CN108779436A - 一种细胞培养基和培养基补充物 - Google Patents

Abstract

一方面，本发明涉及一种本质上无血清白蛋白，化学成分明确的培养基，其高效支持干细胞分化，极大提高实验重复性，并可长期培养分化的细胞。在具体的实施例中，本发明提供了促进干细胞分化为心房和心室心肌细胞的组合物和方法。本发明进一步涉及由干细胞分化心房和心室心肌细胞，和这些心肌细胞的使用，例如，心肌受损修复，新药开发期间的心脏安全性评估，和筛选用于心肌受损的新疗法。

Description

一种细胞培养基和培养基补充物

一.技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种干细胞培养和使其分化能力增强的组合物和方法。本发明提供了提高干细胞心肌分化效率并促进心房和心室心肌细胞形成的组合物和方法，涉及从干细胞分化心房和心室心肌细胞，和这些心肌细胞的应用，如，心肌受损修复及筛选心肌损伤的新治疗方法。

二.背景

由于具有无限增殖和有效分化为心肌细胞的能力^1，2，人多能干细胞(hPSCs)为研究人的心脏发育和心脏疾病、药物开发，尤其是未来心脏细胞替代治疗充血性心力衰竭开辟了一条新途径^3，4。为了实现这些前景，尤其是这些细胞的临床应用，必须在符合生物***要求的培养条件下大量重复生产心肌细胞，特别是心室肌细胞⁵。

hPSCs心肌分化及培养条件是当前hPSC-CMs安全治疗应用的障碍之一。hPSCs最初以鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层，培养在牛血清替代物中⁴。在细胞移植疗法中，细胞培养***中使用的动物或人的产品引起人们对潜在病毒，支原体，和朊病毒传播到细胞的担心，必须进行全面的筛选试验，以排除这些感染传播给细胞移植接受者的风险，并满足临床监管要求⁵。目前大多数用于心肌分化的培养***都包含动物组分^1，2。最近，使用重组人白蛋白建立化学成分明确的心肌分化培养基取得了显著进展^6，7。然而，除去成本和白蛋白的批次差异，大量的重组人白蛋白(5mg/mL⁶，0.5mg/mL⁷)可能会导致大量杂质进入培养***。如果这些污染物质和细胞一起移植，人们将会担心这些污染物在移植患者体内诱发不利的免疫反应。因此，有必要对临床用的干细胞培养组成成分和方法进行优化。

三、发明概述

该概述不用于限制本发明的权利要求范围。本发明的其他技术特征，细节，实用性和优点将在本发明具体实施方式中显现，包括以附图和附加权利要求的方式公开。

为了开发一种无血清白蛋白，化学组分明确的心肌分化培养基，对在人胚胎干细胞诱导心肌分化中广泛使用的一种培养基补充物B27的动物源成分(包括白蛋白)和非必需成分进行***性去除^2,9，并且补充抗氧化剂以维持高效的细胞增殖和心肌分化能力。为期10个月的心肌分化实验数据显示，使用配制的无血清白蛋白、成分明确的培养基(S12培养基)分化心肌，相比于使用了B27补充物的培养基心肌分化效率提高了20.9％，心肌细胞得率提高48.6％，并且组间差异减少了57％。S12培养基不仅支持在二维培养瓶中大规模培养心肌细胞，还可以长期培养心肌细胞(超过100天)。在无血清白蛋白、组分明确的培养条件下用E8培养***和S12培养基，可以获得新的hiPSC细胞系，并增殖分化得到高度均一的心房和心室肌细胞。电生理结果显示，获得的心室肌细胞适用于心肌药物安全性评价。

一方面，一种细胞培养基补充剂，其包括一种替代培养基中血清白蛋白功能的抗氧化剂。一方面，在此公开一种细胞培养基补充剂，其包括至少两种抗氧化剂的组合，替代培养基中血清白蛋白的功能。一方面，在此公开一种细胞培养基补充剂，其包括至少三种抗氧化剂的组合，替代培养基中血清白蛋白的功能。

在前面的任一项实施例中，本文公开的细胞培养基补充剂可包含从以下组中选择出来的至少一种抗氧化剂：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，b)一种维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰半胱氨酸，或谷胱甘肽，或其盐或其酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐，或其酯。其中细胞培养基补充剂配制于基础培养基中，就可以形成本质上无血清白蛋白细胞培养基。

在前面的任一项实施例中，本发明的细胞培养基补充剂可包含从以下组中选择出来的至少两种抗氧化剂的组合：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，b)一种维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰半胱氨酸，或谷胱甘肽，或其盐或其酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐，或其酯。所组成的细胞培养基补充剂配置于基础培养基中，就可以形成基本无血清白蛋白细胞培养基。

在前面的任一项实施例中，本文公开的细胞培养基补充剂可包含从以下组中选择出来的至少三种不同的抗氧化剂的组合：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯。b)一种维生素E的水溶性类似物。c)N-乙酰半胱氨酸，或谷胱甘肽，或其盐或其酯。d)丙酮酸，丙酮酸盐，或其酯。所组成的细胞培养基补充剂配制于基础培养基中，就可以形成本质上无血清白蛋白细胞培养基。

在前面的任一项实施例中，本文公开的细胞培养基补充剂可包含从以下组中选择出来的四种不同的抗氧化剂的组合：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，b)一种维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰半胱氨酸，或谷胱甘肽，或其盐或其酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐，或其酯。

在另一方面，本发明是一个本质上无血清白蛋白的细胞培养基，由一种无血清白蛋白的基础培养基和根据前面任一项实施例制备的一种细胞培养基补充剂组成。

在任一项前面的实施例中，细胞培养基支持干细胞生长和/或分化为心肌细胞，例如分化为心室肌细胞和/或心房肌细胞。在前面任一项实施例中，细胞培养基可支持心肌细胞的培养，如心室肌细胞或心房肌细胞。

在另一方面，此发明是一个包含了根据前面的实施例所述的细胞培养基的包装。在另一方面，此发明提供的是一个试剂盒，它包含根据前面任一项实施例而来的细胞培养基。

在前面的任一项实施例中，这个试剂盒进一步包含能够起始、诱导和/或支持细胞的生长、分化和/或维持其状态的物质。在前面的任一项实施例中，这个试剂盒进一步包含能够起始、诱导和/或支持干细胞、祖细胞、前体细胞的分化/维持其状态的物质。在前面的任一项实施例中，该物质可以起始，诱导和/或支持干细胞分化。在前面的任一项实施例中，该物质可以起始，诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。在前面的任一项实施例中，该物质可以作为骨形态生成蛋白(BMP)的拮抗剂。在前面的任一项实施例中，BMP拮抗剂可以拮抗BMP 4。在前面的任一项实施例中，该物质可包含基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)，BMP 4，activin A，Wnt-3a或作用类似于Wnt-3a(如Bio和/或CHIR99021)的小分子，和/或一个或更多生长因子和/或抑制Wnt信号通路的小分子(例如，dickkopf同系物1(DKK1)，IWP，和Wnt信号通路抑制剂(IWR))，或以上任何合适的组合。

在前述的任一项实施例中，该物质可以起始和/或支持干细胞或者中胚层细胞分化为心肌细胞，如心室肌细胞或心房肌细胞。

在前述任一项实施例中，该物质可以起始，诱导和/或支持干细胞或者中胚层细胞分化为心室肌细胞，其中该物质可选择性包含BMP 4和/或抑制视黄酸信号通路的抑制剂。在前述任一项实施例中，该物质可阻止干细胞或中胚层细胞中的视黄酸信号通路，SAPK/JNK信号通路，和/或p38信号通路。在前述任一项实施例中，该物质可包括泛视黄酸受体拮抗剂，视黄酸拮抗剂，视黄酸受体拮抗剂，视黄酸X受体拮抗剂，或泛视黄酸受体拮抗剂。在前述任一项实施例中，该物质可包括BMS-493，BMS-189453，SP-600125和/或SB-203580.

在前述任一项实施例中，该物质可起始，诱导，和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心房肌细胞。在前述任一项实施例中，该物质可刺激干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路。在前述的任一项实施例中，该物质可包括视黄酸和/或维生素A。

在前述任一项实施例中，这个试剂盒还包含一份用于支持细胞生长，分化和维持其状态的无血清白蛋白细胞培养基的说明书。

在另一方面，本发明是一种使细胞生长、分化或维持其状态的方法，该方法包括在如前所述任一项实施例中的无血清白蛋白细胞培养基中培养细胞。一方面，该方法可使细胞生长。另一方面，该方法可以用来分化细胞。再一方面，该方法可以用来维持细胞状态。

另一方面，本发明是一种根据前面的任一项实施例使细胞生长，分化，和维持其状态的方法。在另一方面，本发明是一种根据前面的任一项实施例分化心肌的方法。在一个实施例中，采用此方法产生的心肌细胞高表达心肌细胞特异基因，产生胚胎心肌样动作电位(AP)和/或典型的心肌细胞Ca²⁺火花信号模式。

在另一方面，本发明是一种根据前面任一项实施例产生心室肌细胞的方法。在一个实施例中，用此方法产生的心室心肌细胞高表达心室特异性基因，产生胚胎心室样动作电位(AP)和/或典型的心室肌细胞的Ca²⁺火花信号。

在另一方面，本发明是一种根据前面的任一项实施例产生心房肌细胞的方法。在一个实施例中，用此方法产生的心房肌细胞产生胚胎心房样动作电位(AP)和/或典型的心房肌细胞的钙火花信号。

在另一方面，本发明是一种药物组分，该药物由根据前面任一项实施例方法使细胞生长，分化和维持其状态的有效剂量的细胞数，药物可受性载体或辅料组成。

在另一方面，本发明是一种治疗心肌受损或心脏疾病的药物组分。一方面，该药物组分由根据前面任一项实施例方法产生心室心肌细胞和心房心肌细胞的有效剂量的细胞数，和药物可受性载体或辅料组成。

在一方面，本发明是一种治疗疾病或病症的方法，该方法包括需要或极其需要此治疗的受试者施用有效剂量的根据前述任一项实施例的药用组分。

在另一方面，本发明是一种治疗心肌受损或心脏疾病的方法，该方法包括需要或极其需要此治疗的受试者施用有效剂量的根据前述任一项实施例的药用组分。

四、具体实施方式

图1为心肌分化培养基的优化。(a)hPSC心肌分化流程图，包括使用的培养基和小分子加入培养基中的时间点。(b)测定细胞在不同培养基中培养的存活率。B27培养基(RPMI1640+B27)，S12培养基(RPMI1640+S12)，S12基础培养基(RPMI 1640+S12无抗氧化剂)，或S12基础培养基-Cys-GSH(不含L-半胱氨酸和谷胱甘肽的RPMI 1640+S12无抗氧化剂)。(c)在S12基础培养基上添加不同抗氧化剂的组合，进行细胞培养，流式细胞仪(FACS)分析表达CTNT细胞的比例。(d)FACS分析S12培养基中去除特定成分的CTNT⁺细胞的比例。(e)去除特定成分的S12培养基中分化的心肌细胞得率。(f)FACS分析不同渗透压下的S12培养基的培养物中分化的CTNT⁺细胞的比例。(g)B27培养基，S12培养基，S12基础培养基中分化的培养物中心肌细胞比例。(h)B27培养基，S12培养基，S12基础培养基中分化的培养物中心肌细胞得率(每一个点代表一次独立的心肌分化)。误差条：标准差。t检验,*p值<0.05,***p值<0.001。

图2hiPSC直接分化为心房和心室肌细胞。(a)FACS分析S12培养基中5个hiPSC细胞系的CTNT表达百分比。XVF：xeno and virus free无异种源无病毒。(b)，免疫荧光染色检测分化14天的心肌特异性蛋白。比例尺，100μm。(c)RT-PCR分析心肌分化过程中特定基因的表达。(d)培养至第12到14天将碳源由葡萄糖换成乳酸钠，FACS分析葡萄糖消耗前和消耗后RA和BMS493处理组中CTNT⁺细胞的比例。(e)Q-PCR分析分化了14天的培养物中IRX4和NR2F2的表达水平。以GAPDH为内参，标准化样品平均表达量如图。(f)RA和BMS493处理组培养60天后，MLC2V和CTNT免疫荧光双染。比例尺，100μm。误差条：标准差。T检验，*p<0.05,***p<0.001。

图3心房样和心室样心肌细胞的电生理特征。(a)全细胞膜片钳技术记录培养30天的心肌细胞的典型的心室样，心房样和窦房结样动作电位(AP)。(b)RA和BMS493处理组中具有心室样，心房样和窦房结样动作电位的心肌细胞比例。(c)RA和BMS493处理组心室样，心房样和窦房结样APs的参数。(d)RA和BMS493处理组中心肌细胞中钠离子电流特征。(e)RA和BMS493处理组中得到的心肌细胞的钙离子电流特征。(f)RA和BMS493处理组中得到的心肌细胞中E-4031敏感I_Kr内向整流钾离子电流特征。(i)典型E-4031敏感的I_Kr。1μM E-4031分离出E-4031敏感的I_Kr。(ii)E-4031敏感的I_Kr的I-V曲线。(iii)E-4031敏感的I_kr归一化尾电流(iv)E-4031敏感的I_k最大尾电流密度。误差条：标准误。

图4膜片钳技术检测hPSC来源心室样心肌细胞的药理反应。(a)在20分钟的记录期间，DMSO对诱发心室样心肌细胞AP的影响。(b)E-4031，(c)nifedipine，(d)isoproterenol(异丙肾上腺素)对诱发心室样心肌细胞AP的作用。刺激频率为1Hz。虚线表示0mV。

图5为心肌分化过程中相关基因的表达谱。Q-PCR分析细胞多能性标志基因(POU5F1)，中胚层标志基因(T，Brachyury)，心肌中胚层标志基因(MESP1)，心肌祖细胞标志基因(ISL1，NKX2.5和TBX5)和心肌细胞标志基因(MLC2A和CTNT)在分化不同时间点的表达水平。以GAPDH为内参，平均表达量如图。误差条：标准差。

图6为100μl添加S12和B27的RPMI1640培养基的SDS-PAGE图。

图7显示了心肌的大规模分化。(a)T175细胞培养瓶中培养30天的培养物表达CTNT的细胞免疫染色。比例尺，50μm。(b)通过FACS测定CTNT⁺细胞来确定T175细胞培养瓶中每平方厘米的心肌细胞得率。误差条：标准差。

图8显示在化学组分明确的条件下产生hiPSCs。(a)人的***成纤维细胞导入携带表达OCT4，SOX2，KLF4，L-MYC，p53shRNA或Lin28基因的游离型质粒，在化学组分明确的条件下产生hiPSCs。(b)新产生的hiPSC中，免疫荧光染色检测细胞多能性标志基因，NANOG，POU5F1，SOX2，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81。DAPI染核。比例尺，100μm。(c)在NOD/SCID小鼠中，用苏木精和伊红染色畸胎瘤。箭头指向形成的三胚层，包括内胚层(肠样上皮和呼吸上皮)、中胚层(软骨和肌肉)和外胚层(神经上皮和表皮)。比例尺，100μm。(d)通过染色体G-带进行hiPSCs的核型检测。

图9展示100nM E-4031引起自发跳动的心室细胞早期后除极。

图10为hPSCs分化为心肌细胞的流程。D为分化天数。从-D3至D0期间，未分化细胞培养在E8培养基中，从D0天开始，在化学组分明确且无血清白蛋白的培养基中添加特定小分子诱导心肌分化。在第5天至第8天期间，将SAPK/JNK通路或p38MAPK小分子抑制剂SP600125或SB203580添加到培养基中。

图11为在不同剂量SP600125(图11A)和SB203580(图11B)处理下，定量RT-PCR分析培养细胞的IRX4和NR2F2基因表达。RA-视黄酸处理培养物。B10-10ng/mL BMP4处理培养物。以GAPDH为内参，样品平均表达量如图。

五.技术细节

A.定义

除非另有规定，本发明所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员普遍理解的含义相同。所有专利，专利申请(已出版或未出版)以及本发明提及的其他出版物均以其全部内容为参考。如果本部分提出与作为参考的发明、申请、出版申请及其他出版物相反或不一致的定义，以本部分提出的定义为准。

所有标题都是为了方便读者，不用于限制标题后正文的意思，除非特别说明。

本发明公开过程中，要求保护的本发明的许多方面以大范围的格式呈现，应该理解的是，大范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对要求保护的发明的范围僵硬的限制。因此，大范围的描述应视为详细公开所有可能的子范围以及在这个范围内的个别参数数值。例如，提供了某值一个范围，应理解为在该范围的上限和下限之间的每一个中间值，以及所述范围内任何其他声明或中间值，都包含在权利要求范围。这些小范围的上下限可以独立的包含在较小的范围内，并且也包含在权利要求范围内，从属于所述范围内任何明确排除的限制。所述范围包括一项或两项限制，要么一项或两项被包括的限制的范围也包括在权利要求范围中。这项应用无视范围所指的宽度。例如，描述范围如1-6，可被视为公开子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，还包括此范围的单数，例如，1，2，3，4，5，和6。

在这里和附加的声明中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”可指复数，除非上下文另有明确指示。例如，“一个”或“一种”表示“至少一个”或“一个或多个”。因此，引用“干细胞”指的是一个或多个干细胞，参照“该方法“，包括对文中所公开的等效步骤和方法的引用，或为本领域技术人员所知，诸如此类。

据了解，本发明所描述的各个方面和实施例包括“包含”和/或“主要包含”方面和实施例。

此处使用的“本质上无血清白蛋白”是指在细胞培养基或补充物包含少于1×10^{－ 8}mg/mL，少于1×10^-7mg/mL，少于1×10^-6mg/mL，少于1×10^-5mg/mL，少于1×10^-4mg/mL，少于1×10^-3mg/mL，少于0.01mg/mL，少于0.1mg/mL，少于1mg/mL，少于3mg/mL或少于5mg/mL白蛋白。

此处的“哺乳动物”是指哺乳类任意物种。通常，“哺乳动物”一词是指人类、人类受试者，人类病人。

此处的“一个治疗特定疾病的的化合物的有效剂量”是一个足以改善或以某种方式减少疾病相关症状的剂量。这样的剂量可以作为一次的剂量服用或根据治疗方案进行给予，使其生效。这一数量可以治愈疾病，但通常是为了改善这种疾病的症状。可能需要重复给药以达到预期的症状减缓。

此处的“治疗”指的是一种状态、失调或疾病得到改善或得到有效改变的任何方法，治疗还包括组成物的任何药物学上的使用。

此处，服用一种特定药物使一种特定疾病的症状得到“改善”，是指任何，无论是永久的或暂时的，持续的或瞬间的，减缓症状的表现由服药引起或与服药有关。

此处“重组方式的生产”是指使用重组核酸方法的生产方法，这种方法依赖于已知的分子生物学方法来表达由克隆核酸编码的蛋白质。

此处的使用的术语“受试者”不限于特定的物种或样本类型。例如，“受试者”一词可能指的是病人，通常指的是人类病人。然而，这一术语并不局限于人类，因此包含了许多哺乳动物物种。

此处“药学上可接受的盐、酯或其他衍生物”包括此领域技术人员通过已知方法准备的任何盐、酯或衍生物和此方法产生的可用于动物或人类而无明显毒性反应的复合物以及有高药效的衍生物或前体药物。

此处“前体药物”是指体内给药可以被代谢掉或转换为具有生物活性、药理活性或治疗活性形式的复合物。为了生产一种前体药，修饰具有药物活性的药物，使活性化合物通过代谢过程再生。通过设计前体药物改变药物代谢稳定性或运输特性，以去除副作用或毒性，改善药物味道或改变药物的其他特性或性质。依据体内的药效学过程和药物代谢的知识，一旦知道了药学活性化合物，本领域技术人员就可以设计此化合物的前体药。(见，例Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford UniversityPress,New York,pages 388-392)。

此处“测试药物(或候选药物)”是指化学组分明确的化合物(例如有机分子、无机分子、有机/无机分子、蛋白质、多肽、核酸、寡核苷酸、脂质、多糖,糖类,或这些分子的组合,如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如，一个测试化合物库，天然提取物或培养液上层清液，等等)

如本文所述，高通量筛选(HTS)是指对大量样本进行测试的过程。如测试各种化学结构样本是否作用于疾病靶点，以找出有效的化学结构。(见，例Broach,et al.,Highthroughput screening for drug discovery,Nature,384:14-16(1996)；Janzen,et al.,High throughput screening as a discovery tool in the pharmaceutical industry,Lab Robotics Automation:8261-265(1996)；Fernandes,P.B.,Letter from the societypresident,J.Biomol.Screening,2:1(1997)；Burbaum,et al.,New technologies forhigh-throughput screening,Curr.Opin.Chem.Biol.,1:72-78(1997))。HTS操作在样品制备，分析程序和后续处理大量数据上已高度自动化和和计算机化。

B.细胞培养基补充剂。

一方面，本发明是一种细胞培养基补充剂，它包含一种抗氧化剂，可以替代细胞培养基中白蛋白的功能。一方面，本发明是一种细胞培养基补充剂，包含至少两种不同的抗氧化物，可以代替培养基中白蛋白的功能。在一些实施例中，细胞培养基补充剂可以包括2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多的抗氧化剂以代替细胞培养基中白蛋白的功能。抗氧化剂可以代替血清白蛋白的任何合适的功能，例如，有助于细胞生长和增殖，提高整体细胞的健康。给细胞提供重要的营养物质，结合毒素以避免对细胞的毒性作用。作为缓冲物质结合过多的蛋白，结合激素和生长肽以保持它们的稳定，并/或结合自由基以减少对细胞的损伤，在一些实施例中，抗氧化物可用于替代白蛋白的任何程度的合适功能，例如细胞培养基中白蛋白至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％的功能

一方面，本发明是一种细胞培养基补充剂，它包含至少一种抗氧化剂或至少两种不同的抗氧化剂，从以下组选出：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐或其酯，b)维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐或其酯，e)过氧化氢酶，f)超氧化物歧化酶，g)硫醇，例如2-巯基乙醇，1-硫代甘油。h)金属硫蛋白，i)硫氧还蛋白，j)硫辛酸或其盐或酯，k)尿酸或其盐或酯，l)胡萝卜素，m)褪黑素，n)，o)二甲基硫脲，和p)白藜芦醇。所述细胞培养基补充剂与基础培养基相结合形成一个本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

前述任一项实施例中，过氧化氢酶浓度范围可以是约0.025μg/mL至250μg/mL，例如，2.5μg/mL。前述任一项实施例中，超氧化物歧化酶的浓度可以为约0.025μg/mL至250μg/mL，例如，2.5μg/mL。前述任一项实施例中，2-巯基乙醇浓度范围是0.04μg/mL至400μg/mL，例如，4μg/mL。前述任一项实施例，1-硫代甘油浓度范围为0.490μg/mL至4900μg/mL，例如，49μg/mL。前述任一项实施例，谷胱甘肽浓度范围为0.010μg/mL至100μg/mL,例如，1μg/mL。前述任意实施例中，金属硫蛋白浓度范围为0.010μg/mL至100μg/mL,例如，1μg/mL。

前述任意实施例中，细胞培养基补充剂包括从以下组中选出的至少两种不同的抗氧化剂：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐或其酯，b)维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐或其酯。其中细胞培养基补充剂与基础培养基配合使用形成一个本质上无血清白蛋白的细胞培养基。前述任意实施例中，细胞培养基补充剂包括从以下组中选出的至少三种不同的抗氧化剂：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐或其酯，b)维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐或其酯。前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可包含a)抗坏血酸，抗坏血酸盐或其酯，b)维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐或其酯。

在特定的实施例中，细胞培养基包含少于1×10^-8mg/mL,少于1×10^-7mg/mL,少于1×10^-6mg/mL,少于1×10^-5mg/mL，少于1×10^-4mg/mL，少于1×10^-3mg/mL，少于0.01mg/mL，少于0.1mg/mL，少于1mg/mL，少于3mg/mL，少于5mg/mL白蛋白，视为细胞培养基本质上不含白蛋白。

前述任一项实施例中，抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，如L-抗坏血酸浓度从0.025mg/mL至250mg/mL，例如，2.5mg/mL。在特定实施例中，抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，浓度范围是0.025mg/mL至0.25mg/mL，从0.25mg/mL至2.5mg/mL,2.5mg/mL至25mg/mL,或25mg/mL至250mg/mL。

前述任意实施例，维生素E的水溶性类似物可包括trolox和MDL-73404，或两者的混合物。

前述任一项实施例中，维生素E的水溶性类似物，如trolox，浓度范围可从0.025mM至250mM，例如，2.5mM。在特定的实施例中，维生素E的水溶性类似物浓度范围为0.025mM至0.25mM，0.25mM至2.5mM，2.5mM至25mM，从25mM至250mM。

前述任一项实施例中，N-乙酰-半胱氨酸，或其盐或酯，如N-乙酰-L-半胱氨酸，浓度范围可从0.025mM至250mM，例如，2.5mM。在特定的实施例中，N-乙酰-L-半胱氨酸或谷胱甘肽，或其盐或酯，浓度范围是0.025mM至0.25mM，从0.25mM至2.5mM，从2.5mM至25mM，从25mM至250mM。

前述任一项实施例中，丙酮酸，丙酮酸盐，或其盐或酯，如丙酮酸钠，浓度范围可从0.5mM至5000mM，例如，50mM。在特定的实施例中，丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，浓度范围为0.5mM至5mM，从5mM至50mM，从50mM至500mM，从500mM至5000mM。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可包括离子载体。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可包含多肽如胰岛素，和/或转铁蛋白。一方面，多肽本身是离子载体。前述任一项实施例中，离子载体包括三价铁离子Fe(Ⅲ)。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可包括离子载体。前述任一项实施例中，离子载体包括三价铁离子Fe(Ⅲ)。

前述任一项实施例中，离子载体可以是转铁蛋白或包含三价铁的无机盐，如Fe(NO₃)₃，硝酸铁九水化合物(Fe(NO₃)₃)·9H₂O),或FeCL3。

前述任一项实施例中，多肽可包括胰岛素。前述任一项实施例中，多肽可包括哺乳动物多肽，多肽包括人多肽。

前述任一项实施例中，多肽可以是重组多肽，它可以是重组人源转铁蛋白，浓度范围从0.0025mg/mL至25mg/mL，例如，0.25mg/mL。它可以是重组人源胰岛素，浓度范围从0.002mg/mL至20mg/mL，例如，0.2mg/mL。在特定的实施例中，重组人源转铁蛋白浓度范围可以从0.0025mg/mL至0.025mg/mL，从0.025mg/mL至0.25mg/mL，从0.25mg/mL至2.5mg/mL，或从2.5mg/mL至25mg/mL。在特定的实施例中，重组人胰岛素浓度范围，从0.002mg/mL至0.02mg/mL，从0.02mg/mL至0.2mg/mL。从0.2mg/mL至2mg/mL，或从2mg/mL至20mg/mL。

前述任一项实施例中，多肽浓度范围是0.002mg/mL至25mg/mL，例如，0.2mg/mL或0.25mg/mL。在特定实施例中，多肽的浓度范围可以是0.002mg/mL至0.02mg/mL,从0.02mg/mL至0.2mg/mL，从0.2mg/mL至2mg/mL，或从2mg/mL至25mg/mL。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂进一步包括水溶性硒化合物。在一些方面，硒化合物包括***钠((Na₂SeO₃)，二氧化硒(SeO₂)，***(H₂SeO₃)，氧氯化硒(SeOCl₂)，硒酸钠(Na₂SeO₄)，或硫化硒(SeS)。或它们的任意组合。

前述任一项实施例中，水溶性硒化合物，如***钠(Na₂SeO₃)，浓度范围可以是0.008μg/mL至80μg/mL，例如，0.8μg/mL。在特定的实施例中，水溶性硒化合物浓度范围可以从0.008μg/mL至0.08μg/mL，从0.08μg/mL至0.8μg/mL，从0.8μg/mL至8μg/mL，或从8μg/mL至80ug/mL。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可以进一步包括C_1-8烷醇胺。在有些方面，C_1-8烷醇胺包含乙醇胺，6氨基-2甲基-2庚醇，甲醇胺，N,N-二甲基乙醇胺，或N-甲基-2-羟基乙胺，或它们的组合。

前述任一项实施例，C_1-8烷醇胺，如乙醇胺，浓度范围为0.0005mg/mL至5mg/mL，例如0.05mg/mL。在特定的实施例中，C_1-8烷醇胺的浓度范围可以是0.0005mg/mL至0.005mg/mL，从0.005mg/mL至0.05mg/mL，从0.05mg/mL至0.5mg/mL，或从0.5mg/mL至5mg/mL。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可包括C_1-8季铵化合物。在有些方面，C_1-8季铵化合物包括肉碱，四乙基溴化铵，四甲基氯化铵，四甲基氢氧化铵，或胆碱，或它们的任意组合。前述任一项实施例中，肉碱可以是L-肉碱盐酸盐。

前述任一项实施例中，C_1-8季铵化合物，如L-肉碱盐酸盐，浓度范围可为0.001mg/mL至10mg/mL。例如，0.1mg/mL。在特定的实施例中，C_1-8季铵的浓度范围可以是0.001mg/mL至0.01mg/mL，从0.01mg/mL至0.1mg/mL，从0.1mg/mL至1mg/mL，或从1mg/mL至10mg/mL。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可进一步包括脂肪酸，如亚油酸，亚麻酸，或两者组合。一方面，脂肪酸可溶于溶剂中，如甲基环糊精。

前述任一项实施例中，脂肪酸可包括C_12-30碳链和至少两个双键。前述任一项实施例中，脂肪酸包含可包含一个18碳链和两或三个双键。前述任一项实施例中，脂肪酸可包括亚麻酸和/或亚油酸。

前述任一项实施例中，脂肪酸如亚油酸和亚麻酸或它们的组合，其浓度范围可为0.0005mg/mL至5mg/mL。例如，0.05mg/mL。在特定的实施例中，脂肪酸浓度可在0.0005mg/mL至0.005mg/mL，0.005mg/mL至0.05mg/mL，0.05mg/mL至0.5mg/mL，或0.5mg/mL至5mg/mL。

在前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可包括：1)抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，2)trolox，3)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，5)转铁蛋白，6)***钠，7)乙醇胺，8)肉碱，9)亚麻酸，10)亚油酸。

前述任一项实施例中，细胞培养基补充剂可进一步包括胰岛素。因此，本文提供了一种包含胰岛素的细胞培养基补充剂，和一种无胰岛素的细胞培养基补充剂。一方面，无胰岛素的细胞培养基补充剂用于干细胞分化过程的早期阶段。

另一方面，本发明是一个试剂包装，包括根据前述任一项实施例而来的细胞培养基补充剂。又一方面，本发明提供了包括根据前述任一项实施例而来的细胞培养基补充剂的一个试剂盒。一方面，试剂盒还包括一份使用和储存细胞培养基补充剂的说明书，例如，将细胞培养基补充剂和本质上无血清白蛋白的基础培养基结合使用，制备本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

一方面，细胞培养基补充剂可用于提高任何合适的干细胞的分化效率。例如，细胞培养基补充剂可用于提高全能、多能、专能、寡能或单能干细胞的心肌分化效率。另一实例中，细胞培养基补充剂可用于提高胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞的心肌分化效率。另一实例中，细胞培养基补充剂可用于增强哺乳动物干细胞如人干细胞的心肌分化效率。另一实例中，细胞培养基补充剂可用于提高人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞的心肌分化效率。

C.细胞培养基

一方面，本文公开的是一种本质上无血清白蛋白的细胞培养基，它包括本质上无血清白蛋白的基础培养基和根据任一前述实施例的细胞培养基补充剂。

前述任一项实施例中，细胞培养基中的抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯的浓度可为0.5mg/L至5000mg/L。例如50mg/L。在特定的实施例中，抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯的浓度可从0.5mg/L至5mg/L，从5mg//L至50mg/L，从50mg/L至500mg/L。从500mg/L至5000mg/L。

前述任一项实施例中，细胞培养基中的维生素E的水溶性类似物，如trolox，浓度可为0.5μM至5000μM，例如，50μM。在特定的实施例中，维生素E的水溶性类似物浓度可从0.5μM至5μM，从5μM至50μM，从50μM至500μM，从500μM至5000μM。

前述任一项实施例中，细胞培养基中N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，例如N-乙酰-L-半胱氨酸，浓度可为0.5μM至5000μM。例如，50uM。在特定的实施例中，N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯的浓度可从0.5μM至5μM，从5μM至50μM，从50μM至500μM，从500μM至5000μM。

前述任一项实施例中，细胞培养基中的丙酮酸、丙酮酸盐、或其酯，如丙酮酸钠，浓度可从0.01mM至100mM之间变化，例如，1mM。在特定的实施例中，丙酮酸，丙酮酸盐或其酯，浓度可从0.01mM至0.1mM，从0.1mM至1mM，从1mM至10mM，从10mM至100mM之间变化。

前述任一项实施例中，细胞培养基中的多肽，例如，转铁蛋白和/或胰岛素，浓度可从0.04mg/L至500mg/L之间变化，例如，重组人转铁蛋白的浓度可从0.05mg/L至500mg/L，例如5mg/L，重组人胰岛素的浓度可从0.04mg/L至400mg/L，例如，4mg/L。在特定的实施例中，重组人转铁蛋白的浓度可从0.05mg/L至0.5mg/L，从0.5mg/L至5mg/L，从5mg/L至50mg/L，从50mg/L至500mg/L之间变化。在特定的实施例中，重组人胰岛素的浓度可从0.04mg/L至0.4mg/L，从约0.4mg/L至约4mg/L,从约4mg/L至约40mg/L，或从约40mg/L至约400mg/L。

前述任一项实施例中，细胞培养基中硒化合物，例如***钠，浓度可从约0.16μg/L至约1600μg/L。例如约16μg/L。在特定的实施例中，硒化合物的浓度约从0.16μg/L至约1.6μg/L，从约1.6μg/L至约16μg/L，从约16μg/L至约160μg/L，从约160μg/L至约1600μg/L。

前述任一项实施例中，细胞培养基中的C_1-8链烷醇，例如乙醇胺的浓度可从约0.01mg/L至约100mg/L，例如约1mg/L。在特定的实施例中，C_1-8链烷醇的浓度在约0.01mg/L和约0.1mg/L之间，在约0.1mg/L和约1mg/L之间，在约1mg/L和10mg/L之间，在10mg/L和100mg/L之间。

前述任一项实施例中，细胞培养基中的C_1-8季铵化合物，例如肉碱或L-肉碱盐酸盐的浓度从约0.02mg/L至200mg/L，例如约2mg/L。在特定的实施例中，C_1-8季铵化合物的浓度在约0.02mg/L和约0.2mg/L之间，在约0.2mg/L和约2mg/L之间，在约2mg/L和约20mg/L之间，在约20mg/L和约200mg/L之间。

前述任一项实施例中，细胞培养基中脂肪酸，例如亚麻酸和/或亚油酸的浓度从约0.01mg/L至100mg/L，例如1mg/L。在特定的实施例中，脂肪酸浓度在约0.01mg/L和约0.1mg/L之间，在约0.1mg/L和约1mg/L之间，在约1mg/L和约10mg/L之间，在约10mg/L和100mg/L之间。

前述任一项实施例中，在细胞培养基中，可以从RPMI1640、DMEM、DMEM/F12、IMDM、M199、BME或它们的任意合适组合等组成的组中筛选出本质上无血清白蛋白的基础培养基。

前述任一项实施例中，细胞培养基中，细胞培养基的补充剂和本质上无血清白蛋白的基础培养基的比率可以为约1：0.01至1：100(体积/体积)，例如约1：50(体积/体积)。在特定的实施例中，该比率在约1：0.01和约1：0.1之间，在约1：0.1和约1：1之间，在约1：1和1：10之间，在约1：10和1：100之间，或小于1：100(所有比率均为体积/体积)。

前述任一项实施例中，细胞培养基可包括5mg/mL或更少的白蛋白。在特定实施例中，细胞培养基包含少于1×10^-8mg/mL，少于1×10^-7mg/mL，少于1×10^-6mg/mL，少于1×10^{- 5}mg/mL，少于1×10^-4mg/mL，少于1×10^-3mg/mL，少于0.01mg/mL，少于0.1mg/mL，少于1mg/mL或少于5mg/mL白蛋白。

前述任一项实施例中，细胞培养基可支持细胞，如干细胞、祖细胞、前体细胞的生长、分化和/或维持其状态。前述任一项实施例中，干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、单能干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是胚胎干细胞、诱导胚胎干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是哺乳动物干细胞。前述任一项实施例中，哺乳动物干细胞可以是人干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

前述任一项实施例中，细胞培养基可支持干细胞生长、分化为心肌细胞，例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞。前述任一项实施例中，细胞培养基支持心肌细胞例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞状态的维持。

另一方面，本发明公开了一种包装，它包括根据前述任一项实施例得到的细胞培养基。又一方面，本发明公开了一种试剂盒，它包括根据前述任一项实施例得到的细胞培养基。

前述任一项实施例中，此试剂盒进一步包含起始、诱导或支持细胞生长、分化、和/或维持其状态的物质。前述任一项实施例中，此试剂盒进一步包含起始、诱导和/或支持干细胞、祖细胞或前体细胞的分化或维持其状态的物质。前述任一项实施例中，该物质可以起始、诱导和/或支持干细胞的分化。前述任一项实施例中，该物质可以起始、诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。前述任一项实施例中，该物质可以是骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂，前述任一项实施例中，BMP拮抗剂可以是BMP 4拮抗剂。前述任一项实施例中，该物质包括碱性成纤维生长因子(bFGF)，BMP4，activin A，Wnt-3a或起Wnt-3a作用或功能的小分子(如Bio和/或CHIR99021)，和/或一种或多种生长因子和/或抑制Wnt信号转导途径的小分子(例如dickkopf同系物(DKK1)，IWP和Wnt信号通路抑制剂(IWR))或其任何合适的组合。

前述任一项实施例中，此物质可以起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心肌细胞，例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞。

前述任一项实施例中，该物质可以起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心室心肌细胞。其中该物质可选择性包含BMP 4和/或视黄酸信号途径的抑制剂。前述任一项实施例中，该物质可以抑制干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路，SAPK/JNK信号通路和/或p38信号通路。前述任一项实施例中，该物质可包括泛视黄酸受体拮抗剂(pan-retinoic acid)、视黄酸拮抗剂、视黄酸受体拮抗剂、视黄酸X受体拮抗剂。前述任一项实施例中，该物质可以包含BMS-493，BMS-189453、SP-600125，和/或SB-203580.

前述任一项实施例中，该物质可起始，诱导和/或支持干细胞、中胚层细胞分化为心房心肌细胞。前述任一项实施例中，该物质可刺激干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路。前述任一项实施例中，该物质可包括视黄酸和/或维生素A。

前述任一项实施例中，此试剂可进一步包括一份使用本质上无血清白蛋白的细胞培养基支持细胞的生长、分化和维持其状态的说明书。

一方面，细胞培养基可用于提高任何合适的干细胞的分化效率。例如，细胞培养基可用于增强全能、多能、专能、寡能或单能干细胞的心肌分化效率。另一个实例中，细胞培养基可用于提高胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞的心肌分化效率。又一个实例中，细胞培养基可用于提高哺乳动物干细胞如人干细胞的心肌分化效率。另一个实例中，细胞培养基可用于提高人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞的分化效率。

干细胞可以通过任何合适的方法获得、制备和/或维持其状态。例如。小鼠ES细胞可以在一层明胶上生长，并需要存在白血病抑制因子(LIF)。人ES细胞人ES细胞可以在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的饲养层上生长，并且可能需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)的存在。参见Chambers等人，“Functional expression cloning of Nanog，apluripotency sustaining factor in embryonic stem cells，”Cell 113(5)：643-55(2003)。

干细胞例如人胚胎干细胞通常由几种转录因子和细胞表面蛋白的存在来确定。例如，转录因子Oct-4，Nanog，和Sox2形成核心调节网络以确保导致分化和维持多能性的基因表达。细胞表面抗原通常用于确定hES细胞，它们是糖脂SSEA3和SSEA4和硫酸角质素抗原Tra-1-60和Tra-1-81.

诱导多能干细胞，一般简写为iPS细胞或iPSCs，是通过强制非多能性细胞如成体细胞表达特定基因，人工获得的一类多能干细胞。可以使用各种基因或其组合使成体细胞成为iPSCs。例如，Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员(Sox1，Sox2，Sox3和Sox15)可用于成体细胞使其转化为iPS细胞。除此以外的其他基因，包括Klf家族(Klf1，Klf2，Klf4和Klf5)某些基因，Myc家族(C-myc，L-myc和N-myc)，Nanog和LIN28可用于增加转化效率。各种基因或其编码的蛋白质通过任何合适的方法导入进成体细胞中。例如，可以通病毒转染***如逆转录病毒***、慢病毒***、腺病毒***或不含任何病毒转染***的质粒将各种基因或其编码蛋白质导入成体细胞。或者将基因编码的蛋白质直接导入成体细胞，例如通过多精氨酸锚定引导某些蛋白质进入细胞的重复处理。

一方面，通过任何合适的方法或试剂，干细胞可以诱导分化为中胚层。在一个实例中，通过使未分化干细胞与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，BMP 4和/或activin A接触，干细胞分化形成中胚层。bFGF、BMP 4和activin A可以以任意顺序处理干细胞。在另一个实例中，通过使未分化干细胞与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，BMP 4和activin A接触，使干细胞分化为中胚层。例如，在干细胞接触activin A之前，使未分化干细胞与碱性成纤维细胞和BMP 4接触，干细胞可分化形成中胚层。在另一个实例中，通过使未分化干细胞与Wnt-3a或与Wnt-3a起相同作用的小分子如Bio或CHIR99021。(Tran等人，Wnt3a-inducedmesoderm formation and cardiomyogenesis in human embryonic stem cells，StemCells 27：1869-1878(2009))。

任何合适的BMP拮抗剂可用于增强干细胞心肌分化效率。例如可以使用BMP 4拮抗剂。在另一个实例中，BMP拮抗剂是Noggin。在另一实例中，BMP拮抗剂是Chordin，Tsg，DAN家族成员(Yanagita,M.BMP antagonists:their roles in development and involvementin pathophysiology.Cytokine Growth Factor Rev 16:309-317(2005)),或作用与BMP拮抗剂相同的小分子如Dorsomorphin(Hao,J.et al.Dorsomorphin,a selective smallmolecule inhibitor of BMP signaling,promotes cardiomyogenesis in embryonicstem cells.PLoS One 3:e2904(2008)).

现在的细胞培养基可进一步包含抑制干细胞中视黄酸信号传导途径的物质。干细胞中的视黄酸信号通路可以通过任何合适的处理或试剂来抑制。在一个实例中，干细胞与视黄酸拮抗剂、视黄酸受体拮抗剂或视黄酸X受体拮抗剂接触以抑制视黄酸信号通路。另一个实例中，通过使干细胞与泛视黄酸受体拮抗剂，如BMS-189453接触来抑制视黄酸信号传导途径。在又一个实例中，通过使干细胞与BMS-453，AGN194310，ANG193109，Ro41-5253，SR11335,9-顺式-视黄酸或抑制视黄酸合成的小分子如双硫仑(disulfiram)和柠檬醛(citral)接触来抑制视黄酸信号传导途径。在另一个实例中，通过减少或耗尽干细胞培养基中的维生素A来抑制视黄酸信号传导途径。

本细胞培养基可以进一步包含Wnt抑制剂以将干细胞分化成心肌细胞。可以使用任何合适的Wnt抑制剂。在一个实例中，Wnt抑制剂是dickkopf同系物1(DKK1)。

D.用于生长、分化和/或维持细胞的方法和组合物

在另一方面，本文公开的是一种生长、分化和/或维持细胞的方法，该方法包括使细胞与根据前述任一项实施例的本质上无血清白蛋白的细胞培养基接触。一方面，该方法可使细胞生长。另一方面，该方法可以使细胞分化。在另一方面，该方法可以维持细胞状态。

前述任一项实施例中，细胞可来源于单细胞生物或多细胞生物。前述任一项实施例中，细胞可以来源于脊椎动物、非人类哺乳动物或人类。

前述任一项实施例中，细胞可以是干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是一种全能、多能、专能、寡能或单能干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是哺乳动物干细胞。前述任一项实施例中，哺乳动物干细胞可以是人干细胞。前述任一项实施例中，干细胞可以是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

前述任一项实施例中，本文公开了一种用于支持干细胞生长和/或分化为心肌细胞的方法，例如心室肌细胞或心房肌细胞。前述任一项实施例中，该方法可进一步包括使干细胞和物质接触以起始、诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。前述任一项实施例中，该物质可以是骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂。前述任一项实施例中，BMP拮抗剂可以是BMP 4拮抗剂。前述任一项实施例中，该物质可包含碱性成纤维生长因子(bGFG)，BMP4，activinA，Wnt-3a或起Wnt-3a作用或功能的小分子(如Bio和/或CHIR99021)，和/或一种或多种生长因子和/或抑制Wnt信号通路的小分子(例如dickkopf同系物1(DKK1)，IWP和Wnt信号通路抑制剂(IWR))，或其任何合适的组合。

前述任一项实施例中，该方法进一步包括使干细胞或中胚层细胞与物质接触以起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞的分化为心肌细胞，例如心室肌细胞和/或心房肌细胞。前述任一项实施例中，该物质可起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心室肌细胞。

前述任一项实施例中，具有起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化作用的小分子可包含BMP 4和抑制视黄酸信号通路的抑制剂。前述任一项实施例中，该物质可抑制干细胞或中胚层细胞中的视黄酸信号通路、SAPK/JNK信号通路和/或p38信号通路。前述任一项实施例中，该物质可包含泛视黄酸受体拮抗剂、视黄酸拮抗剂、视黄酸受体拮抗剂、视黄酸X受体拮抗剂或泛视黄酸受体拮抗剂或以上的任意组合。前述任一项实施例中，该物质可包含BMS-493、BMS-189453、SP-600125和或SB-203580。

另一方面，以本发明公开的方法使用该物质可起始、诱导、和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心房肌细胞。一方面，该物质可刺激干细胞或中胚层细胞中的视黄酸信号通路。前述任一项实施例中，该物质可包含视黄酸和/或维生素A。

前述任一项实施例中，该方法可具有约50％至约90％或以上的心肌分化效率。在特定的实施例中，该方法具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％的心肌分化效率。

前述任一项实施例中，该方法产生的平均心肌细胞密度约1×10⁵个心肌细胞/cm²至1×10⁶个心肌细胞/cm²。前述任一项实施例中，该方法的得率为每个干细胞约1至10个心肌细胞，例如每个干细胞产生1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个心肌细胞。其他的实施例中，该方法的得率为每个干细胞超过10个心肌细胞。

前述任一项实施例中，该方法可具有约50％至90％或以上的心室肌细胞分化效率，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。前述任一项实施例中，该方法的心室肌细胞得率可以到达平均密度约1×10⁵个心肌细胞/cm²至约1×10⁶个心肌细胞/cm²。前述任一项实施例中，该方法产生心室心肌细胞的得率为每一个干细胞得到1至10个心室肌细胞，例如每个干细胞得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个心室肌细胞。在其他的实施例中，该方法的得率为每个干细胞得到超过10个心室肌细胞。

前速任一项实施例中，该方法可具有约50％至90％或以上的心房肌细胞分化效率，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。前述任一项实施例中，该方法的心房肌细胞得率可以到达平均密度约1×10⁵个心肌细胞/cm²至约1×10⁶个心肌细胞/cm²。前述任一项实施例中，该方法产生心房心肌细胞的得率为每一个干细胞得到1至10个心房肌细胞，例如每个干细胞得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个心房肌细胞。在其他的实施例中，该方法的得率超过10个心房肌细胞每个干细胞。

前述任一项实施例中，该方法可进一步包括心肌细胞的富集。前述任一项实施例中，可通过培养基中的葡萄糖浓度下降富集心肌细胞。在一些实施例中，葡萄糖浓度下降的培养基的葡萄糖浓度从1000mg/L至2000mg/L。在一些实施例中，降低的葡萄糖浓度范围从约1000mg/L至1500mg/L。在一些实施例中，降低的葡萄糖浓度从约1500mg/L至2000mg/L。在一些实施例中，降低的葡萄糖浓度是约1500、1600、1700、1800、1900或2000mg/L。

前述任一项实施例中，该方法可在渗透压范围为约100至约500mOsm中进行。在特定的实施例中，该方法可在渗透压范围为约100至约200mOsm、约200mOsm至约300mOsm、约300mOsm至约400mOsm、约400mOsm至约500mOsm中进行。在特定的实施例中，该方法可在渗透压范围为约250至350mOsm中进行，例如从约300和330mOsm之间。

另一方面，本发明根据前述任一项实施例的方法使细胞生长、分化和/或维持其状态。另一方面，本发明根据前述任一项实施例的方法产生心肌细胞。在一个实施例中，这样产生的心肌细胞心肌特异基因表达水平提高、具有胚胎心肌样动作电位(AP)和/或典型心肌细胞Ca²⁺火花信号模式。

另一方面，本发明根据前述任一项实施例的方法产生心室肌细胞。在一个实施例中，这样产生的心室肌细胞心室肌细胞特异基因的表达提高、具有胚胎心室样动作电位(AP)。和/或心室心肌细胞典型Ca²⁺火花信号模式。

另一方面，本发明根据前述任一项实施例的方法产生心房肌细胞。在一个实施例中，这样产生的心房肌细胞具有胚胎心房样动作电位和/或心房心肌细胞典型Ca²⁺火花信号模式。

另一方面，本发明是一种药用组成，它包括有效量的根据前述任一项实施例的方法生长、分化和维持的细胞数和一种药学上可接受的载体或辅料。

前述任一项实施例中，本发明是一种治疗心肌受损或心脏疾病的药用组成。一方面，该药用组成包括有效量的心肌细胞数，根据前述任一项实施例所产生的心室肌细胞和/或心房肌细胞，和一种药学上可接受的载体或辅料。

在另一方面，本发明是一种治疗受试者某疾病或病症的方法，该方法包括需要或极其需要此治疗的受试者施用有效剂量的根据前述任一项实施例的药用组分。

另一方面，本发明是一种治疗受试者心肌受损或心脏疾病的方法，该方法包括需要或极其需要此治疗的受试者施用有效剂量的根据前述任一项实施例的药用组分。

前述任一项实施例中，该方法可用于受试者为人的情况下。

在另一方面，本发明提供了一种促进干细胞分化为心房肌细胞的方法，该方法包括刺激或不抑制一个分化为中胚层的干细胞中的视黄酸信号通路。

本方法可用于促进任何合适的干细胞分化为心房肌细胞。在一个实例中，本发明的方法可用于促进全能、多能、专能、寡能或单能干细胞形成心房肌细胞。另一个实例中，本方法可用于促进胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞形成心房肌细胞。在另一个实例中，本方法可用于促进哺乳动物干细胞如人干细胞形成心房肌细胞。另一个实例中，本方法可用于促进人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞形成心房肌细胞。

干细胞中的视黄酸信号通路可以被任何合适的处理和试剂激活。例如，通过使干细胞与视黄酸或维生素A接触激活干细胞中信号通路。另一个实例中，可以通过使干细胞与视黄酸受体拮抗剂如LG100268和LGD1069接触，激活干细胞的视黄酸信号通路。

E.药用组合物和细胞的用途

细胞，例如心肌细胞，可为了任何合适的目的而使用。一方面，本发明提供了一种用于治疗心肌损伤或心脏疾病的药用组成物，它包括有效数量的细胞如以上方法产生的心肌细胞和任选地一种药学上可接受的载体或辅料。在一个实施例中，药用组成物包括心房和心室心肌细胞的混合物。另一个实施例中，药用组成包括至少50％，最好是60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的心房肌细胞。在另一个实施例中，药用组成包括至少50％，最好是60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的心室肌细胞。

在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者心肌受损或心脏疾病的方法，例如人。该方法包括需要或极度需要该治疗的受试者施用有效剂量的如上药用组成。

根据本领域已知方法(见例,Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April 1997；Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and DeliverySystems,Banga,1999；and Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins,Hovgaard and Frkjr(Ed.),Taylor&Francis,Inc.,2000；MedicalApplications of Liposomes,Lasic and Papahadjopoulos(Ed.),Elsevier Science,1998；Textbook of Gene Therapy,Jain,Hogrefe&Huber Publishers,1998；Adenoviruses:Basic Biology to Gene Therapy,Vol.15,Seth,Landes Bioscience,1999；Biopharmaceutical Drug Design and Development,Wu-Pong and Rojanasakul(Ed.),Humana Press,1999；Therapeutic Angiogenesis:From Basic Science to theClinic,Vol.28,Dole et，al.(Ed.),Springer-Verlag New York,1999).可以测定细胞的组成、剂量和给药途径，例如心肌细胞，主要是心房肌细胞和心室肌细胞或两者的混合物。

心肌细胞可以配制用于任何合适的施用途径。在一个实施例中，心肌细胞通过手术或细胞移植施用。在任何特定情况下，最合适的途径将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度以及所使用的心肌细胞的性质。

心肌细胞可以单独施用。或心肌细胞与一种药学上可接受的载体或辅料共同施用。任何合适的药学上可接受的载体或辅料可用于本发明的方法中。

本方法可以单独使用。或者，本方法可以与适用于预防、治疗或延缓心肌受损、的其他药剂组合使用。这样的其他试剂可以在心肌细胞施用之前，同时或之后使用。例如心肌细胞可以与这类的其他药剂共同施用。

根据本发明，心肌细胞单独或与其他试剂，载体或辅料一起，配制用于任何合适的施用途径如手术或细胞移植。该方法可以采用安瓿瓶封装的单剂量或添加防腐剂以多剂量封存。剂型可以采用在油相或水相中的混悬剂、溶液剂或乳剂并可能含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。也可选择，使用前将粉末状的活性成分溶于合适的媒介，无菌无热源的水或其他溶剂中。

本发明可能用到的药学上可接受的组合物和其给药方式包含但不限于以下专利中描述的：美国专利号5,736,154；专利号6,197,801B1；专利号5,741,511；专利号5,886,039；专利号5,941,868；专利号6,258,374B1和专利号5,686,102。

治疗或预防所使用的治疗剂量的大小将随待治疗病症的严重程度和给药途径不同而不同。剂量和服药频率也随年龄、体重、身体状况和病人个人的反应而变化。

应该注意的是，主治医生会知道如何以及何时终止、中断或调整治疗方法降低剂量以减少毒性或不利反应。相反，如果临床反应不充分(排除毒副作用)，医生也会知道如何以及何时调整治疗至更高水平。

可以使用任何合适的给药方式。剂型包括片剂、锭剂、扁囊剂、分散剂、混悬剂、溶液剂、胶囊剂、贴剂等。见，Remington’s Pharmaceutical Sciences。

在实际应用中，心肌细胞可单独或根据常规制药复合技术与其他试剂联合使用，作为与药用载体或辅料((如β-环糊精和2-羟基丙基-β-环糊精)紧密混合的活性物质。载体可以采取广泛的制备形式，以便合适给药。如静脉注射或输液等肠胃外剂型成分的制备，可以采用类似的药用媒介，如水、乙二醇、油、缓冲液、糖、防腐剂、脂质和本领域技术人员所知的类似物。这种肠胃外剂型成分的例子包括但不限于5％葡萄糖(w/v)，生理盐水或其他溶液。单独或与其他药剂组合以一瓶的液体给药的心肌细胞总剂量可以在约1×10³至1×10¹⁰个细胞，例如1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰个细胞或1×10³至1×10¹⁰个细胞范围内的任何子范围。

本发明还提供了用于实施治疗方案的试剂盒。该试剂盒可包含在一个或多个包装中，它包含有效治疗量的心肌细胞，单独或与其他药剂一起，以药学上可接受的形式。优选的药物剂型将与无菌盐水、右旋葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌液体联合。或者，冷冻或干燥该组分；在这种情况下，该试剂盒可选择性进一步包含药学上可接受的溶液，最好是无菌溶液，来重悬复合物以形成注射用液。典型的药学可接受溶液是盐水和右旋葡萄糖。

另一个实施例中，本发明的试剂盒进一步包括无菌包装的针和注射器，用于注射本发明的药物组合，和/或包装好的酒精垫。药物注射说明书可选择性包括在内。

F.细胞的其他用处

细胞如心肌细胞，可以为了合理的目的去使用。

一方面，本发明公开了一种鉴定方法，鉴定可调节细胞的调节剂。该方法包括：1)根据前述任一项实施例的方法生长、分化和/或维持其状态的细胞与调节剂候选物接触，测量该调节剂候选物对细胞某一特性的影响；2)测量未与调节剂候选物接触的细胞的性质。在实施例中，与调节剂候选物接触的细胞性质不同于未与调节剂候选物接触的细胞性质，确认此调节剂候选物可以调节细胞。

另一方面，本发明公开了一种鉴定方法，鉴定可调节心肌细胞的调节剂。该方法包括：1)由前述任一项的实施例所产生的心肌细胞，心室心肌细胞或心房心肌细胞，与调节剂候选物接触，测量调节剂候选物对心肌细胞某一特性的影响；2)测量未与调节剂候选物接触的心肌细胞的性质。在实施例中，与调节剂候选物接触的心肌细胞的特性不同于未与调节剂候选物接触的心肌细胞，确认该调节剂候选物是心肌细胞调节剂。

该方法可以以任何合适的形式进行，最好是以高通量筛选(HTS)形式进形。

本文提供了另外的实施例以进一步阐述本发明。

实施例1。一种细胞培养基补充剂包括至少一种抗氧化剂或至少两种抗氧化物以替代细胞培养基中血清白蛋白的作用，其中细胞培养基补充剂添加到细胞基础培养基，以形成本质上无血清白蛋白细胞培养基。

实施例2。细胞培养基补充剂包括至少一种抗氧化剂或至少两种抗氧化剂从以下组中选出：a)抗坏血酸、抗坏血酸盐或其酯，b)维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，d)丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，e)过氧化氢酶，f)超氧化物歧化酶，g)硫醇，如2-巯基乙醇或1-硫代甘油，h)金属硫蛋白，i)硫氧还蛋白，j)硫辛酸或其盐或酯，k)尿酸或其盐或酯，l)胡萝卜素，m)褪黑素，n)普罗布考，o)二甲基硫脲和p)白藜芦醇，其中所述细胞培养基补充剂配置为与基础培养基组合以形成本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

实施例3。实施例1或实施例2中的细胞培养基补充剂，包括至少一种抗氧化剂，至少两种，至少三种或全部的抗氧化剂，抗氧化剂从以下组中选出：a)丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，b)维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽，或其盐或酯，d)丙酮酸、丙酮酸盐或其酯。

实施例4。实施例1-3中任一项的培养基补充剂，其中的抗坏血酸、抗坏血酸盐或其酯浓度范围为约0.025mg/mL至约250mg/mL，例如约2.5mg/mL。

实施例5。实施例1-4中任一项的培养基补充剂，其中维生素E的水溶性类似物是trolox或MDL 73404或两者的混合物。

实施例6。实施例1-5中任一项的培养基补充剂，其中维生素E的水溶性类似物，如trolox，浓度范围为约0.025mM至250mM，例如2.5mM。

实施例7。实施例1-6中任一项的培养基补充剂，其中N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽或其盐或酯，如N-乙酰-L-半胱氨酸，浓度范围为约0.025mM至约250mM,例如2.5mM。

实施例8。实施例1-7中任一项的培养基补充剂，其中丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，如丙酮酸钠，浓度范围为约0.5mM至约5000mM，例如约50mM。

实施例9。实施例1-8中任一项的培养基补充剂进一步包括离子载体。

实施例10。实施例1-9中任一项的培养基补充剂进一步包括多肽，所述多肽可选离子载体。

实施例11。实施例9或实施例10的细胞培养基补充剂，其中离子载体是转铁蛋白或含Fe(Ⅲ)的无机盐如Fe(NO₃)₃and FeCl₃。

实施例12。实施例10或实施例11的细胞培养基补充剂，其中的多肽是胰岛素或转铁蛋白。

实施例13。实施例10-12的细胞培养基补充剂，其中的多肽是哺乳动物多肽。

实施例14。实施例10-12的细胞培养基补充剂，其中的多肽是人的多肽。

实施例15。实施例10-14的任一项的培养基补充剂，其中的多肽是重组多肽，可以是重组人转铁蛋白，浓度范围为约0.0025mg/mL至25mg/mL，例如约25mg/mL，或者是重组人胰岛素，浓度范围为约0.002mg/mL至约20mg/mL，例如，约0.2mg/mL。

实施例16。前述实施例10-15中任一项的培养基补充剂，其中多肽的浓度范围为约0.002mg/mL至约25mg/mL，例如，约0.2mg/mL或约0.25mg/mL。

实施例17。实施例1-16中的任一项的培养基补充剂，进一步包括水溶性硒化合物。

实施例18。实施例17中细胞培养基补充剂，其中硒化合物是***钠(Na₂SeO₃),二氧化硒(SeO₂)，***(H₂SeO₃),硒基氯(SeOC_l2)，硒酸钠(Na₂SeO₄)或硫化硒(SeS)或以上所有的任意组合。

实施例19。实施例17或18的细胞培养基补充剂，其中水溶性硒化物，如***钠(Na₂SeO₃)，浓度范围为约0.008μg/mL至约80μg/mL，例如约0.8μg/mL。

实施例20。实施例1-19的任一项的培养基补充剂，进一步包括C_1-8醇胺。

实施例21。实施例20的细胞培养基补充剂，其中C_1-8醇胺是乙醇胺、6氨基-2甲基-2庚醇、甲醇胺、二甲基乙醇胺或N-甲基乙醇胺，或以上任何组合。

实施例22。实施例20或21的细胞培养基补充剂，其中C_1-8醇胺如乙醇胺，浓度范围为0.0005mg/mL至约5mg/mL，例如0.05mg/mL。

实施例23。实施例1-22中任一项的培养基补充剂，进一步包括C_1-8季铵化合物。

实施例24。实施例23中的细胞培养基补充剂，其中C_1-8季铵化合物是肉碱、四乙基溴化铵、四甲基氯化铵、四甲基氢氧化铵、胆碱或以上化合物的任意组合。

实施例25。实施例24的细胞培养基补充剂，其中肉碱是L-肉碱盐酸盐。

实施例26。实施例2-25的任一项的培养基补充剂，其中C_1-8季铵化合物，如L-肉碱盐酸盐，浓度范围为约0.001mg/mL至约10mg/mL，例如0.1mg/mL。

实施例27。实施例1-26中任一项的培养基补充剂，进一步包括脂肪酸，如亚油酸和亚麻酸或两者组合，该脂肪酸可选择性溶解在溶剂甲基-β-环糊精中。

实施例28。实施例27的细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸包括C_12-30碳链和至少2个双键。

实施例29。实施例28中的细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸包括18碳链和2或3个双键。

实施例30。实施例28或29的细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸包括亚麻酸和/或亚油酸。

实施例31。实施例27-30中的任一项的培养基补充剂，其中的脂肪酸，如亚油酸和亚麻酸或其组合，浓度范围为约0.0005mg/mL至约5mg/mL，例如0.05mg/mL。

实施例32。实施例1-31中的任一项的培养基补充剂，其中包括：1)抗坏血酸、抗坏血酸盐或其酯，2)trolox，3)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽，或其盐或酯，4)丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，5)转铁蛋白，6)***钠，7)乙醇胺，8)肉碱，9)亚麻酸和10)亚油酸。

实施例33。实施例32的细胞培养基补充剂，进一步包括胰岛素。

实施例34。一个，它包装。包括实施例1-33的任一项的培养基补充剂。

实施例35。包含实施例1-33中任一项细胞培养基补充剂的试剂盒。

实施例36。实施例35的试剂盒进一步包括一份存储或使用该细胞培养基补充剂的说明书，例如，细胞培养基补充剂与本质上无血清白蛋白的基础培养基联合使用以准备本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

实施例37。本质上无血清白蛋白的细胞培养基包含本质上无血清白蛋白的基础培养基和实施例1-33的任一项的培养基补充剂。

实施例38。实施例37的细胞培养基，其中抗坏血酸、抗坏血酸盐或其酯，如L-抗坏血酸，浓度范围为约0.5mg/L至约5000mg/L，例如约50mg/L。

实施例39。实施例37或38的细胞培养基，其中维生素E的水溶性类似物，如trolox，浓度范围为约0.5μM至5000μM，例如约50μM。

实施例40。实施例37-39中任一项的培养基，其中N-乙酰-L-半胱氨酸，范围为约0.5μM至约5000μM，例如，约50μM。

实施例41。实施例37-40中任一项的培养基，其中丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，如丙酮酸钠，浓度范围为约0.01mM至100mM，例如约1mM。

实施例42。实施例37-41中任一项的培养基，其中多肽，例如转铁蛋白和/或胰岛素，浓度范围为约0.04mg/L至约500mg/L，例如，重组人源转铁蛋白的浓度范围为约0.05mg/L至500mg/L，例如约5mg/L，重组人源胰岛素的浓度范围为约0.04mg/L至400mg/L，例如4mg/L。

实施例43。实施例37-42中任一项的培养基，其中硒化合物，例如***钠(Na₂SeO₃),浓度范围为约0.16μg/L至约1600μg/L，例如约16ug/L。

实施例44。实施例37-43中任一项的培养基，其中C_1-8醇胺，例如，乙醇胺，浓度范围为约0.01mg/L至约100mg/L，例如1mg/L。

实施例45。实施例37-44中任一项的培养基，其中C_1-8季铵化合物，例如肉碱或L-肉碱盐酸盐，浓度范围为约0.02mg/L至约200mg/L，例如2mg/L。

实施例46。实施例37-45中任一项的培养基，其中脂肪酸，例如亚麻酸和/或亚油酸，浓度范围为约0.01mg/L至约100mg/L，例如1mg/L。

实施例47。实施例37-46中任一项的培养基，其中，本质上无血清白蛋白基础培养基从以下组成中选出：RPMI 1640，DMEM，DMEM/F12，IMDM，M199和BME。

实施例48。实施例37-47中任一项的培养基，其中，细胞培养基补充剂和本质上无血清白蛋白基础培养基的比例在1：0.01和1：100之间(体积/体积)，例如约1：50(体积/体积)。

实施例49。实施例37-48中任一项的培养基包括5mg/mL或更少的白蛋白。

实施例50。实施例37-49中任一项的培养基，配制为支持细胞生长、分化和/或维持其状态。

实施例51。实施例50的细胞培养基，配制为支持干细胞、祖细胞或前体细胞生长、分化和/或维持其状态。

实施例52。实施例51的细胞培养基，其中干细胞是一种全能、多能、专能、寡能或单能干细胞。

实施例53。实施例51的细胞培养基，其中干细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞或成体干细胞。

实施例54。实施例51的细胞培养基，其中干细胞是哺乳动物干细胞。

实施例55。实施例54的细胞培养基，其中哺乳动物干细胞是人干细胞。

实施例56。实施例51的细胞培养基，其中干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

实施例57。实施例51-56的细胞培养基，配制为支持干细胞生长和/或分化为心肌细胞，例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞。

实施例58。实施例51-56的细胞培养基，配制为支持心肌细胞，例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞状态的维持。

实施例59。一个包装，它包含实施例37-58中任一项的培养基。

实施例60。一个试剂盒，它包括实施例37-58的任一项的培养基。

实施例61。实施例60中的试剂盒，进一步包括能起始、诱导和/或支持细胞生长、分化和/或维持其状态的物质。

实施例62。实施例60的试剂盒，进一步包括能起始、诱导和/或支持干细胞、祖细胞和前体细胞的生长、分化和/或维持其状态的物质。

实施例63。实施例62的试剂盒，其中该物质起始、诱导和/或支持干细胞的分化。

实施例64。实施例63的试剂盒，其中该物质起始、诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。

实施例65。实施例63的试剂盒，其中该物质为骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂。

实施例66。实施例65的试剂盒，其中BMP拮抗剂是BMP 4拮抗剂。

实施例67。实施例63的试剂盒，其中该物质包括碱性成纤维生长因子(bFGF)、BMP4、activin A、Wnt-3a或起Wnt-3a作用的小分子(如Bio和/或CHIR99021)、一个或更多生长因子和/或阻止Wnt信号通路的小分子(例如dickkopf同系物1(DKK1)、IWP和Wnt信号通路反应的抑制剂(IWR))

实施例68。实施例63的试剂盒，其中该物质起始、诱导和/或支持干细胞、中胚层细胞分化为心肌细胞，例如心室肌细胞和心房肌细胞。

实施例69。实施例68的试剂盒，其中该物质起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心室心肌细胞，其中该物质可选择性包含BMP 4和/或视黄酸信号通路。

实施例70。实施例69的试剂盒，其中该物质抑制干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路、SAPK/JNK信号通路和/或p38信号通路。

实施例71。实施例70的试剂盒，其中该物质是泛视黄酸受体拮抗剂、视黄酸拮抗剂、视黄酸受体拮抗剂、视黄酸X受体拮抗剂，或是泛视黄酸受体拮抗剂。

实施例72。实施例70的试剂盒，其中该物质是BMS-493、BMS-189453、SP-600125，或SB-203580。

实施例73。实施例68的试剂盒，其中该物质包括起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心房心肌细胞。

实施例74。实施例73的试剂盒，其中该物质刺激干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路。

实施例75。实施例74的试剂盒，其中该物质是视黄酸或维生素A。

实施例76。实施例60-75的试剂盒，进一步包括一份使用本质上无血清白蛋白的细胞培养基以支持干细胞(如干细胞、祖细胞或前体细胞)生长、分化和/或维持其状态的说明书。

实施例77。一种使细胞生长、分化和/或维持其状态的方法，该方法包括使细胞接触实施例37-58中任一本质上无白蛋白细胞培养基。

实施例78。实施例77的方法，用于使细胞生长。

实施例79。实施例77的方法，用于分化细胞。

实施例80。实施例77的方法，用于维持细胞的状态。

实施例81。实施例77-80中任一项的方法，其所述细胞来源于单细胞生物或多细胞生物。

实施例82。实施例77-80中任一项的方法，其所述细胞来源于脊椎动物、非人哺乳动物或人类。

实施例83。实施例77-82中任一项的办法，其所述的细胞是干细胞。

实施例84。实施例83方法中所述的干细胞是一种全能、多能、专能、寡能或单能干细胞。

实施例85。实施例83方法中所述干细胞为胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞。

实施例86。实施例83方法中所述的干细胞是哺乳动物干细胞。

实施例87。实施例86方法中，其中哺乳动物干细胞是人干细胞。

实施例88。实施例83方法所述的干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

实施例89。实施例83-88中任一项的方法，用于支持干细胞生长和/或分化为心肌细胞，例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞。

实施例90。实施例83-89中任一项的方法，进一步包括使干细胞与一种物质接触以起始、诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。

实施例91。实施例90方法中，该物质为骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂。

实施例92。实施例91方法中的BMP拮抗剂可以是BMP4拮抗剂。

实施例93。实施例91方法中的该物质包含碱性成纤维生长因子、BMP4、activinA、Wnt-3a或具有Wnt-3a作用的小分子(如Bio和/或CHIR99021)，和/或一个或更多的生长因子和/或阻止Wnt信号通路的小分子(例如dickkopf同系物1(DKK1)、IWP和Wnt信号通路的抑制剂(IWR))

实施例94。实施例83-93中任一项方法，进一步包括使干细胞或中胚层细胞接触某物质以起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心肌细胞，例如心室心肌细胞和/或心房心肌细胞。

实施例95。实施例94方法，其中该物质起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心室心肌细胞，其中该物质可选择性包括BMP4和/或视黄酸信号通路抑制剂。

实施例96。实施例95的方法，其中该物质抑制干细胞中或中胚层细胞中的视黄酸信号通路、SAPK/JNK信号通路和/或p38信号通路。

实施例97。实施例96的方法，其中该物质是泛视黄酸受体拮抗剂、视黄酸拮抗剂、视黄酸X受体拮抗剂，或泛视黄酸受体拮抗剂。

实施例98。实施例97的方法，其中该物质是BMS-493、BMS-189453、SP-600125或SB-203580。

实施例99。实施例95的方法，其中该物质起始、诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心房肌细胞。

实施例100。实施例99的方法，其中该物质刺激干细胞或中胚层细胞中的视黄酸信号通路。

实施例101。实施例100的方法，其中该物质是视黄酸或维生素A。

实施例102。实施例94-101中任一项方法的心肌分化效率范围为约50％至90％。

实施例103。实施例94-102中任一项方法所产生的心肌细胞平均密度范围为约1×10⁵个心肌细胞/cm²至1×10⁶个心肌细胞/cm²。

实施例104。实施例95-98，102和103任一项方法的心肌细胞的得率为约1至10个心肌细胞每个干细胞。

实施例105。实施例95-98和102-104中任一项方法的心室肌细胞分化效率为约50％至约90％。

实施例106。实施例95-98和102-105中任一项方法所产生的心室肌细胞的平均密度为约1×10⁵个心肌细胞/cm²至约1×10⁶个心肌细胞/cm²。

实施例107。实施例95-98和102-106任一项方法所产生的心室肌细胞的得率为约1至10个心肌细胞每个干细胞。

实施例108。实施例99-104中任一项方法的心房肌分化效率为约50％至约90％。

实施例109。实施例99-104和108中任一项方法所产生的心房心肌细胞的平均密度为约1×10⁵个心肌细胞/cm²至约1×10⁶个心肌细胞/cm²。

实施例110。实施例99-104，108和109的任一项方法产生的心房肌细胞的得率为约1至10个心肌细胞每个干细胞。

实施例111。实施例94-110的任一项方法，进一步包括心肌细胞的富集。

实施例112。实施例111的方法，其中通过降低培养基的葡萄糖浓度富集培养基中的心肌细胞，降低的葡萄糖浓度在约1000mg/L至约2000mg/L的范围内。

实施例113。实施例77-112中任一项的方法，是在渗透压约100至约500mOsm的范围实施，例如100-200mOsm、200-300mOsm、250-350mOsm(如300-330mOsm)、300-400mOsm和400-500mOsm。

实施例114。通过实施例77-113中任一项的方法使细胞生长、分化或维持其状态。

实施例115。通过实施例94-113中任一项的方法产生心肌细胞。

实施例116。实施例115的心肌细胞，其心肌细胞特异性基因表达水平提高，具有胚胎心肌样动作电位(AP)和/或典型的心肌细胞Ca²⁺火花信号模式。

实施例117。通过实施例94-98，102-107和111-113中任一项的方法产生的心室肌细胞。

实施例118。实施例117的心室肌细胞，其心室肌细胞特异性基因表达水平提高，具有胚胎心室样动作电位和/或典型的心肌细胞Ca²⁺火花信号模式。

实施例119。通过实施例94、99-104和108-1113中任一项的方法产生的心房肌细胞。

实施例120。实施例119的心房肌细胞，具有胚胎心房样动作电位(AP)和/或Ca²⁺火花信号模式。

实施例121。一种药用组分，它包含有效量的通过实施例77-113中任一项的方法生长、分化和/或维持其状态的细胞，以及药学上可接受的载体或辅料。

实施例122。一种用于心肌受损或病症的药用组分，它包含有效量的实施例115或116的心肌细胞，实施例117或118的心室肌细胞或实施例119或120的心房肌细胞和一种药学上可接受的载体或辅料。

实施例123。一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向需要或极其需要该治疗的受试者施用有效量的实施例121的药用组分。

实施例124。一种治疗受试者心肌受损或病症的方法，该方法包括向需要或极其需要该治疗的受试者施用有效量的实施例122的药用组分。

实施例125。实施例123或124的方法，其受试者是人。

实施例126。一种鉴别细胞调节剂的办法，该方法包括：1)使实施例114的细胞与调节剂候选物接触，并测量调节剂候选物对细胞某一特性的影响；2)并测量未与调节剂候选物接触的细胞的此特性，由此与调节剂候选物接触的细胞的特性不同于未与调节剂候选物接触的细胞，确定此候选物可以调节细胞的某一特性，为细胞调节剂。

实施例127。一种鉴别心肌细胞调节剂的办法，该方法包括：1)使实施例115或116的心肌细胞、实施例117或118的心室心肌细胞、或实施例119或120的心房心肌细胞与调节剂候选物接触，并测量调节剂候选物对心肌细胞某一特性的影响；2)并测量未与调节剂候选物接触的心肌细胞的此特性，由此与调节剂候选物接触的心肌细胞的特性不同于未与调节剂候选物接触的心肌细胞，确定此候选物可以调节心肌细胞的某一特性，为心肌细胞调节剂。

C、例：

化学成分明确无血清白蛋白方式产生人心房和心室心肌细胞。

综述

当前所有用于人多能干细胞分化心肌细胞的培养基都含有大量的白蛋白。对于hPSC来源的心肌细胞(hPSC-CMs)的临床应用，人们担忧白蛋白的免疫原性。白蛋白批次变化差异大是造成hPSC心肌分化不一致的主要原因之一。在该例案中，证明了抗氧化剂如L-抗坏血酸、trolox、N-乙酰-L-半胱氨酸和丙酮酸(如丙酮酸钠)，可以代替培养基中白蛋白的功能。通过这种替换，制备了一种无白蛋白、化学成分明确的培养基(S12培养基)，该培养基可有效支持hPSC心肌分化，显著提高了可重复性并可长期培养hPSC-CMs。在化学成分明确且无白蛋白的条件下，建立了人诱导多能干细胞(hiPSCs)，并将其定向分化为高度均一的心房和心室肌细胞，对它们的电生理特性进行表征。结果表明，该培养***产生的hiPSCs-来源心室肌细胞适合用于新药物的心脏安全性评估。综上所述，这种简化的、化学成分明确的培养基能促进hPSC-CMs的研究和临床应用。

材料与方法

人诱导多能细胞的产生。经生物物理研究所审查委员会批准的协议和从病人处获得的书面同意书，从一个5岁男孩***环切手术中获得***组织。该组织切碎成小块，在Tryple胰酶消化液(Life Technology,0040090DG)中4℃，过夜孵育，再37℃孵育30min。小块的组织用E6培养基(E8培养基无bFGF和TGF-β)清洗3次，接到预先包被重组人玻连蛋白(VTN-NC,2.2μg/cm²)的24孔板中。添加100ng/mL重组人EGF(Peprotech,AF-100-15)¹⁰的E8培养基培养这些细胞4-5天，以使成纤维细胞生长。1.25μg每种游离质粒(Addgene)，pCXLE-hOCT3/4-shp53(27077)、pCXLE-hSK(27078)and pCXLE-hUL(27080)电转染至1×10⁶个***成纤维细胞(传代数<6)，使用Amaxa仪器，设置：程序U-018和Nucleofector试剂盒VPD1001(Lonza)。然后细胞铺在玻连蛋白包被的平板中。在细胞汇合20％之前用E8+氢化可的松培养基培养，之后换成常规E8培养基。挑取具有hESC特点的克隆至VTN-NC包被的24孔板(一个克隆一个孔)，用包含10μM Y27632(Abcam,ab120129)的培养基培养24h。然后Versene溶液(Life Technology,21051-024,15040-066)消化hiPSCs克隆用于扩增培养^10，18。

hPSCs状态的维持和分化。为了维持hPSCs，hESC H7细胞系(WiCell研究所)和hiPSC细胞系培养在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中。未分化的hPSCs在2.2μg/cm²VTN-NC包被的含E8培养基的平板上维持其状态。

对于小分子诱导的心肌分化，hESC H7细胞系或hiPSCs用Versene溶液消化成单细胞，并以2.5-3.0×10⁵个细胞/孔的密度接种至VTN-NC包被的24孔板上。第一天补充Y27632(10μM)，之后撤去。在E8培养基中培养2-3天直到细胞汇合90％。为起始细胞分化(指定为第0天)，培养基更换为不含胰岛素的S12培养基。细胞用4-8μMCHIR99021(Tocris，4423)处理1天。然后，将培养基更换为不含CHIR99021的新鲜培养基。在第3天，向新鲜培养基添加5μMIWR-1(Sigma-Aldrich，I0161)2天。从第5天起，使用含有胰岛素的S12培养基。之后，每隔一天更换培养基(图1a)。

一方面，胰岛素会抑制hESCs早期中胚层分化，所以分化过程的前五天将胰岛素移除或培养基中不含胰岛素¹³。

为了定向分化为心房或心室肌细胞，在如前所述的分化过程中第5-8天，向分化培养基中添加1μM RA(Sigma-Aldrich,R2625)or 1μMBMS493(Tocris,3509)⁹。

E8和S12培养基的配方分别列在表1和表2中。

在一个实施例中，补充剂和培养基的配方列在表3中。

表1：E8培养基的配置。

表2：S12培养基的配置

表3：一个实施例中的补充剂和培养基的配置

注意，亚油酸和亚麻酸是脂溶性成分，溶于甲基-β-环糊精。

流式细胞术。心肌细胞用0.25％typsin-EDTA((Life Technology,25200-072)37℃作用5min，消化为单个细胞并用B缓冲液(Sigma,A9418-50G)清洗，B缓冲液含有溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)的0.25％牛血清白蛋白。然后用4％多聚甲醛在室温下固定细胞，用缓冲液A清洗，缓冲液A含有溶于PBS的0.5％牛血清白蛋白和0.1％皂苷(Sigma-Aldrich,S7900)。然后这些细胞与抗-人CTNT一抗((R&D systems,MAB1874)一起4℃孵育40min，用缓冲液A清洗，之后与羊抗鼠FITC标记的二抗(ZSGB-BIO,ZF-0312)4℃孵育40min。FACScalibur(Becton Dickinson)收集数据，FlowJo软件(Treestar)对数据进行分析。

RT-PCR和定量实时RT-PCR(QPCR)。用RNeasy Plus Mini kit(Qiagen,74134)分离总RNA。用PrimeScript^TMRT reagent kit with gDNA eraser去除基因组污染的反转录试剂盒(Takara,RR047A)反转录1μg总RNA。根据厂家说明书，RT-PCR使用2×Taq Mix((CW-BIO,CW0682C)。用1.5％琼脂糖胶电泳分析PCR产物。QPCR 3次，用2×QuantiFast SYBR Green IPCR Master Mix((Qiagen,204057)试剂，在Rotor Gene 6200Real-Time PCR Machine(Corbett)仪上反应，退火温度60℃。用GAPDH的表达量标准化每个基因的表达量。引物序列见表4(RT-PCR引物序列和表5(QPCR引物序列)。

表4：PT-PCR的引物序列

表5：QPCR引物序列

细胞活力测定。根据制造商的说明书(Dojindo)用CCK-8试剂盒评估不同培养条件下的细胞活力。简而言之，将细胞接种在24孔板中并分化，在每个检验点，弃去细胞培养基并用反应混合物取代(每孔500μLRPMI 1640+50μLCCK-8试剂)。在细胞培养箱中孵育40min后，每孔取110μL反应混合物转移至96孔板并用酶标仪(Perkin Elmer)测量在450nm处的吸光度。空白对照为无细胞、加入反应混合物的培养基。

蛋白电泳(SDS PAGE)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按Invitrogen Bi-Tris Mini凝胶电泳方案进行。用4-12％NuPAGE Bis-Tris预制凝胶(Invitrogen，NP0335PK2)和MES电泳缓冲液(Invitrogen，NP0002)分析100μLS12和B27培养基的蛋白质组分。凝胶用考马斯亮蓝染色。

免疫荧光。分化的培养物用0.25％typtin-EDTA 胰蛋白酶消化，将细胞铺在0.1％明胶包被的盖玻片上5天以使完全附着。用PBS洗盖玻片后4℃下在4％多聚甲醛中固定20min。然后将固定的细胞用0.1％Triton X-100在4℃下通透20min，并在室温下用10％山羊血清(ZSGB-BIO，ZLI-9021)封闭1h。然后，细胞与以下一抗4℃孵育过夜：抗人CTNT(R&Dsystems,MAB1874)、小鼠抗人α-actinin(Sigma-Aldrich，A7811)、小鼠抗人MHC(Abcam，ab15)、山羊抗人α-SMA(Abcam，ab5694)，小鼠抗人MLC2A(Synaptic Systems，311011)和兔抗人MLC2V(ProteinTech，10906-1-AP)。山羊抗小鼠488-(ZSGB-BIO，ZF-0511)或594-缀合的二抗(ZSGB-BIO，ZF-0513)和山羊抗-兔488-缀合的二抗(ZSGB-BIO，ZF-0516)用作第二抗体。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma-Aldrich，D0542)复染。使用Olympus显微镜***X51或Olympus LSCM FV1000(Olympus)使免疫荧光图像可视化并记录。

用PBS洗涤T175烧瓶中的分化培养物，在4％多聚甲醛中固定并用0.1％Triton X-100透化。首先用10％山羊血清(ZSGB-BIO，ZLI-9021)封闭细胞1小时。然后，将细胞与抗人CTNT抗体(R&D systems，MAB1874)4℃孵育1小时，随后与两步IHC检测试剂Two-Step IHCDetection(ZSGB-BIO，PV-6001)和DAB(ZSGB-BIO，ZLI-9018)孵育。苏木精(ZSGB-BIO，ZLI9609)复染细胞核约50s。免疫染色图像由Canon相机记录。

hESC来源心肌细胞单细胞的制备。使用的分离方法如前所述。简而言之，将培养25-30天的分化心肌团用低钙液洗，然后与溶于低钙液中的1mg/mL胶原酶II(LifeTechnology，17101-015)于37℃培养30-40min。将分离的单细胞用含有10％FBS的S12培养基重悬，转移至0.1％明胶包被的盖玻片上，于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

全细胞膜片钳式记录。取培养3-8天的单个贴壁细胞进行膜片钳实验。在35±2℃下记录自发产生的APs和除Ca²⁺电流以外的离子电流，Ca²⁺电流在室温下记录。采样频率为10k Hz或50k Hz，用Axon 200B和Digidate1322digitizer以2kHz进行过滤，并通过Clamfit10和Origin 8软件进行分析。使用充满细胞内溶液的膜片钳微电极(2–4MΩ电阻)。在表6和表7中列出了用于膜片钳记录的细胞内液和细胞外液的配方。

表6：用于膜片钳记录的细胞内液。

表7：用于膜片钳记录的细胞外液。

	INa(mM)	ICa(mM)	IKr(mM)	AP(mM)
					NaCl	50		140	140
KCl			5.4	5.4
					CaCl2 2H2O	1.8	5	1.8	1.8
MgCl2 6H2O	1	1	1	1
					Glucose	10	10	10	10
HEPES	10	10	10	10
					K-aspartate	110
TEA-Cl		160
					4-AP		2
nifedipine	0.001		0.002
					pH7.4	CsOH	CsOH	NaOH	NaOH

钠电流(I_Na)的记录：钳制电压为-120mV，阶跃电压刺激从-80mV到80mV，步阶为10mV，持续时间为40ms。钙电流的记录：钳制电压-50mV，阶跃电压刺激从-70mV到60mV，持续时间为300ms。为了记录E-4031敏感的I_kr电流，细胞外液中加入1μM E-4031来分离I_kr，钳制电压为40mV，阶跃电压刺激从-40mV到20mV，步阶为5mV，持续时间3s。细胞膜电容测量，钳制电压为-70mV，使用10mV测量膜电容。电流峰值振幅与膜电容的比值为电流密度，用于绘制电流I-V曲线。

穿孔式全细胞记录模式用于药物测试。将两性霉素B(240μg/mL；Sigma，A2411)加入到内液中。选择心室心肌细胞，通过短暂的电流脉冲(0.1-0.3nA)诱发AP的产生，刺激频率设置为1Hz。以4min为间隔，从最低到最高浓度添加药物并记录每个浓度的APs。分析以下参数：复极化90％及50％的动作电位时程(APD₉₀和APD₅₀)、APA、MDP和dV/dt。在表6和表7中列出了用于膜片钳记录的电极内液和细胞外液的配置表。

用蒸馏水制备E-4031(Tocris，1808)和异丙肾上腺素(Sigma-Aldrich，I5627)的储备液。用DMSO制备nifedipine(Sigma-Aldrich，N7634)储备液。储备液在使用前用≤0.1％DMSO稀释。其他化学品来自Sigma-Aldrich。

数据分析。结果用平均值±标准误差(mean±SD/SEM)表示。T检验(双尾检验)进行显著性差异分析。*P<0.05，***P<0.001。

结果

建立无血清白蛋白以及化学组分明确的分化培养体系。

为了建立无血清白蛋白和化学组分明确的分化培养体系，用E8培养基扩培hESC细胞系H7¹⁰，并且在化学成分确定的RPMI 1640培养基中用Wnt信号通路相关的小分子诱导心肌分化，以评估B27成分(图1a)²。B27有20种成分，其中4种(牛血清白蛋白、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和D-半乳糖)来源于动物。与之前的报道¹¹类似，从B27中撤去血清白蛋白、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和***，导致心肌分化效率大大降低，细胞生长停滞和中度细胞死亡。为避免细胞生长停滞，提高心肌分化效率，在分化的前三天加入50μg/mL重组人源玻连蛋白(VTN-NC)，因为VTN可以促进上皮-间充质转换(EMT)的发生。然而在配制培养基的过程中，两种维生素E的类似物：DL-α-生育酚醋酸酯和DL-α-生育酚不溶于无血清白蛋白的培养基。因此，我们测试维生素E的水溶性类似物trolox，能否能够在撤去前述4种动物源成分、DL-α-生育酚醋酸酯和DL-α-生育酚的培养基中支持心肌分化。同时，亚油酸和亚麻酸是脂溶性的成分，可溶于甲基-β-环糊精溶剂。流式细胞仪(FACS)分析CTNT表达的细胞表明，通过撤去这6种成分，向培养基加入trolox，有效地支持心肌分化。用此方法逐步鉴定B27中其他组分对心肌分化的影响。结果表明培养基移除B27中13种成分，在分化的前三天加入VTN-NC，不会显著影响心肌分化效率或心肌细胞得率(表8)。在表8中，第一列为B27的20种成分，玻连蛋白和trolox。列a-l是使用含有标记为灰色的化合物的培养基分化心肌。表8倒数第二行表示心肌分化效率，倒数第一行表明每个分化培养基的心肌细胞得率。“+”意为与使用B27补充剂的培养基分化心肌的得率相似。“-”意为心肌细胞得率显著少于使用B27补充剂的培养基分化心肌的得率。

表8：B27补充剂培养基的初步优化

基于以上结果，我们配制了一种hPSC心肌分化培养基，通过往RPMI1640培养基中加入trolox和8种组分。这8种组分是重组人源胰岛素(抑制hESCs早期中胚层分化¹³，在分化的前5天从培养基中去除)，重组人源转铁蛋白(一种铁离子载体，通过调节铁摄取维持细胞稳态^14，15)，***钠(一些抗氧化酶功能必需^14，15)，乙醇胺(一种磷脂合成前体，对于质膜和细胞器是必不可少的)，L-肉碱盐酸盐(将长链脂肪酸从细胞质转移到线粒体基质中进行氧化，这是心脏发育过程中主要的产能方式¹⁶)，亚麻酸和亚油酸(是支持理想心血管功能所需的必须脂肪酸)溶于甲基-β-环糊精(作为一种溶剂)。添加这8种成分的RPMI1640培养基命名为S12基础培养基。

从之前的经验，了解到第一次撤去的6种成分，血清白蛋白、超氧化物歧化酶和两种维生素E类似物(DL-生育酚酸酯和DL-α-生育酚)，都具有抗氧化的功能。因此，抗氧化剂可能替代了被撤去的分子的功能，在无玻连白蛋白培养基中支持hPSCs的增殖和心肌分化。为了验证这个假设，通过比较培养在添加了谷胱甘肽(一种三肽，含谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸)的S12基础培养基上和培养在无L-半胱氨酸(两种具有抗氧化功能的成分)的RPMI1640中的干细胞分化情况，看抗氧化剂对于干细胞分化为心肌是否起关键作用。在无抗氧化剂的培养环境中，细胞在3天或4天内死亡(图1b)。然后测试向S12基础培养基中加入额外的抗氧化剂，是否支持心肌分化。结果显示，额外加入单个抗氧化剂trolox、L-抗坏血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或丙酮酸钠均略微提高了心肌分化效率，组内差异稍大。然而，添加四种抗氧化剂中的任意三种将心肌分化效率提高到超过60％，四种抗氧化剂一起添加不仅显著增加心脏分化效率(76％；图1c)，并且细胞可以在无玻连蛋白培养基上生长良好(图1b)。此时，S12培养基为RPMI1640培养基中添加12种补充的成分，包括两种蛋白：重组人源胰岛素(4mg/L)和重组人源转铁蛋白(5mg/L),7种化学物质(L-抗坏血酸、trolox、NAC、丙酮酸钠、***钠、乙醇胺和肉碱)和两种脂肪酸(亚油酸和亚麻酸)，甲基-β-环糊精(溶剂)。

通过实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测配制的培养基(S12培养基)和B27培养基中分化而来的心肌细胞多功能标志基因POU5F1，中胚层基因Brachyury(T)和MESP1，和心肌相关基因ISL1、NKX2.5、TBX5、MLC2A和CTNT的表达水平。结果显示：在这两种培养基中分化的培养物中这些基因具有类似的表达(图5)。蛋白电泳表明S12培养基相比B27培养基蛋白含量明显更少(图6)。

进一步测定除四种抗氧化剂外的其余7种补充成分对心肌分化的必要性。结果显示：S12培养基中单独撤去7种成分的每种成分，除胰岛素外其他成分单独缺少都会显著降低心肌分化效率(图1d)。S12培养基中分化的心肌细胞得率显著高于缺少7种成分中任一种的培养基分化的心肌细胞得率(图1e)。这些结果表明转铁蛋白、亚油酸、L-肉碱、亚麻酸、***钠、乙醇胺和胰岛素对支持hPSC心肌分化效率很重要。

在无血清白蛋白培养基中，渗透压对干细胞培养起着重要的作用。在不同的渗透压水平下用S12培养基分化H7细胞系，结果表明渗透压在300-330mOsm范围内，心肌分化效率较好。(图1f)。

对于大规模生产心肌细胞而言，心肌分化的可重复性是个重要问题，本次研究中，进行为期10个月，多次分化实验进行统计对比验证。用24孔板在B27培养基中进行了42次独立实验(使用了3个不同批次B27补充剂)，S12培养基中进行51次独立分化实验，S12基础培养基进行27次独立分化实验。数据显示使用S12培养基的心肌分化效率显著高于使用B27培养基(平均分化效率分别为73.4％和52.5％；图1g)。S12培养基的分化效率标准差(8.6％)明显小于B27培养基标准差(19.2％)，表明使用S12培养基进行心肌分化实验具有更高的重复性相比于使用B27培养基。S12培养基的平均心肌细胞得率为5.2×10⁵个/cm²，比B27培养基(3.5×10⁵个细胞/cm²；图1h)高48.6％。

心肌细胞大规模生产是实际应用的前提。H7细胞系在培养瓶中进行大规模二维心肌分化。3个平行实验的结果：平均分化效率为83.3％，平均产率3.2×10⁵个心肌细胞/cm²。1瓶T175培养瓶平均产生5.6×10⁷个心肌细胞(图7)。注意到T175培养瓶中每平方厘米培养物的心肌细胞产量低于24孔培养板中培养的心肌细胞产量。这可能反应培养环境不同或T175培养物的样本量小。这些分化的心肌细胞可以在S12培养基中维持正常跳动能力超过100天。

hiPSC在无血清白蛋白并且化学成分明确的培养条件下中分化为心房样和心室样心肌细胞。使用基于重组蛋白的E8培养基(通过酿酒酵母表达的重组人源全铁转铁蛋白代替人全铁转铁蛋白)，重组人源玻连蛋白作为基质，附加质粒表达Yamanaka的因子，采用无动物源重组酶的方法进行传代扩增，在无血清白蛋白和化学成分明确的条件下得到了24个hiPSC细胞克隆(图8a)。这些hiPSC细胞系表达多功能性标志基因POU5F1、NANOG、SOX2等，并可形成具有三胚层组织的畸胎瘤(图8b和图8c)。遗传检测表明这些hiPSC细胞系具有正常的核型(图8d)。从hiPSC细胞系中选取5株培养在S12培养基中进行心肌分化。FACS分析CTNT表达细胞表明5株细胞系全部有效地分化为心肌细胞(图2a)。荧光免疫染色和RT-PCR证明这些分化的心肌细胞在分化过程中表达了中胚层相关基因和心肌相关基因(图2b和图2c)。

为了直接分化hPSC为高度均一的心房样和心室样肌细胞。从hiPSC细胞系中选取一株，xeno and virus free(XVF)4，在S12培养基中分化，按如前所述方法用视黄酸(RA)处理hiPSC-XVF4以向心房肌细胞分化，用RA抑制剂BMS493处理以向心室肌细胞分化。FACS分析CTNT表达细胞表明两种处理的分化培养物的心肌分化效率都超过80％(图2d)。实时定量RT-PCR表明BMS493处理组心室肌标志基因IRX4的表达水平明显高于RA处理组。另一方面，RA处理组的心房肌标志基因NR2F2的表达显著高于BMS493处理组(图2e)。双荧光染色培养60天的培养物CTNT和成熟心室肌细胞标志MLC2V，结果BMS493处理组的心肌细胞广泛表达MLC2V，而RA处理组不广泛(图2f)。

通过代谢选择在分化处理的培养物中进一步富集心肌细胞，即在分化14天的RPMI1640培养基中将葡萄糖换成DL-乳酸。FACS分析表明RA处理组葡萄糖被取代的2天内，心肌细胞从85％富集到95.7％，BMS-493处理组从86.3％富集到94.3％(图2d)。

hPSC来源的心房样和心室样心肌细胞的电生理特征。动作电位(AP)和离子通道活性对于心肌细胞的功能至关重要。用全细胞膜片钳技术研究单个心肌细胞的AP和离子通道。根据动作电位的性质可分为窦房结样、心房样和心室样APs。特别的是，窦房结样AP具有更慢的去极化速率(dV/dt)，较小的动作电位幅度(APA)，去极化的最大舒张电位，跳动频率更快相比于心房样和心肌样APs。用复极化动作电位时程的90％(APD₉₀)是否小于150ms来进一步区分心房样和心室样Aps，因为心室样AP具有显著平台期^21，22。尽管三种AP类型都被记录到，RA处理组中，90.3％(n＝31)具有心房样APs，BMS-493处理组，93.3％(n＝30)具有心室样APs(图3b)。结果表明RA处理组中的心肌细胞是高度均一化的心房样肌细胞，BMS-493处理组的心肌细胞是高度均一化的心室样心肌细胞。被记录的三种AP类型的参数的分析(图3c)。

心房肌细胞和心室肌细胞的钠电流(I_Na)、钙电流(I_Ca)和E-4031敏感电流(I_Kr)的研究。心室样心肌细胞的膜电容(35.1±2.3pF，n＝23)比心房样心肌细胞的膜电容((25.3±2.0pF，n＝26)大。心室样心肌细胞和心房样心肌细胞的最大I_Na密度分别为-151.7±20.0pA/pF(n＝9)和-148.5±19.7pA/pF(n＝9；图3d)。I_Ca的峰电流密度，心室样心肌细胞大于心房样心肌细胞(-11.5±1.6pA/pF，n＝7相对于-5.7±0.9pA/pF，n＝10；图3e)。钾电流的测定需要用1μM E-4031分离其敏感的I_Kr电流。I_Kr电流存在于所有记录的心室样心肌细胞(n＝7)和心房样心肌细胞(n＝6)中。心室样心肌细胞的I_Kr峰尾电流密度和心房样心肌细胞的I_Kr峰尾电流密度分别是1.7±0.2and 1.8±0.3pA/pF(图3f)。综上所述，在干细胞来源的心房和心室样心肌细胞中，I_Ca的动作电位时程和幅度有显著差异，但并未在I_Na和I_Kr的幅度中观察到。

hPSC来源的心室样心肌细胞的安全性研究。hPSC-CMs在开发新药的心脏安全性评估实验上提供了一个独一无二的实验模型。由于ICH S7B要求对人用药品潜在的致尖端扭转型室速(一种危及生命的室性心律失常)进行风险评估，，因此，心脏毒性分析最相关的心肌细胞亚型是心室样心肌细胞。

在这项研究中，采用全细胞膜片钳技术测试三种已知药物(E-4031、nifedipine和异丙肾上腺素)对心室样心肌细胞APs的影响。结果显示,0.1％DMSO的细胞外液在20min的记录期内对心室样AP无影响。E-4031，一个hERG钾离子通道阻断剂，浓度在100nM会诱导自发跳动细胞的早期后除极(图9)。以1Hz的刺激频率(0.2-0.3nA)，心室样心肌细胞被激活，E-4031能够延长AP时程，并具有浓度依赖性。10nM E-4031对AP的没有明显变化，然而浓度提高到100nM和1000nM时，可以分别将APD50延长到169.6±13.4％和195.6±12.3％。而对APA和dV/dt参数没有明显作用。(图4b)。nifedipine，一种L型钙离子通道抑制剂，浓度10nM和100nM时分别将APD90缩短至73.6±2.7％和47.1±6.1％，1μM时略微缩短APA和dV/dt。对于加快心率的异丙肾上腺素而言，一种β肾上腺素能受体激动剂，能缩短APD₉₀，对AP其他参数没有明显影响(图4和表9)。在表9中，数据是以未处理心肌细胞AP的百分比表示，同时以平均数±标准误的格式显示。MDP：最大去极化电位；APD50和APD90：复极化50％动作电位时程和复极化90％动作电位时程；APA：动作电位幅度；dV/dt：最大去极化速率。

E-4031和nifedipine对我们的均一的心室样心肌细胞AP的影响结果类似于之前研究报道的用非定向分化步骤产生的hPSC来源心室样心肌细胞^25，26。

讨论

在这个例子中，维持培养基中的活性氧簇在合适的浓度对于hPSC增殖和有效地分化心肌很重要。ROS是由细胞代谢和其他生理过程中，自然持续产生的。培养基中缺少抗氧化物***会使细胞中ROS积累，产生氧化应激压力，最后导致细胞生长永久停滞和细胞凋亡^27，28。S12培养基中的4种抗氧化剂中，抗坏血酸和trolox会在水相或生物脂中与自由基反应，如过氧自由基和单线态分子氧(¹O₂)²⁹。NAC不仅是谷胱甘肽的前体，也会直接与ROS和活性氮反应作为氧自由基的清除剂³⁰。丙酮酸钠则通过非酶促反应清除细胞培养基中的过氧化氢³¹。E8培养基首次表明血清白蛋白，之前一直认为是一种不可缺少的细胞培养基必需成分，可以从支持长期培养hPSC的培养基中除去¹⁰。证明了通过调节培养基中抗氧化物的浓度，可以实现在无血清白蛋白条件下长期培养分化的细胞。这些研究为细胞培养基的研究提供了新的角度。

尽管关于hPSC-CMs移植到心肌梗死灵长类动物模型的报道证明了细胞治疗的潜力³²，人们担忧移植的细胞会引起心律失常³³。没有定向分化，心房肌细胞、心室肌细胞和窦房结肌细胞自发分化。现在证实了移植不均一的肌细胞团到左心室会使心脏产生异常跳动³⁵。对于心肌梗塞采用基于细胞的移植治疗，使用在无血清白蛋白和化学成分明确的条件下中产生的高度均一的心室肌细胞团不仅能减少心律不齐的风险，也易于对生物安全问题的监管。

hPSC来源的心室肌细胞为药物的心脏毒性实验分析提供了一个新的，有效率的和经济的致心律失常风险评估模式。目前正在研究是否可以作为药物心脏安全评价的补充被政府相关部门、学术界和制药行业所接受³⁷。因为hPSC来源的心室样心肌细胞具有成人心室肌细胞的电流^26，28，在心脏安全性评估中使用这些细胞不仅可以避免物种差异性，也能获得完整的细胞生理药物反应，这是无法从传统的单离子通道转基因细胞模型中获得²⁴。在无血清白蛋白和化学成分明确的条件下产生高度均一的hPSC来源心室样心肌细胞是高通量药物筛选技术的前提，如自动膜片钳技术，用于开发新药化合物的早期临床前安全性评估²³。

综上所述，从培养基中撤去血清白蛋白提供了优势。首先，消除了血清白蛋白的批次于批次之间的差异，极大的增加了心肌分化过程的可重复性。可以通过大规模二维心肌分化获得更多的心室样或心房样心肌细胞。第二，在基于细胞的药物评估中排除了血清白蛋白与被测药物反应的干扰³⁹。因此，通过探索各种潜在因素它提供了一个平台以产生成熟心室样或心房样心肌细胞。最重要的是，它减少了这些细胞的在临床应用的潜在病原污染和细胞免疫风险。这个无血清白蛋白和化学成分明确的培养基会促进未来的hPSC-CMs的研究和临床应用。

参考文献

1.Yang L et al.Human cardiovascular progenitor cells develop from akdr+embryonicstem-cell-derived population.Nature.2008；453:524-528.

2.Lian X et al.Robust cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells via temporal modulation of canonical wntsignaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America.2012；109:E1848-1857.

3.Takahashi K et al.Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell.2007；131:861-872.

4.Thomson JA et al.Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science.1998；282:1145-1147.

5.Stacey GN et al.The development of'feeder'cells for the preparationof clinical grade hes cell lines:Challenges and solutions.Journal ofbiotechnology.2006；125:583-588.

6.Ng ES et al.A protocol describing the use of a recombinant protein-based,animal product-free medium(apel)for human embryonic stem celldifferentiation as spin embryoid bodies.Nature protocols.2008；3:768-776.

7.Burridge PW et al.Chemically defined generation of humancardiomyocytes.Nature methods.2014.

8.Kobayashi K.Summary of recombinant human serum albumindevelopment.Biologicals:journal of the International Association ofBiological Standardization.2006；34:55-59.

9.Zhang Q et al.Direct differentiation of atrial and ventricularmyocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals.CellRes.2011；21:579-587.

10.Chen G et al.Chemically defined conditions for human ipscderivation and culture.Nature methods.2011；8:424-429.

11.Minami I et al.A small molecule that promotes cardiacdifferentiation of human pluripotent stem cells under defined,cytokine-andxeno-free conditions.Cell reports.2012；2:1448-1460.

12.Zhang J et al.Extracellular matrix promotes highly efficientcardiac differentiation of human pluripotent stem cells:The matrix sandwichmethod.Circulation research.2012；111:1125-1136.

13.Xu XQ et al.Chemically defined medium supporting cardiomyocytedifferentiation of human embryonic stem cells.Differentiation.2008；76:958-970.

14.Gstraunthaler G.Alternatives to the use of fetal bovine serum:Serum-free cell culture.Altex-Altern Tierexp.2003；20:275-281.

15.Barnes D,Sato G.Serum-free cell culture:A unifyingapproach.Cell.1980；22:649-655.

16.Longo N et al.Disorders of carnitine transport and the carnitinecycle.Am J Med Genet C.2006；142C:77-85.

17.Duda MK et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acid supplementationfor the treatment of heart failure:Mechanisms and clinicalpotential.Cardiovasc Res.2009；84:33-41.

18.Okita K et al.A more efficient method to generate integration-freehuman ips cells.Nature methods.2011；8:409-412.

19.Wu SP et al.Atrial identity is determined by a coup-tfiiregulatory network.Developmental cell.2013；25:417-426.

20.Tohyama S et al.Distinct metabolic flow enables large-scalepurification of mouse and human pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes.Cell stem cell.2013；12:127-137.

21.Peng S et al.The action potential and comparative pharmacology ofstem cell-derived human cardiomyocytes.Journal of pharmacological andtoxicological methods.2010；61:277-286.

22.Honda et al.Electrophysiological characterization ofcardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.Journal ofpharmacological sciences.2011；117:149-159.

23.International conference on harmonisation；guidance on s7bnonclinical evaluation of the potential for delayed ventricularrepolarization(qt interval prolongation)by human pharmaceuticals；availability.Notice.Federal register.2005；70:61133-61134.

24.Mandenius CF et al.Cardiotoxicity testing using pluripotent stemcell-derived human cardiomyocytes and state-of-the-art bioanalytics:Areview.J Appl Toxicol.2011；31:191205.

25.Gibson JK et al.Human stem cell-derived cardiomyocytes detectdrug-mediated changes in action potentials and ion currents.Journal ofpharmacological and toxicological methods.2014；70:255-267.

26.Ma J et al.High purity human-induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes:Electrophysiological properties of action potentials and ioniccurrents.American journal of physiology.Heart and circulatoryphysiology.2011；301:H2006-2017.

27.Davies KJ.The broad spectrum of responses to oxidants inproliferating cells:A new paradigm for oxidative stress.IUBMB life.1999；48:41-47.

28.Morel Y,Barouki R.Repression of gene expression by oxidativestress.The Biochemical journal.1999；342 Pt 3:481-496.

29.Sies H,Stahl W.Vitamins e and c,beta-carotene,and othercarotenoids as antioxidants.The American journal of clinical nutrition.1995；62:1315S-1321S.

30.Zafarullah M et al.Molecular mechanisms of n-acetylcysteineactions.Cellular and molecular life sciences:CMLS.2003；60:6-20.

31.Babich H et al.Choice of dmem,formulated with or without pyruvate,plays an important role in assessing the in vitro cytotoxicity of oxidantsand prooxidant nutraceuticals.In vitro cellular&developmentalbiology.Animal.2009；45:226-233.

32.Chong JJ et al.Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytesregenerate nonhuman primate hearts.Nature.2014.

33.Anderson ME et al.Embryonic stem cell-derived cardiac myocytes arenot ready for human trials.Circulation research.2014；115:335-338.

34.He JQ et al.Human embryonic stem cells develop into multiple typesof cardiac myocytes:Action potential characterization.Circulationresearch.2003；93:32-39.

35.Kehat I et al.Electromechanical integration of cardiomyocytesderived from human embryonic stem cells.Nature biotechnology.2004；22:1282-1289.

36.Chen HS et al.Electrophysiological challenges of cell-basedmyocardial repair.Circulation.2009；120:2496-2508.

37.Cavero I,Holzgrefe H.Comprehensive in vitro proarrhythmia assay,anovel in vitro/in silico paradigm to detect ventricular proarrhythmicliability:A visionary 21st century initiative.Expert opinion on drugsafety.2014；13:745-758.

38.Hoekstra M et al.Induced pluripotent stem cell derivedcardiomyocytes as models for cardiac arrhythrnias.Front Physiol.2012；3.

39.Francis GL.Albumin and mammalian cell culture:Implications forbiotechnology applications.Cytotechnology.2010；62:1-16.

例2：

在无血清白蛋白和化学成分明确的培养基中，SAPK/JNK通路和p38通路在干细胞分化中的作用。

在这个例子中，我们在无血清白蛋白和化学成分明确的培养条件下研究SAPK/JNK通路和p38MAPK通路在调控人多能干细胞向心室肌细胞分化时所起的作用。参见Derynckand Zhang,Nature 425:577-84(2003)；Miyazono et al.,J Biochem.147:35-51(2010)。

如图10所述，人多能干细胞系H7分化为心肌细胞，随后用CHIR09221和IWR1处理。在分化的5-8天，期间干细胞分化而来的心肌细胞开始确定亚型，SAPK/JNK通路或p38MAPK通路被其各自的小分子抑制剂SP600125(对于SAPK/JNK)或SB203580(对于p38通路)所抑制。见Bennett et al.,PNAS 98:13681-86(2001)；Lali et al.,J.Biol.Chem.275:7395-402(2000).

在第24天，定量实时反转录聚合酶链式反应检测特异的心室肌标志基因IRX4⁵，心房肌细胞标志基因NR2F2。见Zhang et al.,Cell Res.21:579-87(2011)；Devalla et al.,EMBO Mol.Med.7:394-410(2015)。图11为结果，表明与未处理组相比，SAPK/JNK或p38通路的抑制提高了心室标志基因IRX4的表达水平，并抑制了心房标志基因NR2F2的表达。这些结果表明SAPK/JNK或p38通路的抑制促进向心室肌细胞分化而不是心房肌细胞，这两条通路的小分子抑制剂可用于促进干细胞分化为心室肌细胞。

以上出版物或文件的引用并不是为了承认上述任何一项内容是相关现有技术，也不构成对以上出版物或文件的内容或日期承认。

Claims (127)

1.一种细胞培养基补充剂包括至少一种或至少两种抗氧化剂以替代培养基中血清白蛋白的作用，其中所述的细胞培养基补充剂与一种基础细胞培养基联合使用，形成本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

2.一种细胞培养基补充剂，包含至少一种抗氧化剂或至少两种不同的选自以下组的抗氧化剂：

a)抗坏血酸、抗坏血酸盐、或其酯，

b)一种维生素E的水溶性类似物，

c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽、或其盐或酯，

d)丙酮酸、丙酮酸盐、或其酯，

e)一种过氧化氢酶，

f)一种超氧化物歧化酶，

g)一种硫醇，如2-巯基乙醇或1-硫代甘油，

h)一种金属硫蛋白，

i)一种硫氧还蛋白，

j)硫辛酸或其盐或酯，

k)尿酸或其盐或酯，

l)一种胡萝卜素，

m)褪黑激素，

n)普罗布考，

o)二甲基硫脲，

p)白藜芦醇，

其中所述细胞培养基补充剂与一种基础培养基联合使用，形成本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

3.权利要求1或2的细胞培养基补充剂，其包含至少一种抗氧化剂或至少两种、至少三种或所有选自以下组的抗氧化剂：

a)抗坏血酸、抗坏血酸盐、或其酯，

b)一种维生素E的水溶性类似物，

c)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽，或其盐或酯，和

d)丙酮酸、丙酮酸盐或其酯。

4.权利要求1-3的细胞培养基补充剂，其中抗坏血酸、抗坏血酸盐或其酯，如L-抗坏血酸，浓度范围为约0.025mg/mL至250mg/mL，例如约2.5mg/mL。

5.权利要求1-4中任一项细胞培养基补充剂，其中维生素E的水溶性类似物是trolox或MDL 73404或两者的混合物。

6.权利要求1-5中任一项细胞培养基补充剂，其中维生素E的水溶性类似物，如trolox，浓度范围为约0.025mM至约250mM，例如约2.5mM。

7.权力要求1-6中任一项细胞培养基补充剂，其中N-乙酰-半胱氨酸或谷氨酰胺、或其盐或酯，如N-乙酰-L-半胱氨酸，浓度范围为约0.025mM至约250mM，例如约2.5mM。

8.权力要求1-7中任一项细胞培养基补充剂，其中丙酮酸、丙酮酸盐或其酯，如丙酮酸钠，浓度范围为约0.5mM至约5000mM，例如50mM。

9.权力要求1-8中任一项细胞培养基补充剂，进一步包含一种离子载体。

10.权力要求1-9中任一项细胞培养基补充剂，进一步包含一种多肽，这种多肽可以是离子载体。

11.权力要求9或10中的细胞培养基补充剂，其中离子载体可以是一种转铁蛋白或一种含有三价铁的无机盐如Fe(NO₃)₃和FeCl₃。

12.权力要求10或11的细胞培养基补充剂，其中的多肽是胰岛素或转铁蛋白。

13.权利要求10-12中任一项的细胞培养基补充剂，其中的多肽是一种哺乳动物多肽。

14.权利要求10-12中任一项的细胞培养基补充剂，其中的多肽是一种人源多肽。

15.权力要求10-14中任一项的细胞培养基补充剂，其中的多肽是一种重组多肽，它可以是一种重组人源转铁蛋白，浓度范围为约0.0025mg/mL至约25mg/mL，例如约0.25mg/mL，也可以是一种重组人源胰岛素，浓度范围为约0.002mg/mL至约20mg/mL，例如约0.2mg/mL。

16.权利要求10-15中任一项的细胞培养基补充剂，其中多肽的浓度范围为约0.002mg/mL至约25mg/mL，例如约0.2mg/mL或0.25mg/mL。

17.权利要求1-16中任一项的细胞培养基补充剂，进一步包含一种水溶性硒化合物。

18.权利要求17的细胞培养基补充剂，其中的硒化合物是***钠(Na₂SeO₃)、二氧化硒(SeO₂)，***(H₂SeO₃)、氧氯化硒(SeOCl₂)、硒酸钠(Na₂SeO₄)、硫化硒(SeS)或以上的任意组合。

19.权利要求17或18的细胞培养基，其中水溶性硒化物，如***钠(Na₂SeO₃)，浓度范围为约0.008μg/mL至约80μg/mL，例如0.8μg/mL。

20.权利要求1-19中任一项细胞培养基补充剂，进一步包含一种C_1-8链烷醇胺。

21.权利要求20的细胞培养基补充剂，其中C_1-8链烷醇胺是乙醇胺、6氨基-2甲基-2庚醇、甲醇胺、二甲基乙醇胺或N-甲基乙醇胺或以上的任意组合。

22.权力要求20或21的细胞培养基补充剂，其中C_1-8链烷醇胺，如乙醇胺，浓度范围为约0.0005mg/mL至5mg/mL，例如约0.05mg/mL。

23.权利要求1-22中任一项细胞培养基补充剂，进一步包含一种C1-8季铵化合物。

24.权力要求23的细胞培养基补充剂，其中C_1-8季铵化合物是肉碱，四乙基溴化铵、四甲基氯化铵、四甲基氢氧化铵或胆碱，或以上的任意组合。

25.权利要求24的细胞培养基补充剂，其中肉碱是L-肉碱盐酸盐。

26.权利要求23-25中任一项的细胞培养基补充剂，其中C_1-8季铵化合物，如L-肉碱盐酸盐，浓度范围为约0.001mg/mL至约10mg/mL，例如0.1mg/mL。

27.权利要求1-26中任一项细胞培养基补充剂，进一步包含一种脂肪酸，如亚油酸和亚麻酸或两者的混合物，该脂肪酸可以选择性溶解在甲基-β-环糊精的溶剂中。

28.权利要求27的细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸包含一种C_12-30碳链和至少两个双键。

29.权利要求28的细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸包含一种18碳链和至少两个或三个双键。

30.权力要求28或29的细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸包含亚麻酸和/或亚油酸。

31.权力要求27-30中任一项细胞培养基补充剂，其中的脂肪酸，如亚油酸和亚麻酸或两者的混合物，浓度范围为约0.0005mg/mL至约5mg/mL，例如0.05mg/mL。

32.权利要求1-31中任一项细胞培养基补充剂，它包含：

1)抗坏血酸、抗坏血酸盐、或其酯，

2)trolox，

3)N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽，或其盐或酯，

4)丙酮酸、丙酮酸盐、或其酯，

5)转铁蛋白，

6)***钠，

7)乙醇胺，

8)肉碱，

9)亚麻酸，和

10)亚油酸。

33.权利要求32的细胞培养基补充剂，进一步包含胰岛素。

34.一个包装，它包含权力要求1-33中任一项细胞培养基补充剂。

35.一个试剂盒，它包含权利要求1-33中任一项细胞培养基补充剂。

36.权利要求35的试剂盒，进一步包含一份存储和/或使用细胞培养基补充剂的说明书，例如细胞培养基补充剂加入到一种本质上无血清白蛋白化学成分明确的基础培养基中，以配制本质上无血清白蛋白的细胞培养基。

37.一种本质上无血清白蛋白的细胞培养基，它包括一种本质上无血清白蛋白的基础培养基和权利要求1-33中任一项的细胞培养基补充剂。

38.权利要求37的细胞培养基，其中抗坏血酸、抗坏血酸盐、或其酯，如L-抗坏血酸，浓度范围为约0.5mg/L至约5000mg/L，例如50mg/L。

39.权利要求37或38的细胞细胞培养基，其中一种维生素E的水溶性类似物，如trolox，浓度范围为约0.5μM至约5000μM，例如约50μM。

40.权利要求37-39任一项的细胞培养基，其中N-乙酰-半胱氨酸或谷胱甘肽、或其盐或酯，如N-乙酰-L-半胱氨酸，浓度范围为约0.5μM至约5000μM，例如约50μM。

41.权利要求37-40中任一项的细胞培养基，其中丙酮酸、丙酮酸盐、或其酯，如丙酮酸钠，浓度范围为约0.01mM至约100mM，例如约1mM。

42.权利要求37-41中任一项的细胞培养基，其中多肽，例如转铁蛋白和/或胰岛素，浓度范围为约0.04mg/L至约500mg/L，例如，重组人源转铁蛋白的浓度范围为约0.05mg/L至500mg/L，例如约5mg/L，重组人源胰岛素的浓度范围为约0.04mg/L至400mg/L，例如4mg/L。

43.权利要求37-42中任一项的细胞培养基，其中硒化合物，例如***钠(Na₂SeO₃)，浓度范围为约0.16μg/L至约1600μg/L，例如约16μg/L。

44.权利要求37-43中任一项的细胞培养基，其中C_1-8烷醇胺，例如乙醇胺，浓度范围为约0.01mg/L至约100mg/L，例如约1mg/L。

45.权利要求37-44中任一项的细胞培养基，其中C_1-8季铵化合物，例如肉碱或L-肉碱盐酸盐，浓度范围为约0.02mg/L至约200mg/L，例如2mg/L。

46.权利要求37-45中任一项的细胞培养基，其中脂肪酸浓度，例如亚麻酸和/或亚油酸，浓度范围为约0.01mg/L至约100mg/L，例如2mg/L。

47.权利要求37-46中任一项的细胞培养基，其中本质上无血清白蛋白的基础培养基是从以下培养基选出的：RPMI1640、DMEM、DMEM/F12、IMDM、M199和BME。

48.权利要求37-47中任一项的细胞培养基，其中细胞培养基补充剂与本质上本质上无血清白蛋白的基础培养基比例为约1:0.01至约1:100(体积/体积)，例如约1：50(体积/体积)。

49.权利要求37-48中任一项的细胞培养基，它包括5mg/mL或更少的血清白蛋白。

50.权利要求37-49中任一项的细胞培养基，配制为可以支持细胞生长、分化和/或维持其状态的培养基。

51.权利要求50的细胞培养基，被配制为可以支持干细胞、祖细胞或前体细胞生长、分化和/或维持其状态的培养基。

52.权利要求51的细胞培养基，其中所述干细胞是一种全能、多能、专能、寡能或单能干细胞。

53.权利要求51的细胞培养基，其中所述干细胞是一种胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞。

54.权利要求51的细胞培养基，其中所述干细胞是哺乳动物干细胞。

55.权利要求54的细胞培养基，其中所述哺乳动物干细胞是人干细胞。

56.权利要求51的细胞培养基，其中所述干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

57.权利要求51-56中任一项的细胞培养基，可以支持干细胞生长或干细胞分化为心肌细胞，例如心室肌细胞和/或心房肌细胞。

58.权利要求51-56中任一项的细胞培养基，可以支持维持心肌细胞的状态，例如心室肌细胞和/或心房肌细胞。

59.一个包含权利要求37-58中任一项的细胞培养基的包装。

60.一个试剂盒，它包括权利要求37-58中任一项的细胞培养基。

61.权力要求60的试剂盒，进一步包括一种物质，该物质可以起始，诱导和/或支持细胞的生长、分化和/或维持其状态。

62.权利要求60的试剂盒，进一步包括一种物质，该物质可以起始，诱导和/或支持干细胞、祖细胞或前体细胞的分化或维持其状态。

63.权利要求62的试剂盒，其中该物质起始，诱导和/或支持干细胞的分化。

64.权利要求63的试剂盒，其中该物质起始，诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。

65.权利要求63的试剂盒，其中该物质为骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂。

66.权利要求65的试剂盒，其中BMP拮抗剂是一种BMP 4拮抗剂。

67.权力要求63的试剂盒，其中该物质包括碱性成纤维生长因子(bFGF)、BMP 4、activin A、Wnt-3a或起Wnt-3a作用的小分子(如Bio和/或CHIR99021)，和/或一个或更多生长因子和/或抑制Wnt信号通路的小分子(例如dickkopf同系物1(DDK1)，IWP，和Wnt信号通路抑制剂(IWR))。

68.权利要求63的试剂盒，其中该物质起始，诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心肌细胞，例如心室肌细胞和/或心房肌细胞。

69.权利要求68的试剂盒，其中该物质起始，诱导和支持干细胞或中胚层细胞分化为心室肌细胞，其中该物质可以选择性包含BMP 4和/或视黄酸信号通路的抑制剂。

70.权利要求69的试剂盒，其中该物质抑制干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路、SAPK/JNK信号通路和/或p38信号通路。

71.权利要求70的试剂盒，其中该物质是一种泛视黄酸受体拮抗剂、视黄酸拮抗剂、视黄酸受体拮抗剂、视黄酸X受体拮抗剂，或泛视黄酸受体拮抗剂。

72.权利要求70的试剂盒，其中该物质是BMS-493、BMS-189453、SP-600125或SB-203580。

73.权利要求68的试剂盒，其中该物质起始，诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化成心房肌细胞。

74.权利要求73的试剂盒，其中该物质激活干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路。

75.权力要求74的试剂盒，其中该物质是视黄酸或维生素A。

76.权力要求60-75的试剂盒，进一步包括一份使用本质上无血清白蛋白的细胞培养基支持细胞(如干细胞、祖细胞、或前体细胞)生长、分化和/或维持其状态的说明书。

77.使细胞生长、分化或维持其状态的方法，它包括使细胞与权力要求37-58中任一项的本质上无血清白蛋白细胞培养基接触。

78.权利要求77的方法，可以用于使细胞生长。

79.权利要求77的方法，可以用于分化细胞。

80.权利要求77的方法，可以用于维持细胞状态。

81.权力要求77-80的方法，其所述细胞来源于单细胞有机体或多细胞有机体。

82.权利要求77-80的方法，其所述细胞来源于脊椎动物、非人类哺乳动物或人。

83.权利要求77-82的方法，其所述细胞是干细胞。

84.权力要求83的方法，其所述干细胞是一种全能、多能、专能、寡能或单能干细胞。

85.权力要求83的方法，其所述干细胞是一种胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞。

86.权利要求83的方法，其所述干细胞是哺乳动物干细胞。

87.权利要求86的方法，其所述哺乳动物干细胞是人干细胞。

88.权利要求83的方法，其所述干细胞是人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。

89.权利要求83-88中任一项的方法，用于支持干细胞生长和/或分化为心肌细胞，例如，心室心肌细胞和/或心房心肌细胞。

90.权利要求83-89中任一项的方法，进一步包括使干细胞与一种物质接触以起始，诱导和/或支持干细胞分化为中胚层细胞。

91.权利要求90的方法，其中该物质是一种骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂。

92.权利要求91的方法，其中BMP拮抗剂是一种BMP 4拮抗剂。

93.权力要求91的方法，其中该物质包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、BMP 4、activin A、Wnt-3a或起Wnt-3a作用的小分子(如Bio和/或CHIR99021)，和/或一个或更多生长因子和/或抑制Wnt信号通路的小分子(例如dickkopf同系物1(DDK1)、IWP和抑制Wnt信号通路的抑制剂(IWR))。

94.权利要求83-93中任一项的方法，进一步包括使干细胞或中胚层细胞与一种物质接触以起始，诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心肌细胞，例如，心室肌细胞和/或心房肌细胞。

95.权利要求94的方法，其中该物质起始，诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心室肌细胞，其中该物质可选择性地包括BMP 4和/或视黄酸信号通路的抑制剂。

96.权力要求95的方法，其中该物质抑制干细胞或中胚层细胞的视黄酸信号通路、SAPK/JNK信号通路和/或p38信号通路。

97.权力要求96的方法，其中该物质是一种泛视黄酸受体拮抗剂、一种视黄酸拮抗剂、一种视黄酸受体拮抗剂、一种视黄酸x受体拮抗剂或一种泛视黄酸受体拮抗剂。

98.权利要求97的方法，其中该物质是BMS-493、BMS-189453、SP-600125和/或SB-203580。

99.权利要求95的方法，其中该物质起始，诱导和/或支持干细胞或中胚层细胞分化为心房肌细胞。

100.权力要求99的方法，其中该物质激活干细胞或中胚层细胞的是视黄酸信号通路。

101.权利要求100的方法，其中该物质是视黄酸或维生素A。

102.权力要求94-101中任一项的方法，其心肌分化效率为约50％至90％。

103.权力要求94-102中任一项的方法，其产生的心肌细胞的平均密度为约1×10⁵个心肌细胞/cm²至约1×10⁶个心肌细胞/cm²。

104.权力要求95-98、102和103中任一项的方法，其心肌细胞的产率为每个干细胞产生约1至10个心肌细胞。

105.权利要求95-98和102-104中任一项的方法，其心室肌分化效率为约50％至约90％。

106.权利要求95-98和102-105中任一项的方法，其产生的心室肌细胞的平均密度为约1×10⁵个心肌细胞/cm²至1×10⁶个心肌细胞/cm²。

107.权利要求95-98和102-106中任一项的方法，其心室肌细胞产率为每个干细胞产生约1-10个心肌细胞。

108.权利要求99-104中任一项的方法，其心房肌分化效率为约50％至约90％。

109.权利要求99-104和108中任一项的方法，其产生的心房心肌细胞的平均密度为约1×10⁵个心肌细胞/cm²至1×10⁶个心肌细胞/cm²。

110.权利要求99-104、108和109中任一项的方法，其心房肌细胞产率为每个干细胞产生约1-10个心肌细胞。

111.权利要求94-110中任一项方法，进一步包括心肌细胞的富集。

112.权利要求111的方法，其中通过将心肌细胞培养在葡萄糖浓度降低的培养基上富集心肌细胞，降低的葡萄糖浓度范围为约1000mg/L至约2000mg/L。

113.权力要求77-112中任一项方法，在渗透压水平约为100至约500mOsm下实施，例如100-200mOsm、200-300mOsm、250-350mOsm(例如，300-330mOsm)、300-400mOsm和400-500mOsm。

114.通过权利要求77-113中任一方法生长，分化或维持其状态的细胞。

115.通过权力要求94-113中任一项方法产生的心肌细胞。

116.权利要求115中的心肌细胞，其心肌细胞特异标志基因的表达水平升高，具有胚胎心肌样动作电位(AP)和/或典型的心肌细胞Ca²⁺火花模式。

117.通过权利要求94-98、102-107和111-113中任一项方法产生的心室肌细胞。

118.权利要求117中的心室肌细胞，其心室特异标志基因表达水平升高，具有胚胎心室样动作电位(AP)和/或典型的心室肌细胞Ca²⁺火花模式。

119.通过权利要求94、99-104和108-113中任一项方法产生的心房肌细胞。

120.权利要求119的心房肌细胞，具有胚胎心房样动作电位(AP)和/或典型的心房肌细胞Ca²⁺火花模式。

121.一种药用组分，它包括有效量的通过权利要求77-113中任一项方法生长，分化和维持其状态的细胞，和一种药学上可接受的载体或辅料。

122.一种用于治疗心肌受损或病症的药用组分，它包括有效量的权利要求115或116中心肌细胞数，权力要求117或118中心室肌细胞数，或权利要求119或120中心房肌细胞数，和一种药学上可接受的载体或辅料。

123.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，它包括给需要或极度需要这种治疗的受试者施用有效量的权利要求121中的药用组分。

124.一种治疗受试者的心肌受损或心脏病症的方法，它包括给需要或极度需要这种治疗的受试者施用有效量的权利要求122中的药用组分。

125.权利要求123或124的方法，其中的受试者是人。

126.一种确定细胞调节剂的方法，该方法包括：

1)使调节剂候选物作用于权利要求114中的细胞，测量调节剂候选物对此细胞的某一特性的影响；并且

2)测量未与调节剂候选物作用的细胞该特性，

由此，与调节剂候选物接触的细胞该特性不同于未与调节剂候选物接触的细胞，可以确定该调节剂候选物是细胞此特性的调节剂。

127.一种确定心肌细胞调节剂的方法，该方法包括：

1)使权力要求115或116中的心肌细胞、权利要求117或118中的心室心肌细胞或权利要求119或120中的心房心肌细胞与调节剂候选物接触，测量调节剂候选物对心肌细胞某一特性的影响；并且

2)测量未与调节剂候选物接触的心肌细胞该特性，

由此，与调节剂候选物接触的心肌细胞该特性不同于未与调节剂候选物接触的心肌细胞，可以确定该调节剂候选物是此心肌细胞该特性的调节剂。