CN108795882A - 调节戊型肝炎病毒组装和衣壳蛋白orf2稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过HDAC6抑制剂改善戊型肝炎病毒生产、HEV病毒复制、病毒ORF2蛋白稳定性、和HEV病毒样颗粒形成的方法。本发明还涉及用于戊型肝炎病毒、病毒样颗粒和ORF2蛋白生产的细胞培养***、和细胞培养物。此外，本发明也涉及通过增加细胞中HDAC6的表达和/或活性，治疗HEV病毒感染的方法。

Description

调节戊型肝炎病毒组装和衣壳蛋白ORF2稳定性的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和病毒学领域。具体地，本发明涉及乙酰化戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)衣壳蛋白ORF2，和调节戊型肝炎病毒ORF2多肽的乙酰化水平的方法。本发明还涉及HDAC6的抑制剂在改善ORF2多肽稳定性、HEV病毒形成、HEV病毒复制和HEV病毒样颗粒形成中的用途。本发明也涉及通过改变细胞中HEV ORF2的乙酰化水平来治疗HEV病毒感染的方法。

背景技术

戊型肝炎病毒(HEV)在全球范围内感染人和动物，引起肠道传播的病毒性肝炎，在孕妇中致死率达到25％。1989年报道了来自肠道传播的非A非B肝炎患者的戊型肝炎病毒序列，该序列类似于从猪、兔、大鼠、鹿和野猪中分离的序列。HEV的衣壳蛋白ORF2是该病毒的主要抗原，特异性结合HEV基因组RNA的5’末端，在病毒感染及组装和病毒基因组完整性的维持上具有重要作用。然而，对于HEV感染细胞中ORF2多肽稳定性和病毒包涵体(IB)形成的调节，目前所知甚少。

戊型肝炎病毒(HEV)，作为无包膜病毒，含有7.2kb单股正链RNA，其编码三种蛋白ORF1，ORF2和ORF3(1)。现存在四种主要的HEV基因型，每年在全球引起大约2000万人感染，包括3.3百万症状性戊型肝炎病例和56600戊型肝炎引起的死亡(2,3)。1和2基因型HEV主要感染人并在发展中国家造成流行性爆发，基因型3和4在发展中和发达国家中具有人畜共患性。

ORF2是HEV的主要抗原，包含660个氨基酸残基，在病毒感染中起主要作用，可诱导宿主免疫应答(5)。截短的ORF2(aa112-660)片段能够自组装成病毒样颗粒(VLP)(6)。ORF2VLP可与天然病毒诱导相同免疫原性途径，已经在研究和疫苗生产中用于模拟HEV(7,8)。同时，HEV ORF2也能够结合HEV基因组RNA的5’末端，在病毒组装和基因组完整性的维持上起作用(9)。ORF2的N端信号序列在内质网(ER)中共翻译，并在ER中实现N-连接糖基化修饰(10)。此外，ORF2的C端52个氨基酸残基也参与HEV包装和衣壳颗粒的稳定化(11)。尽管ORF2在HEV生命周期中非常重要，但是其在宿主中如何被调节仍未明。

赖氨酸乙酰化是一种重要的翻译后修饰(PTM)，由赖氨酸乙酰转移酶动态催化，并由赖氨酸去乙酰化酶去除。赖氨酸的乙酰化涉及病毒生命周期的多种关键事件，包括染色质重塑、基因表达和蛋白质稳定性调节，细胞内运输和病毒的裂解-潜伏转化(13)。HDAC6是IIb类HDAC酶家族成员，对例如α-微管蛋白,HSP90和p300等非组蛋白进行去乙酰化(14-17)。HDAC6在调节细胞形态、粘着和迁移、错误折叠蛋白的降解和应激反应、肿瘤细胞侵袭、血管发生、以及药物抗性中有重要作用(18-30)。近来的研究显示，HDAC6也在病毒感染和发病机理中起重要作用(13)。然而，HDAC6似乎具有双重作用(13)。一方面，HDAC6参与抗病毒感染的宿主防御(31-35)。另一方面，HDAC6被病毒利用，帮助病毒进入宿主细胞或病毒RNA合成(36-38)。迄今为止，病毒中仅HIV-1Tat蛋白已经鉴定为HDAC6底物(35)。

考虑到目前戊型肝炎对人类健康的严重危害且近年来发病率呈迅速上升趋势，因此，目前仍需要改善HEV病毒疫苗生产和治疗HEV病毒感染的新方法。经过深入的研究，本发明人发现，HEV利用宿主的翻译后修饰***来维持HEV衣壳蛋白ORF2稳定性和包涵体(IB)形成的新机制。基于此发现，本发明人提出了通过靶向调节宿主细胞中ORF2的乙酰化水平来改善HEV疫苗生产和治疗HEV感染的新方法和新组合物。

发明概述

因此，在一方面，本发明提供了一种改善HEV病毒、病毒样颗粒(VLP)或衣壳蛋白ORF2生产的方法和细胞培养***，包括在生产细胞中调节HEV衣壳蛋白ORF2的K411位乙酰化水平。在一个实施方案中，生产HEV病毒。在进一步实施方案中，生产细胞是能够用于HEV病毒体外培养和生产的哺乳动物细胞，优选地A549细胞和PLC/PRF/5细胞。在进一步的实施方案中，所述方法包括步骤：用HEV病毒感染所述细胞。在另一实施方案中，生产HEV病毒样颗粒(VLP)或ORF2多肽。在进一步的实施方案中，生产细胞是包含ORF2编码核酸的细胞，例如哺乳动物细胞(包括但不限于HeLa细胞和293T细胞)、昆虫细胞(包括但不限于sf9细胞)。在本发明的此方面，优选地，调节ORF2乙酰化水平是增强ORF2乙酰化水平。在一个实施方案中，调节ORF2乙酰化水平通过抑制细胞中HDAC6表达和/或活性来实现。在进一步实施方案中，使用HDAC6RNAi分子(如siRNA)敲低细胞中HDAC6表达水平。在进一步实施方案中，使用HDAC6化学抑制剂，降低细胞中HDAC6活性。在另一实施方案中，通过调节ORF2的K411位乙酰化水平，增加细胞中ORF2的稳定性，和/或增加细胞中ORF2的量，尤其是ORF2多聚体的量。在另一实施方案中，通过调节ORF2的K411位乙酰化水平，增加细胞中病毒的复制。在另一实施方案中，通过调节ORF2的K411位乙酰化水平，增加细胞中VLP的组装和/或VLP产量。

在另一方面，本发明也提供了分离的K411乙酰化HEV ORF2多肽。所述ORF2多肽包含HEV基因型1-4野生型ORF2序列，或其同源物或变体。在再一方面中，本发明提供增加K411乙酰化HEV ORF2多肽生产的方法和细胞培养物，其特征在于，抑制细胞中HDAC6的表达和/或活性，其中相对于未抑制HDAC6表达和/或活性的对照细胞，K411乙酰化ORF2多肽在细胞中的产量增加。在一个实施方案中，所述细胞是HDAC6敲低的细胞。在另一个实施方案中，向细胞使用HDAC6化学抑制剂。在一个实施方案中，本发明的方法还包括：收集产生的乙酰化HEV ORF2多肽或该K411乙酰化HEV ORF2多肽与未乙酰化ORF2的混合物，用于制备免疫组合物或疫苗或HEV病毒样颗粒。在一个实施方案中，本发明也提供了该乙酰化HEV ORF2多肽用于促进ORF2多聚化和/或病毒或病毒样颗粒形成的用途。

在再一方面，本发明提供了治疗HEV感染的方法，包括向感染HEV的个体施用HEVORF2多肽K411乙酰化调节剂。在一个实施方案中，所述调节剂降低ORF2多肽K411的乙酰化水平。在进一步的实施方案中，所述调节剂增加细胞中HDAC6的表达和/活性。在进一步实施方案中，所述调节剂是HDAC6表达核酸。

附图简述

图1:HEV衣壳蛋白ORF2在保守残基K411位的乙酰化。

(A)表达GFP-1-ORF2(112-660)或GFP-4-ORF2(112-660)的293T细胞用GFP抗体免疫沉淀，并通过考马斯蓝染色。

(B-D)质谱鉴定K411位置的乙酰化。通过质谱分析了293T细胞中表达的GFP-1-ORF2(112-660)(图C)和GFP-4-ORF2(112-660)蛋白(图D)。EPTVK⁴¹¹LYTSVEN肽在不同HEV基因型之间是保守的(图1B)。

(E)在293T细胞中通过免疫印迹确定GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2的乙酰化。通过抗GFP抗体免疫沉淀在293T细胞中过表达的GFP-1-ORF2(112-660),GFP-4-ORF2(112-660)或GFP，之后用抗乙酰赖氨酸(乙酰基-Lys)抗体(左侧图)和抗GFP抗体(右侧图)进行western印迹检测。

(F)免疫印迹显示，K411是GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)的主要乙酰化位点。在293T细胞中过表达GFP-1-ORF2^K411R(112-660),GFP-4-ORF2^K411R(112-660)和野生型质粒。在使用抗GFP抗体免疫沉淀后，通过抗乙酰赖氨酸抗体(上图)和抗GFP抗体(下图)确定免疫沉淀物。WT：野生型；K411R：K411R突变体。

图2：ORF2的K411R突变阻碍HEV包涵体形成。

(A)HeLa细胞中GFP-1-ORF2(112-660)野生型(上方图)和K411R突变体(下方图)的代表性免疫荧光图。GFP(绿色)和免疫荧光染色α-微管蛋白(红色)。用DAPI染色DNA(蓝色)。注意到，GFP-1-ORF2定位于病毒包涵体和细胞质中。(比例尺：10μm)。

(B)对GFP-4-ORF2(112-660)进行与A中所述相同的实验。

(C)对GFP-1-ORF2(1-660),GFP-1-ORF2(112-660),GFP-1-ORF2^K411R(112-660)进行与A中所述相同的实验。

(D)固定瞬时表达HA-标记的或Flag标记的1-ORF2(112-660)的HeLa细胞，并用抗HA或Flag抗体(绿色)、抗α-微管蛋白抗体(红色)、和DAPI(蓝色)进行免疫染色。(比例尺：10μm)。

(E)在转染GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)的细胞中统计学分析含有病毒包涵体的细胞。进行了三个独立实验，n＝200个细胞/组。Spot细胞：在细胞质中具有包涵体的细胞数(GFP点数>3/细胞)

(F)在GFP-1-ORF2(1-660)全长分子,GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-1-ORF2^K411R(112-660)转染的细胞中统计学分析含有包涵体的细胞。进行了三个独立实验，n＝200个细胞/组；**p<0.01。数据为平均值±SD，使用Student t检验。Spot细胞：在细胞质中具有包涵体的细胞数(GFP点数>3/细胞)。

图3：动态评估K411R对包涵体形成的影响。

(A-B)对HeLa细胞中的GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-1-ORF2^K411R(112-660)的活细胞成像。

GFP-1-ORF2质粒与RFP-标记的组蛋白2B质粒一起转染。转染12小时后，分别获取沿着活细胞z-轴的5层图像，并通过，合并图层得到最终图像。注意到，病毒包涵体逐渐出现在野生型组中，并且开始得早。而GFP-1-ORF2^K411R(112-660)在该时程中不能有效地形成病毒包涵体。

图4：HDAC6使ORF2去乙酰化并影响IB形成。

(A)Flag-HDAC6与GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2相互作用。用GFP-ORF2(112-660)质粒和Flag质粒或Flag-HDAC6质粒转染293T细胞，并用Flag抗体免疫沉淀，之后用GFP抗体和Flag抗体进行westen印迹。也显示了细胞裂解物的westen印迹结果。图中，“Flag”表示转染Flag质粒；“Flag-HDAC”表示转染Flag-HDAC6质粒；“1-ORF2”表示转染GFP-1-ORF2(112-660)质粒；“4-ORF2”表示转染GFP-4-ORF2(112-660)质粒。

(B)GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2与内源性HDAC6相互作用。用GFP,GFP-1-ORF2(112-660)或GFP-4-ORF2(112-660)质粒转染293T细胞，并用兔GFP抗体进行免疫沉淀，用HDAC6特异性抗体和小鼠GFP抗体进行western印迹。也显示了细胞裂解物的westen印迹结果。

(C)HDAC6敲低增加了GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2的乙酰化。在HDAC6敲低293T细胞中表达GFP-1-ORF2(112-660),GFP-4-ORF2(112-660)质粒。使用GFP抗体进行免疫沉淀后，使用抗乙酰赖氨酸抗体通过western印迹检测乙酰化ORF2。也显示了，使用抗HDAC6抗体、抗GAPDH抗体和抗GFP抗体在细胞裂解物和免疫沉淀物上进行的western印迹检测。图中“con”表示转染非特异性siRNA作为对照”；“HDAC6i”表示转染HDAC6siRNA。

(D)免疫印迹显示，GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2的乙酰化随着TBSA处理而增加。在293T细胞中过表达GFP-1-ORF2(112-660),GFP-4-ORF2(112-660)质粒，用DMSO或TBSA处理。使用GFP抗体进行免疫沉淀后，通过抗乙酰赖氨酸抗体(上图)和抗GFP抗体(下图)检测免疫沉淀物。

(E)在HDAC6抑制剂处理下GFP-1-ORF2(112-660)的代表性免疫荧光图。加入Trichostatin A(TSA,0.5μM)或Tubastatin A(TBSA,3μM)，处理8小时。

(F)在HDAC6抑制剂处理下GFP-4-ORF2(112-660)的代表性免疫荧光图。加入Trichostatin A(TSA,0.5μM)或Tubastatin A(TBSA,3μM)，处理8小时。

(G)在以DMSO,TSA或TBSA处理的GFP-1-ORF2(112-660)转染细胞中，统计学分析含有10个以上病毒包涵体的细胞。进行三次独立实验，n＝200个细胞/组。**p<0.01,***p<0.001。数据为平均值±SD,使用Student t检验。

(H)在以DMSO,TSA或TBSA处理的GFP-4-ORF2(112-660)转染细胞中，统计学分析含有10个以上病毒包涵体的细胞。进行三次独立实验，n＝200个细胞/组。**p<0.01,***p<0.001。数据为平均值±SD,使用Student t检验。

图5：抑制HDAC6促进HEV ORF2的稳定性。

(A)HDAC6RNAi上调了HEV ORF2多肽水平。用HDAC6siRNA或对照siRNA(Santacruz)转染293T细胞48小时，并用GFP-1-ORF2或GFP-4-ORF2(112-660)转染24小时。收集细胞裂解物，并使用抗HDAC6抗体、抗GFP抗体和抗GAPDH抗体通过western印迹检测。

(B)HEV ORF2的不能乙酰化的突变体通过蛋白酶体依赖途径降低了ORF2的蛋白质稳定性。用GFP-1-ORF2(112-660)WT(野生型),GFP-1-ORF2^K411R(112-660),GFP-4-ORF2(112-660)WT(野生型),和GFP-4-ORF2^K411R(112-660)转染293T细胞24小时。收集细胞裂解物，并用抗GFP抗体和抗GAPDH抗体通过western印迹检测。加入MG132，处理4小时。注意到，ORF2的不能乙酰化突变体的快速降解可以通过加入蛋白酶体抑制剂MG132来挽救。图中显示了不同western印迹显影曝光时间得到的结果。

(C)Tubastatin A增加了GFP-ORF2多肽稳定性。用GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)转染293T细胞24小时。加入Tubastatin A(TBSA,3μM)，处理8小时。在非还原PAGE中使用的样品浓度是还原性SDS-PAGE中使用的两倍，但来自相同来源。

图6：ORF2K411的乙酰化可以调节ORF2的稳定性和HEV IB形成。

(A)Tubastatin A增加了PLC/PRF/5细胞培养物上清中的HEV抗原水平。在HEV感染3周后，将DMSO，Trichostatin A(TSA,0.5μM)或Tubastatin A(TBSA,3μM)加入PLC/PRF/5细胞，3天后收集细胞培养物上清液，通过ELISA检测HEV抗原。***p<0.001。数据是平均值±SD，使用Student t检验。图中，“HEV Ag S/Co”为ELISA检测时使用的单位，表示：样品OD值/cut off检测线数值。

(B)在非变性PAGE中考马斯兰染色检测sf9细胞中表达的ORF2VLP，并通过质谱分析。

(C-E)TSA,TBSA和CAY改善ORF2在sf9细胞中的表达。加入DMSO,Trichostatin A(TSA,1μM),Tubastatin A(TBSA,6μM)或CAY10603(CAY,0.2μM)，处理5天。收集sf9细胞培养物上清液，并40000rpm超离心2小时，通过ELISA检测全细胞培养物上清液和游离级分和VLP级分。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。数据是平均值±SD，使用Student t检验。

(F)透射电子显微镜检测在以TBSA或DMSO处理的细胞中野生型(WT)0GFP-1-ORF2,GFP-1-ORF2，以及突变体GFP-1-ORF2^K411R。红色圈指出VLP区域。

(G)透射电子显微镜检测在以TBSA或DMSO处理的细胞中野生型(WT)GFP-4-ORF2,GFP-4-ORF2,以及突变体GFP-4-ORF2^K411R。红色圈指出VLP区域。

图7：1-ORF和4-ORF及其截短片段和HDAC6的序列。

图8：A549细胞中HEV ORF2的代表性免疫荧光图像。A549细胞中GFP-1-ORF2(112-660)(绿色)野生型和K411R突变体在加或不加TSA处理下的代表性免疫荧光图像。DNA用DAPI染色(蓝色)。注意到，在TSA处理时，由于ORF2的去乙酰化被抑制，对于野生型ORF2，细胞中形成的包涵体数量增加。相反，在TSA处理下，ORF2突变体不受影响，仍主要均一地分散在细胞质中。

图9：统计学分析GFP-ORF2转染的spot活细胞的比例。计算GFP-1-ORF2(112-660),GFP-1-ORF2^K411R(112-660),GFP-4-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2^K411R(112-660)转染的spotHeLa细胞。进行三个独立实验，n＝200个细胞/组；**p<0.01,***p<0.001。数据为平均值±SD,使用Student t检验。Spot细胞：在细胞质中具有包涵体的细胞(GFP点数>3/细胞)。

图10：HeLa细胞中GFP-4-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)K411R的活细胞成像。(A-B)HeLa细胞中GFP-4-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2^K411R(112-660)的活细胞成像。GFP-4-ORF2质粒和RFP-标记的组蛋白2B质粒一起转染。转染后12小时，沿着活细胞z-轴获取5层图像，合并图层获得最终图像。注意到，病毒包涵体逐渐出现在野生型组中，开始得早。GFP-4-ORF2^K411R(112-660)在时程中未能有效形成病毒包涵体。

图11：用GFP-1-ORF2转染24小时后用DMSO,TBSA或TSA处理的293T细胞。293T细胞中转染GFP-1-ORF2质粒，加入DMSO，Trichostatin A(TSA,0.5μM)或Tubastatin A(TBSA,3μM)，处理8小时，于显微镜下观察。结果显示，Trichostatin A或Tubastatin A处理组细胞状态与DMSO对照组相比无显著差别。

图12：用TSA处理，上调GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)蛋白水平。

图13：GFP-1-ORF2的降解依赖于蛋白酶体途径。用cycloheximide(CHX,10μM)和MG132(50μM)处理转染了GFP-1-ORF2的293T细胞0-9小时。免疫印迹检测GFP-1-OFR2和肌动蛋白的量。CHX和DMSO处理组中ORF2多肽随药物作用时间延长，蛋白量降低。CHX和MG132处理组中ORF2多肽随药物作用时间增加，蛋白量无显著变化。

发明详述

本发明人发现，在基因型1和4的戊型肝炎病毒(HEV)中，ORF2在保守氨基酸残基411位被乙酰化(实施例1)。对野生型和乙酰化突变ORF2的延时活细胞成像，表明K411乙酰化在戊型肝炎包涵体(IB)自组装中起关键作用(实施例2和3)。并且，本发明人发现，K411乙酰化可以增强HEV ORF2多肽对蛋白酶体依赖性降解的抵抗性，增加HEV ORF2多肽的稳定性(实施例5)。进一步地，本发明人证实，HDAC6(组蛋白去乙酰化酶6)催化K411位乙酰化的HEVORF2的脱乙酰化(实施例4)，负面调节病毒包涵体(IB)形成(实施例4)和ORF2多肽稳定性(实施例5)。并且，本发明人证实，HDAC6的抑制可以增加HEV病毒复制和病毒样颗粒的形成(实施例6)。本发明人的这些发现提供了直接的证据，证实HEV病毒利用宿主翻译后修饰机制以维持衣壳蛋白ORF2的稳定性并增强病毒包涵体形成的新机制，提示HDAC6发挥抗HEV感染的宿主防御机制。

由此，基于上述发现，本发明人提出了：

(a)分离的K411乙酰化ORF2多肽及其用于促进病毒或病毒样颗粒组装的用途。

(b)通过调节ORF2在K411位的乙酰化，改善戊型肝炎病毒、病毒样颗粒(VLP)和ORF2多肽生产的方法；和改善HEV OFR2蛋白稳定性的方法；

(c)ORF2的K411乙酰化水平调节剂，尤其是HDAC6抑制剂，在增加细胞中HEV病毒复制和病毒样颗粒形成和ORF2稳定性中的用途；

(d)一种新的HEV治疗方法，其中包括将调节HEV ORF2的K411乙酰化的药物和/或手段(例如，减少或抑制ORF2乙酰化，或增强HDAC6对ORF2的去乙酰化)施用于HEV患者，例如病重患者和慢性HEV感染患者，或感染HEV的非人动物(如施用于猪，以减少所述动物向环境中排出的HEV病毒量)。

在上述任一方面，优选HEV病毒为1-4基因型，更优选基因型1或4的HEV病毒。优选地，ORF2多肽包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN，并在肽的保守残基K411位置乙酰化。优选地，在用于生产的细胞中，通过抑制HDAC6，增加ORF2在K411的乙酰化水平。不受理论的约束，ORF2的K411乙酰化可以利于ORF2多聚化、和/或增加HEV ORF2多肽对抗蛋白酶体降解途径的抗性和ORF2的稳定性。不受任何理论的约束，通过增加ORF2的K411乙酰化，可以增加细胞中用于病毒组装或VLP组装的ORF2多肽量，并相应地增加病毒或VLP的产量。

本发明的各方面将在下面各小节中进一步详述。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

定义：

在本发明中，术语“戊型肝炎病毒”(“HEV”)是指病毒、病毒类型或病毒类别。HEV归于肝炎病毒属的单链正链RNA二十面体病毒，基因组大小为7.2kb，包含三个开放阅读框(ORF)，其中ORF2编码衣壳蛋白。HEV有四种主要的基因型，即1，2,3和4基因型。在本发明中，HEV病毒的ORF2多肽优选包含肽序列EPTVK⁴¹¹LYTSVEN，优选地HEV病毒是基因型1-4的病毒，更优选基因型1或4的病毒。

在本发明中，术语“HEV ORF2”或“ORF2多肽”或“ORF2”可互换使用，指来自戊型肝炎病毒(HEV)基因组的ORF-2开放阅读框编码的衣壳蛋白、或其片段、或其同源物或变体。本发明的ORF2多肽的特征在于包含共有序列：E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN，优选地包含共有序列：EPTVK⁴¹¹LYTSVEN，能够在K411位被乙酰化。

HEV病毒的衣壳ORF2蛋白及其序列是本领域公知的。本发明的ORF2可以包含来自1-4基因型HEV的ORF2序列，例如基因型1的ORF2序列(也简称为1-ORF2)或基因型4的ORF2序列(也简称为4-ORF2)。本发明的一个示例性ORF2是在GenBank登录号JQ655734下给出的基因型1的HEV ORF2蛋白(序列示于SEQ ID NO:1中)。本发明的另一示例性ORF2是在GenBank登录号JQ655736下给出的基因型4型HEV ORF2蛋白(序列示于SEQ ID NO:2中)。其它适用于本发明的HEV ORF2包括，例如，在如下登录号下给出的序列：P29326；P33426；Q6J8F7；Q9IVZ8；Q9YLQ9；Q03500；Q04611；Q68985；Q81871。

在本发明中，表述“ORF2片段”或“ORF2截短片段”是指相对于ORF2全长蛋白，在N端和/或C端截短的ORF2片段。在一个示例性方案中，本发明的HEV ORF2片段由SEQ ID NO:1或3或前述任一登录号下ORF2蛋白的第112-660位氨基酸残基组成，或由112-607或112-608位氨基酸残基组成。ORF2片段保留共有序列：E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN，以及在K411乙酰化的性质，且优选地保留多聚化和组装成病毒衣壳或病毒样颗粒的能力。优选地，片段具有免疫原性。

根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的HEV衣壳蛋白ORF2)的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸取代)，或者具有至少60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽(例如，对于本发明的HEV衣壳蛋白的变体而言)的必要特性可以指，在K411位乙酰化、以及优选地多聚化和组装成病毒衣壳或病毒样颗粒的能力。

在本发明中，当提及氨基酸位置时，通过参考SEQ ID NO:1，即，登录号JQ655734的HEV ORF2蛋白(也称作1-ORF2)的氨基酸序列，予以确定。可以通过进行氨基酸序列比对(例如使用BLAST；可从http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_ TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome获得的Basic Local Alignment Search Tool，使用默认参数，进行比对)，鉴定在其它ORF2多肽(包括全长序列或ORF2片段)上的对应氨基酸位置。因此，在本发明中，当提及“K411”时，是指SEQ ID NO:1的第411位氨基酸残基，或经比对在其它HEV ORF2序列上的对应位置的氨基酸残基。相应地，在本发明中，当提及“相应序列片段”或“相应片段”时，是指当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置(即对应氨基酸位置)的片段。

在本发明中，提及ORF2多肽时，表述“K411乙酰化”与“乙酰化”可互换使用，表示该多肽在K411位置(即，与参考SEQ ID NO:1序列的K411位置对应的位置)具有乙酰化的赖氨酸残基。相应地，提及ORF2多肽时，表述“未K411乙酰化”与“未乙酰化”可互换使用，表示该多肽在K411位置不具有乙酰化。可以通过本领域技术人员已知的多种方式确定ORF2多肽上K411的乙酰化，例如质谱，western印迹等。

在本发明中，HDAC6是指组蛋白去乙酰化酶IIb家族的组蛋白去乙酰化酶6。HDAC6具有两个催化结构域和一个锌指结构域。HDAC6可以催化K411乙酰化的HEV ORF2多肽(例如SEQ ID NO:1-4)脱乙酰化，产生在K411去乙酰化的ORF2多肽。HDAC6的序列是本领域已知的，可以从GenBank获得。在图7中列出了一个HDAC6示例性蛋白序列及其编码序列(SEQ IDNO:5和6)。

根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列在某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个ORF2多肽在K411位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。在两条核酸序列或多肽序列进行比较的情形下，百分比“同一性”是指，当在比较窗中或在指定区域内，利用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测检查进行最大一致性比较和比对时，两条序列具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基数(例如，在指定区域内至少60％同一性、任选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性)。可选地，百分比同一性可以是60％到100％的任一整数。

“序列同一性百分比”可以通过在比较窗内比较两条最佳比对的序列来确定，其中在两条序列最佳比对后，在所述比较窗中多核苷酸序列或多肽序列的部分，与参考序列(不包含添加或缺失)的部分相比，可包含添加或缺失(即空位)。所述百分比通过以下来计算：确定两条序列中存在的相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数并将结果乘以100以产生序列一致性的百分比。

用于比较的序列比对方法是本领域内公知的。适合确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法(参见Altschul等，Nuc.Acids Res.25:3389-402,1977和Altschul等J.Mol.Biol.215:403-10,1990。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公众获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。出于本申请的目的，同一性百分比通常用设置为缺省参数的BLAST2算法来确定。

如本文中使用的，术语“保守取代”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学功能的氨基酸取代。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守取代。典型的保守型氨基酸取代是指将一种氨基酸取代为具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的另一种氨基酸。以下六组各自包含彼此可进行典型保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

术语“分离的”或“基本纯化的”，意指基本不含其他细胞组分的化学组合物。纯度和均一性通常可以利用分析化学的技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法或质谱来确定。一般而言，基本上纯化或分离的蛋白应包含制剂中存在的所有大分子物质的70％以上。在一些实施方案中，纯化蛋白占存在的所有大分子物质的90％以上、95％以上或纯化至基本均质，其中通过常规技术没有检测到其它大分子物质种类。对于本发明的分离的乙酰化ORF2蛋白，在一些实施方案中，该蛋白为至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％或至少约99％或更高纯度的，且优选地通过常规技术检测不到K411位未乙酰化的ORF2蛋白。

根据本发明，术语“病毒样颗粒(VLP)”是指不含病毒核酸的、在结构上与天然的病毒颗粒相似的空壳结构，其通常由病毒衣壳蛋白或其变体或片段组成。由于VLP在结构上与天然的病毒颗粒十分相似，因此，其具有很强的免疫原性和免疫反应性。同时，由于VLP不含病毒的遗传物质，因此，其不具有感染性。由于上述优点，VLP已被开发用作疫苗。此外，VLP在结构上允许外源基因或基因片段的***而形成嵌合型VLP，并且能够将外源性抗原展示在其表面。此外，大部分VLP还具有包裹核酸或其他小分子的能力，因此，其还可作为基因或药物的运载工具。

根据本发明，术语“组装”是指病毒的结构蛋白(例如衣壳蛋白)之间或结构蛋白与核酸之间通过各种相互作用，形成有规则的颗粒状结构的过程，其包括天然病毒颗粒的组装和病毒样颗粒的组装。在昆虫细胞和哺乳动物细胞中ORF2可以自动组装产生VLP颗粒。对于大肠杆菌***生产的ORF2，可以通过在VLP组装溶液中从ORF2组装产生VLP颗粒。用于从ORF2组装形成HEV病毒样颗粒的组装溶液是本领域已知的。

在本发明中，“表达构建体”是指能够表达目的多肽的重组核酸分子。例如，“重组ORF2表达构建体”是能够表达ORF2多肽的重组核酸分子。应理解，表达构建体涵盖载体构建体。

乙酰化HEV ORF2蛋白及其用途

天然的HEV ORF2蛋白质是包含660个氨基酸的蛋白质。天然ORF2在感染HEV的细胞中作为前体合成并通过信号序列切割加工成能够自我组装的成熟蛋白质。当使用杆状病毒***在Sf9昆虫细胞中表达ORF2编码序列时，可以产生具有估计分子量72kDa和59-62kDa的稳定蛋白质产物。包含位置125-601和112-607和位置112-660之间氨基酸的截短蛋白质可以组装成病毒样颗粒(Surjit，M.等，Journ.Virol，78：320-328(2004)，Li，TC等Journ.Virol.79,12999-13006(2005))。在HEV ORF2的氨基酸残基aa458-aa607之间具有中和结构域(Zhou，YH等，Vaccine 22：2578-2585(2004)，Ahmad，I。等，Virus Res.161：47-58(201))。

本发明部分地基于观察到HEV ORF2蛋白在K411位置是乙酰化的，而且该位置的乙酰化可以促进ORF2的稳定性和ORF2的二聚化和多聚化，并促进病毒颗粒和VLP颗粒的组装。

因此，在一个方面，本发明提供分离的HEV ORF2多肽，其特征在于K411位置具有乙酰化。在一个实施方案中，本发明的ORF2多肽包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN，优选地包含肽序列：EPTVK⁴¹¹LYTSVEN。在再一个实施方案中，本发明的ORF2多肽是ORF2片段，包含起始于位置112-125之间且终止于位置601-660之间或607-660之间的氨基酸序列。在再一个实施方案中，本发明的HEV ORF2多肽是ORF2片段，包含458-607位的C端氨基酸残基，并包含125-457位的N末端氨基酸残基，以便能够形成VLP，且具有免疫原性。在一个优选实施方案中，本发明HEV ORF2片段至少包含125-601位，优选125-607位的氨基酸残基。在再一优选实施方案中，本发明HEV ORF2片段缺失aa1-111的N-末端氨基酸序列。图1示例性显示了一个HEV ORF2基因型1蛋白的全长序列(SEQ ID NO:1)及其aa112-660截短片段(SEQ ID NO:2)，和一个HEV ORF2基因型4的全长序列(SEQ ID NO:3)及其aa112-660截短片段(SEQ ID NO:4)。

本领域技术人员理解，在本发明的HEV ORF2多肽(包括全长序列和截短片段)中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，取代，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在再一方面，本发明提供分离的HEV ORF2多肽，其中所述HEV ORF2多肽包含天然(即，野生型)HEV ORF2多肽(如前所述的全长序列或片段)，或与其同源的序列，且优选地与天然HEV ORF2多肽在生物学上等价。在本发明中，“生物学上等价”指所述多肽能够在K411位置被乙酰化，且能够组装形成病毒衣壳或病毒样颗粒，而且优选地有免疫原性。由此，在一些实施方案中，当将包含本发明的HEV ORF2多肽和任选地可药用载体的本发明疫苗组合物，注射入哺乳动物，可刺激产生保护性抗体，这些抗体可以保护哺乳动物免受野生型HEV的侵袭。在本发明中，优选地，同源序列与天然HEV ORF2多肽序列的同一性优选为70％以上，更优选地80％或90％以上，特别优选的是95％以上例如，95％，96％，97％，98％，99％或以上。更优选地，同源序列与天然HEV ORF2多肽序列仅相差1-10个氨基酸改变，且优选地1-5个、或1-3个氨基酸改变，更优选地所述改变为保守氨基酸取代。

本领域技术人员已知，多种ORF2片段可以用于体外和体内组装形成VLP病毒样颗粒(参见WO2010099547，和Expression and self-assembly of empty virus-likeparticles of hepatitis E virus.Li TC,Yamakawa Y,Suzuki K,Tatsumi M,Razak MA,Uchida T,Takeda N,Miyamura T.,J Virol.1997Oct；71(10):7207-13.Essentialelements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-likeparticles of hepatitis E virus.Li TC,Takeda N,Miyamura T,Matsuura Y,Wang JC,Engvall H,Hammar L,Xing L,Cheng RH.J Virol.2005Oct；79(20):12999-3006.)。这些ORF2片段也适用于本发明中。因此，在一些实施方案中，本发明提供在K411位乙酰化的ORF2片段。在一些实施方案中，ORF2片段具有N端至少连续25个氨基酸的缺失，优选至少缺失50个氨基酸，至少100个氨基酸，优选地缺失N端1-111位氨基酸序列。在一些实施方案中，ORF2片段具有C端区域缺失，例如缺失至少10个连续C端氨基酸残基，例如至少20个、优选地缺失C端602-660,603-660,604-660,605-660,606-660,607-660,608-660,或609-660位氨基酸序列。

在一些优选实施方案中，本发明提供一种分离的乙酰化戊型肝炎病毒开放阅读框2(HEV ORF2)多肽，其特征在于包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN，并在K411位具有乙酰化。优选地，所述多肽包含选自以下的序列：(a)野生型HEV病毒ORF2蛋白的全长序列，优选基因型1-4，更优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；(b)(a)的截短片段，所述片段包含E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN肽序列，优选地保留多聚化和组装成病毒衣壳或病毒样颗粒的能力，优选地，片段具有免疫原性；(c)(a)或(b)的同源物或变体。在一些实施方案中，所述ORF2片段为截短了N端a1-aa111的氨基酸序列，优选地包含全长ORF2序列的至少aa125至601，或125至aa607区域，优选地由aa112至aa660的氨基酸序列组成。

在一个优选实施方案中，所述ORF2多肽包含来自基因型1的天然HEV ORF2全长序列或其截短片段，或与其同源的序列。在再一优选实施方案中，所述ORF2蛋白包含来自基因型4的天然ORF2全长序列或其截短片段，或与其同源的序列。在再一些优选实施方案中，所述ORF2多肽包含选自SEQ ID NO:1-4的序列，或与其同源的序列。优选地，所述同源序列与SEQ ID NO:1或2的序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％或以上的同一性，更优选地，与SEQ ID NO:1或2的序列仅相差1-10个氨基酸改变，且优选地1-5个、或1-3个氨基酸改变，更优选地所述改变为保守氨基酸取代。优选地，所述同源序列与SEQ ID NO:3或4的序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％或以上的同一性，更优选地，与SEQ ID NO:3或4的序列仅相差1-10个氨基酸改变，且优选地1-5个、或1-3个氨基酸改变，更优选地所述改变为保守氨基酸取代。在这些实施方案中，优选地，所述截短片段是N端截短片段，例如缺失N端的aa1-aa111氨基酸序列。更优选地，所述片段包含全长ORF2序列的至少氨基酸125位至氨基酸601位的区域，优选地氨基酸112位至660位的区域。

本发明的HEV ORF2乙酰化多肽可以通过在具有乙酰化***的细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞以及大肠杆菌中，表达编码这些蛋白及其片段的DNA片段而容易地获得。合适的表达***，例如基于杆状病毒、基于哺乳动物细胞的表达***是本领域已知的。这样的表达***在本领域中被广泛地描述并且它们是商业上可获得的。考虑到易用性和相对较高的产量，基于杆状病毒是优选的***。在一些实施方案中，表达的蛋白缺少ORF2的N-末端111个氨基酸，是可溶的。在再一些实施方案中，重组ORF2多肽，例如ORF2片段aa112-aa607或aa112-660作为可溶性蛋白在培养基中分泌，但也存在于细胞沉淀中。

从未乙酰化的蛋白中分离乙酰化蛋白的方法在本发明中已知的(参见例如CN103930433A和US2004247614)，包括例如色谱、HPLC,排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术。例如，为了纯化和分离本发明的乙酰化蛋白，可以先用ORF2抗体富集所有的ORF2蛋白，再用乙酰化赖氨酸抗体富集具有乙酰化修饰的ORF2蛋白。此外，可以通过N端或C端标签(例如Flag)设计而便于蛋白纯化。此外，也可以制备特异性针对K411乙酰化ORF2蛋白的抗体，利用该特异性抗体进行纯化。在一个实施方案中，本发明也提供了包含纯化的K411乙酰化ORF2蛋白的组合物。

本发明人发现，当在细胞中生产本发明的乙酰化ORF2多肽时，本发明多肽在K411位上的乙酰化水平受到细胞的HDAC6去乙酰化酶活性的影响。由此，在一方面，本发明也提供了一种增加乙酰化HEV ORF2多肽产生的方法，包括：将编码HEV ORF2多肽的核酸引入宿主细胞，其中所述细胞为HDAC6敲低的细胞；在合适所述核酸表达的条件下培养细胞。优选地，所述HDAC6敲低的细胞是HDAC6条件敲低的细胞。在再一方面，本发明提供一种增加乙酰化HEV ORF2多肽产生的方法，包括：将编码HEV ORF2蛋白或其片段的核酸引入宿主细胞；在合适所述核酸表达的条件下培养细胞；向细胞施用HDAC6抑制剂抑制HDAC6活性。优选地，HDAC6抑制剂是HDAC6化学抑制剂，如非选择性抑制剂如TSA或选择性抑制剂如TBSA，更优选地HDAC6选择性抑制剂。在一个实施方案中，细胞是HEV病毒感染的细胞。在一个实施方案中，细胞是引入了ORF2表达构建体的重组细胞。在一个实施方案中，相对于未抑制HDAC6表达和/或活性的对照细胞，K411乙酰化ORF2蛋白在细胞中的产量增加。在一个实施方案中，本发明方法还包括：收集产生的乙酰化HEV ORF2蛋白，或该K411乙酰化HEV ORF2蛋白与未乙酰化ORF2的混合物。在一个实施方案中，HEV ORF2多肽在细胞中组装产生VLP。在一些实施方案中，将分离K411乙酰化ORF2多肽或根据本发明方法获得的K411乙酰化ORF2多肽或其与未乙酰化ORF2的混合物，用于制备免疫组合物或疫苗，或用于制备病毒样颗粒VLP。

在另一方面，本发明提供用于生产本发明K411乙酰化ORF2多肽的细胞培养物，其包含HDAC6敲低的细胞，所述细胞包含表达ORF2多肽的核酸。在一个实施方案中，所述细胞是HEV病毒感染的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是引入了重组ORF2表达构建体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞用于生产乙酰化ORF2多肽、病毒或病毒样颗粒。

此外，本发明也提供本发明K411乙酰化ORF2蛋白的二聚体或多聚体。不受理论的约束，认为K411的乙酰化具有促进ORF2蛋白的聚集和组装的能力。因此，在再一方面，本发明也提供本发明K411乙酰化ORF2蛋白用于促进ORF2多聚化、或促进病毒或VLP颗粒组装的用途。在一个实施方案中，所述用途包括将K411乙酰化ORF2蛋白加入VLP颗粒的组装溶液中，其中所述溶液包含未乙酰化ORF2蛋白，其中与未加入K411乙酰化ORF2蛋白的对照相比，VLP颗粒的组装效率提高。

HDAC6抑制剂：

HDAC6抑制剂在本文中包括可以降低细胞中HDAC6表达和/或活性的分子。例如，HDAC6抑制剂可以是，当与HDAC6蛋白质(例如，SEQ ID NO.5)或其功能片段结合或相互作用时，降低或消除所述蛋白质的生物活性(包括生物活性的强度或持续时间)的分子(在本文中称作“HDAC6化学抑制剂”)。再例如，HDAC6抑制剂也可以是阻止或减少编码HDAC6蛋白质的基因表达，即阻止或减少基因转录，mRNA成熟，mRNA翻译和翻译后修饰的核酸分子(在本文中称作“HDAC6抑制性核酸分子”)。由此，HDAC6抑制剂将降低或消除细胞中HDAC6蛋白脱乙酰酶对ORF2的K411乙酰化赖氨酸的去乙酰化活性。

HDAC6抑制性核酸分子

HDAC6抑制性核酸分子的例子包括但不限于，例如，对HDAC6蛋白质基因或mRNA序列特异的反义核苷酸序列；对HDAC6蛋白质mRNA特异的核酶；对HDAC6蛋白质mRNA特异的适体(aptamer)；和对HDAC6蛋白mRNA特异的干扰RNA(RNAi)；或其表达构建体(能够表达产生RNAi分子的任何核酸分子，包括表达载体)。这些抑制性核酸分子可以由基因工程领域技术人员根据本领域中关于转基因和基因表达抑制的知识进行构建和产生。(Clarke,A.R.(2002)Transgenesis Techniques.Principles and Protocols,2nd Ed.Humana Press,Cardiff University；US patent 20020128220.Gleave,Martin.TRPM-2antisensetherapy；Puerta-Ferández E et al.(2003)Ribozymes:recent advances in thedevelopment of RNA tools.FEMS Microbiology Reviews 27:75-97；Kikuchi et al.,2003.RNA aptamers targeted to domain II of Hepatitis C virus IRES that bindto its apical loop region.J.Biochem.133,263-270；Reynolds A.et al.,2004.Rational siRNA design for RNA interference.Nature Biotechnology 22(3):326-330).

在一些实施方案中，HDAC6抑制剂是通过称作RNA干扰的过程指导组蛋白乙酰化酶HDAC6mRNA分子发生序列特异性降解的RNAi分子。

本领域熟知抑制靶基因表达和靶基因敲低的RNAi手段。RNAi包括但不限于siRNA和shRNA。siRNA是小的或短的干扰RNA分子，可以应用亲脂性转染试剂转染进入细胞，实现对靶基因的瞬时敲除。siRNA可以是例如长19-25个核苷酸的双链RNA分子，在其3’末端带有2nt的突出残基。在应用时，可以采用针对单个靶位点的单个siRNA分子，也可以采用多对例如三对siRNA双链分子组成的混合物。shRNA是小发夹和短发夹RNA。可以将shRNA的编码核酸质粒通过脂通透转染而引入细胞。利用shRNA可以瞬时或稳定地实现shRNA分子表达和靶基因抑制。shRNA质粒可以是由一种或多种，例如3-5种质粒混合组成，每一种质粒可以例如含有靶基因特异性的19-25nt shRNA及6bp的茎环区。可以将shRNA编码核酸置于例如组成型或诱导型启动子控制下。转染后，可以筛选稳定表达shRNA的细胞。也可以通过慢病毒颗粒将shRNA编码质粒递送到靶细胞中，用于瞬时或稳定地敲低靶基因的表达。

在本发明的一个实施方案中，通过向细胞引入体外合成的siRNA来抑制靶基因HDAC6的表达。在另一实施方案中，在体外构建shRNA表达载体,然后将载体转移到细胞内转录产生shRNA，从而实现HDAC6基因表达的抑制。在再一实施方案中，shRNA表达核酸在细胞中组成型表达，从而实现对靶基因HDAC6的组成型敲低。在一些实施方案中，在本发明的HEV病毒或病毒样颗粒或ORF2生产方法中，使用HDAC6组成型敲低的细胞。在再一实施方案中，shRNA表达核酸在诱导型启动子控制下，由此可以通过诱导物诱导shRNA表达和HDAC6的敲低，获得HDAC6的条件性敲低细胞。在一些实施方案中，在本发明的HEV病毒或病毒样颗粒或ORF2生产方法中，使用HDAC6的条件性敲低细胞，且优选地在用HEV病毒感染或引入或表达ORF2编码核酸之前，诱导HDAC6的表达水平降低。

因此，在本发明的一些实施方案中也涉及HDAC6敲低细胞，包括HDAC6组成型敲低细胞或HDAC6条件性敲除细胞用于本发明方法的用途。在本文中，HDAC6组成型敲低的细胞是指HDAC6的表达被稳定敲低/抑制的细胞，例如，由于细胞中抑制性核酸分子例如HDAC6RNAi分子的组成型表达所导致。HDAC6条件性敲低的细胞是指HDAC6的表达被条件性地敲低/抑制的细胞，例如，由于细胞中抑制HDAC6表达的抑制性核酸分子例如RNAi分子的诱导性表达，使得HDAC6的表达水平在诱导物存在下降低的细胞。本领域已知用于产生条件性敲低细胞的多种方法，参见例如王婷等，条件性RNA干扰技术研究进展，现代生物医学进展，2015年第15卷第3期，p547-549；Pfeiffenberger E等，Conditional RNAi Using theLentiviral GLTR System.Methods Mol Biol.2016；1448:121-38(doi:10.1007/978-1-4939-3753-0_10)；Fewell GD等，Vector-based RNAi approaches for stable,inducibleand genome-wide screens，Drug Discov Today.2006Nov；11(21-22):975-82.Epub2006Sep 26；US20130096370A1。

在一个实施方案中，本发明涉及对靶HDAC6RNA具有RNAi活性的siRNA分子，其中该siRNA分子包含与HDAC6RNA序列互补的序列。HDAC6的核苷酸序列是本领域已知的。在图7中给出了一个示例性HDAC6核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。基于这些序列信息，本领域技术人员可以使用本领域已知的方法，产生合适的HDAC6抑制性siRNA分子。本发明的siRNA可以是未修饰的或化学修饰的。可以通过对siRNA的化学修饰来例如增加siRNA对体内核酸酶降解的抗性和/或改善细胞对siRNA的摄取。

本领域中存在糖，碱和磷酸修饰的实例描述，其可以被引入到核酸分子中，增强其抗核酸酶稳定性和功效。例如，向寡核苷酸中引入核酸酶抗性基团，例如2'氨基，2'-C-烯丙基，2'-氟，2'-O-甲基等修饰，增强其稳定性和/或增强其生物活性(参见例如Usman和Cedergren，1992，TIBS.17,34；Usman等，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31,163；Burgin等，1996，Biochemistry，35,14090)。核酸分子的糖修饰也已经在本领域中被广泛描述(参见Eckstein等，PCT国际公布WO92/07065；Perrault等，Nature，1990,344,565,568；Pieken等，Science，1991，253,314-317；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.，1992,17,334-339；Usman等，PCT国际公布WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等，1995，J.Biol.Chem.270,25702；Beigelman等，PCT国际公开WO 97/26270；Beigelman等，美国专利号5,716,824)。

在一些实施方案中，本发明涉及对靶HDAC6RNA具有RNAi活性的shRNA分子。shRNA分子可以由基因组整合的转基因或基于质粒的表达载体编码并由其表达。因此，在一些实施方案中，能够抑制mRNA表达的分子是编码小干扰核酸的转基因或基于质粒的表达载体。此类转基因和表达载体可以使用聚合酶II或聚合酶III启动子来驱动这些shRNA的表达并导致细胞中的功能性siRNA。也可以使用诱导型和组织特异性表达***来驱动这些shRNA的表达。在一些实施方案中，转基因和表达载体由组织特异性启动子控制。在其他实施方案中，转基因和表达载体由诱导型启动子，如四环素诱导型表达***控制。本领域已知多种用于shRNA递送的运载体，包括病毒运载体，例如慢病毒颗粒(参见例如，综述Manjunath N等，Lentiviral delivery of short hairpin RNAs，Adv Drug Deliv Rev.2009Jul 25；61(9):732-45.doi:10.1016/j.addr.2009.03.004.Epub 2009Mar 31)。

除了siRNA和shRNA分子外，也可以化学合成或重组产生其它RNAi分子如dsRNA。设计RNAi分子的方法和将RNAi分子转染入细胞和动物的方法在本领域中是众所周知的，并且可以从商业途径获得(Verma N.K.等,J.Clin.Pharm.Ther.,28(5):395-404(2004),MelloC.C.等.Nature,431(7006)338-42(2004),Dykxhoorn D.M.等.,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.4(6):457-67(2003)，Santa cruz biotechnology(Dallas,USA))。

除了RNAi外，可以使用的其它抑制性核酸分子包括反义核酸、核酶、适体(aptamer)等。反义和核酶抑制策略通过降低基因产物的表达或通过在特异切割转录物来发挥作用(Carter and Lemoine Br.J.Cancer.67(5):869-76,1993；Lange et al.,Leukemia.6(10:1786-94,1993；Valera et al.,J.Biol.Chem.269(46):28543-6,1994；Dosaka-Akita et al.,Am.J.Clin.Pathol.102(5):660-4,1994；Feng et al.,CancerRes.55(10):2024-8,1995；Quattrone et al.,Cancer Res.55(1):90-5,1995；Lewin etal.,Nat.Med.4(8):967-71,1998)。这些分子均在本发明的考虑中。

HDAC6化学抑制剂

适用于本发明方法的HDAC化学抑制剂可以是任何本领域已知的HDAC6抑制剂，包括选择性HDAC6抑制剂和抑制HDAC6和其它HDAC酶的非特异性HDAC抑制剂，如TSA,但优选HDAC6选择性抑制剂，如TBSA。

一些选择性HDAC6抑制剂可以具有纳摩尔甚至皮摩尔的HDAC6抑制活性，并相对于其它HDAC酶，表现出明显的HDAC6选择性。如本文所用，“HDAC6选择性”是指，与任何其他类型的HDAC酶如HDAC1或HDAC2相比，化合物与HDAC6结合的程度显著更大，例如高10，50，100，500或更多倍，即，该化合物对HDAC6比任何其他类型的HDAC酶都具有选择性。相对于其他HDAC同种型，对HDAC6的选择性抑制可以降低对细胞或组织的毒性或副作用。

已经研究了各种HDAC6抑制剂。参见，例如，Butler等，“Rational Design andSimple Chemistry Yield a Superior，Neuroprotective HDAC6Inhibitor，TubastatinA，”J Am Chem Soc 2010,132(31)：10842-10846；Kalin等,"Second-Generation HistoneDeacetylase 6Inhibitors Enhance the Immunosuppressive Effects of Foxp3+T-Regulatory Cells,"J Med Chem 2012,55(2):639-651；West和Johnstone,J.Clin.Invest.2014,124,30-39；Mottamal et al.Molecules 2015,20,3898-3941。Batchu等提供了关于HDAC6抑制剂的详细讨论(Clinical Science(2016)130,987-1003)。也参见WO2018039581A1；WO2018034801A1；Sabrina Dallavalle,Claudio Pisano,andFranco Zunino,"Development and therapeutic impact of HDAC6-selectiveinhibitors,"Biochemical Pharmacology,84(6),2012,p756-76。上述文献均完整并入本文作为参考。

HDAC6抑制剂的非限制性实例包括，rocilinostat(ACY-1215)，ACY-241，Tubacin，Tubastatin A(TBSA)，CAY10603，Nexturastat A，HPOB，ACY-738(N-hydroxy-2-(1-phenylcycloproylamino)pyrimidine-5-carboxamide)，ACY-775(2-((1-(3-fluorophenyl)cyclohexyl)amino)-N-hydroxypyrimidine-5-carboxamid e),和ACY-1083。其它HDAC6抑制剂包括Vorinostat,LBH589,ITF2357,PXD-101,Trichostatin A(TSA)。这些抑制剂可商业途径获得。

在一个实施方案中，本发明的HDAC6抑制剂是选自以下的HDAC6选择性抑制剂：

Rocilinostat(ACY-1215)

Citarinostat(ACY-241)

CAY10603

Tubastatin A

Tubac in

ACY-1083

或其可药用盐。

在一个实施方案中，HDAC6抑制剂是TSA。在一个实施方案中，HDAC6抑制剂是TBSA。在另一实施方案中，HDAC6抑制剂是CAY10603。

HDAC6激活剂

HDAC6激活剂在本文中包括可以提高细胞中HDAC6表达和/或活性的分子。例如，HDAC6激活剂可以是，当与HDAC6蛋白(例如，SEQ ID NO.5)或其功能片段结合或相互作用时,增加所述蛋白的生物学活性的强度或延长其持续时间的分子。HDAC6激活剂也可以是，允许增加编码HDAC6蛋白的基因表达的那些化合物。

本发明在一个方面涉及，使用HDAC6激活剂开发用于预防和治疗HEV病毒感染的药物或治疗组合物中的用途。在一个实施方案中，所述化合物由基因构建体构成，所述基因构建体包含编码HDAC6的核苷酸序列(例如SEQ ID NO.6)，其允许在哺乳动物细胞，例如人或非人哺乳动物细胞内，优选在肝细胞内，表达HDAC6蛋白质(例如SEQ ID NO.5)。

在一个实施方案中，本发明提供使用HDAC6激活剂治疗HEV感染的方法，其中所述HDAC6激活剂是基因载体或表达载体，所述载体可以在哺乳动物细胞，优选在肝细胞内，表达能够模拟或再现HDAC6蛋白去乙酰酶生物学活性的肽或蛋白质，所述载体包含选自以下的核苷酸序列：

a)编码HDAC6蛋白的核苷酸序列

b)a)核苷酸序列的片段，和

c)与a)和b)同源的序列。

可以例如通过引入保守或非保守取代，包括***一个或多个核苷酸，在分子的任何末端添加一个或多个核苷酸、或在序列的任何末端或内部缺失一个或多个核苷酸构建同源序列，其中所述同源序列表达具有HDAC6蛋白去乙酰酶活性的蛋白，该蛋白保留对ORF2蛋白K411位的乙酰化赖氨酸进行去乙酰化的作用。

在一些实施方案中，同源序列具有至少80％，优选至少85％，或更优选至少95％的同一性程度。在另一些实施方案中，同源序列是参照序列的变体，例如1-10个氨基酸改变的变体，所述改变尤其是保守氨基酸改变。

如前所述，这些构建体和载体可以由本领域技术人员根据常规方法构建(Sambroock等，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989))。

筛选方法

在本发明的另一方面，本发明也提供鉴定HDAC6调节剂(包括抑制剂和激活剂)和评估其对ORF2乙酰化和HEV病毒复制的激活和/或抑制的方法，其包括以下步骤：

·i)将包含ORF2编码核酸的细胞与潜在的化合物接触并在合适的条件下孵育，

ii)确定i)的细胞中ORF2乙酰化的水平、或指示病毒复制或组装的参数，以及

iii)当观察到指示ORF2蛋白乙酰化水平增加和/或指示病毒复制增加的参数改变时，或当观察到指示ORF2乙酰化水平降低和/或病毒复制降低的参数改变时，鉴定该化合物是HDAC6蛋白活性抑制剂或激活剂化合物。

ORF2蛋白乙酰化水平可以使用本领域已知的方法，例如免疫印迹或western印迹，或实施例中实例的方法，进行检测。病毒复制水平可以使用本领域已知的方法，或实施例中实例的方法进行检测。

本发明也包括将筛选获得的HDAC6调节剂用于本发明的方法和组合物中的用途。

本发明的生产方法和细胞培养***

基于前述发现，本发明人提出了，通过调节HDAC6表达和/活性来改善HEV病毒、病毒样颗粒或ORF2蛋白(可以用于配制HEV病毒疫苗)生产的方法。本发明人也提出了用于所述生产的细胞培养***。由本发明方法和培养***生产的HEV病毒、病毒样颗粒或ORF2蛋白可以用于配制抗HEV病毒药物，例如免疫组合物或疫苗。

细胞培养***

在一方面，本发明提供用于HEV病毒、病毒样颗粒或ORF2蛋白生产的细胞培养***，所述***包括：(i)包含编码ORF2多肽的核酸的细胞；和(ii)HDAC6抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂是引入所述细胞中的HDAC6抑制性核酸分子，尤其是RNAi如siRNA或shRNA或其表达构建体。在一个实施方案中，所述抑制剂是加入所述细胞的培养物中的HDAC6化学抑制剂，尤其是HDAC6选择性抑制剂。在一个实施方案中，所述细胞是HEV病毒感染的细胞。在另一实施方案中，所述细胞是引入了ORF2表达构建体的重组细胞。在一个实施方案中，在细胞感染HEV病毒之前或在细胞表达ORF2之前，细胞中的HDAC6表达被HDAC6抑制性核酸分子敲低。在本发明的细胞培养***可以用于本发明的生产方法。

HEV病毒生产方法

在一方面，本发明提供在HEV病毒的体外培养细胞中改善HEV病毒生产的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括：在HDAC6抑制剂存在下，体外培养HEV感染的细胞。在另一实施方案中，本发明的方法包括：用HEV感染HDAC6敲低的细胞，并体外培养该细胞。在另一实施方案中，本发明方法包括：用HDAC6化学抑制剂处理HEV感染的细胞。在再一实施方案中，本发明包括收获HEV病毒颗粒。在进一步实施方案中，将收获的HEV病毒颗粒配制成疫苗或免疫组合物。在再一方面，本发明也涉及收获的HEV病毒颗粒或经配制成的疫苗或免疫组合物在治疗HEV感染中的用途。

如本领域技术人员可以理解的，任何允许HEV病毒复制的细胞培养物(即对HEV病毒易感的细胞)均可以用于本发明方法中。本领域已知可以在病毒感染后支持HEV复制的细胞系，包括但不限于，A549(人肺细胞癌)和PLC/PRF/5(人肝细胞癌)。此外，猪肾上皮细胞系LLC-PK1也已经证实可以支持HEV株复制。此外，也报道了使用HepG2(ATCC号HB-8065)或HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)在细胞培养基中生产高滴度戊型肝炎病毒(参见CN106367397A)。

在本发明的一些实施方案中，用于HEV病毒生产的细胞是哺乳动物细胞，例如人或猪细胞系，例如肝细胞系或肺细胞系或肾细胞系，如PLC/PRF/5人肝癌细胞或A549人肺细胞或HepG2/C3A人肝癌细胞系或LLC-PK1猪肾细胞系。在本发明的另一些实施方案中，优选所述细胞是A549细胞或PLC/PRF/5细胞。

在一些实施方案中，相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，在HDAC6抑制剂处理的细胞中病毒复制增加。增加的病毒复制是指，当HEV病毒感染细胞，例如人的肝细胞系或肺细胞系，如PLC/PRF/5肝癌细胞或A549肺细胞时，相比于未用HDAC6抑制剂处理的对照细胞，用HDAC6抑制剂处理的细胞产生更大数量的HEV病毒。病毒复制水平可以例如参照实施例6中所述测定，例如在病毒感染细胞后一段时间，以HDAC6处理，之后收集细胞培养物上清液，用ELISA检查HEV抗原量来确定。此外，可以利用本领域熟知的方法测量ORF2的产生来评估病毒的生产水平，例如，可以应用流式细胞术或荧光显微术或免疫印迹等方法，检测细胞上清液和/或细胞裂解物中的ORF2量。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了用于生产包含病毒的药物(例如免疫原性的组合物或疫苗)的方法，该方法基于病毒的体外细胞培养，所述方法包括：用HEV病毒感染细胞，并在细胞中复制和生产病毒足够的时间后，从该细胞纯化病毒。在一个实施方案中，所述方法包括：用HEV病毒感染HDAC6敲低的细胞并培养感染的细胞。在再一实施方案中，所述方法包括：在细胞上生产病毒的同时，或者可以在感染后的不同病毒生产阶段，向该病毒添加HDAC6化学抑制剂。优选地，在病毒感染细胞后，例如大约3周，用HDAC6化学抑制剂处理细胞(例如处理3天)。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种改善HEV病毒生产的方法，包括：在用于体外HEV病毒培养的细胞中，调节细胞的HDAC6表达和/或活性。优选地，所述细胞为哺乳动物细胞，优选地人或猪细胞系，尤其是A549肺细胞和PLC/PRF/5肝癌细胞。优选地所述方法包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养所述细胞，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，所述细胞中病毒复制增加。优选地，所述方法包括步骤：用HEV病毒感染所述细胞和任选地收获HEV病毒。

在一个优选实施方案中，所述方法包括：(i)向细胞中引入HDAC6RNAi分子(尤其是siRNA或shRNA)或其编码核酸，产生HDAC6敲低细胞，(ii)用HEV病毒感染HDAC6敲低的细胞；(iii)培养细胞一段时间和任选地收获病毒。

在一个优选实施方案中，所述方法包括：(i)用HEV病毒感染细胞；(ii)向细胞施加HDAC6化学抑制剂，例如HDAC6选择性抑制剂，(iii)用培养细胞一段时间和任选地收获病毒。

优选地，所述方法还包括：将收获的病毒配制成免疫组合物或疫苗用于治疗或预防HEV感染。

病毒样颗粒生产方法

在一方面，本发明提供了一种改善HEV病毒样颗粒(VLP)生产的方法，包括：在包含编码ORF2多肽的核酸的细胞中，抑制细胞的HDAC6表达和/或活性。优选地，通过本发明的方法可以改善细胞中HEV VLP的组装和/或VLP产量。通过本发明方法获得病毒样颗粒可以用于制备抗HEV病毒感染的药物，例如免疫原性组合物或疫苗。

不受理论的束缚，认为抑制细胞中HDAC6去乙酰化酶活性，可以增加ORF2在K411位的乙酰化水平；与未乙酰化的ORF2蛋白相比，乙酰化ORF2蛋白具有更高的蛋白酶体降解抵抗能力和促进ORF2二聚化和多聚化形成VLP的能力。不受理论的束缚，认为：通过抑制HDAC6处理，可以增加细胞中的ORF2量，并减少以游离形式存在的ORF2，增加细胞表达的ORF2组装成VLP的效率。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过增加细胞中乙酰化ORF2的量来促进VLP组装效率的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括：在HDAC6化学抑制剂存在下，体外培养包含编码HEV ORF2多肽的核酸的细胞。在另一实施方案中，本发明的方法包括：将编码ORF2多肽的核酸转移入HDAC6敲低的细胞中，并体外培养该细胞。在本发明的方法中，在一些实施方案中，细胞是自身具有乙酰化-去乙酰化***的细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞，优选昆虫细胞，尤其是sf9细胞。

本领域已知，可以通过各种表达***获得HEV的ORF2结构蛋白，然后在体内或体外将结构蛋白组装成为病毒样颗粒(VLP)，从而获得HEV的病毒样颗粒。例如本领域已知，可以利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV ORF2片段(例如aa112-aa607或aa14-aa608或aa112-660)，在细胞裂解物中或在细胞上清液中获得自组装的HEV VLP。此外，已经证实，在截短ORF2的C末端***11氨基酸的B细胞表位标签产生的嵌合ORF2衣壳蛋白，仍然可以形成二十面体颗粒。在口服施用后，该嵌合HEV VLP能刺激针对该***表位的免疫反应(Niikura etal.,2002.Virology 293,273-280)。这些表达***和ORF片段均适用于本发明中。

在一些实施方案中，用于本发明病毒样颗粒生产的表达***包括，但不限于，使用昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达***。优选的表达***包括使用昆虫细胞的杆状病毒表达***。用于处理和制备杆状病毒载体和杆状病毒DNA以及昆虫细胞培养的方法，是本领域已知的。参见例如A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect CellCulture Procedures。例如，可以将HEV衣壳蛋白ORF2或其截短片段克隆在杆状病毒载体中，用于感染适合的宿主细胞。(参见，例如，O'Reilly等人,"Baculovirus ExpressionVectors:A Lab Manual,"Freeman&Co.1992)。可以用包含编码本发明ORF2多肽的多核苷酸的转移载体，转化昆虫细胞系(例如sf9或Tn5)。转移载体包括例如，线性化杆状病毒DNA和含有期望多核苷酸的质粒。宿主细胞系可以用线性化杆状病毒DNA和质粒共转染，以产生重组杆状病毒。

在一个优选的实施方案中，本发明使用杆状病毒/昆虫细胞表达***进行VLP的生产。在进一步的实施方案中，使用截短的ORF2片段进行VLP生产，所述ORF2片段优选包含aa125-601,aa112-aa607、或aa112-660序列，但缺失N端的1-111位氨基酸序列。在一个实施方案中，该ORF2片段在C末端融合肽抗原，例如B细胞表位标签。

本领域已知生产和纯化病毒样颗粒的方法(参见，例如Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.Li TC,Yamakawa Y,Suzuki K,Tatsumi M,Razak MA,Uchida T,Takeda N,Miyamura T.,J Virol.1997Oct；71(10):7207-13.Essential elements of the capsid protein for self-assembly intoempty virus-like particles of hepatitis E virus.Li TC,Takeda N,Miyamura T,Matsuura Y,Wang JC,Engvall H,Hammar L,Xing L,Cheng RH.J Virol.2005Oct；79(20):12999-3006.Niikura M et al,Chimeric recombinant hepatitis E virus-likeparticles as an oral vaccine vehicle presenting foreign epitopes.Virology2002；293:273-280)。这些文献并入本文作为参考。

在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种改善HEV病毒样颗粒生产的方法，包括：在包含编码ORF2或其片段的核酸的细胞中，调节细胞的HDAC6表达和/或活性。在一个优选实施方案中，所述细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞，尤其是昆虫细胞，例如sf9细胞。在一个优选实施方案中，ORF2片段是能够自组装为VLP的ORF2片段，优选地截短了N端aa1-111序列的ORF2片段；优选地ORF2片段包含aa125-601或125-607氨基酸残基，更优选地ORF2片段是aa112-660片段。在一个实施方案中，ORF2片段在C末端融合氨基酸抗原肽，例如B细胞表位标签。在一个优选实施方案中，所述方法包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养所述细胞，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，所述细胞中VLP的组装和/或产量增加。在一个优选实施方案中，所述方法包括：(i)向细胞中引入HDAC6RNAi分子(尤其是siRNA或shRNA)或其编码核酸，产生HDAC6敲低细胞，(ii)将编码ORF2或其片段的核酸引入该HDAC6敲低细胞；(iii)培养细胞一段时间和任选地收获病毒样颗粒。在一个优选实施方案中，所述方法包括：(i)将编码ORF2或其片段的核酸引入细胞；(ii)向细胞施加HDAC6化学抑制剂，例如HDAC6的选择性抑制剂，(iii)培养细胞一段时间和任选地收获病毒样颗粒。优选地，所述方法还包括：将收获的病毒样颗粒配制成免疫组合物或疫苗用于治疗或预防HEV感染。

ORF2多肽生产方法

在再一方面，本发明提供了一种改善HEV ORF2多肽生产的方法，包括：在包含编码HEV ORF2多肽的核酸的细胞中，调节细胞的HDAC6表达和/或活性。优选地，所述细胞是昆虫细胞如sf9细胞、哺乳动物细胞如293T细胞和HeLa细胞。优选地，所述细胞是HEV ORF2转基因细胞，或HEV病毒感染的细胞。

在一个实施方案中，所述ORF2多肽可以是如本发明前述的任何ORF2全长序列或截短片段及其同源物或变体。优选地，ORF2片段是截短了N端aa1-111序列的ORF2片段；优选地ORF2片段包含aa125-607氨基酸残基，更优选地ORF2片段是aa112-660片段。优选地，所述片段保持K411乙酰化和被HDAC6去乙酰化的特征，并保留自组装形成病毒衣壳或病毒样颗粒的能力，优选地具有免疫原性。

在一个优选实施方案中，所述方法包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养所述细胞，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中ORF2的稳定性增加，且优选地细胞中ORF2的量增加，更优选地细胞中ORF2多聚体的量增加。

在一个优选实施方案中，所述方法包括：(i)向细胞中引入HDAC6RNAi分子(尤其是siRNA或shRNA)或所述RNAi分子的编码核酸，产生HDAC6敲低细胞，(ii)将编码ORF2或其片段的核酸引入该HDAC6敲低细胞；(iii)培养细胞一段时间和任选地收获产生的ORF2。在一个优选实施方案中，所述方法包括：(i)将编码ORF2或其片段的核酸引入细胞；(ii)向细胞施加HDAC6化学抑制剂，例如HDAC6的选择性抑制剂，(iii)培养细胞一段时间和任选地收获产生的ORF2。ORF2可以从细胞上清液和/或细胞裂解物中收获。优选地，所述方法还包括：将收获的ORF2配制成免疫组合物或疫苗用于治疗或预防HEV感染。

HDAC6抑制剂的用途

在一方面，本发明提供HDAC6抑制剂，如HDAC6抑制性核酸或HDAC6化学抑制剂，的用途，(a)用于增加HEV ORF2的K411乙酰化水平,(b)用于增加HEV ORF2的稳定性和/或ORF2产量，(c)用于增加HEV病毒复制和/或病毒产量,或(d)用于增加HEV VLP的组装和/或VLP产量的用途。优选地，所述应用包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养HEV感染的细胞或引入了重组ORF2表达构建体的细胞。

再一方面，本发明提供一种包含HDAC6敲低细胞的细胞培养物，其中所述细胞包含编码HEV ORF2的核酸。优选地，所述细胞是HEV感染的细胞，或是引入了重组ORF2表达构建体的细胞。该细胞培养物可以用于生产HEV病毒、病毒样颗粒或ORF2多肽。

在本发明上述任一生产方法和HDAC6抑制剂用途中，在一个优选的实施方案中，用HDAC6抑制剂来敲低细胞中HDAC6的表达水平，优选地使用HDAC6siRNA或shRNA。在再一实施方案中，HDAC6敲低的细胞是包含siRNA或shRNA表达核酸的细胞。在一个实施方案中，细胞是HDAC6组成型敲低的细胞，其中siRNA或shRNA表达核酸在细胞中组成型表达。在再一实施方案中，细胞是HDAC6条件敲低的细胞，其中siRNA或shRNA表达核酸在诱导性启动子控制下，并在诱导物存在下表达并降低HDAC6活性。在一个实施方案中，siRNA或shRNA表达核酸稳定整合在细胞的基因组中。

在本发明上述任一生产方法和HDAC6抑制剂用途中，在另一优选的实施方案中，使用HDAC6抑制剂来降低细胞中HDAC6的活性，其中所述HDAC6抑制剂是化学抑制剂，例如TSA，TBSA或CAY10603，尤其是TBSA。在一个实施方案中，Trichostatin A(TSA)的浓度为0.2μM-5μM，例如，0.5μM，1μM，2μM，5μM。在一个实施方案中，Tubastatin A(TBSA)的浓度为1μM-10μM，例如，3μM，6μM，10μM。在一个实施方案中，CAY10603的浓度为0.1μM-1μM，例如，0.2μM，0.5μM，1μM。优选浓度为TSA,1μM,TBSA,6μM，或CAY10603,0.2μM。

在本发明上述任一生产方法和HDAC6抑制剂用途中，在一个实施方案中，在HDAC6抑制剂处理一段时间后，通过收集细胞培养基来收获病毒或病毒样颗粒或ORF2；和/或通过裂解细胞来收获病毒或病毒样颗粒或ORF2。任选地，可以纯化收获的病毒或病毒颗粒或ORF2。纯化可以包括至少一个选自下述的步骤：澄清、超滤/渗滤、超速离心(例如密度超速离心，具体地，蔗糖梯度密度超速离心)和色谱法或它们的任意组合。取决于期望的纯度水平，可以以任意方式组合上述步骤。

在一些优选的实施方案中，通过抑制细胞中HDAC6表达和/或活性，HEV ORF2蛋白的K411乙酰化水平增加，和/或细胞中ORF2的稳定性增加和/或细胞中ORF2的量增加，尤其是细胞中ORF2多聚体的量增加。在一些优选的实施方案中，通过抑制细胞中HDAC6表达和/或活性，细胞中病毒包涵体的形成增加。在一些优选的实施方案中，通过抑制细胞中HDAC6表达和/或活性，细胞中HEV病毒的复制增加。在一些优选的实施方案中，通过抑制细胞中HDAC6表达和/或活性，细胞中VLP的组装和/或VLP产量产生。

利用本发明的方法产生的戊型肝炎病毒、ORF2蛋白和病毒样颗粒，可通过本领域技术人员已知的方法从生产其的细胞或培养物上清液中纯化或部分纯化，之后用作本发明的药物组合物和疫苗中的免疫原。因此本发明也涉及产生自本发明的HEV乙酰化ORF2蛋白、病毒和病毒样颗粒用于制备免疫组合物和疫苗的用途。例如，可以将病毒配制为活疫苗或灭活疫苗(例如***灭活的疫苗)，以预防或治疗哺乳动物的戊型肝炎。例如，可以将乙酰化ORF2蛋白或病毒样颗粒配制在包含佐剂的免疫组合物中，用于预防或治疗哺乳动物的戊型肝炎。或者，免疫原可以为部分或基本纯化的重组蛋白或病毒样颗粒。

治疗方法

在再一方面，本发明也提供治疗HEV病毒感染的方法，包括向感染HEV病毒的个体施用HEV ORF2蛋白K411乙酰化调节剂，其中所述调节剂降低ORF2蛋白K411的乙酰化水平。优选地，所述调节剂增加细胞中HDAC6的表达和/活性，优选地所述调节剂是HDAC6表达核酸。优选地，所述个体是哺乳动物，例如人或猪。

在前述本发明的任一方面中，优选地，HEV病毒是基因型1-4，优选基因型1和4的HEV病毒。

在前述本发明的任一方面中，优选地，HEV ORF2多肽包含选自以下的序列：

(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；

(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN肽序列，优选包含aa125-601，尤其是aa125-607的序列，特别优选由aa112-660的序列组成；

(c)(a)或(b)的同源物或变体。

本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图(附图简述紧随其后)和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

实施例

在实施例和附图中使用的下述缩写具有如下含义：

ORF2表示HEV病毒的ORF2多肽，包括全长序列或其截短片段；

ORF2(112-660)表示HEV的ORF2截短片段aa112-660；

在ORF2之前的数字1和4，例如1-ORF2或4-ORF2，表示该ORF2多肽来自HEV基因型1或基因型4。

在ORF2之前加上GFP或FLAG，例如“GFP-ORF2”或“FLAG-ORF2”，表示N端带有GFP或FLAG标记的ORF2多肽或片段。

在ORF2之后的K411R，例如，ORF2^K411R或ORF2^K411R(112-660)，表示该ORF2多肽或片段在K411位置具有赖氨酸至精氨酸突变。因此例如，1-ORF2^K411R(112-660)表示HEV基因型1型ORF2截短片段aa112-660的不能乙酰化突变体，其中K411位赖氨酸突变为精氨酸；而4-ORF2^K411R(112-660)表示HEV基因型4型ORF2截短片段的不能乙酰化突变体，其中K411位赖氨酸突变为精氨酸。

TSA：HDAC6抑制剂Trichostatin A；

TBSA：HDAC6抑制剂Tubastatin A；

CAY：HDAC6抑制剂CAY10603；

抗Acetyl-Lys:抗乙酰化赖氨酸抗体；

IP：免疫沉淀；

IB：免疫印迹；

在实施例和附图中，提及ORF2时，除非特别说明所用的ORF2多肽是全长蛋白，否则指ORF2的aa112-660片段。

一般方法和材料

质粒构建

从HEV基因型1株W2-1，PCR扩增1-ORF2的全长和112-660aa片段(GenBank登录号:JQ655734)。从HEV基因型4株W2-5，PCR扩增4-ORF2的全长和112-660aa片段(GenBank登录号:JQ655736)。将扩增的片段克隆在pAcGFP1-C载体(Clontech,Mountain View,CA)中。为了产生HA-标记的ORF2，将HEV ORF2克隆在pCMV-HA(Clontech)中。通过PCR，从HEK293TcDNA克隆HDAC6，并***pCMV-Flag(Clontech)。使用KOD Neo DNA聚合物和以下引物，位点诱变产生不能乙酰化的突变体：

引物GCGAGCCGACTGTTAGGCTGTATACATCTG用于1-ORF2^K411R,

引物CGAGCCGACAGTACGACTTTACACCTCAGT用于4-ORF2^K411R。

细胞培养、药物处理和质粒转染

将HeLa(美国典型培养物保藏中心[ATCC],CCL-2),HEK 293T(ATCC,CRL-1573)和A549(ATCC,CCL-185)细胞，在37℃和5％CO₂中，培养在具有10％胎牛血清,100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(Hyclone,Logan,UT)中。为了富集乙酰化蛋白，用0.5μMTrichostatin A(Sigma,St.Louis,MO.)或3μM Tubastatin A(Selleck,Houston,TX,Cat#:S8049)处理HEK 293T细胞、HeLa细胞和PLC/PRF5细胞(ATCC,CRL-8024)8小时。用1μMTrichostatin A或6μM Tubastatin A或0.2μM CAY10603(Selleck Cat#:S7596)处理sf9细胞5天。对于转染，将293T细胞生长至大约70％汇合，使用聚乙烯亚胺(PEI,Alfa Aesar,Cat#:43896)进行质粒转染。HeLa细胞或A549细胞用lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)根据生产商提供的方案进行转染。

抗体和免疫荧光

兔抗HDAC6多克隆抗体(Cat#:12834-1-AP)和小鼠抗GAPDH单克隆抗体(Cat#:60004-1-Ig,Clone No.:1E6D9)购自Proteintech(Proteintech Group,Rosemont,IL)。Flag(Cat#:F3165,Clone No.:M2)和α-微管蛋白(Cat#:T9026,Clone No.:DM1A)的小鼠单克隆抗体购自sigma。兔抗乙酰化赖氨酸多克隆抗体(Cat#:9441)购自cell signaltechnology(Cell Signaling Technology,Boston,MA)。小鼠抗GFP抗体(Cat#:AI10151)购自Abgent(Abgent,San Diego,CA)，兔抗GFP多克隆抗体是实验室自制。所有荧光染料缀合的二抗购自Invitrogen。

将培养在盖玻片上的细胞用PBS中10％TCA室温固定15分钟，在PBS缓冲液中的0.1％Triton X-100中透化5分钟。细胞与在具有3％BSA的PBS中稀释(1:100)的一抗，在37℃孵育1小时，或在4℃孵育过夜。然后，在PBS中洗涤细胞3次，并与在具有3％BSA的PBS中1:500稀释的荧光染料缀合的二抗，在37℃孵育1小时。用PBS洗细胞3次后，用mowiol封固剂(Sigma)将细胞封固在载玻片上，所述封固剂含有用于DNA染色的DAPI。通过UltraView VoXsysterm(PerkinElmer,Waltham,MA)获取活细胞成像数据。为了显微观察固定的样品，通过Zeiss LSM710显微镜获取图像。

免疫沉淀(IP)

在具有0.5％NP40的裂解缓冲液(20mM Tris-HCL,pH 7.5,150mM NaCl,10mMNaVO₃,10mM NaF和0.5mM EGTA)中在冰上裂解HeLa或293T细胞，并4℃离心收集上清液。抗GFP或抗Flag抗体与蛋白A珠(GE Healthcare,Fairfield,CT)在4℃孵育1小时。分离珠子，洗涤，并与细胞裂解物4℃孵育2小时，然后用裂解缓冲液洗涤4次。最后，珠子上的蛋白使用样品缓冲液洗脱，并通过western印迹分析。

RNAi实验

生长细胞24小时后，使用lipofectamine 2000，根据厂商描述的方案，用HDAC6的siRNA(Santa cruz biotechnology,Dallas,TX,Cat#:sc-35544)转染。72小时转染后，收获细胞用于western印迹。

质谱分析

用GFP-1-ORF2或GFP-4-ORF2质粒转染细胞24小时，在细胞裂解缓冲液中冰上裂解细胞20分钟。细胞裂解物在4℃孵育2小时，与20μl蛋白A-Sepharose珠和兔抗GFP抗体混合。在用裂解缓冲液洗涤珠子后，将GFP-ORF2多肽重悬在样品缓冲液中。对样品进行SDS-PAGE分离纯化，并使用凝胶切片进行乙酰-MS分析。

在PLC/PRF/5细胞中培养HEV

在补加了10％胎牛血清(FBS),100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的最低基本培养基(MEM；Hyclone)中，37℃和5％CO2中，生长PLC/PRF/5细胞。将戊型肝炎病毒(病毒登录号:AJ272108,基因型4)加入具有2％FBS的PLC/PRF/5细胞中，每三天收集一次培养物上清液(45)。

通过ELISA定量HEV ORF2多肽

在HEV感染的PLC/PRF/5细胞培养物上清液中的HEV和从sf9细胞(ATCC CRL-1711)表达的ORF2(112-660)蛋白，经稀释后，用HEV抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)(Wantai,Beijing,China)(45)进行检测。

电子显微镜观察

培养的293T细胞用0.1M甲胂酸钠缓冲液中的2.5％戊二醛固定，然后用相同缓冲液中的1％氧化锇后固定。用梯度乙醇脱水并置换为环氧丙烷后，将样品包埋在Pon 812树脂中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅，对超薄切片进行后染色。使用JEM-1400透射电子显微镜(JEOL,日本)和用于EM的特定图像***(830.10U3CCD camera,Gatan,USA)进行观察。

实施例1：HEV衣壳蛋白ORF2在保守氨基酸残基K411乙酰化。

ORF2的N端对于其抗原性和病毒颗粒组装不是必需的(39)。ORF2(112-660)与野生型病毒共有相同的生物学特性(40)。因此，使用该截短ORF2，研究HEV ORF2与宿主蛋白的相互作用，并成功地鉴定了多个与ORF2相互作用的分子(12)。为了测试ORF2是否发生翻译后修饰，包括乙酰化，将GFP标记的基因型1和4型ORF2截短片段(GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660))引入293T细胞中。然后，使用GFP抗体免疫沉淀ORF2，进行乙酰化质谱分析(图1A,1C,1D)。质谱结果显示，GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2在相同肽EPTVK⁴¹¹LYTSVEN的K411位置乙酰化，该肽在9种检查的ORF2多肽序列(包括基因型1-4)中是十分保守的序列(图1B)。

利用抗乙酰化赖氨酸的抗体，进一步验证乙酰化发生在GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2中，但不发生在单独的GFP上(图1E)。为了验证K411是ORF2的乙酰化位点，将K411突变为精氨酸并在293T细胞中表达了GFP标记的该突变体。与野生型ORF2相比，突变体的乙酰化大大地降低(图1F)，说明K411是ORF2的主要乙酰化位点。

实施例2：HEV包涵体的形成依赖于ORF2的K411乙酰化

由于在病毒的生命周期中赖氨酸乙酰化有重要作用，故决定评估HEV ORF2的K411乙酰化的功能。用与GFP标记融合的野生型1-ORF2(112-660),4-ORF2(112-660),突变体1-ORF2^K411R(112-660),或4-ORF2^K411R(112-660)，转染HeLa细胞。固定细胞，用抗GFP抗体和抗微管蛋白抗体进行免疫荧光染色，并通过DAPI染色DNA。荧光显微镜确定ORF2在细胞中的定位。令人惊奇地发现，GFP-1-ORF2^K411R(112-660)和GFP-4-ORF2^K411R(112-660)主要均一地分散在细胞质中，而基因型1和基因型4的野生型GFP-ORF2(112-660)均显示出强的包涵体形成(图2A,2B)。为了检测增强的包涵体形成是否因N端截短所致，检测了全长ORF2(ORF2(1-660))，获得与上述截短ORF2相似的结果(图2C)。为了排除包涵体形成的增强由GFP标记引起这种可能性，将GFP标记替换为HA或FLAG，结果仍获得了相似的结果(图2D)。具有包涵体的细胞(GFP点数>3/细胞)占表达野生型GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)的总细胞数的80％和75％以上(图2E)。在细胞质中具有包涵体的细胞数(GFP点数>3/细胞)对于全长和截短ORF2看上起是相当的(图2F)。然而，GFP-1-ORF2^K411R突变体具有显著降低的包涵体数量(图2F)。

为了验证上述结果，以GFP标记的ORF2野生型和K411R突变体(即，野生型1-ORF2(112-660),4-ORF2(112-660),1-ORF2^K411R(112-660),或4-ORF2^K411R(112-660))，转染A549细胞(一种用于HEV培养的细胞(41))。这些细胞呈现出与在HeLa细胞中相似的结果(图8)。

综上，这些数据表明，K411在ORF2介导的包涵体形成上发挥重要的作用。

实施例3：动态评估突变K411R对包涵体形成的影响

看起来，HEV ORF2的乙酰化参与调节包涵体的形成(图2)。然而，HEV ORF2的包涵体形成过程仍未知。为了确定K411乙酰化对该过程的影响，对野生型ORF2和乙酰化缺失的ORF2在HeLa细胞中进行活细胞成像，分析了ORF2包涵体形成。活细胞成像开始于GFP-1-ORF2(112-660)转染12小时后，并持续8小时之多。在成像开始时细胞几乎没有可检测的包涵体，大约30-90分钟后形成少数可察的包涵体(图3A)。之后，随着时间的延长，组装产生越来越强的大体积包涵体(图3A)。这些结果说明，K411的乙酰化极大地影响ORF2包涵体的自组装。为了检测乙酰化是否是包涵体形成的决定因素之一，在GFP-1-ORF2^K411R(112-660)转染8小时后进行活细胞成像，结果在细胞中没有形成可检查的点(图3B)。

在3,000个以上活细胞中通过高内涵细胞分析仪ImageXpress Micro XL***计数，进行包涵体统计学分析，SPOT细胞计算方式，>1点/细胞。结果显示，GFP-1-ORF2^K411R与野生型GFP-1-ORF2相比具有显著减少的包涵体形成(图9)。此外，也在GFP-4-ORF2和GFP-4-ORF2^K411R表达细胞中获得了同样的结果(图10)。

因此，这些数据第一次呈现了ORF2在细胞中形成包涵体的动态过程，并表明K411的乙酰化缺陷会妨碍包涵体形成过程。

实施例4：HDAC6引起ORF2去乙酰化并影响包涵体形成

赖氨酸的乙酰化和去乙酰化是动态调节的。之前已经将组蛋白去乙酰化酶HDAC6鉴定为与ORF2发生蛋白-蛋白相互作用的分子(12)。之前的研究显示，HDAC6会影响蛋白聚集和病毒感染过程。因此，提出假说：HDAC6可能通过调节ORF2的乙酰化，在包涵体形成中发挥调节作用。在此，通过免疫沉淀实验证实，基因型1和4的ORF2都与外源的和内源的HDAC6发生物理相互作用(图4A和4B)。此外，当用siRNA敲除HDAC6时，HDAC6的量减少，而乙酰化ORF2的量显著地增加，这说明HDAC6引起ORF2去乙酰化，而抑制HDAC6表达可以增加乙酰化ORF2的量(图4C)。进一步，使用2个HDAC6的小分子抑制剂Trichostatin A(TSA)和Tubastatin A(TBSA)，还检测了阻断HDAC6活性是否会影响ORF2的乙酰化和包涵体形成。尽管TSA是非特异的HDAC抑制剂，但TBSA对HDAC6具有高度选择性(42,43)。结果发现，在8小时TBSA处理后，与DMSO对照处理相比，乙酰化的GFP-1-ORF2和GFP-4-ORF2增加(图4D)。用TSA处理，也上调了GFP-1-ORF2(112-660)和GFP-4-ORF2(112-660)蛋白水平(图12)。重要的是，与DMSO对照处理相比，用HDAC6抑制剂处理的细胞形成了显著增多的包涵体，且包涵体的体积更大(图4E,4G)。值得注意的是，TBSA处理的细胞显示出了更密集的细胞中包涵体分布(图4E,4G)，这可能是由于TBSA对HDAC6的高效力抑制所引起。在TSA和TBSA处理后，GFP-4-ORF2也显示出了相似的细胞表型(图4F,4H)。用GFP-1-ORF2转染24小时后用DMSO,TBSA或TSA处理的293T细胞的细胞图像，显示在图11中。

上面的这些结果说明，HDAC6造成ORF2去乙酰化，并负面调节ORF2形成包涵体。

实施例5：乙酰化促进HEV ORF2的蛋白稳定性

HDAC6的一个重要生物学功能是促进蛋白质降解(13)。为了研究赖氨酸乙酰化是否影响HEV ORF2多肽水平，使用了siRNA敲低HDAC6。实际上，发现HDAC6的耗竭极大地增加了ORF2的水平(图5A)。为了揭示ORF2降解过程，使用蛋白翻译抑制剂cycloheximide(CHX)阻断蛋白合成，并使用蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白降解。在CHX处理的293T细胞中GFP-1-ORF2的蛋白水平随时间而减少，尤其是在6小时CHX处理后(图13)。相反地，使用CHX和MG132两者处理的细胞显示出了相当的GFP-1-ORF2多肽水平，说明ORF2多肽的丰度受蛋白酶体依赖性降解途径的调节。这些结果提示，ORF2可能通过乙酰化来稳定，提示ORF2的乙酰化可能增加ORF2抵抗蛋白酶体降解的能力并由此提高ORF2的稳定性。这被以下结果所证实：在293T细胞中评估GFP-1-ORF2,GFP-4-ORF2,GFP-1-ORF2^K411R和GFP-4-ORF2^K411R的蛋白水平；与野生型ORF2相比，K411突变体的量极大地减少(图5B,左侧图)。再者，在用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞6小时后，野生型和突变ORF2的蛋白量差异被很大程度地消除(图5B，右侧图)。

综上，这些数据表明：K411的乙酰化可以增强ORF2多肽对蛋白酶体依赖性降解的抵抗性，增加ORF2多肽的稳定性；而且K411乙酰化对ORF2的这种稳定作用可以被HDAC6所拮抗。

为了研究HEV ORF2的蛋白质稳定性和包涵体形成之间的关系，用HDAC6抑制剂TBSA处理表达GFP-1-ORF2或GFP-4-ORF2的细胞8小时，并通过非还原SDS-PAGE检测了单体和多聚体ORF2多肽(图5C)。与DMSO对照组相比，单体ORF2多肽没有随着TBSA处理而显著增加。相反，多聚体ORF2多肽随着TBSA处理而急剧地上调(图5C)。导致此增加的原因可能是高乙酰化水平有利于ORF2包涵体形成。通过还原性SDS-PAGE检测，也评估了TBSA处理后的ORF2多肽总量(图5C)。这些数据表明，ORF2的高乙酰化水平可以通过促进ORF2多聚化而有利于HEV ORF2的蛋白稳定性。

实施例6：抑制HDAC6可增强HEV复制和VLP形成

由于K411乙酰化在调节ORF2介导的包涵体形成和ORF2多肽质稳定性方面有重要作用，故决定评估乙酰化是否影响HEV病毒复制。近来，已经在PLC/PRF/5细胞中开发出了HEV基因型4的有效细胞培养***(44)。因此，使用特异性HDAC6抑制剂，通过调节HDAC6活性，使用该细胞培养***研究了乙酰化对HEV病毒复制的影响。为此，用HEV感染PLC/PRF/5细胞3周，之后用HDAC6抑制剂处理细胞3天。之后，收集细胞培养物上清液，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检查HEV抗原。结果显示，与DMSO处理相比，HEV抗原(ORF2)的量在TBSA处理后被上调(图6A)。此结果与使用GFP标记的ORF2得到的结果相符(图5C)，说明抑制HDAC6活性可以增强HEV病毒复制。

考虑到从sf9表达的ORF2多肽也可以有效地形成VLP并且该昆虫细胞也具有其自身的乙酰化-去乙酰化***(45)，故通过质谱评估了从sf9细胞上清液纯化的HEV 1-ORF2VLP的乙酰化，并证实了ORF2K411被乙酰化(图6B)。靶向HDAC6的小分子抑制剂TSA、TBSA和CAY(CAY10603)，被添加至表达ORF2的sf9细胞中。5天后，ELISA检测细胞培养物上清液中的ORF2。结果显示，所有三种抑制剂均显著地改善了ORF2表达(图6C)，说明HDAC6抑制剂增强VLP形成。实际上，尽管CAY处理增加了游离ORF2的水平，但是与DMSO对照处理相比，在用所有三种HDAC6抑制剂处理后，通过超离心从sf9细胞培养物上清液纯化的VLP都显示出显著增加(图6D,6E)。

此外，使用透射电子显微镜评估乙酰化对VLP形成的影响。发现，GFP-1-ORF2成功自组装为VLP(集中于黑色区域)(图6F)。在用TBSA处理细胞后，与ORF2^K411R VLP相比，ORF2VLP区域显得大得多，进一步证实了K411的乙酰化可在ORF2VLP组装或ORF2VLP稳定化上具有重要作用。在GFP-4-ORF2和GFP-4-ORF2^K411R表达细胞中的这些结果，与基因型1ORF2的结果相似(图6G)。

综上，这些数据表明，ORF2的高乙酰化水平促进HEV复制和VLP组装，而HDAC6可起到对抗HEV复制和病毒颗粒形成的宿主防御机制。

讨论：

病毒包涵体已经被提出是有效病毒复制的复制工厂或平台(31)。一般，包涵体可以由HEV病毒颗粒或衣壳蛋白ORF2与细胞蛋白的聚集物自发形成。然而，不知晓宿主蛋白如何调节衣壳蛋白ORF2自组装和病毒包涵体形成。HEV病毒具有有限的基因组大小，由此在该病毒的生命周期中需要利用宿主细胞蛋白。在此本发明人报道了HEV ORF2稳定性维持和包涵体形成所基于的一种新机制。本发明人发现，HEV ORF2在基因型1和基因型4的保守氨基酸残基K411位置被乙酰化。当K411被突变为精氨酸时，ORF2形成包涵体的能力和该蛋白质的稳定性被显著地削弱，说明赖氨酸乙酰化参与调节包涵体形成和ORF2抗原丰度。

赖氨酸乙酰化在病毒生命周期的调节中具有重要作用。例如，当α-微管蛋白的乙酰化被抑制时，HIV-1包膜依赖性细胞融合和感染受到极大抑制(46,47)。考虑到α-微管蛋白在哺乳动物细胞中被乙酰化且微管参与人3型副流感病毒包涵体的融合(31)，因此存在这样的可能性，即，在TSA和TBSA处理下HEV ORF2包涵体的增加可能部分地是由α-微管蛋白的乙酰化受到抑制所导致。然而，乙酰化缺失的ORF2^K411R突变体丧失聚集为包涵体的能力，说明ORF2乙酰化对于该过程是必需的。

延时活细胞成像揭示出，ORF2的K411乙酰化对于从头包涵体自组装具有显著的影响。而且，K411的乙酰化显著地促进了HEV ORF2通过形成多聚体来对抗蛋白酶体依赖性降解途径的抗性，促进了HEV ORF2的稳定性。因此，本发明人的发现揭示了一种通过宿主赖氨酸乙酰化***来调节HEV ORF2稳定性和IB形成的新机制(图7)。尽管负责乙酰化ORF2的K411残基的乙酰转移酶还有待鉴定，但是目前的发现说明HDAC6看起来可以拮抗ORF2乙酰化。就本发明人所知，HEV ORF2是迄今鉴定的HDAC6的第二个病毒蛋白靶点。与ORF2的去乙酰化结果相一致，抑制HDAC6极大增强了ORF2多肽稳定性、包涵体形成、HEV复制和病毒样颗粒形成。这说明，HDAC6可以通过拮抗ORF2乙酰化而发挥对抗HEV感染的宿主防御机制。因此，调节ORF2的乙酰化可以是在病重患者和慢性HEV感染患者中用于HEV治疗的新方法。此外，HDAC6抑制剂的应用可以改善HEV疫苗生产效力。

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Claims (23)

1.一种改善HEV病毒生产的方法，包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养HEV感染的细胞，

其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，

其中所述HEV病毒是基因型1-4的HEV病毒。

2.一种改善HEV病毒样颗粒生产的方法，包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养包含表达ORF2多肽的重组表达构建体的细胞，

其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，

其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：

(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；

(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN且包含全长ORF2序列的aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；

(c)(a)或(b)的同源物或变体。

3.一种改善HEV ORF2多肽生产的方法，包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养包含编码HEVORF2多肽的核酸的细胞，

其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，

其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：

(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；

(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN且包含全长ORF2序列的aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；

(c)(a)或(b)的同源物或变体。

4.权利要求1-3的方法，其中敲低细胞中HDAC6的表达水平，优选地使用抑制HDAC6表达的核酸分子，尤其是siRNA或shRNA或其表达构建体来实现HDAC6水平的敲低；优选地，在病毒感染或ORF2表达之前敲低HDAC6表达。

5.权利要求1-4的方法，其中所述细胞是HDAC6敲低细胞，优选地细胞是HDAC6组成型敲低细胞或HDAC6条件性敲低细胞。

6.权利要求1-3的方法，其中使用HDAC6化学抑制剂处理细胞以降低细胞中HDAC6活性，

其中HDAC6化学抑制剂选自：非选择性抑制剂如TSA、Vorinostat,LBH589,ITF2357,PXD-101，或HDAC6选择性抑制剂如rocilinostat(ACY-1215)，ACY-241，Tubacin，Tubastatin A(TBSA)，CAY10603，Nexturastat A，HPOB，ACY-738，ACY-775,和ACY-1083，或其任意组合。

7.权利要求6的方法，其中使用选自以下的HDAC6抑制剂处理细胞：

(a)浓度0.2μM-5μM，优选1μM的Trichostatin A(TSA)，

(b)浓度1μM-10μM，优选6μM的Tubastatin A(TBSA)，

(c)浓度0.1μM-1μM，优选0.2μM的CAY10603。

8.权利要求1-7的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中HEV ORF2蛋白的K411乙酰化水平增加。

9.权利要求1-8的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中ORF2的稳定性增加和/或细胞中ORF2的量增加，尤其是细胞中ORF2多聚体的量增加。

10.权利要求1-9的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中HEV病毒的复制和/或HEV病毒产量增加。

11.权利要求1-9的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中VLP的组装和/或VLP产量增加。

12.HDAC6抑制剂，如HDAC6抑制性核酸或HDAC6化学抑制剂，的用途，

(a)用于增加HEV ORF2的K411乙酰化水平,

(b)用于增加HEV ORF2的稳定性和/或ORF2产量，

(c)用于增加HEV病毒复制和/或病毒产量,或

(d)用于增加HEV VLP的组装和/或VLP产量的用途。

13.一种细胞培养***，其包括：

(i)包含编码ORF2多肽的核酸的细胞；和(ii)HDAC6抑制剂，

其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，

其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：

(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；

(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN且包含全长ORF2序列的aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；

(c)(a)或(b)的同源物或变体。

14.权利要求13的细胞培养***，其中所述抑制剂是引入所述细胞中的HDAC6抑制性核酸分子，尤其是siRNA或shRNA或其表达构建体；或所述抑制剂是加入所述细胞的培养物中的HDAC6化学抑制剂，尤其是HDAC6选择性抑制剂。

15.权利要求14的细胞培养***，其中所述细胞是基因型1-4的HEV病毒感染的细胞。

16.权利要求14的细胞培养***，其中所述细胞是引入了表达所述ORF2多肽的表达构建体的重组细胞。

17.权利要求14-16的细胞培养***用于生产病毒、病毒样颗粒或ORF2多肽的用途。

18.一种包含HDAC6敲低细胞的细胞培养物，其中所述细胞包含编码HEV ORF2的核酸，

其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：

(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；

(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK⁴¹¹LYTSVEN且包含全长ORF2序列的aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；

(c)(a)或(b)的同源物或变体，

优选地其中所述细胞是HEV感染的细胞，或是包含表达ORF2多肽的表达构建体的细胞。

19.权利要求17的细胞培养物用于生产HEV病毒、病毒样颗粒或ORF2多肽的用途。

20.根据权利要求1的方法得到的病毒、或根据权利要求2的方法得到的病毒样颗粒、或根据权利要求3的方法得到的ORF2多肽用于制备免疫组合物或疫苗的用途。

21.一种治疗HEV病毒感染的方法，包括向感染HEV的个体施用HEV ORF2蛋白K411乙酰化调节剂，其中所述调节剂降低ORF2蛋白K411的乙酰化水平，其中HEV病毒是基因型1-4的HEV病毒。

22.权利要求21的方法，其中所述调节剂增加细胞中HDAC6的表达和/活性，优选地所述调节剂是HDAC6表达核酸。

23.权利要求21的方法，其中所述个体是哺乳动物，例如人或猪。