CN108795867A - 用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法 - Google Patents

用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，包括步骤：(1)将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；(2)将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。采用了本发明的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，可以模拟生理微环境，用于更好地理解结直肠癌转移过程中粘附和侵袭能力的变化，将完善现用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型，且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解。

Description

用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是指一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法。
背景技术
20多年，中国和其他经济转变型国家的结肠癌发病率在不断上升，主要的原因是环境因素和人的生活和饮食习惯的改变而引起的。结直肠癌已经成为世界常见恶性肿瘤之一，发病率占胃肠道肿瘤的第3位的结肠癌，其复发与转移是临床上急需解决的问题。
研究发现，腹膜转移的发生是癌细胞经血路腹膜转移或腹膜直接种植生长所致。临床表明，患者出现腹膜转移的情况下，病情发展加快、预后差，多需采用联合治疗措施。胃肠道肿瘤细胞之所以容易发生手术后腹膜转移，是因为腹膜腔表面覆盖着一层间皮细胞，当脱落的肿瘤细胞接触到间皮细胞时，就会粘附在上面，侵入腹膜，逐渐形成新的肿瘤。虽然已经建立的动物模型可以用于体内药物的筛选，但是对于体外研究以及早起分子标志物的发现仍存在一定的弊端。鉴于肿瘤转移是一个极其复杂的过程，它包括细胞外基质、细胞粘附性能改变、肿瘤血管形成、细胞存活等几个方面。
二维(2D)表面细胞的培养为基础细胞生物学和肿瘤发生提供了突破性的见解。然而，在这些简化的条件下，器官或肿瘤的大多数生理参数(例如组织结构，细胞与细胞和细胞与基质的相互作用，机械性质以及生物化学网络)都丧失了。
近期的研究都在检测癌细胞间的相互作用时，细胞外基质和间皮细胞也需要进一步的加入研究中。目前没有研究完成细胞外基质或间皮细胞的体外培养实验。并且，目前的研究并没有明确成纤维细胞在癌细胞粘附和侵袭过程中的作用。此外，大多数研究只进行了癌细胞转移到腹膜的研究，然后仅仅推测转移的作用机制是和其他转移(如，肝转移)是相似的。然而，目前并不清楚为什么结肠癌有一个对腹膜转移的倾向，为什么结肠癌转移到腹膜比其他位点更容易发生。
本发明致力于提出一个新型的模拟体内结肠癌抚摸转移的体外三维模型，用来研究结肠癌腹膜转移过程中的微环境存在的作用以及早期结肠癌转移标志物的寻找和探索。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种完善用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型、且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法。
为了实现上述目的，本发明的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法如下：
所述的方法包括步骤：
(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；
(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；
(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。
较佳地，所述的步骤(1)中的成纤维细胞为原代腹膜成纤维细胞；所述的步骤(1)中的I型胶原为I型鼠尾胶原蛋白；所述的步骤(2)中的间皮细胞为原代腹膜间皮细胞；所述的步骤(3)中的结肠癌细胞为结肠癌细胞HCT116。
较佳地，所述的步骤(1)的具体步骤为：
准备好悬浮于培养液的成纤维细胞，并放置于冰浴中，将I型胶原加到0.1mol/LNaOH中，立即混匀，再加入10×PBS或10×培养液，混匀，混匀后pH为7左右，加入成纤维细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。
在所述的体外三维模型中，每100ul培养基中成纤维细胞的个数为100～200个。
较佳地，在所述的体外三维模型中，间皮细胞贴壁伸展后在成纤维细胞-I型胶原复合体表面形成融合层，且所述的融合层完全覆盖所述的成纤维细胞-I型胶原复合体表面。
较佳地，所述的方法在无菌环境中进行。
较佳地，所述的步骤(1)中的成纤维细胞和所述的步骤(2)中的间皮细胞传代均不可超过10代。
较佳地，所述的步骤(1)中的成纤维细胞和所述的步骤(2)中的间皮细胞均通过形态学、免疫荧光法鉴定。
较佳地，所述的步骤(3)中的结肠癌细胞使用荧光标记。
采用了本发明的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，可以模拟生理微环境，用于更好地理解结直肠癌转移过程中粘附和侵袭能力的变化，它结合了胞外基质、原代人间皮细胞和原代人腹膜成纤维细胞来研究基质和胞外基质两者在转移过程的作用，用于研究人间皮细胞以及人成纤维细胞在结直肠癌细胞粘附侵袭这个过程中的作用，以及共培养体系下，癌细胞对正常细胞是否有一定的促进其癌变的过程，将完善现用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型，且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解。
附图说明
图1为显微镜白光拍摄下组织分离提取的原代人腹膜间皮细胞细胞形态。
图2为显微镜白光拍摄下组织分离提取的原代人成纤维细胞细胞形态。
图3为免疫荧光法鉴定腹膜间皮细胞：角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)抗原阳性，脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylase)阴性。
图4为免疫荧光法鉴定腹膜成纤维细胞：角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)、脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylase)抗原阳性。
图5为所建立的3D模型示意图，主要由成纤维细胞、间皮细胞和结肠癌细胞组成，将成纤维细胞包埋在I型胶原中，在顶部铺上一层间皮细胞的融合层，并将癌细胞铺于最上层。
图6为用荧光标记的HCT116细胞检测2D和3D培养体系中癌细胞对药物敏感性的差异。
图7为用荧光标记的HCT116细胞在2D和3D培养模型中分别进行粘附能力测定，通过荧光显微镜测定粘附细胞的数量。
图8为用荧光标记的HCT116细胞在2D和3D培养模型中分别测定侵袭能力测定，通过荧光显微镜测定侵入细胞的数量。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
本发明的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法包括步骤：
(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；
(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；
(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。
其中，所述的步骤(1)中的成纤维细胞为原代腹膜成纤维细胞；所述的步骤(2)中的间皮细胞为原代腹膜间皮细胞。
本发明提供一种腹膜间皮细胞原代培养，具体包括：
1)腹膜间皮细胞的提取分离
无菌腹部手术摘除的腹膜组织，将剪取血管脂肪相对较少的腹膜组织置于无菌培养皿内，用无菌PBS漂洗3次后，用剪子剪成3cm*3cm大小，将剪取的腹膜组织置于含500U/ml的青霉素和500ug/ml链霉素的PBS磷酸盐缓冲液中浸泡20min，然后用PBS冲洗5min，将漂洗后的组织平铺于无菌培养皿内，再用PBS反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的组织剪成1cm*1cm大小，小块放入50ml培养瓶内，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA细胞消化液20ml孵育，放置于37℃，5％CO2培养箱内消化25min，每5min振荡一次，最后5min保持静止。消化结束后将消化液用100目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含20％的小牛血清的RPMI1640培养基终止消化。用移液器分装于10ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞沉淀，分装于50ml细胞培养瓶中，放置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱内培养。
2)腹膜间皮细胞传代培养
原代细胞培养24h后，以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，此后每3天换液1次。约培养(4～7)d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液0.5ml，在37℃，5％CO2，培养箱内消化5min。镜下观察细胞消化情况。细胞脱落后，加入5ml完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管中，1000r/ml离心10min，弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞沉淀，分别传代于50ml培养瓶中。加入适量完全培养液，于培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。间皮细胞采用前几代(1～10代)以减少去分化和原始表性的改变。
3)利用形态学、免疫荧光法鉴定腹膜间皮细胞
如图1所示，分离培养的腹膜间皮细胞光镜下呈铺路鹅卵石状；如图3所示，免疫组化鉴定显示角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)抗原阳性，脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylase)阴性来确定。证实培养的细胞的确为PMC，并排除成纤维细胞、白细胞、血管内皮细胞。
本发明提供一种腹膜成纤维细胞原代培养，具体包括：
1)腹膜成纤维细胞的提取分离
腹膜组织用含100U的透明质酸酶和III型胶原蛋白酶，总体积为100ml的PBS在37℃消化6小时。丢弃组织，含有细胞的悬浮液转移至15ml离心管中，1500rpm/min离心5min，沉淀用RPMI1640(含20％的FBS和100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素)培养液洗两次。成纤维细胞的纯化由脯氨酰羟化酶免疫组化染色阳性来确定。成纤维细胞采用前几代(1～10代)以减少去分化和原始表型的改变。
2)腹膜成纤维细胞传代培养
原代细胞培养24h后，以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，此后每3d换液1次。约培养(4～7)d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液0.5ml，在37℃，5％CO2，培养箱内消化2～5min。镜下观察细胞消化情况。细胞脱落后，加入5ml完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管中，1000rpm/min离心10min，弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞沉淀，分别传代于50ml培养瓶中。加入适量完全培养液，于培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。间皮细胞采用前几代(1-10代)以减少去分化和原始表性的改变。
3)用形态学、免疫荧光法鉴定腹膜成纤维细胞
如图2所示，分离培养的腹膜成纤维细胞光镜下呈长梭形；如图4所示，免疫组化鉴定显示角蛋白(Cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)抗原阳性，脯氨酰羟化酶(Prolyl-hydroxylase)阳性来确定。证实培养的细胞的确为成纤维细胞。
本发明提供一种免疫荧光法鉴定细胞抗原表达的方法，具体包括：
1)培养板中固定细胞爬片，将间皮细胞或成纤维细胞用RPMI1640(含20％FBS，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素)培养液进行铺板，待细胞贴壁后，用PBS浸洗3次，每次3min；
2)用4％的多聚甲醛4℃固定爬片20min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3)0.3％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；
4)PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加5％BSA(PBS配制)，室温封闭30min；
5)吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(1:50，PBS配制，含1％BSA和0.1％Triton X-100)并放入湿盒，4℃孵育过夜；
6)加荧光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育至少1小时，PBS浸洗切片3次，每次3min；注意。
7)复染核：滴加DAPI(1μg/ml,PBS稀释)避光孵育5min，对标本进行染核，PBS洗去多余的DAPI，漂洗3次，每次3min；
8)在荧光显微镜下观察采集图像。
本发明提供一种构建体外三维转移模型的实施方式，具体包括：
含成纤维细胞的三维胶原的制备(以配制1毫升，1mg/ml三维胶为例)：准备好悬浮于培养液的成纤维细胞，并放置于冰浴中，将200ul鼠尾胶原蛋白I型(5mg/ml)加到12ul0.1mol/L NaOH中(如果反过来把12ul 0.1mol/L NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结)，立即混匀，再加入23ul 10×PBS或10×培养液，混匀(混匀后pH为7左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试)；
加入760ul的成纤维细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。将培养器皿在室温下放置20分钟，2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺铺入板中。间皮细胞于1ml培养基中铺入板中18～38小时后，将HCT116-GFP细胞铺入板中以完成3D培养凝胶模型的构建，图5显示了本发明提供的3D模型示意图。
实施例1.MTT实验
MIT实验为检测荧光标记的HCT116细胞在3D培养体系相对于2D培养体系中的药物敏感性。
96孔培养板中：200个成纤维细胞混合鼠尾胶原蛋白I型在培养基中(RPMI1640，含20％FBS，100U/ml青霉素和100ug/ml的链霉素)。胶凝固后，10000个原代间皮细胞加入到培养体系中，37℃孵育，直到间皮细胞形成一个汇合层(18～38小时)。HCT116-GFP细胞悬液接种在每孔中。待细胞完全贴壁后，抗癌药5-FU进行给药，给药24小时后，通过荧光显微镜100倍镜获取，定量细胞存活数目，计算出细胞存活率，三次重复实验。
如图6所示，相较于2D培养体系，本发明中的3D模型***下的结肠癌细胞在实施例1中，展现出更强的符合体内结肠癌发展趋势的一定耐药性的稳定保持。
实施例2.粘附实验
粘附实验为检测荧光标记的HCT116细胞粘附到间皮细胞和或包裹成纤维细胞的Ⅰ型胶原融合层的能力。
96孔培养板中：200个成纤维细胞混合鼠尾胶原蛋白I型在培养基中(RPMI1640，含20％FBS，100U/ml青霉素和100ug/ml的链霉素)。胶凝固后，10000个原代间皮细胞加入到培养体系中，37℃孵育，直到间皮细胞形成一个汇合层(18～38小时)。HCT116-GFP细胞悬液接种在每孔中。粘附细胞通过荧光显微镜100倍镜获取，定量粘附的细胞数目。三次重复实验。
如图7所示，相较于2D培养体系，本发明中的3D模型***下的结肠癌细胞在实施例2中，展现出更强的符合体内结肠癌发展进程的增强的细胞粘附能力。
实施例3.侵袭实验
侵袭实验为检测荧光标记的HCT116细胞浸润到间皮细胞和包裹成纤维细胞的Ⅰ型胶原融合层的运动能力。
24孔培养板的Transwell(8um孔径的型号)小室中先覆盖一层含200个成纤维细胞和鼠尾胶原蛋白Ⅰ型的混合体(50ul培养基)，在37℃下孵育2-4小时。在含10000个间皮细胞的100ul培养液加入到鼠尾胶原蛋白Ⅰ型和成纤维细胞混合凝胶表面，在37℃培养18-38小时。HCT116-GFP细胞悬液接种在每孔中。细胞通过荧光显微镜100倍镜获取，定量穿透小室到达小室下部的细胞数目。三次重复实验。
如图8所示，相较于2D培养体系，本发明中的3D模型***下的结肠癌细胞在实施例3中，展现出相似的结肠癌细胞的运动能力。
腹膜间皮细胞是构成腹膜的主要细胞群体，并能分泌多种细胞因子，是腹膜原发肿瘤的实质细胞，在腹膜纤维化和腹腔黏连中也起着使动和关键作用。成纤维细胞包括癌的基质的主要细胞组分。有研究表明癌症相关成纤维细胞可以刺激起始的非肿瘤发生正常上皮细胞的肿瘤进展并促进动物模型中结肠癌的生长。同时，其他科研人员发现结肠癌细胞与基质细胞的相互作用可以激活癌细胞中的β-catenin信号通路并导致结肠癌干细胞的增加。因此，了解肿瘤与周围基质间旁分泌相互作用的分子机制将有助于发现可能成为潜在药物靶点的新分子。
单层细胞培养(2D)模型研究肿瘤对化疗敏感性时，得到的结果往往与体内实验有极大的差距。相比于2D培养，3D培养可以在体外很好的模拟癌组织的生长情况，包括侵袭性、耐药性、基因表达变化和蛋白分泌情况。本发明旨在构建模拟体内成瘤情况及癌细胞见相互作用，尤其是细胞间粘附的三维培养模型。从体内分离得到的具有耐药性的肿瘤细胞进行体外单层培养时，其耐药性多发生降低或消失；而在三维细胞培养模型中，细胞逐渐具备耐药性。腹膜转移三维模型(间皮细胞、成纤维细胞、结肠癌癌细胞)来研究结肠癌粘附和侵袭。3D模型包括从腹膜获取的原代的成纤维细胞，与I型胶原混合，再覆盖一层从腹膜获取的原代间皮细胞。在添加结肠癌细胞后，构建三维培养的腹膜微观转移模型。在3D培养或三维聚集体(多细胞球体)中生长的细胞更好地重现了组织和肿瘤的体内结构。3D培养***可以解决不同癌症模型中的人肿瘤和基质细胞之间的功能性相互作用。
采用了本发明的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，可以模拟生理微环境，用于更好地理解结直肠癌转移过程中粘附和侵袭能力的变化，它结合了胞外基质、原代人间皮细胞和原代人腹膜成纤维细胞来研究基质和胞外基质两者在转移过程的作用，用于研究人间皮细胞以及人成纤维细胞在结直肠癌细胞粘附侵袭这个过程中的作用，以及共培养体系下，癌细胞对正常细胞是否有一定的促进其癌变的过程，将完善现用于研究结直肠癌癌转移的体外细胞培养模型，且有助于增强对结直肠癌癌早期转移过程的总体理解。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (9)

1.一种用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)、将成纤维细胞悬浮液与I型胶原混合，混匀后立即加到培养器皿中；
(2)、将培养器皿在室温下放置20分钟，随后放置在细胞培养箱中2～4小时后凝固，继续将间皮细胞铺入板中18～38小时；
(3)将结肠癌细胞铺入板中，完成体外3D模型的构建。
2.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的成纤维细胞为原代腹膜成纤维细胞；所述的步骤(1)中的I型胶原为I型鼠尾胶原蛋白；所述的步骤(2)中的间皮细胞为原代腹膜间皮细胞；所述的步骤(3)中的结肠癌细胞为结肠癌细胞HCT116。
3.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(1)的具体步骤为：
准备好悬浮于培养液的成纤维细胞，并放置于冰浴中，将I型胶原加到0.1mol/L NaOH中，立即混匀，再加入10×PBS或10×培养液，混匀，混匀后pH为7，加入成纤维细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。
4.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，在所述的体外三维模型中，每100ul培养基中成纤维细胞的个数为100～200个。
5.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，在所述的体外三维模型中，间皮细胞贴壁伸展后在成纤维细胞-I型胶原复合体表面形成融合层，且所述的融合层完全覆盖所述的成纤维细胞-I型胶原复合体表面。
6.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的方法在无菌环境中进行。
7.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的成纤维细胞和所述的步骤(2)中的间皮细胞传代均不可超过10代。
8.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的成纤维细胞和所述的步骤(2)中的间皮细胞均通过形态学、免疫荧光法鉴定。
9.根据权利要求1所述的用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的结肠癌细胞使用荧光标记。
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