CN108823228B - 高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用，涉及基因工程技术领域。本发明以pcDNA3.1(‑)质粒为骨架，将cumate‑cymR诱导表达调控单元装入pUC ori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET‑28a T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列***cumate‑cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN‑001。本发明的重组质粒DN‑001具有最经济、最方便和高产量等优点，使得基因表达载体的重组省时、省力；可以适用于生产大剂量的重组蛋白；同时有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达，使得这一载体具有广泛的市场前景。

Description

高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种通过基因工程方法改造的高拷贝高表达重组质粒，及该重组质粒在外源基因表达中的应用。
背景技术
原核生物基因表达***是最经济、最方便和使用最广泛的重组基因表达***，包括His标签重组蛋白的表达(现有文献：Rosano GL,Ceccarelli EA.Recombinant proteinexpression in Escherichia coli:advances and challenges.FrontMicrobiol.2014Apr 17；5:172；Wingfield PT.Overview of the purification ofrecombinant proteins.Curr Protoc Protein Sci.2015Apr 1；80:6.1.1-35有相关说明)。His标签由6个组氨酸组成，分子量小、免疫原性差、不改变蛋白质的空间结构及其溶解性；利用带镍离子的填料进行亲和纯化，方法简单、成本低、目标蛋白纯度高，是目前应用最广泛的融合表达亲和标签。pET和PQE系列质粒载体是目前最常用的His蛋白表达载体，目的基因被克隆到pET和PQE质粒载体上，受T7或T5强转录及翻译(可选择)信号控制；充分诱导时，细菌能高度地表达目的蛋白。然而，pET和PQE系列质粒表达***存在三个明显的缺陷。其一，它们在大肠杆菌中的复制效率低，基因重组费时、成本高；其二，重组的目的蛋白易漏出表达，表达有毒蛋白时会抑制细菌生长甚至杀灭细菌。其三，诱导剂IPTG的高花费和潜在的毒性阻碍这一表达***用于生产大剂量的重组蛋白。近年开发的另一原核生物表达***---cumate诱导表达***(现有文献：Choi YJ,Morel L,Le
Figure BDA0001603853220000011
T,Bourque D,Bourget L,Groleau D,Massie B,Míguez CB.Novel,versatile,and tightly regulatedexpression system for Escherichia coli strains.Appl Environ Microbiol.2010，76(15):5058-66；Mullick A,Xu Y,Warren R,Koutroumanis M,Guilbault C,Broussau S,Malenfant F,Bourget L,Lamoureux L,Lo R,Caron AW,Pilotte A,Massie B.The cumategene-switch:a system for regulated expression in mammalian cells.BMCBiotechnol.2006，6:43有关原核生物表达***---cumate诱导表达***的说明)被认为优于pET和PQE系列质粒载体***。这一***采用结合cuo操纵子的CymR阻遏物进行调控，外源基因的表达依赖诱导剂cumate加入，由于小分子化合物Cumate水溶性好而且无毒，这一***适用于生产大剂量的重组蛋白。然而，国内市场尚无相关的质粒载体。另外，我们测试发现依文献构建的载体有漏出表达。因此，借鉴cumate诱导***构建新的高拷贝高表达且无漏出表达的质粒载体将会有极大的市场价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高拷贝高表达重组质粒，利用该重组质粒在外源基因表达中的应用，以及在表达有毒蛋白中的应用。通过这一新的表达载体在大肠杆菌DH5α和TOP10等中高度复制,携带的外源基因在大肠杆菌中呈高水平且严格依赖诱导剂cumate表达,无漏出表达；实现了重组质粒DN-001在大肠杆菌DH5α和TOP10中的高拷贝复制，重组质粒DN-001携带的外源基因实现了在大肠杆菌BL21(DE3)中高表达His标签蛋白，重组质粒DN-001携带的外源基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的无漏出表达，表达有毒蛋白时，细菌可以保持良好的生长状态，解决以上现有技术的不足。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种高拷贝高表达重组质粒的构建，
所述重组质粒由pUC ori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym-cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；
所述重组质粒的构建包括如下步骤：
SS01采用质粒pcDNA3.1(-)为模板，PCR扩增出含pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，
设计引物为：
pcDNA-5:TCGACCTCT AGCTAGAGCTT
pcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAA
SS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym-cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR-cuo；
SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo两片段连接环合为原核***表达载体DN-002；
SS04以质粒pET-28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M-His-T，
设计引物为：
pET-5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGAT
pET-3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTC
SS05将步骤SS04中的DNA片段M-His-T和步骤SS03中的质粒DN-002用Nco I和XhoI进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN-001，如SEQ ID NO1所示。
进一步地，所述高拷贝高表达重组质粒在表达有毒蛋白中的应用。
进一步地，所述高拷贝高表达重组质粒在外源基因表达中的应用。
本发明所依据的原理：
以pcDNA3.1(-)质粒为骨架，将cumate-cymR诱导表达调控单元装入pUC ori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET-28a T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列***cumate-cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN-001。
这一新的表达载体有如下四个优点：(1)由于含有pUC ori高拷贝复制子，因此它可以高效率启动质粒复制，我们从每ml饱和生长菌中提取超过15μg DN-001质粒，而提取的pET-28a和PQE-60等质粒低于1μg，(2)在T5强启动子的作用下外源基因高度表达，充分诱导时外源基因的表达量超过细菌总蛋白50％以上。使用这一载体表达几十种不同类型的重组蛋白的产量均不低于对照pET-28a载体的表达量。(3)抑制蛋白cymR在T7强启动子(取代Pkm启动子)的作用下高表达，同时外源基因表达序列上游装入并列的两个cymR结合的cym-cmt操纵子序列P1-cuo和P2-cuo,这样有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达。(4)小分子诱导物Cumate水溶性好而且无毒，这一***适用于生产大剂量的重组蛋白。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用原核生物His标签重组蛋白的表达***，具有最经济、最方便和高产量等优点，解决了目前市场广泛使用的pET和PQE系列质粒载体都在大肠杆菌中的复制效率低和目的蛋白易漏出表达等缺陷。
2、本发明构建的载体DN-001整合了pUC ori高拷贝复制子和T5、T7强启动子,在保证重组的His蛋白可以高度表达的同时，质粒载体在扩增菌里也能高效复制，使得基因表达载体的重组省时、省力。
3、本发明构建的载体DN-001使用cumate诱导***而不是IPTG诱导***，可以适用于生产大剂量的重组蛋白。
4、本发明构建的载体DN-001含2个并列的cumate结合的cym-cmt操纵子序列P1-cuo和P2-cuo,使得重组目的蛋白的表达绝对依赖诱导剂cumate的诱导，从而有效地抑制了漏出表达，使得这一载体特别适合有毒蛋白的表达，使得这一载体具有广泛的市场前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DN-001质粒图谱。
图2为质粒DN-001和pET28a在大肠杆菌DH5α和TOP10中的提取对比图。泳道1是从大肠杆菌DH5α中提取的质粒DN-001，泳道2是从大肠杆菌DH5α中提取的质粒pET28a，泳道3是从大肠杆菌TOP10中提取的质粒DN-001，泳道4是从大肠杆菌TOP10中提取的质粒pET28a。从图中发现，质粒在大肠杆菌DH5α和TOP10中的复制效率明显高于pET28a。
图3为DN-001和pET28a在大肠杆菌BL21(DE3)中表达一个15kd的蛋白CRIPT的表达产量对比图。泳道1是DN-001-CRIPT诱导组菌体，泳道2是DN-001-CRIPT未诱导组菌体，泳道3是pET28a-CRIPT诱导组菌体，泳道4是pET28a-CRRIPT未诱导组菌体。由图可知，DN-001-CRIPT和pET28a-CRIPT在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产量相同。
图4为DN-001-CKAP1和DN-001-ACTB在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产量图。泳道1是DN-001-CKAP1未诱导组菌体，泳道2是DN-001-CKAP1诱导组菌体，泳道3是DN-001-ACTB未诱导组菌体，泳道4是DN-001-ACTB诱导组菌体。图中显示，CKAP1和ACTB的表达水平均很高。
序列表信息：
SEQ ID NO1：重组质粒DN-001序列。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明(高拷贝高表达重组质粒中的“重组质粒”由“重组质粒DN-001”表达)以pcDNA3.1(-)质粒为骨架，将cumate-cymR诱导表达调控单元装入pUC ori高拷贝复制子和Ampicillin抗性基因之间，同时将pET-28a T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列***cumate-cymR调控单元的下游构建出高复制和高表达的重组质粒DN-001。
以下结合本实施例详细阐述本发明的具体内容：
实施例一：重组质粒DN-001的构建
高拷贝高表达重组质粒DN-001由pUC ori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym-cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；如图1所示为该质粒DN-001的质粒图谱。
高拷贝高表达重组质粒DN-001的构建包括如下步骤：
SS01采用质粒pcDNA3.1(-)为模板，PCR扩增出含pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，
设计引物为：
pcDNA-5:TCGACCTCT AGCTAGAGCTT
pcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAA
以质粒pcDNA3.1(-)为模板，用上述两个引物进行PCR扩增，扩增出由pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因组成的约2400bp的DNA片段pUC-Amp，其中，PCR反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，进行30个循环；72℃延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒纯化回收pUC-Amp。
SS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym-cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR-cuo；
SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo两片段连接环合为原核***表达载体DN-002；
SS04以质粒pET-28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M-His-T，
设计引物为：
pET-5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGAT
pET-3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTC
PCR反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个循环；72℃延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒纯化回收M-His-T。
SS05将步骤SS04中的DNA片段M-His-T和步骤SS03中的质粒DN-002用Nco I和XhoI进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN-001，如SEQ ID NO1所示。图2为质粒DN-001和pET28a在大肠杆菌DH5α和TOP10中的提取对比图。图3为DN-001和pET28a在大肠杆菌BL21(DE3)中表达一个15kd的蛋白CRIPT的表达产量对比图。
高拷贝高表达重组质粒在表达有毒蛋白中的应用。
高拷贝高表达重组质粒在外源基因表达中的应用。
实施例二：表达外源基因的重组质粒的构建
图4为DN-001-CKAP1和DN-001-ACTB在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产量图。
将外源基因(如Trypsin、EcoRI、CRIPT、ACT B等但不限于上述基因)的DNA片段和DN-001用Nco I和Xho I进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒。经酶切验证和测序筛选出正确的DN-001外源基因表达质粒。作为对照，外源基因同时也用Nco I和Xho I位点克隆入pET-28a载体，构建出pET-28a外源基因表达质粒。
实施例三：外源基因的诱导表达
将构建好的重组质粒转化至BL21(DE3)中，挑单克隆接种至含氨苄青霉素钠(终浓度为50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。次日，按1：200的比例将过夜活化的菌液接入新鲜的LB抗性培养基，扩大培养，37℃摇床培养3小时，将菌液平分为两组，一组为诱导组，一组为对照组；诱导组加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续37℃摇床培养4小时。诱导结束，将诱导组和对照组8500rpm离心2min，尽量去除上清，加入1×SDS-PAGE loadingBuffer，95℃煮5分钟，8500rpm离心1min。SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达效果，电泳条件如下：15％分离胶，5％浓缩胶，电压90V，电泳时间90分钟。
以上公开的优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
序列表：
SEQ ID NO1：
Figure BDA0001603853220000091
Figure BDA0001603853220000101
Figure BDA0001603853220000111
Figure BDA0001603853220000121
Figure BDA0001603853220000131
Figure BDA0001603853220000141
Figure BDA0001603853220000151
Figure BDA0001603853220000161

Claims (3)

1.高拷贝高表达重组质粒，其特征在于：
所述重组质粒由pUC ori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym-cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；
所述重组质粒的构建包括如下步骤：
SS01采用质粒pcDNA3.1(-)为模板，PCR扩增出含pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，
设计引物为：
pcDNA-5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTT
pcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAA
SS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym-cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR-cuo；
SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo两片段连接环合为原核***表达载体DN-002；
SS04以质粒pET-28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M-His-T，
设计引物为：
pET-5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGAT
pET-3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTC
SS05将步骤SS04中的DNA片段M-His-T和步骤SS03中的质粒DN-002用Nco I和Xho I进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN-001，如SEQ ID NO1所示。
2.如权利要求1所述的高拷贝高表达重组质粒在表达有毒蛋白中的应用。
3.如权利要求1所述的高拷贝高表达重组质粒在外源基因表达中的应用。
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