CN108815191A - Rig-i通路介导对hcmv细胞抗病毒作用 - Google Patents

Rig-i通路介导对hcmv细胞抗病毒作用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了RIG‑I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用，星形胶质细胞的模式识别受体RIG‑I识别病毒蛋白和核酸的病原相关分子模式，导致细胞信号转导通路活化，启动I型干扰素的表达。I型干扰素促进干扰素刺激基因的表达，通过多种机制抑制病毒的复制。本发明的有益效果是对胚胎发育期的抗HCMV感染具有重要的临床应用价值。

Description

RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及RIG-I通路介导HCMV感染的神经星形胶质细胞抗病毒作用。
背景技术
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属于庖疹病毒β亚科，在大部分免疫***正常的成人中潜伏感染、无临床症状，在免疫缺陷性疾病中病毒重新激活、导致高发病率和高死亡率。HCMV感染所致的神经***发育异常是出生缺陷的常见原因之一。HCMV对发育中的脑组织有特殊亲嗜性，在神经发育的重要时期孕早期感染容易导致严重的胎儿神经***损伤。由于CMV感染具有严格的细胞嗜性和种属特异性，至今HCMV感染与胚胎发育时期神经组织的相互作用机制不明，也不了解中枢神经组织对抗病毒感染的免疫相关机制。
星形胶质细胞在神经发育的过程中始终伴着神经元的整个发育过程，在正常生理、神经***发育、抗感染免疫过程中发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用，本发明的有益效果是对胚胎发育期的抗HCMV感染具有重要的临床应用价值。
本发明所采用的技术方案是RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用。
进一步，RIG-I通路介导HCMV感染的神经星形胶质细胞抗病毒作用。
附图说明
图1是本发明实验路线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
1.关于HCMVAD169感染的人孕早期星形胶质细胞全基因组表达谱分析中首次发现，与未感染组比较，HCMV感染6h，模式识别受体RIG-I通路分子表达变化明显RIG-I、IPS-1、IRF3/7表达上调，变化有统计学意义(p<0.05)，而已经证实的HCMV模式识别受体TLR2、TLR4的表达变化没有统计学意义(p>0.05)。实验方法如图1所示，基于以上前期实验结果，本项目拟高表达和低表达RIG-I分子及接头蛋白IPS-1，转导HCMV AD169感染的人孕早期星形胶质细胞，通过检测实验组和对照组细胞的HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达，验证RIG-I识别通路介导的HCMV感染的人孕早期星形胶质细胞的抗病毒作用。
2.2.1.1RIG-I分子介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理后，高表达RIG-I/ShRNA RIG-I慢病毒载体转导细胞，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达以及测定细胞内外病毒滴度。
2.2.1.2接头蛋白IPS-1介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理后，高表达及ShRNA IPS-1(RIG-I下游的必须接头蛋白)慢病毒载体转导细胞，RT-qPCR、Westernblotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达以及测定细胞内外病毒滴度，通过研究IPS-1，进一步证实RIG-I通路介导的HCMV感染星形胶质细胞的抗病毒作用。
2.2.1.3共培养检测RIG-I介导抗病毒作用通过共培养方法或者收集人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理细胞上清(SN)加入HCMV感染的星形胶质细胞或神经元，检测病毒复制，进一步证实RIG-I介导的抗病毒作用。
2.2.2RIG-I通路参与合成抗病毒分子I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG已经证实，模式识别受体识别病原体的病原相关分子模式，活化细胞并传递信号给下游分子诱导IFN、ISG的合成以抑制病毒的复制和扩散，本项目拟通过HCMV感染活化RIG-I通路，检测抗病毒分子I型和III型IFN和ISG的表达和分泌，进一步证实RIG-I通路介导HCMV感染的人孕早期星形胶质细胞抗病毒作用。
2.2.2.1HCMV感染细胞I型、III型IFN和ISG表达的检测
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)与细胞RIG-I作用后，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting检测和ISG的表达。
2.2.2.2检测I型和III型IFN是否参与ISG的表达
通过IFNAR2中和抗体和IFNλ胞外段抗体IL-10Rβ处理HCMV感染细胞，检测I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG表达，证明I型IFNα/β和III型IFNλ是否参与ISG的表达
2.3.1RIG-I通路介导HCMV感染神经星形胶质细胞抗病毒作用
2.3.1.1RIG-I分子介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理后，高表达RIG-I/ShRNA RIG-I慢病毒载体转导细胞，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting、免疫组化方法检测HCMV病毒物IE1/2、pp65的表达以及测定细胞内外病毒滴度。
①RT-qPCR检测：接种细胞，次日更换为维持生长培养基，设定感染组和未感染组，病毒感染3h、6h、12h后，收集感染和未感染组细胞，TRIzol抽提总RNA，以Oligo(dt)作为引物，将RNA逆转录为cDNA，qPCR检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达。
②Western blotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：蛋白标准曲线的制作及蛋白浓度的测定，蛋白提取。Western blotting：i.从不同样品中取出等量蛋白(100μg)与蛋白上样缓冲液混合，并于100℃变性3min；ii.电泳；iii.转膜；iv.5％的脱脂奶粉PBST溶液封闭；用封闭液稀释的一抗(包括RIG-I、IRF3、IRF7、ISGs、Actin、GAPDH 4℃孵育过夜；vi.洗涤；vii.二抗室温孵育1h；viii.洗涤；ix.加底物和显色剂，暗室中进行曝光显色。
③免疫组化检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：i.接种细胞；ii.甲醛固定：弃掉培养基4％的多聚甲醛4℃固定细胞30min，0.01M PBS洗3次；iii.透化：0.2％的Tritonx-100室温透化30min，0.01M PBS洗3次；iv.封闭：10％的山羊血清室温封闭30min，不洗；v.孵育1抗：4℃孵育过夜；0.01M PBS洗3次；vi.孵育二抗：加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:100)37℃闭光孵育30min；0.01M PBS洗3次；vii.DAPI复染细胞核，激光共聚焦显微镜下观察，拍照。
④病毒滴度的测定：收集细胞，经10％甲醛固定和0.5％结晶紫染色，倒置显微镜下进行空斑计数。空斑定量检测细胞内、外病毒滴度变化，病毒负荷量按下列公式计算：感染性病毒量(PFU/mL)＝(蚀斑均数×病毒稀释倍数)/病毒接种量(mL)，再取log值。
2.3.1.2接头蛋白IPS-1介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNApoly(dAT:dAT)处理后，高表达及ShRNA IPS-1(RIG-I下游的必须接头蛋白)慢病毒载体转导细胞，RT-qPCR、Westernblottingting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp 65的表达以及测定细胞内外病毒滴度，通过研究IPS-1，进一步证实RIG-I通路介导的HCMV感染星形胶质细胞的抗病毒作用。
①RT-qPCR检测：接种细胞，次日更换为2％FBS维持生长培养基，设定感染组和未感染组，病毒感染3h、6h、12h后，收集感染和未感染组细胞，TRIzol抽提总RNA，以Oligo(dt)作为引物，将RNA逆转录为cDNA，qPCR检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达。
②Western blotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：蛋白标准曲线的制作及蛋白浓度的测定，蛋白提取。Western blotting：i.从不同样品中取出等量蛋白(100μg)与2×SDS蛋白上样缓冲液混合，并于100℃变性5min；ii.电泳；iii.转膜；iv.5％牛奶的PBST溶液封闭；用封闭液稀释的一抗(包括RIG-I、IRF3、IRF7、ISGs、、Actin、GAPDH v4℃孵育过夜；vi.洗涤；vii.二抗室温孵育1h；viii.洗涤；ix.加底物显色剂，暗室中进行曝光显色。
③免疫组化检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：i.细胞接种；ii.固定：弃掉培养基4％的多聚甲醛4℃固定细胞30min，0.01M PBS洗3次；iii.透化：0.2％的Tritonx-100室温透化30min，0.01M PBS洗3次；iv.封闭：10％的山羊血清室温封闭30min，不洗；v.孵育一抗：4℃孵育过夜；0.01M PBS洗3次；vi.孵育二抗：加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:100)37℃闭光孵育30min；0.01M PBS洗3次；vii.DAPI复染细胞核，激光共聚焦显微镜下观察，拍照。
④病毒滴度的测定：收集细胞，经10％甲醛固定和0.5％结晶紫染色，倒置显微镜下进行空斑计数。空斑定量检测细胞内、外病毒滴度变化，病毒负荷量按下列公式计算：感染性病毒量(PFU/mL)＝(蚀斑均数×病毒稀释倍数)/病毒接种量(mL)，再取log值。
2.3.1.3共培养检测RIG-I分子介导抗病毒作用
使用人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理细胞16h，然后和HCMV感染的星形胶质细胞或神经元共培养，处理细胞在transwell共培养小室的下面，未处理的星形胶质细胞或神经元在transwell共培养小室的上面，共培养48h后，检测共培养小室上面的HCMV感染的病毒复制，进一步证实RIG-I介导的抗病毒作用；另外，收集人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理细胞上清(SN)加到HCMV感染的星形胶质细胞或神经元的培养基中，检测病毒复制，进一步证实RIG-I介导的抗病毒作用。将dsDNA poly(dAT:dAT)刺激的培养上清(SD)，dsDNApoly(dAT:dAT)5％，10％，20％vol/vol)加入到HCMV感染的星形胶质细胞或神经元中，48h后检测病毒复制，更充分地证实RIG-I介导的抗病毒作用。
2.3.2RIG-I参与合成抗病毒分子I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG
2.3.2.1HCMV感染细胞I型、III型IFN和ISG表达的检测
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNApoly(dAT:dAT)与人胚胎星形胶质细胞RIG-I作用后，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting、免疫组化、ELISA方法检测I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG的表达。RT-qPCR、Western blotting、免疫组化操作方法同前。ELISA方法如下：
接种人星形胶质细胞于96孔板，HCMV(MOI＝(1.0～5.0)感染人星形胶质细胞，同时设立阴性对照组，感染不同时间后，取细胞培养上清液，每孔取50uL，每个时间点取20孔，然后用0.45nm的微孔滤膜过滤，无菌EP管收集，-86℃保存，备用。采用ELISA法检测培养上清液中星形胶质细胞分泌的I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG的含量。每个检测重复3次。实验步骤依据说明书(Quantikine R&D systems Europe Ltd,UK)操作定量化。
2.3.2.2检测I型和III型是否参与ISG的表达
通过IFNAR2中和抗体和IFNλ胞外段抗体IL-10Rβ处理HCMV感染细胞，检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达、I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG表达。
i.接种人胚胎星形胶质细胞于6孔板，5×105/孔，同时设定对照组。
ii.第二天，IFNAR2中和抗体或IL-10Rβ处理细胞后，HCMV感染细胞，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting、免疫组化(操作方法同前)检测I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG的表达。
本发明具有如下优点：
(1)HCMV对发育中的脑组织有特殊亲噬性，神经发育的重要时期在孕早期，这一时期感染HCMV容易导致神经损伤，由于HCMV的种属特异性，目前国内外无动物模型用于试验。本项目采用HCMV感染的原代人孕早期星形胶质细胞为模型进行研究，人孕早期星形胶质细胞比其他细胞株更接近体内细胞的特性，实验结果更具说服力；
(2)本发明首次发现HCMV感染星形胶质细胞RIG-I通路分子表达上调的现象，国内外首次研究模式识别受体RIG-I介导的HCMV感染星形胶质细胞的抗病毒效应，揭示RIG-I通路在HCMV感染的神经星形胶质细胞固有免疫抗病毒作用的重要意义，具有重要的临床应用价值。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用。
2.按照权利要求1所述RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用，其特征在于：所述RIG-I通路介导HCMV感染的神经星形胶质细胞抗病毒作用。
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