CN108794568A - 一种大黄鱼活性多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大黄鱼活性多肽，活性多肽中为分子量为1‑3kDa的抗氧化剂活性多肽，且活性多肽中含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，其含量为35%以上。该活性多肽的制备方法为：向大黄鱼肉中加水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡后匀浆；匀浆中加入复合蛋白酶，超声波酶解，灭酶，过滤，滤液超滤，纳滤得浓缩肽液，采用凝胶过滤色谱分离纯化，收集洗脱抗氧化能力强的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得活性多肽。有益效果为：本发明大黄鱼活性多肽的分子量较低且分布均匀，含有较多的碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，表现出较强的体外及体外抗氧化活性，其制备方法可提高活性蛋白的溶出速率和蛋白质在水中的溶解度。

Description

一种大黄鱼活性多肽

技术领域

本发明涉及生物活性成分技术领域，特别是涉及一种大黄鱼活性多肽。

背景技术

大黄鱼属鲈形目，石首鱼科，黄鱼属，也称黄鱼、大黄花，是我国特有的地方性鱼类，其身体呈长楠圆形，鱼体侧扁，体长约为体高的3倍，头部较大，吻稍钝尖，鱼体呈黄褐色，侧线下方各鳞具有发达的发光腺体，呈金黄色，各鳍呈黄色或灰黄色。大黄鱼是我国近海重要经济鱼类，主要分布于黄海中部以南至琼州海峡以东的中国大陆近海及朝鲜西海岸。关于大黄鱼的研究主要集中在养殖技术、疾病防治和鱼肉的冷冻保鲜。然而，大黄鱼产业仍存在许多问题，大黄鱼大部分以鲜销品或冷冻销售为主，加工技术含量低，尤其是精深加工技术落后，多为初级加工产品（半干黄花鱼、糟黄鱼、黄鱼莖、烟熏大黄鱼等），产品加工附加值低。近年来，随着养殖规模的扩大和养殖技术的提高，也产生了供过于求、市场需求乏力的问题。因此，推动大黄鱼的精深加工，提高产品附加值十分必要。随着科技的进步与发展，产品的保健与药用价值越来越受到关注。运用酶法水解技术水解水产蛋白，制备生物活性化，是开发利用水产蛋白资源的一个重要途径。大黄鱼含有丰富的蛋白质，利用现代食品生物技术水解大黄鱼制备生物活性化，进一步提高这一优质蛋白质资源的利用率，为大黄鱼的精深加工开辟新途径，具有重要的科学价值。然而天然蛋白质中往往含有较多的疏水蛋白，限制了蛋白酶对底物的深度水解，同时也影响了某些疏水性氨基酸如缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸的释放，导致抗氧化肽无法形成良好的氨基酸比例影响其抗氧化活性。超声波可产生空化效应、机械效应和热效应，可改变物料的物理性质，改善相关功能性质，超声波预处理和水解过程中一定的超声波辅助处理主要是改变蛋白质分子的聚集状态，促进蛋白质解折叠、促进化链伸展和特异位点的释放，使蛋白质分子分布更均匀，并降低蛋白质分子间的相互作用，提高酶与底物接触效率。因此，利用超声波辅助酶解，可提高蛋白的水解度和产物的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子量较低且分布均匀，含有较多的碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，表现出较强的体外及体外抗氧化活性的大黄鱼活性多肽，其制备方法可提高活性蛋白的溶出速率和蛋白质在水中的溶解度。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种大黄鱼活性多肽，活性多肽为分子量为1-3kDa的抗氧化剂活性多肽。本发明活性多肽的分子量较低且分布均匀，表现出较强的体外及体外抗氧化活性，其O₂ ^-·清除力、DPPH·清除力和Cu²⁺螯合力均较强，使生物大分子和生物膜等免受自由基的损害，还能有效抑制多酷氧化酶的活性，降低食物褐变的几率，使得该活性多肽能广泛应用于化妆品、保健食品、医药制品和饲料添加剂等领域。

作为优选，活性多肽中含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，其含量为35%以上。较多的碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，可通过侧链上的羧基整合Fe²⁺、Cu²⁺等金属离子，同时组氨酸上的咪唑环具有很强的给质子能力，且环上的共扼结构也有利于给出质子后其自由基中间体的稳定，使得活性多肽表现出更强的自由基清除活化。

一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其包括如下的步骤：

前处理：按固液比为1:10-15向大黄鱼肉中加水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡25-35min后匀浆，备用；

超声波酶解：调节匀浆的pH至6.5-7.5，按加酶量为3-4%加入复合蛋白酶，然后在温度为40-50℃、超声波功率为600-800W的条件下超声波酶解40-60min，灭酶，过滤，滤液即为酶解液，超声波可产生空化效应、机械效应和热效应，可改变蛋白质分子的聚集状态，促进蛋白质解折叠、促进化链伸展和特异位点的释放，使蛋白质分子分布更均匀，并降低蛋白质分子间的相互作用，提高酶与底物接触效率，因此，利用超声波辅助酶解，可提高蛋白的水解度和产物的活性；

过滤：将酶解液经截留分子量为3.5-4.5kDa的超滤膜进行超滤，获得3.5-4.5kDa以下的肽混合物，再经0.5-1kDa的纳滤膜纳滤，获得0.5-1Da以上的浓缩肽液，备用，由于蛋白质的酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的肽和游离的氨基酸，该步骤分离属于物理方式，没有引入化学试剂，较好的保存了胶原蛋白肽的原有特性，且对酶解液具有较好分离纯化效果；

分离纯化：将浓缩肽液采用Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化，于214nm下检测吸收光值，上样量为0.2-2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2-2mL/min，检测波长为220nm，收集洗脱抗氧化能力强的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得活性多肽。

作为优选，前处理步骤中莽草酸的添加量为大黄鱼肉重的0.02-0.03%，对羟基肉桂酸的添加量为大黄鱼肉重的0.05-0.1‰。莽草酸和对羟基肉桂酸的存在一方面能够改变细胞的渗透压，破坏细胞膜物质，提高活性蛋白的溶出速率，大大提高了提取的效率，另一方面能够作用于蛋白质的疏水端，提高蛋白质在水中的溶解度，使所得酶解液中含有较多种类活性多肽，各活性活性多肽间起到增益作用，提高活性多肽的抗氧化作用。

作为优选，超声波酶解步骤中复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶和羧肽酶B，其重量比为1:0.6-1:0.02-0.04。该复合蛋白酶是含有内切酶和外切酶，能广泛酶切多个位点，对活性多肽中氨基酸的组成和数量有重要影响，使得酶解产物的酶解度和活性多肽的得率均较高，更使得活性多肽中含有较多的碱性氨基酸，使得活性多肽表现出更强的自由基清除活化。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明活性多肽的分子量较低且分布均匀，表现出较强的体外及体外抗氧化活性，使得该活性多肽能广泛应用于化妆品、保健食品、医药制品和饲料添加剂等领域；2）该活性多肽含有较多的碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，使得活性多肽表现出更强的自由基清除活化；3）该活性多肽的制备方法可提高活性蛋白的溶出速率和蛋白质在水中的溶解度，使所得酶解液中含有较多种类活性多肽，最终提高蛋白的水解度和产物的活性，使蛋白质分子分布更均匀。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种大黄鱼活性多肽，活性多肽为分子量为1-3kDa的抗氧化剂活性多肽。上述活性多肽的分子量较低且分布均匀，表现出较强的体外及体外抗氧化活性，其O₂ ^-·清除力、DPPH·清除力和Cu²⁺螯合力均较强，使生物大分子和生物膜等免受自由基的损害，还能有效抑制多酷氧化酶的活性，降低食物褐变的几率，使得该活性多肽能广泛应用于化妆品、保健食品、医药制品和饲料添加剂等领域。

活性多肽中含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，其含量为35%以上。较多的碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸，可通过侧链上的羧基整合Fe²⁺、Cu²⁺等金属离子，同时组氨酸上的咪唑环具有很强的给质子能力，且环上的共扼结构也有利于给出质子后其自由基中间体的稳定，使得活性多肽表现出更强的自由基清除活化。

一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其包括如下的步骤：

1）前处理：按固液比为1:10向大黄鱼肉中加水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡35min后匀浆，备用；

2）超声波酶解：调节匀浆的pH至6.5，按加酶量为4%加入复合蛋白酶，然后在温度为40℃、超声波功率为800W的条件下超声波酶解40min，灭酶，过滤，滤液即为酶解液，超声波可产生空化效应、机械效应和热效应，可改变蛋白质分子的聚集状态，促进蛋白质解折叠、促进化链伸展和特异位点的释放，使蛋白质分子分布更均匀，并降低蛋白质分子间的相互作用，提高酶与底物接触效率，因此，利用超声波辅助酶解，可提高蛋白的水解度和产物的活性；

3）过滤：将酶解液经截留分子量为4.5kDa的超滤膜进行超滤，获得4.5kDa以下的肽混合物，再经0.5kDa的纳滤膜纳滤，获得0.5Da以上的浓缩肽液，备用，由于蛋白质的酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的肽和游离的氨基酸，该步骤分离属于物理方式，没有引入化学试剂，较好的保存了胶原蛋白肽的原有特性，且对酶解液具有较好分离纯化效果；

4）分离纯化：将浓缩肽液采用Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化，于214nm下检测吸收光值，上样量为2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2mL/min，检测波长为220nm，收集洗脱抗氧化能力强的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得活性多肽。

前处理步骤中莽草酸的添加量为大黄鱼肉重的0.03%，对羟基肉桂酸的添加量为大黄鱼肉重的0.05‰。莽草酸和对羟基肉桂酸的存在一方面能够改变细胞的渗透压，破坏细胞膜物质，提高活性蛋白的溶出速率，大大提高了提取的效率，另一方面能够作用于蛋白质的疏水端，提高蛋白质在水中的溶解度，使所得酶解液中含有较多种类活性多肽，各活性活性多肽间起到增益作用，提高活性多肽的抗氧化作用。

超声波酶解步骤中复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶和羧肽酶B，其重量比为1:1:0.02。该复合蛋白酶是含有内切酶和外切酶，能广泛酶切多个位点，对活性多肽中氨基酸的组成和数量有重要影响，使得酶解产物的酶解度和活性多肽的得率均较高，更使得活性多肽中含有较多的碱性氨基酸，使得活性多肽表现出更强的自由基清除活化。

实施例2：

一种大黄鱼活性多肽，活性多肽为分子量为1-3kDa的抗氧化剂活性多肽。

活性多肽中含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，其含量为35%以上。

一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其活性多肽的制备方法包括如下的步骤：

1）前处理：按固液比为1:12向大黄鱼肉中加水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡30min后匀浆，备用；

2）超声波酶解：调节匀浆的pH至7.0，按加酶量为3.5%加入复合蛋白酶，然后在温度为45℃、超声波功率为700W的条件下超声波酶解50min，灭酶，过滤，滤液即为酶解液；

3）过滤：将酶解液经截留分子量为4kDa的超滤膜进行超滤，获得4kDa以下的肽混合物，再经0.8kDa的纳滤膜纳滤，获得0.8Da以上的浓缩肽液，备用；

4）分离纯化：将浓缩肽液采用Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化，于214nm下检测吸收光值，上样量为1mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为1mL/min，检测波长为220nm，收集洗脱抗氧化能力强的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得活性多肽。

前处理步骤中莽草酸的添加量为大黄鱼肉重的0.025%，对羟基肉桂酸的添加量为大黄鱼肉重的0.08‰。

超声波酶解步骤中复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶和羧肽酶B，其重量比为1:0.8:0.03。

实施例3：

一种大黄鱼活性多肽，活性多肽为分子量为1-3kDa的抗氧化剂活性多肽。

活性多肽中含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，其含量为35%以上。

一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其活性多肽的制备方法包括如下的步骤：

1）前处理：按固液比为1:15向大黄鱼肉中加水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡25min后匀浆，备用；

2）超声波酶解：调节匀浆的pH至7.5，按加酶量为3%加入复合蛋白酶，然后在温度为50℃、超声波功率为600W的条件下超声波酶解60min，灭酶，过滤，滤液即为酶解液；

3）过滤：将酶解液经截留分子量为3.5kDa的超滤膜进行超滤，获得3.5kDa以下的肽混合物，再经1kDa的纳滤膜纳滤，获得1Da以上的浓缩肽液，备用；

4）分离纯化：将浓缩肽液采用Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化，于214nm下检测吸收光值，上样量为0.2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为2mL/min，检测波长为220nm，收集洗脱抗氧化能力强的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得活性多肽。

前处理步骤中莽草酸的添加量为大黄鱼肉重的0.02%，对羟基肉桂酸的添加量为大黄鱼肉重的0.1‰。

超声波酶解步骤中复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶和羧肽酶B，其重量比为1:0.6:0.04。

实施例4：

体外抗氧化活性测试

用蒸饱水和实施例2活性多肽配制浓度为20mg/mL的溶液，分别测定各组分还原力、O₂ ^-·清除力、DPPH·清除力和Cu²⁺螯合力。

还原力测定：取2 mL样品溶液与2mL0.2mol/L磷酸酸盐缓冲液混合（pH6.6），再加入2mL1%铁氯化钟溶液，在50℃下保温20min后迅速冷却。然后加入2mL10%（w/v）氯乙酸溶液，混匀后3000r/min离必10min。取1 mL上清液，加入3mL蒸馏水和0.4mL0.1%（w/v）氯化铁溶液充分混匀后静置10min，于700nm下测量吸光值，计算得其还原力为0.902。

O₂ ^-·清除力测定：将邻苯三酚溶于10mmol/L HCl中配制浓度为3mmol/L的溶液。取pH8.2的Tris-HCl缓冲液（浓度100mmol/L）4.5mL于25℃水浴保温20min。取出后立即加入500μL样品溶液，再加入邻苯三酚1mL（试验前于25℃保温），迅速摇匀并开始计时，每隔30s测定325nm处吸光值A325，反应4.5min后结束。样品抑制邻苯三酚自氧化的速率为V_样，空白管以蒸馏水作对照V_空，计算公式为：O₂ ^-·清除力（%）=（V_空-V_样）/V_空×100%，计算得其O₂ ^-·清除力为83.97%。

DPPH·清除力测定：用95%乙醇溶液配制浓度为0.2mmol/L的DPPH·溶液。取2mLDPPH·溶液于试管中，加入1mL样品溶液与1mL蒸溜水，混合均匀，在暗室下避光反应30min后在517nm处测定吸光值（A_S）。以95%乙醇溶液代替样品溶液作为对照（A_c），空白对照以95%乙醇溶液代替DPPH·溶液（A_b）。DPPH·清除力按下式计算：DPPH·清除力（%）=1-（V_s-V_b）/V_c×100%，计算得其DPPH·清除力为90.21%。

Cu²⁺螯合力测定：在1mL2mmol/L硫酸铜溶液中加入1mL10%的吡啶及100μL邻苯二酚紫，混合均匀，加入1mL样品溶液，用等体积蒸馏水作为对照，测定632nm处吸光值，分别为A_样和A₀。Cu²⁺螯合力按下式计算：Cu²⁺螯合力（%）=1-A_样/A₀×100%，计算得其Cu²⁺螯合力为75.66%。

计算结果表明，活性多肽的O₂ ^-·清除力、DPPH·清除力和Cu²⁺螯合力均较强，表现出较强的体外抗氧化活性。

实施例5：

体内抗氧化活性测试

所有实验过程，均符合中国法律有关实验动物使用和保护的规定。动物房温度为20±2℃，每天12h日光灯照明，标准颗粒饲料自由进食和饮水。实验动物适应性喂养一周后，随机分成７组，每组10只小鼠并编号。实验期间，毎天观察小鼠的一般行为。具体分组情况如下：第一组：小鼠每日灌胃0.9%生理盐水（正常组），自由进食、饮水；第二组：小鼠皮下注射30mg/kg BWD-Gal（模型组），自由进食、饮水；第三组：注射30mg/kg BWD-Gal，灌胃200mg/kg的实施例2活性多肽产品，自由进食、饮水。小鼠连续给药一个月后，隔夜禁食，去其肝脏、脑和心，测量肝脏中SOD（超氧化物歧化酶）的活性，并与未服用本发明活性多肽的小白鼠（模型组）进行对比，试验结果如表1所示。

表1 药理试验结果

	小白鼠数量（只）	SOD（U/g）
			第一组	10	238.22
第二组	10	89.34
			第三组	10	531.07

由表1可见灌胃本发明实施例2产品的小鼠肝脏中的SOD的活性明显高于第一组和第二组，可见过量的过氧化氨可被有效清除，说明本发明实施例2产品的体内抗氧化效果优异。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种大黄鱼活性多肽，其特征在于：所述活性多肽中为分子量为1-3kDa的抗氧化剂活性多肽。

2.根据权利要求1所述的一种大黄鱼活性多肽，其特征在于：所述活性多肽中含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，其含量为35%以上。

3.一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述的活性多肽的制备方法包括如下的步骤：

1）前处理：向大黄鱼肉中加水，再加入莽草酸和对羟基肉桂酸，浸泡后匀浆，备用；

2）超声波酶解：匀浆中加入复合蛋白酶，超声波酶解，灭酶，过滤，滤液即为酶解液；

3）过滤：将酶解液超滤，纳滤，即得浓缩肽液，备用；

4）分离纯化：将浓缩肽液采用Sephadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化，以蒸馏水为洗脱液，收集洗脱抗氧化能力强的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得活性多肽。

4.根据权利要求3所述的一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述大黄鱼肉和水的固液比为1:10-15，浸泡25-35min。

5.根据权利要求3所述的一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1中莽草酸的添加量为大黄鱼肉重的0.02-0.03%，对羟基肉桂酸的添加量为大黄鱼肉重的0.05-0.1‰。

6.根据权利要求3所述的一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶和羧肽酶B，其重量比为1:0.6-1:0.02-0.04。

7.根据权利要求3所述的一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中加酶量为3-4%，超声波酶解pH为6.5-7.5、温度为40-50℃、超声波功率为600-800W、时间为40-60min。

8.根据权利要求3所述的一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中超滤膜的截留分子量为3.5-4.5kDa，纳滤膜的截留分子量为0.5-1kDa。

9.根据权利要求3所述的一种大黄鱼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4中上样量为0.2-2mL，洗脱液流速为0.2-2mL/min，检测波长为220nm。