的代谢转变成有活性的成分来发挥抗血小板聚集效应。氯吡格雷先由CYP2C19、CYP1A2和CYP2B6转化为中间代谢产物2-O-氯吡格雷，再经CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、CYP2B6和PON1催化生成活性代谢物，该代谢物选择性不可逆地与血小板膜上的二磷酸腺苷(ADP)受体P2Y12结合，减少ADP结合位点，阻断ADP介导的纤维蛋白原与其受体糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的结合，抑制血小板的活化和聚集，发挥抗血小板作用，少部分2-O-氯吡格雷和活性代谢物也可被酯酶水解为羧酸代谢物排出体外。氯吡格雷作为目前使用最广泛的抗血小板凝集药，用于急性冠脉综合征、动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗。
氯吡格雷是一种前体药物，经肝脏细胞色素P450酶(主要是CYP2C19酶)代谢为有活性的产物后才能发挥药效。不同个体对于氯吡格雷的反应有差异，约40％的亚裔病人会产生氯吡格雷抵抗，主要原因是CYP2C19基因突变导致弱代谢。CYP2C19至少有36种等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3占亚洲人群弱代谢表型的99％以上，CYP2C19*17是目前发现的唯一具有超快活性的基因分型。2010年FDA提出黑框警告，明确建议医生对将要服用氯吡格雷的患者进行CYP2C19基因分型检测，针对患者基因型实施个性化用药。临床研究表明，CYP2C19基因突变导致的弱代谢个体，栓塞重新形成的风险增加，心脑血管事件的发生风险增加，病死率升高。对于这类个体，需要增加氯吡格雷的剂量，以达到阻断血小板聚集的效果。由上述可见，CYP2C19的活性在临床指导用药上具有非常广泛的作用，而CYP2C19多态性的检测凸显其重要性，为此我们设计出了一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒来解决以上问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案:
一种用于同时检测人CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因多态性的特异性引物组及探针，其特征在于，所述基因多态性位点为CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17，所述引物组及探针序列为：
CYP2C19*2-F：5’-TTCCCCATCAAGATATAC-3’；
CYP2C19*2-R：5’-CGAGGGTTGTTGATGTCC-3’；
CYP2C19*3-F：5’-TCATCCTGGGCTGTGCTC-3’；
CYP2C19*3-R：5’-ATTCAAAAATGTACTTCAGG-3’；
CYP2C19*17-F：5’-TGTTTTATGAACAGGATGAATGTGGTA-3’；
CYP2C19*17-R：5’-GAGGTCTTCTGATGCCCA-3’；
CYP2C19*2-P：5’-CCGGGAACCCATAACAAATTAATCCCCCGG-3’；
CYP2C19*3-P：5’-TGGATCCAGGTAAGGCCAAGTATCCATCCA-3’；
CYP2C19*17-P：5’-AAGCATCTCTGATGTAAGAGAATCCTGCTT-3’。
一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，试剂盒内包括PCR反应管、野生型对照和阴性对照。
优选的，所述PCR反应管内有干冻粉、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、MgCl2和海藻糖。
优选的，所述PCR反应液冻干粉的储存条件为2-30℃避光保存。
优选的，所述野生型对照为CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因位点野生型质粒的混合物。
优选的，所述阴性对照为TE缓冲液或无核酸酶水作为空白对照。
一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤，
一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，试剂盒内包括PCR反应管、野生型对照和阴性对照。
优选的，所述PCR反应管包括干冻粉、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、MgCl2和海藻糖。
优选的，所述野生型对照为CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因位点野生型质粒的混合物。
优选的，所述阴性对照为TE缓冲液或无核酸酶水作为空白对照。
一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤，
S1，准备待测的人血液和唾液样品：直接取待检测的全血、唾液作为PCR模板，人血液包含但不限于静脉血，指尖血、脐带血和血片等人体血液均适用于；
S2，将铝箔袋包装的PCR反应管从试剂盒中取出，剪开包装取出试剂，按每管加入20μL DNA溶解液的量，溶解反应管中的冻干粉；
S3，用微量加液器向每孔PCR反应管中加入0.5μL相应的PCR模板或5μL相应的阴性/野生型对照品，并立即盖严管盖；
S4，将已加入模板的PCR反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20-30s，瞬时离心；
S5，将已充分振荡混匀后的PCR反应管转移至PCR扩增仪上，进行PCR扩增反应：50℃孵育2分钟；95℃变性10分钟；10次循环：95℃15秒，65℃20秒(每个循环下降1℃)，72℃20秒；50个循环：95℃15秒，55℃20秒，72℃20秒；熔解曲线阶段：95℃1分钟，35℃3秒，40℃-72℃(升温速率0.04℃/s)；
S6，PCR结果判定:在试剂盒的野生型对照和空白对照品符合规定的情况下，通过比较待测样本在检测体系中共三个检测通道与野生型对照之间熔点的差异判断样本的人CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因多态性的基因型；
优选的，所述S4中的三个检测通道分别为FAM、HEX和ROX通道。
本发明的有益效果：
1、本发明试剂盒选取靶序列适宜的区域并设计了高特异性的引物和探针。
2、本发明试剂盒直接采用微量全血扩增，因其用血量少，减少病人的痛苦；免去抽提DNA程序，省时省力，并且大大减少经济支出。
3、本发明试剂盒在反应体系中加入冻干保护剂(海藻糖)，使反应液冻干后可在2-30℃条件下存储运输。
附图说明
图1为本发明提出的一种用于人CYP2C19*2基因多态性位点检测试剂盒的CYP2C19*2的多态性检测结果；
图2为本发明提出的一种用于人CYP2C19*2基因多态性位点检测试剂盒的CYP2C19*3的多态性检测结果；
图3为本发明提出的一种用于人CYP2C19*2基因多态性位点检测试剂盒的CYP2C19*17的多态性检测结果。
图中：1-纯和突变型、2-杂合突变型、3-野生型、4-阴性对照。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一。
一种用于人CYP2C19*2基因多态性位点检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤，
S1，准备待测的人血液和唾液样品：直接取待检测的全血样本1、2和3以及唾液样本1、2和3作为PCR模板；
S2，将铝箔袋包装的PCR反应管从试剂盒中取出，剪开包装取出试剂，按每管加入20μL DNA溶解液的量，溶解反应管中的冻干粉；
S3，用微量加液器向每孔PCR反应管中加入0.5μL相应的PCR模板或5μL相应的阴性/野生型对照品，并立即盖严管盖；
S4，将已加入模板的PCR反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20-30s，瞬时离心；
S5，将已充分振荡混匀后的PCR反应管转移至PCR扩增仪上，进行PCR扩增反应；
S6，PCR结果判定:在试剂盒的野生型对照和空白对照品符合规定的情况下，通过比较全血样本1、2和3以及唾液样本1、2和3在检测体系中共三个检测通道与野生型对照之间熔点的差异判断样本的人CYP2C19*2基因多态性的基因型。
实施例二
一种用于人CYP2C19*3基因多态性位点检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤，
S1，准备待测的人血液和唾液样品：直接取待检测的全血样本4、5和6以及唾液样本4、5和6作为PCR模板；
S2，将铝箔袋包装的PCR反应管从试剂盒中取出，剪开包装取出试剂，按每管加入20μL DNA溶解液的量，溶解反应管中的冻干粉；
S3，用微量加液器向每孔PCR反应管中加入0.5μL相应的PCR模板或5μL相应的阴性/野生型对照品，并立即盖严管盖；
S4，将已加入模板的PCR反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20-30s，瞬时离心；
S5，将已充分振荡混匀后的PCR反应管转移至PCR扩增仪上，进行PCR扩增反应；
S6，PCR结果判定:在试剂盒的野生型对照和空白对照品符合规定的情况下，通过比较全血样本4、5和6以及唾液样本4、5和6在检测体系中共三个检测通道与野生型对照之间熔点的差异判断样本的人CYP2C19*3基因多态性的基因型。
实施例三
一种用于人CYP2C19*17基因多态性位点检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤，
S1，准备待测的人血液和唾液样品：直接取待检测的全血样本7、8和9以及唾液样本7、8和9作为PCR模板；
S2，将铝箔袋包装的PCR反应管从试剂盒中取出，剪开包装取出试剂，按每管加入20μL DNA溶解液的量，溶解反应管中的冻干粉；
S3，用微量加液器向每孔PCR反应管中加入0.5μL相应的PCR模板或5μL相应的阴性/野生型对照品，并立即盖严管盖；
S4，将已加入模板的PCR反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20-30s，瞬时离心；
S5，将已充分振荡混匀后的PCR反应管转移至PCR扩增仪上，进行PCR扩增反应；
S6，PCR结果判定:在试剂盒的野生型对照和空白对照品符合规定的情况下，通过比较全血样本7、8和9以及唾液样本7、8和9在检测体系中共三个检测通道与野生型对照之间熔点的差异判断样本的人CYP2C19*17基因多态性的基因型。
上述实施例中CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17的对照品选择为：野生型对照为CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因位点野生型质粒混合物，阴性对照为DNA溶解液(TE缓冲液)。
阴性对照判定：阴性对照在反应管中均无熔解曲线检测信号。若对照检测结果存在熔解曲线检测信号，表明实验过程被污染，可能原因：试剂交叉污染、存在气溶胶等，实验无效，需重新试验；
野生型对照判定：野生型对照在各体系及各通道中的熔点(Tm)值范围如下：
反应体系：FAM通道56.59±1.5；HEX通道56.26±1.5；ROX通道61.24±1.5。
Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，请参考野生型对照和阴性对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm值。
在判定阴性对照和野生型对照符合规定值时，样本检测结果再按表1、表2进行结果判定：
表1检验结果判读标准
注：W代表野生型峰，P代表多态性熔解峰。
表2试剂盒可以检测的多态性类型及各多态性类型在对应通道的ΔTm值波动范围
注：a、表中“-”指检测样本熔解峰与对应野生型熔解峰Tm差异的在±1℃之内。
b、表中黑体字为野生型与对应通道多态性类型ΔTm±3SD，当3SD＜1.0时按照ΔTm±1.0，由多次试验得到的统计结果。
c、各位点基因型检测结果示意图见说明书附图1-3，可结合图示进行理解，说明书附图1-3中的箭头为各基因型对应的Tm值。
上述实施例中CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*3(野生型、杂合突变型和纯合突变型)的全血和唾液样本由上述检测方法选取。
上述实施例中1-9全血和唾液样本的试剂盒检测结果为：
注：全血和唾液样本1-9分别为：CYP2C19*2位点野生型样品、CYP2C19*2位点杂合突变型样品、CYP2C19*2位点纯合突变型样品、CYP2C19*3位点野生型样品、CYP2C19*3位点杂合突变型样品、CYP2C19*3位点纯合突变型样品、CYP2C19*3位点野生型样品、CYP2C19*3位点杂合突变型样品、CYP2C19*3位点纯合突变型样品。
上述9例样品(全血及唾液)荧光定量PCR检测结果与测序结果一致，表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于血液直接检测CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于临床检测和推广。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，其特征在于，试剂盒内包括PCR反应管、野生型对照和阴性对照。
2.根据权利要求1所述的一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应管内有干冻粉、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、MgCl2和海藻糖。
3.根据权利要求1所述的一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，其特征在于，所述野生型对照为CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因位点野生型质粒的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为TE缓冲液或无核酸酶水作为空白对照。
5.一种用于人CYP2C19基因多态性位点检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1，准备待测的人血液和唾液样品：直接取待检测的全血、唾液作为PCR模板，人血液包含但不限于静脉血，指尖血、脐带血和血片等人体血液均适用于；
S2，将铝箔袋包装的PCR反应管从试剂盒中取出，剪开包装取出试剂，按每管加入20μLDNA溶解液的量，溶解反应管中的冻干粉；
S3，用微量加液器向每孔PCR反应管中加入0.5μL相应的PCR模板或5μL相应的阴性/野生型对照品，并立即盖严管盖；
S4，将已加入模板的PCR反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20-30s，瞬时离心；
S5，将已充分振荡混匀后的PCR反应管转移至PCR扩增仪上，进行PCR扩增反应；
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