CN108778302B - 制备昭和草提取物的方法，由此制备的提取物以及所述提取物的用途 - Google Patents

制备昭和草提取物的方法，由此制备的提取物以及所述提取物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种制备昭和草提取物的方法和由此制备的提取物。本发明进一步涉及一种包含所述昭和草提取物的医药组成物/组合。还提供所述提取物和包含所述提取物的所述组成物/组合在癌症预防或治疗中的用途。

Description

制备昭和草提取物的方法，由此制备的提取物以及所述提取 物的用途
技术领域
本发明涉及一种制备昭和草(Crassocephalum crepidioides)的草本药物提取物的方法以及所述昭和草提取物在治疗或预防有需要的个体的癌症中的用途。
背景技术
癌症是死亡的主要原因。有效治疗已变成现代医学、医药以及学术界中研究的主要焦点。常规癌症治疗包括手术、化学疗法以及靶向疗法。首先通过手术切除肿瘤组织。剩余细胞接着通过化学疗法和靶向疗法杀死。然而，所述治疗方案对于末期癌症患者远远不够。晚期癌症患者的存活率和生命质量并不能通过常规治疗方法来提高。
最近，已从临床研究观测到，对接受以草本药物作为辅助性治疗(支持性治疗)的癌症患者的治疗效果显著改良，草本药物可预防或减少化学疗法的毒性副作用，以改良化学疗法的效应，且草本药物可增强患者的免疫反应且缩短术后恢复时间。另外，已发现，草本药物可单独用于治疗不适合手术和/或化学疗法的患者。
昭和草已知为一种可食用植物，其传统上用作治疗炎症性疾病、高血压、头痛、呕吐、水肿、便秘等的草本药物。
徐丽芬(Lie-fen Shyur)等人(US 8,048,455B2)公开昭和草的提取物，且发现相较于顺铂(一种化学治疗剂)，昭和草提取物在C57BL/6J小鼠中抑制黑色素瘤细胞的生长具有更好的效果。徐丽芬等人还发现，昭和草提取物中所含的活性组分为半乳糖脂化合物，其命名为1,2-二-O-α-亚麻酰基-3-O-β-吡喃半乳糖-sn-甘油(dLGG)，且dLGG可在巨噬细胞细胞系中抑制iNOS、COX-2和PEG2的表达和产生。
徐丽芬等人(US 2014/356301A1)进一步公开一种富含半乳糖脂的植物提取物，其是通过用一系列溶剂萃取选自由以下组成的群组的植物样本来制备：白凤菜(Gynuradivaricata subsp.formosana)(菊科)、大苞水竹叶(Murdannia bracteata)(C.B.Clarke)J.K.Morton ex D.Y.Hong(鸭跖草科)和神仙草(Crassocephalum rabens S.Moore)(菊科)。所述申请案还提供一种用于治疗或预防急性暴发性肝炎和败血症和其相关适应症以及用于皮肤增白的组成物，其包含植物提取物或其纯化物和医药、健康或食物可接受的媒剂。
李直邕(Chien-Yung Lee)(US 2004/0013748A1)公开一种用于治疗肝肿瘤和胰腺癌的草本组合，其包含假茼蒿(Jiatonghao)(昭和草)、茯苓(Fuling)等。
安仁阳子(YOKO ANIYA)(WO 2008/105436A1)公开一种自然生长在冲绳的植物(即昭和草(Crassocephalum crepidioides S.Moore))的提取物。安仁阳子发现，所述提取物可抑制肿瘤坏死因子-α和***素合成酶-2。
因此尚需要识别可用于治疗癌症的新颖草本提取物。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及一种用于制备昭和草的提取物的方法。
本发明的另一方面涉及可从本发明的制备方法获得的昭和草提取物。
本发明的又一方面涉及一种包含所述昭和草提取物的组成物。
本发明的又一方面涉及一种包含所述昭和草提取物和化学治疗剂的组合。
本发明的另一方面是提供一种用于治疗或预防有需要的个体的癌症的方法，其包含向所述个体单独或与化学治疗剂组合施用本发明的昭和草提取物。本发明还提供所述昭和草提取物或含有所述提取物的组成物/组合在治疗或预防有需要的个体的癌症中的用途。
将由以下描述和所附权利要求书显而易知本发明的其它方面和优点。
附图说明
图1显示本发明的昭和草提取物的HPLC图。
具体实施方式
本发明可参照本发明的各种实施例、实例和具有相关描述的表格的以下详细描述更易于理解。除非另外定义，否则本文中所用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解相同的含义。将进一步理解，除非在本文中明确地定义，否则术语，如在常用词典中所定义的那些术语应与其在相关技术的上下文中的含义解释一致，且不应以理想化或过于形式的意义解释。还应理解，本文中所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不意欲为限制性的。
必须指出，除非上下文另外清楚地规定，否则如本说明书和随附权利要求书中所用，单数形式“一(a、an)”和“所述”包括多个指示物。因此，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。
本文中范围经常表示为“约(about)”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表示此一范围时，实施例包括从一个特定值和/或到另一特定值的范围。同样地，当值通过使用词语“约”表示为近似值时，将了解特定值形成另一实施例。可进一步了解，每一范围的端点在与另一端点相关和独立于另一端点方面都是有意义的。如本文所用，术语“约”是指±20％、优选±10％、更优选±5％且甚至更优选±1％。
制备方法
本发明提供一种用于制备昭和草提取物的方法，其包含以下步骤：
(a)使昭和草植物与70％乙醇接触，获得悬浮液；
(b)将所述悬浮液中的固体部分与液体部分分离，且接着收集所述液体部分，获得粗提取物；
(c)将所述粗提取物稀释为60％乙醇提取物；
(d)将所述60％乙醇提取物与巨孔苯乙烯二乙烯基苯树脂混合；
(e)将所述60％乙醇提取物与巨孔树脂混合物倾入到柱中；
(d)用乙醇以约2倍到10倍于柱体积的体积洗涤所述柱；
(e)用乙醇/乙酸乙酯或乙酸乙酯的溶剂洗脱所述柱，且在不同时间间隔下收集洗脱部分；以及
(f)分析各洗脱部分并将富含1,2-二-O-α-亚麻酰基-3-O-β-吡喃半乳糖-sn-甘油(dLGG)且含有植醇的洗脱部分鉴定为昭和草提取物。
如本文中所用，术语“提取物”是指昭和草植物的必要成分的浓缩制剂。提取物可呈液体、浸膏(extractum spissum)、固体或粉末形式。
如本文中所用，昭和草植物可为全株植物或其一或多个部分，其包括但不限于种子、花、叶、茎和根。在本发明的一个实施例中，昭和草植物为全株植物。在本发明的另一个实施例中，昭和草植物为种子、花、叶或其任何组合。在本发明的一个优选实施例中，昭和草植物呈干燥和粉末状。
在本发明的一个实施例中，在步骤(a)中，干燥植物的重量与70％乙醇溶剂的体积的比率在约1:1到约1:50范围内，如约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49或1:50。在本发明的一个优选实施例中，比率为约1:1到约1:20。在本发明的另一优选实施例中，比率为约1:10。另外，来自步骤(b)的固体部分可以步骤(a)的接触条件处理，获得另一悬浮液。所述重复步骤可进行一或多次，且将从其获得的所有粗提取物在进行步骤(c)之前混合在一起。
在本发明的一个实施例中，可利用针对溶液的任何常规浓缩方法(如使用减压旋转式蒸发器)将获自步骤(b)的粗提取物浓缩成浸膏或粉末。
在本发明的一个实施例中，可通过用水直接稀释粗提取物获得步骤(c)的60％乙醇提取物。在本发明的一个优选实施例中，获自步骤(b)的粗提取物被浓缩为浸膏，接着将所述浸膏在60％乙醇中稀释以制备步骤(c)的60％乙醇提取物。
根据本发明，其中所用巨孔苯乙烯二乙烯基苯树脂为基于苯乙烯二乙烯基苯的树脂，其孔隙具有在约
Figure BDA0001750471640000041
到约
Figure BDA0001750471640000042
范围内的平均孔隙半径。巨孔树脂的孔隙体积为约1.5ml/g，且巨孔树脂的表面为芳香族非极性表面，且因此所述表面具疏水性。在本发明的一个优选实施例中，巨孔树脂为Sepabeads树脂或Dialon树脂。在本发明的一个更优选实施例中，巨孔树脂选自(但不限于)Sepabeads SP70(三菱(Mitsubishi))、Sepabeads SP710(三菱)、Sepabeads SP825(三菱)、Sepabeads SP850(三菱)、Sepabeads SP207(三菱)、Sepabeads SP700(三菱)、Dialon HP20(三菱)、MCI Gel CHP20P(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))、
Figure BDA0001750471640000043
Figure BDA0001750471640000044
(西格玛-奥德里奇)和
Figure BDA0001750471640000045
Figure BDA0001750471640000046
(西格玛-奥德里奇)。在本发明的一个更优选实施例中，巨孔树脂为Sepabeads SP70，且所述树脂经过10％乙醇预处理。
在本发明制备方法的步骤(d)中，所用乙醇的浓度可为约50％到90％、优选约70％到90％且更优选约80％。用于洗涤柱的乙醇的体积为约2倍到10倍于所述柱的体积、优选约4倍到8倍且更优选约4倍。
在本发明制备方法的一个实施例中，用于步骤(e)的溶剂为乙醇/乙酸乙酯，其中乙醇与乙酸乙酯的体积比率在约1:1到1:50、优选约1:1到1:30、更优选约1:1到1:10范围内，且更优选为约1:1。在本发明的制备方法的另一个实施例中，用于步骤(e)的溶剂为乙酸乙酯。
在本发明的制备方法的步骤(f)中，分析方法可为识别dLGG的任何已知方法。举例来说，HPLC和HPLC-MS。
在本发明的一个优选实施例中，当利用HPLC在以下条件下测定时，昭和草提取物分别在滞留时间12.59min、12.893min、13.828min、14.158min、14.922min、15.455min和16.478min下具有7个主要峰：
柱：Symmetry Shield C18，15μm，4.6×150mm
温度：环境
洗脱：H2O/CH3CN梯度
检测：UV 210nm
Figure BDA0001750471640000051
医药组成物/组合
本发明提供一种医药组成物，其包含治疗有效量的利用本发明的制备方法制备的昭和草提取物。本发明还提供一种医药组合，其包含治疗有效量的利用本发明的制备方法制备的昭和草提取物和治疗有效量的化学治疗剂。医药组成物/组合可包括医药学上可接受的载剂或媒剂。
如本文中所用，术语“治疗有效量”是指草本提取物或化合物被施用后可一定程度上减轻所治疗疾病或病症的一或多种症状的足够量。结果可为减轻和/或缓解疾病的病征、症状或病因或生物***的任何其它所需的改变。
术语“化学治疗剂”在本文中用于指具有抑制人类中的赘瘤，尤其恶性(癌性)病变(如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病)的发生或进展的功能性质的药剂。转移或血管生成的抑制时常为化学治疗剂的性质。化学治疗剂可为细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或遏制细胞生长和/或细胞增殖的药剂。
化学治疗剂的非限制性实例包括抗代谢物(例如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉宾(fludarabine)、喷司他丁(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、5-氟尿嘧啶(5FU)、氟尿苷(FUDR)、胞嘧啶***糖苷(arabinoside)(阿糖胞苷)、甲氨喋呤、三甲氧苄二胺嘧啶、嘧啶甲胺和培美曲唑(pemetrexed))；烷化剂(例如环磷酰胺、二氯甲二乙胺、乌拉莫司汀(uramustine)、美法仑(melphalan)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、噻替派(thiotepa)/氯芥苯丁酸、异环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链脲菌素(streptozocin)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、顺铂、卡铂、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、赛特铂(satraplatin)、四硝酸三铂、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺(temozolomide))；蒽环霉素(例如道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾达霉素(idarubicin)和瓦尔霉素(valrubicin))；抗生素(例如放线菌素d(dactinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、安曲霉素(anthramycin)、链佐霉素(streptozotocin)、短杆菌素D(gramicidin D)、丝裂霉素(mitomycin)(例如丝裂霉素C)、倍癌霉素(duocarmycin)(例如CC-1065)和卡奇霉素(calicheamicin))；抗有丝***剂(包括例如类美登素(maytansinoid)、奥瑞他汀(auristatin)、海兔毒素(dolastatin)、隐藻素(cryptophycin)、长春花属生物碱(例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞宾(vinorelbine))和紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))和秋水仙碱；拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊甙(teniposide)和米托蒽醌(mitoxantrone))；和蛋白酶体抑制剂(例如肽基硼酸)。
可以常规制剂形式向患者口服或肠胃外施用组成物/组合，常规制剂形式如胶囊、微囊、片剂、粒剂、散剂、糖衣片、丸剂、栓剂、注射剂、悬浮液和糖浆。适合调配物可利用常用方法使用如以下的常规有机或无机载剂来制备：赋形剂(例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙或碳酸钙)、粘合剂(例如纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、***胶、聚乙二醇、蔗糖或淀粉)、崩解剂(例如淀粉、羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、被低取代的羟丙基纤维素、碳酸氢钠、磷酸钙或柠檬酸钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石或月桂基硫酸钠)、调味剂(例如柠檬酸、薄荷脑、甘氨酸或橘子粉)、防腐剂(例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、稳定剂(例如柠檬酸、柠檬酸钠或乙酸)、悬浮剂(例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或硬脂酸铝)、分散剂(例如羟丙基甲基纤维素)、稀释剂(例如水)和底蜡(例如可可脂、白凡士林或聚乙二醇)。
实用性
本发明的医药组成物/组合可用于治疗或预防有需要的个体中的癌症。
如本文所用，术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指为达治愈、愈合、缓解、减轻、改变、医治、改善、改良、影响病症、病症的症状或倾向性或降低病症、病症的症状或倾向性的风险的目的，向患有疾病/病症或具有其的症状或倾向性的个体施用治疗活性剂、组成物、药物或组合。举例来说，治疗癌症是指抑制癌症生长或癌细胞生长、癌症生长消退(即减小可检测癌症的大小)或癌症消失的治疗结果。
如本文所用，术语“个体”意欲包括哺乳类、灵长类、人类和非人类动物。举例来说，个体可为患有癌症的患者(例如人类患者或兽医患者)。除非另有指示，否则本发明的术语“非人类动物”包括所有非人类脊椎动物，例如非人类哺乳类和非哺乳类，如非人类灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖类、爬虫类等。
术语“癌症”是指各种恶性赘瘤中的任一种，其特征为可侵入周围组织且转移到新的身体部位的细胞增殖。良性和恶性肿瘤根据发现肿瘤的组织的类型分类。举例来说，纤维瘤为纤维***的赘瘤，且黑色素瘤为色素(黑色素)细胞的异常生长。源自上皮组织(例如皮肤、支气管和胃)的恶性肿瘤称为癌瘤。如在***、***和结肠中发现的上皮腺组织的恶性疾病称为腺癌。***(例如肌肉、软骨、淋巴组织和骨胳)的恶性生长称作肉瘤。淋巴瘤和白血病为在白血球中产生的恶性疾病。
在赘瘤、癌症、肿瘤生长或肿瘤细胞生长的情形下，抑制可通过以下方式来评估：原发性或继发性肿瘤的出现延迟、原发性或继发性肿瘤的发展减缓、原发性或继发性肿瘤的出现率降低、疾病的继发效应的严重程度减缓或降低、肿瘤生长停滞和肿瘤消退等等。在极端情况下，完全抑制在本文中称为预防或化学预防。在此情形下，术语“预防”包括完全预防临床上显而易见的瘤发病，或预防有风险个体中临床前显而易见的瘤阶段发病。此定义还欲涵盖预防恶化前细胞转化成恶性细胞或使恶化前细胞向恶性细胞的进展停滞或逆转。这包括那些有瘤形成风险的个体的预防治疗。
提供以下实例以帮助本领域技术人员实施本发明。即使如此，这些实例不应解释为过度限制本发明，因为本领域技术人员可在不偏离本发明发现的精神或范围的情况下对本文中论述的实施例作出修改和变化。
实例
实例1：昭和草提取物的制备
1.02kg干燥昭和草(全株植物)碾磨，且浸渍于70％乙醇溶液(体积为10倍于干燥植物总重量)中24小时，且接着通过1号过滤器在减压下过滤植物提取物，获得第一滤液。固体残余物进一步浸渍70％乙醇溶液(体积为5倍于干燥植物总重量)中24小时，且接着通过1号过滤器在减压下过滤植物提取物，获得第二滤液。将第一和第二滤液混合，获得昭和草粗提取物，且所述粗提取物在减压下浓缩，获得1.05L浸膏，其重量为213.69g，浓度为203.51mg/mL和产率为20.95％。
将425g浸膏用12L 60％乙醇稀释，获得粗制提取物。粗制提取物添加到含有经过10％乙醇预处理的巨孔树脂SP70(三菱)的容器中。容器中的内含物(包括树脂和稀释提取物)经搅拌，且接着使其静置隔夜。将内含物倾入到柱中。柱的洗脱速率控制在每小时1.5倍到2倍于所述柱的体积下。首先洗脱出的部分为不吸附样本。柱接着经由梯度方法分别通过80％乙醇和乙醇:乙酸乙酯(1:1)的溶剂洗脱。各溶剂的体积4倍于柱的体积。收集通过乙醇:乙酸乙酯(1:1)洗脱且富含dLGG的部分，并将其浓缩且干燥，获得45.82g干燥产物(Cr-E03)，其产率为10.78％。
实例2：昭和草提取物的组分分析
HPLC的条件
柱：Symmetry Shield C18，15μm，4.6×150mm
温度：环境
洗脱：H2O/CH3CN梯度
检测：UV 210nm
Figure BDA0001750471640000081
昭和草提取物(Cr-E03)的光谱展示于图1中。将Cr-E03与标准物和LCMS-APCI(+)比对之后，确认峰(1)为dLGG([M+H]+：613、595和335)，且峰(2)为植醇(M.W.＝296.5)。
实例3：昭和草提取物在抑制MKN45癌细胞生长中的效应
MKN45细胞在含有5％FBS
Figure BDA0001750471640000082
的RPMI-1640培养基(西格玛-奥德里奇)中培养。将6×103个细胞添加到96孔平板的各孔中。各孔含有180μL的上述培养基。平板在37℃下培育4小时，且接着将20μL的不同浓度的粗制提取物、Cr-E03和dLGG各自添加到所述平板的各孔中。每种浓度重复3次测试。进一步在37℃下培育48小时之后，移除孔中的培养基，且将180μL含有3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)的5％FBS培养基添加到所述孔中。在37℃下反应1小时之后，通过ELISA读取器(型号680微板读取器，伯乐(Bio-Rad))测量所述孔在490nm处的吸收值。粗制提取物、Cr-E03和dLGG的IC25、IC50和IC75值分别通过使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad软件公司(GraphPad Software))计算来获得。IC25、IC50和IC75值定义为测试样本分别达到MKN45细胞生长最大抑制的25％、50％和75％的浓度。结果展示于表1中。
表1
药物 IC<sub>25</sub>(μg/mL) IC<sub>50</sub>(μg/mL) IC<sub>75</sub>(μg/mL)
粗制提取物 36.08 58.14 89.00
Cr-E03 21.55 55.36 138.33
dLGG 35.86 47.31 61.96
如从表1可见，粗制提取物、Cr-E03和dLGG均可抑制MKN45细胞生长。
实例4：昭和草提取物与5-氟尿嘧啶(5-FU)或表柔比星的组合在抑制MKN45癌细胞生长中的效应
制备不同浓度的各粗制提取物、Cr-E03和dLGG与不同浓度的各5-氟尿嘧啶(5-FU)和表柔比星的组合。测试基于实例3的相同程序进行，且组合的组合指数(CI)还通过GraphPad Prism 5软件的计算获得。结果展示于表2中。CI定理首次由周T.C.(Chou T.C.)和塔拉莱P.(Talalay P.)在1984年(酶调节进展(Advances in Enzyme Regulation),22:27-55,1984)提供。根据CI定理，CI＝1表示具有累加/累积作用的组合；CI<1表示具有协同作用的组合；和CI>1表示具有拮抗作用的组合。
表2
Figure BDA0001750471640000091
如表2中所示，粗制提取物和Cr-E03可分别与5-FU或表柔比星组合，且在抑制MKN45细胞生长中达成协同效应。然而，观测到dLGG分别与5-FU和表柔比星的组合无协同效应。
实例5：Cr-E03和Cr-E03与5-FU或表柔比星的组合在抑制A549肺癌细胞和Colo205结肠癌细胞生长中的效应
Cr-E03和Cr-E03与5-FU或表柔比星的组合抑制A549和Colo205癌细胞系生长的效应是基于与实例3和4类似的那些方法测定。
发现，单独的Cr-E03可有效地抑制A549癌细胞系生长，其IC50值为75.6μg/mL。
Cr-E03分别与5-FU和表柔比星的组合对A549和Colo205细胞系生长的抑制效应展示于表3中。
表3
Figure BDA0001750471640000092
Figure BDA0001750471640000101
表3的结果展示Cr-E03与5-FU或表柔比星的组合在抑制A549细胞中可提供累加效应，且Cr-E03与表柔比星的组合在抑制Colo205细胞中可提供极强的协同效应。
应了解，尽管指示本发明的优选实施例，然上述详细描述和特定实例仅以说明的方式提供。在本发明的精神和范围内的各种改变和修改将从此详细描述对本领域技术人员变得显而易见。对于本领域技术人员应显而易见的所有所述修改意欲包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (15)

1.一种用于制备昭和草的提取物的方法，其包含以下步骤：
(a)使昭和草植物与70％乙醇接触，获得悬浮液；
(b)将所述悬浮液中的固体部分与液体部分分离，且接着收集所述液体部分，获得粗提取物；
(c)将所述粗提取物稀释为60％乙醇提取物；
(d)将所述60％乙醇提取物与巨孔苯乙烯二乙烯基苯树脂混合；
(e)将所述60％乙醇提取物与巨孔树脂混合物倾入到柱中；
(f)用乙醇以2倍到10倍于所述柱的体积的体积洗涤所述柱；
(g)用乙醇/乙酸乙酯或乙酸乙酯溶剂洗脱所述柱，且在不同时间间隔下收集洗脱部分；以及
(h)分析各洗脱部分并将富含1,2-二-O-α-亚麻酰基-3-O-β-吡喃半乳糖-sn-甘油dLGG且含有植醇的洗脱部分鉴定为所述昭和草提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述昭和草植物为干燥和粉末状的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中所述干燥植物的重量与所述70％乙醇溶剂的体积的比率范围在1:1到1:50。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中在步骤(a)中所述干燥植物的重量与所述70％乙醇溶剂的体积的比率为1:10。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述巨孔树脂选自Sepabeads SP70和SepabeadsSP710。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述巨孔树脂为Sepabeads SP70。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)用乙醇/乙酸乙酯溶剂洗脱所述柱，且其中乙醇与乙酸乙酯的体积比率为1:1。
8.一种昭和草提取物，其能够从根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法获得。
9.根据权利要求8所述的昭和草提取物，当其利用HPLC在以下条件下测定时，分别在滞留时间12.59min、12.893min、13.828min、14.158min、14.922min、15.455min和16.478min下具有7个主要峰：
柱：Symmetry Shield C18，15μm，4.6×150mm
温度：环境
洗脱：H2O/CH3CN梯度
检测：UV 210nm
Figure FDA0003116952930000021
10.一种医药组成物，其包含治疗有效量的根据权利要求8或9所述的昭和草提取物和医药学上可接受的载剂。
11.一种医药组合，其包含治疗有效量的根据权利要求8或9所述的昭和草提取物和化学治疗剂，所述化学治疗剂选自抗代谢物、蒽环霉素或蛋白酶体抑制剂。
12.根据权利要求11所述的医药组合，其中所述化学治疗剂为5-氟尿嘧啶5-FU或表柔比星。
13.一种根据权利要求8或9所述的昭和草提取物的用途，其用于制造供治疗或预防有需要的个体癌症用的药剂。
14.一种根据权利要求8或9所述的昭和草提取物的用途，其用于制造供与化学治疗剂组合治疗或预防有需要的个体癌症用的药剂，所述化学治疗剂选自抗代谢物、蒽环霉素或蛋白酶体抑制剂。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述化学治疗剂为5-氟尿嘧啶5-FU或表柔比星。
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