CN108823173A - 用于杂交瘤细胞培养的补料培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基,在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分:葡萄糖10g,谷氨酰胺3g,牛血白蛋白60g,缬氨酸52mg,异亮氨酸54mg,苯丙氨酸35mg,亮氨酸59mg,色氨酸9mg,苏氨酸53mg,蛋氨酸17mg,赖氨酸91mg。本发明原料配比科学,配制方法简单,制备的补料培养基克服了现有补料培养基存在的批间差,达到了稳定流加培养工艺,稳定提高抗体产量的目的。在采用流加式培养方法时,作为补料培养基,接种培养72小时后,经过纯化的抗体产量不低于300mg/L,且工艺稳定,抗体产量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞培养,尤其是涉及一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基,本发明还涉及该补料培养基的制备方法 。
背景技术
1975年建立了杂交瘤技术,通过将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合,形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行***繁殖,且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇,被称为单克隆抗体(简称单抗)。目前单抗主要应用于疾病的预防、诊断和治疗,生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势,1997年单抗的销售额是50亿美金,此后每年都有大的增长,至2003年已达500亿美金,由此可见单抗技术是生物技术领域中升起的一颗新星。
2000-2010年,全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32%。2011年,单克隆抗体药物继续领跑全球药品市场,全球生物制药产品的市场规模过亿美元,占生物制药产品的25%。有研究数据表明,生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升。
目前国内外实验室广泛采用的大量制备单抗的方法主要有两种:一是体外培养法,二是动物体内生产法。
杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞,因此既可以进行单层细胞培养,又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段,即将杂交瘤细胞加入培养瓶中,以含小牛血清的培养基培养,杂交瘤细胞浓度1.0×107个/皿,然后收集培养上清,其中单抗含量0.3mg/皿。
由于上述方法制备的单抗量极为有限,无疑不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗,就必须进行杂交瘤细胞的大量高密度培养,单位体积内细胞数量越多,杂交瘤细胞存活时间越长,单抗的浓度就越高,产量就越大。
杂交瘤细胞的悬浮培养法中,如果小规模悬浮培养,则多采用转瓶进行培养,通过搅拌使细胞呈悬浮状态;而大规模悬浮培养,则多采用发酵式的生物反应器进行培养,其培养方式可分为纯批式培养和流加式培养。由于纯批式培养细胞活率下降快,导致抗体产量不高,故应用较少。流加式培养,由于可通过流加补料培养基来延长细胞的存活时间,大大提高了抗体产量。但是现有的补料培养基国外厂商的质量好但售价高,增加了生产成本;国内厂家补料培养基配方不稳定,存在批间差,使用后导致抗体分泌量下降,无法满足生产需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种批间差异小、质量品质一致的用于杂交瘤细胞培养的补料培养基,本发明还提供该补料培养基的制备方法。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的用于杂交瘤细胞培养的补料培养基,在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分:葡萄糖 10g,谷氨酰胺 3g,牛血白蛋白60g,缬氨酸 52mg,异亮氨酸 54 mg,苯丙氨酸35 mg,亮氨酸59 mg,色氨酸9 mg,苏氨酸53 mg,蛋氨酸17 mg,赖氨酸91 mg。
本发明用于杂交瘤细胞培养的补料培养基的制备方法包括下述步骤:
第一步,将800ml注射用水在烧杯中加热至30~35℃,将缬氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,色氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,赖氨酸陆续加入到烧杯中,边加边搅拌,使之充分溶解;
第二步,待第一步中所有原料充分溶解后,再将葡萄糖,谷氨酰胺,牛血白蛋白依次加入到烧杯中,边加边搅拌,使之充分溶解;
第三步,待第二步中添加的原料充分溶解后,将溶液定容至1000ml,经除菌过滤器过滤后,得到补料培养基成品。
所述除菌过滤器的过滤精度为0.2μm。
本发明的优点在于原料配比科学,配制方法简单。采用葡萄糖、谷氨酰胺、牛血白蛋白和氨基酸构成补料培养基的配方,其中其中葡萄糖主要提供细胞生产所需的碳源,谷氨酰胺既可作为碳源也是核苷合成的重要成份,氨基酸是蛋白质合成的必需原料。本发明制备的补料培养基克服了现有补料培养基存在的批间差,达到了稳定流加培养工艺,稳定提高抗体产量的目的。在采用流加式培养方法时,作为补料培养基,接种培养72小时后,经过纯化的抗体产量不低于300mg/L,且工艺稳定,抗体产量稳定。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。
本发明所述的用于杂交瘤细胞培养的补料培养基,在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分:葡萄糖(分析纯) 10g,谷氨酰胺(生化试剂) 3g,牛血白蛋白(生化试剂)60g,缬氨酸(生化试剂) 52mg,异亮氨酸(生化试剂) 54 mg,苯丙氨酸(生化试剂)35 mg,亮氨酸(生化试剂)59 mg,色氨酸(生化试剂)9 mg,苏氨酸(生化试剂)53 mg,蛋氨酸(生化试剂)17 mg,赖氨酸(生化试剂)91 mg。
本发明的补料培养基制备时,制备条件和设备:环境气压为一个大气压,环境温度为室温。
按以下配比准确称量下述原料:葡萄糖10g,谷氨酰胺 3g,牛血白蛋白60g,缬氨酸52mg,异亮氨酸54 mg,苯丙氨酸35 mg,亮氨酸59 mg,色氨酸9 mg,苏氨酸53 mg,蛋氨酸17mg,赖氨酸91 mg;注射用水1000ml备用。
其制备方法如下:
第一步,首先将800ml注射用水倒入烧杯中加热至30~35℃,将缬氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,色氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,赖氨酸陆续加入到烧杯中,边加边搅拌,原料全部加入后持续搅拌约10min,使之充分溶解,液体透亮,无杂质;
第二步,待第一步中所有原料充分溶解后,再将葡萄糖,谷氨酰胺,牛血白蛋白依次加入到烧杯中,边加边搅拌,原料全部加入后持续搅拌约10min,使之充分溶解,液体透亮,无杂质;
第三步,待第二步中添加的原料充分溶解后,将溶液定容至1000ml,经0.2μm的除菌过滤器过滤后,得到补料培养基成品,4℃、密封保存。
使用时,每次添加培养体积的5%,每24小时添加一次,细胞活率降至20%以下后,停止添加,并收取培养液。
下面分别使用进口、国产、本发明实施例自制三种补料培养基,在摇床上进行流加式培养对比验证。过48小时培养,进行1000rpm、10min离心收取上清,使用亲和层析柱纯化抗体,并使用A280检测抗体含量,结果见表1。
表1
结论:从以上三种补料培养培养的结果可以看出,相比阴性对照,抗体产量都有所提升。本发明实施例自制的产量高于国产的64.5%,低于进口约7.3%。从产量看进口最优,但从成本、产量、技术进步等综合方面考量,本发明自制的补料培养基具有更大的优势。
Claims (3)
1.一种用于杂交瘤细胞培养的补料培养基,其特征在于:在1000ml单位容积的注射用水中包含以下组分:葡萄糖 10g,谷氨酰胺 3g,牛血白蛋白60g,缬氨酸 52mg,异亮氨酸 54mg,苯丙氨酸35 mg,亮氨酸59 mg,色氨酸9 mg,苏氨酸53 mg,蛋氨酸17 mg,赖氨酸91 mg。
2.权利要求1所述用于杂交瘤细胞培养的补料培养基的制备方法,其特征在于:包括下述步骤:
第一步,将800ml注射用水在烧杯中加热至30~35℃,将缬氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,色氨酸,苏氨酸,蛋氨酸,赖氨酸陆续加入到烧杯中,边加边搅拌,使之充分溶解;
第二步,待第一步中所有原料充分溶解后,再将葡萄糖,谷氨酰胺,牛血白蛋白依次加入到烧杯中,边加边搅拌,使之充分溶解;
第三步,待第二步中添加的原料充分溶解后,将溶液定容至1000ml,经除菌过滤器过滤后,得到补料培养基成品。
3.根据权利要求2所述用于杂交瘤细胞培养的补料培养基的制备方法,其特征在于:所述除菌过滤器的过滤精度为0.2μm。
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