CN108795892B - 一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法 - Google Patents

一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶分离技术技术领域，公开了一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其包括如下步骤：步骤1）培养黑曲霉，步骤2）制备发酵液，步骤3）制备粗酶液，步骤4）分离纯化。本发明获得的产品酶活高，并且收率可达到50％以上。

Description

一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法
技术领域
本发明属于酶分离技术领域，具体涉及一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）在分子氧存在下，专一催化β-D-葡萄糖氧化成1，5-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，而后葡萄糖酸内酯又自发和水结合产生葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶是酶技术领域中一种非常重要的酶，被广泛应用于食品加工、发酵工业、医学检测。
葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，完全不溶于***、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等。50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀，一般制品中含有过氧化氢酶。分子量为150000左右，每克分子酶含2克分子FAD。酶的最大光吸收波长为377nm 和455nm。在紫外光下无荧光，但是在热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。固体酶制剂在0℃下保存至少稳定两年，在-15℃下稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的pH 值范围为3-4，最适pH值为5，如果没有葡萄糖等保护剂的存在，pH 值大于8 或小于3，葡萄糖氧化酶将迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用温度为30-60℃，该酶对EDTA、KCN 及NaF不受阻抑，但HgCl2、AgCl、对氯汞苯甲酸和苯肼对酶有阻抑。在有氧情况下，葡萄糖氧化酶可以从某***中除去葡萄糖，在过量葡萄糖的存在下可除去氧。基于此原理，葡萄糖氧化酶能广泛应用于各类食品制造，器械除氧防锈等方面。如：蛋品加工中脱糖，防止褐变；果汁、啤酒、食品罐头等的除氧；用于防止虾肉、干鲜食品的氧化；生产葡萄糖酸等。另外，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性，它也被用于一些复杂生化体系中的葡萄糖的定量测定。如：血液中葡萄糖含量测定；制成糖尿试纸用于临床诊断。
葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，由于在动植物体中提取有一定局限性，从酶量来说也不丰富，而霉菌在一定条件下，产生葡萄糖氧化酶的能力强，便于大规模生产葡萄糖氧化酶的主要霉菌来源于霉菌。酶的生产方法可分为提取法、发酵法以及化学合成法。发酵法是20 世纪50 年代以来酶生产的主要方法，是利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶。
葡萄糖氧化酶的生产一般都采用霉菌属的菌株作生产菌。菌株在不同条件下产酶效率差距较大，选择产酶菌株在适合该菌株产酶条件下进行发酵是需要研究的重点。文献“点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育，河北省科学学院学报2006年”报道，以产葡萄糖氧化酶的点青霉8312为出发菌株，经紫外线诱变处理，初筛、复筛得到了一株高产葡萄糖氧化酶的菌株，连续12次对其传代试验，该突变株遗传性状稳定，摇瓶产酶水平达到55.7U/mL，比出发株(36.2U/mL)提高了53.9%。文献“产葡萄糖氧化酶黑曲霉的诱变选育及葡萄糖酸钙发酵条件的研究，食品工业科技2010年”公开了采用紫外线和钴60放射线照射对产葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株进行诱变,以含有2-脱氧-D-葡萄糖的选择培养基进行筛选,共获得7个耐受菌株,其中产酶活性最大的U-69菌株的葡萄糖氧化酶活力是出发菌株的2.5倍。研究了U-69菌株合成葡萄糖酸钙的发酵条件,结果显示,最佳发酵条件为葡萄糖150g/L，碳酸钙400g/L,硫酸铵3～4g/L,pH5.5，250mL三角瓶装30mL发酵液,接种量10%，30～34℃发酵18h。在葡萄糖氧化酶发酵生产中，一般采用葡萄糖作为碳源，一方面作为菌体利用的碳源，酶合成的诱导物，另一方面其分解代谢物又能阻遏其生物合成，因此，控制发酵培养基中葡萄糖浓度对菌株发酵产酶影响很大。申请人前期的研究成果“一种利用微生物发酵制备葡萄糖氧化酶的方法”，以黑曲霉为出发菌株,干酪乳杆菌协同发酵，并且对培养条件进行优化，提高了酶活力，缩短了发酵时间。
发明内容
在前序研究的基础上，本发明继续对发酵液进行分离纯化，以获得纯度更高的酶制剂。
本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：
一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其包括如下步骤：步骤1）培养黑曲霉，步骤2）制备发酵液，步骤3）制备粗酶液，步骤4）分离纯化。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
步骤1）培养黑曲霉：黑曲霉种子液按照6-8%的接种量含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养温度为30-34℃，罐压为0.02-0.03MPa，风量为500-600L/h，培养时间为30-40h；
步骤2）制备发酵液：将干酪乳杆菌种子液按照8-10%的接种量接入到发酵罐中，再添加甲醇，继续培养20-30h，通过流加氨水控制pH为7.2-7.8，得到发酵液；
步骤3）制备粗酶液：以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提2h，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；
步骤4）分离纯化：取粗酶液，过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，收集洗脱液，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得。
优选地，
所述甲醇的添加量为0.1-0.2wt%。
优选地，
所述离心的转速为2000rpm，时间为5min。
优选地，
所述黑曲霉种子液的制备方法为：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为（1-2）×108CFU/mL的黑曲霉种子液。
优选地，
所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L。
优选地，
所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L。
优选地，
所述干酪乳杆菌种子液的制备方法为：将干酪乳杆菌接入到MRS琼脂培养基中进行培养，然后接种到MRS液体培养基中进行种子培养，获得密度为（3-5）×108CFU/mL的干酪乳杆菌种子液。
本发明技术方案通过对现有技术的改进，带来一系列的有益效果，主要包括以下几个方面：
本发明通过两种菌株混合发酵来制备葡萄糖氧化酶，纯度较高，并且收率可达到50％以上；
高浓度碳源有利于菌体增殖，但是会阻遏产酶，可能影响酶向细胞外渗透，也可能是酸浓度使蛋白变性，影响了酶活力表达；本发明首先采用高浓度的碳源对黑曲霉进行增殖培养，待培养到30-40h时，菌体生物量增幅明显，此时产酶能力开始提高，但是高浓度的葡萄糖会抑制产酶效果，接种干酪乳杆菌可以利用葡萄糖，与黑曲霉产生竞争，从而提高产酶能力；
黑曲霉产生的葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖代谢为葡萄糖酸，随着代谢产物的浓度增加，会对葡萄糖氧化酶的合成产生反馈抑制作用，干酪乳杆菌可以利用葡萄糖酸作为碳源，有效解除了抑制作用；
本发明在第二阶段培养中添加低浓度的甲醇可以增加细胞膜的通透性，提高分泌水平；合适的pH和钙离子可以影响酶合成，提高酶活力。本发明通过单因子试验对上述因素进行了优化，确定最佳的产酶条件。
本发明菌株选择：实施方式中具体使用的菌株为黑曲霉ATCC20611、干酪乳杆菌ATCC334；也可以使用同一种属中功能类似的其他菌株。
附图说明
图1：甲醇浓度对酶活力的影响：
图2：pH对酶活力的影响；
图3：第二阶段培养时间对酶活力的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其包括如下步骤：
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为1×108CFU/mL的黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L；
将干酪乳杆菌接入到MRS琼脂培养基中进行培养，然后接种到MRS液体培养基中进行种子培养，获得密度为3×108CFU/mL的干酪乳杆菌种子液；
黑曲霉种子液按照8%的接种量含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养温度为32℃，罐压为0.02MPa，风量为500L/h，培养时间为35h；
将干酪乳杆菌种子液按照10%的接种量接入到发酵罐中，再添加0.1wt%的甲醇，继续培养25h，通过流加氨水控制pH为7.5，得到发酵液，
以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提2h，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用0.5mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，线性梯度洗脱，分部收集，合并，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，用0.05mol/L pH7.1 的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得纯品。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆30g/L，碳酸钙20g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素0.2g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，pH值7.0。
实施例2
一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其包括如下步骤：
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为2×108CFU/mL的黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L；
将干酪乳杆菌接入到MRS琼脂培养基中进行培养，然后接种到MRS液体培养基中进行种子培养，获得密度为5×108CFU/mL的干酪乳杆菌种子液；
第一阶段培养：黑曲霉种子液按照6%的接种量含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养温度为30℃，罐压为0.03MPa，风量为600L/h，培养时间为40h；
第二阶段培养：将干酪乳杆菌种子液按照8%的接种量接入到发酵罐中，再添加0.15wt%的甲醇，继续培养30h，通过流加氨水控制pH为7.8，得到发酵液以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提2h，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；用0.05mol/LpH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用0.5mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，线性梯度洗脱，分部收集，合并，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆30g/L，碳酸钙20g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素0.2g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，pH值7.0。
对比例1
一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其包括如下步骤：
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为1×108CFU/mL的黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L；
黑曲霉种子液按照8%的接种量含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养温度为33℃，罐压为0.02MPa，风量为600L/h，培养时间为60h，得到发酵液，以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提2h，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用0.5mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，线性梯度洗脱，分部收集，合并，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，用0.05mol/L pH7.1 的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆30g/L，碳酸钙20g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素0.2g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，pH值7.0。
对比例2
一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其包括如下步骤：
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为1×108CFU/mL的黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L；
将干酪乳杆菌接入到MRS琼脂培养基中进行培养，然后接种到MRS液体培养基中进行种子培养，获得密度为3×108CFU/mL的干酪乳杆菌种子液；
黑曲霉种子液按照8%的接种量、干酪乳杆菌种子液按照10%的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，添加0.1wt%的甲醇，继续培养25h，通过流加氨水控制pH为7.5，培养温度为32℃，罐压为0.02MPa，风量为500L/h，培养时间为60h，得到发酵液，以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提2h，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液平衡DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用0.5mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，线性梯度洗脱，分部收集，合并，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，用0.05mol/LpH7.1 的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱，流速0.3mL/min，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得。
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆30g/L，碳酸钙20g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素0.2g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，pH值7.0。
实施例3
以实施例1、对比例1-2为例，检测了发酵35h以及发酵结束后，发酵液中葡萄糖的浓度，发酵结束后葡萄糖酸的浓度以及菌体生物量，具体结果见表1：
表1
组别 35h葡萄糖浓度g/L 结束后葡萄糖浓度g/L 结束后葡萄糖酸浓度g/L 菌体生物量g/L
实施例1 17.8 0.6 0.1 87.1
对比例1 18.3 5.7 4.3 51.4
对比例2 11.2 1.3 0.7 69.3
如表1所示，实施例1采用先后接种的方式，发酵结束后，生物量最高，而葡萄糖酸的浓度最低；黑曲霉产生的葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖代谢为葡萄糖酸，随着代谢产物的浓度增加，会对葡萄糖氧化酶的合成产生反馈抑制作用，干酪乳杆菌可以利用葡萄糖酸作为碳源，有效解除了抑制作用，从而提高产酶效率。
实施例4
本发明所得粗酶液的酶活测试：
采用分光光度计测定（460nm吸光值）。具体酶活数据见表2：
表2
组别 实施例1 实施例2 对比例1 对比例2
酶活U/ml 231 249 92 138
实施例5
甲醇浓度、pH以及第二阶段培养时间对产酶效率的影响：
分别设置甲醇浓度wt%为0，0.05,0.1,0.15.0.2,0.25,0.3，以实施例1为例，检测产酶活性，如图1所示，甲醇可以增加细胞膜的通透性，提高酶解代谢物的分泌水平，从而提高产酶活性，随着甲醇浓度的增加，甲醇有利于产酶活性迅速增加，0.1wt%后，增幅缓慢，随着浓度的增加，活性有所降低，可能是因为浓度过高容易产生细胞毒性。
分别设置pH为5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5六个梯度，以实施例1为例，检测产酶活性，如图2所示，pH维持在7-8最有利于酶活力的提高。如图3所示，第二阶段的培养时间选择25-30h可以达到较高的酶活力，随着时间的进一步增加，酶活没有提升，反而会有所降低，可能是培养液中的养分含量过低，无法支持菌株继续增殖，造成部分菌株活力降低和自溶；缩短了培养时间，节约了成本。
实施例6
以实施例1为例，选用粗酶液1000ml，最终获得7.1mg纯品，粗酶液和纯品的各项指标检测如下：
表3
指标 总活力（万U） 酶活力回收率％
粗酶液 23.1 100％
纯品 11.9 55.6
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种制备、分离和纯化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）培养黑曲霉：黑曲霉种子液按照6-8%的接种量含有发酵培养基的发酵罐中进行培养，培养温度为30-34℃，罐压为0.02-0.03MPa，风量为500-600L/h，培养时间为30-40h；
步骤2）制备发酵液：将干酪乳杆菌种子液按照8-10%的接种量接入到发酵罐中，再添加甲醇，继续培养20-30h，通过流加氨水控制pH为7.2-7.8，得到发酵液；所述甲醇的添加量为0.1-0.2wt%；
步骤3）制备粗酶液：以5000rpm离心5min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀研磨粉碎，再添加五倍重量的0.1mol/L的磷酸缓冲液浸提，4℃浸提，完成后4℃、12000rpm离心20min，取上清液，即为粗酶液；
步骤4）分离纯化：取粗酶液，过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，收集洗脱液，然后过Superdex-200 凝胶过滤层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为2000rpm，时间为5min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浸提时间为2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉种子液的制备方法为：将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，然后接种到种子培养基进行培养，获得密度为（1-2）×108CFU/mL的黑曲霉种子液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组分均为：蔗糖20g/L，酵母膏10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.02g/L，一水硫酸锰0.01g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干酪乳杆菌种子液的制备方法为：将干酪乳杆菌接入到MRS琼脂培养基中进行培养，然后接种到MRS液体培养基中进行种子培养，获得密度为（3-5）×108CFU/mL的干酪乳杆菌种子液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析柱为DEAE-Sepharose离子交换层析柱，所述凝胶过滤层析柱为Superdex-200 凝胶过滤层析柱。
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