CN108761054B

CN108761054B - 免疫细胞免疫刺激应答性的测定、免疫细胞免疫突触形成能力的判定、以及细胞分析装置

Info

Publication number: CN108761054B
Application number: CN201810314681.7A
Authority: CN
Inventors: 柳田匡俊; 三轮桂子; 冈祐马
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: US11125740B2; EP3388832A1; CN115508550A; JP6990522B2; US20210356454A1; CN108761054A; JP2018179709A; US11808761B2; EP4224162A1; EP3388832B1; US20180292385A1

Abstract

本发明涉及免疫细胞免疫刺激应答性的测定、免疫细胞免疫突触形成能力的判定、以及细胞分析装置。测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法包含：(i)使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；(ii)使测定对象的免疫细胞形成与不同于测定对象的免疫细胞的物质的接触面的工序；(iii)使测定对象的免疫细胞与和接触面的表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定在检测光学信号之前解除了接触面的测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序。

Description

免疫细胞免疫刺激应答性的测定、免疫细胞免疫突触形成能力的判定、以及细胞分析装置

技术领域

本发明涉及测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法、判定免疫细胞的免疫突触形成能力的方法和细胞分析装置。

背景技术

免疫是生物体为了识别体内的自己或非己并排除非己而进行的细胞性和体液性的生物学反应的总称。免疫***是生命活动中非常重要的生理机制。免疫***的细胞通过分泌被称为细胞因子的蛋白质或者发挥细胞杀伤功能来参与免疫***的活化、抑制。

免疫***与可决定移植疗法成功与否的、对异体细胞的排斥反应密切相关。近年来，利用免疫***对人类疾病进行治疗的免疫疗法的有用性已经显示，把握免疫***的状态的重要性日益提高。

作为免疫***的状态的分析方法，已知基于细胞因子分泌的分析方法。该分析方法需要在对免疫***细胞进行免疫刺激后培养前述细胞，从免疫刺激后起至细胞因子的检测需要很长的时间(数十小时)和劳动量。

近年正在关注当免疫细胞与靶细胞接触时、在其接触面处形成于免疫细胞的结构体。由于该结构体在功能和形态学上类似于由神经细胞形成的突触结构，因此被称为免疫突触。已经提示了免疫突触与免疫刺激信号的增幅有关，并已知免疫突触形成能力与分泌细胞因子的能力有关(非专利文献1)。另外，已知免疫突触的形成与细胞因子分泌相比，是在短时间(几十分钟)内发生的(非专利文献1)。

作为测定免疫突触的方法，例如已知如下方法：使用玻璃基板上的免疫刺激因子刺激免疫细胞，在维持与玻璃基板的接触面的状态下，利用全内反射荧光显微镜测定T细胞的免疫突触(非专利文献2)。另外已知如下方法：在维持与靶细胞之间所形成的接触面的状态下，利用成像流式细胞仪测定T细胞的免疫突触(非专利文献3)。在非专利文献2中，免疫突触的检测以共刺激分子CD28为指标来进行；在非专利文献3中，免疫突触的检测以CD3为指标来进行。在非专利文献2和非专利文献3中，均在维持与对象物之间的接触面的状态下观察免疫细胞。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Carlin LM.等,Blood,vol.106,p.3874-3879,2005

非专利文献2：Yokosuka T.等,Immunity,vol.29,p.589-601,2008

非专利文献3：Hosseini BH.等,Proc Natl Acad Sci USA,vol.106,p.17852-17857,2009

发明内容

发明要解决的课题

迅速且简便地把握免疫***的状态、即把握免疫***的细胞对各种免疫刺激的应答性在进行涉及各种免疫***的治疗中是非常重要的。

以往，为了分析免疫***的细胞对免疫刺激的应答性，使用以细胞因子的分泌为指标的分析方法。但是，该分析方法在免疫刺激后至分泌细胞因子前必需对免疫细胞进行培养，烦杂且花费时间。

在为了测定免疫***的细胞对各种免疫刺激的应答性而使用全内反射荧光显微镜的情况下，能测定的细胞数少，测定也费工夫，因此不能简便地进行测定，不适合于自动化装置。

因此，在该领域中，对于迅速且简便地把握免疫***的细胞对各种免疫刺激的应答性存在需求。

本发明人为了解决前述课题，着眼于与细胞因子分泌相比在短时间内产生变化且已经提示与免疫刺激信号的增幅有关的免疫突触。但是，免疫突触是在与靶细胞的结合面处形成于免疫细胞中的松散结合(非专利文献3)，因此担心其在测定前和测定中解离。实际上，迄今为止，免疫突触尚未以靶细胞与免疫细胞的接触面解除的状态被作为免疫细胞对免疫刺激的应答性的指标使用。

对于迅速地检测免疫细胞对免疫刺激的应答性的方法，本发明人着眼于已知与免疫突触的形成有关的各种因子反复进行了研究。其结果是，发现在各种因子中以共刺激分子等表面抗原为指标时，即使免疫细胞与对象物的接触面解除，也能够判定免疫细胞的免疫突触形成能力，并完成了本发明。

用于解决课题的方案

本发明的第1方式提供一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其包含：(i)使测定对象的免疫细胞和免疫刺激因子接触的工序；(ii)使测定对象的免疫细胞形成与不同于测定对象的免疫细胞的物质的接触面的工序；(iii)使测定对象的免疫细胞与能和接触面的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定在检测光学信号之前解除了接触面的测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序。

本发明的第2方式提供一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其包含：(i)使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；(ii)使测定对象的免疫细胞形成与不同于测定对象的免疫细胞的物质的接触面的工序；(iii)使测定对象的免疫细胞与能和接触面的共刺激分子结合且能产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，自动判定测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序。

本发明的第3方式提供一种判定免疫细胞的免疫突触形成能力的方法，其包含：(i)使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；(ii)使测定对象的免疫细胞形成与不同于测定对象的免疫细胞的物质的接触面的工序；(iii)使测定对象的免疫细胞与能和接触面的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定在检测光学信号之前解除了接触面的测定对象的免疫细胞中的表面抗原的局部存在的工序。

本发明的第4方式提供一种细胞分析装置，其包含：导入部，其导入复合体，所述复合体为受到免疫刺激的测定对象的免疫细胞与能和前述免疫细胞的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体的复合体，前述捕捉体与前述免疫细胞和不同于前述免疫细胞的物质的接触面的表面抗原结合；拍摄部，其对由该导入部供给的复合体进行拍摄；和分析部，其基于由拍摄部拍摄的图像判定在实施拍摄之前解除了接触面的测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

本发明的第5方式提供一种细胞分析装置，其包含：导入部，其导入复合体，所述复合体为受到免疫刺激的测定对象的免疫细胞与能和前述免疫细胞的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体的复合体，前述捕捉体与前述免疫细胞和不同于前述免疫细胞的物质的接触面的表面抗原结合；检测部，其对由该导入部供给的复合体照射光，并检测所产生的来自复合体的光学信号；和分析部，其基于所检测出的光学信号，判定在检测出光学信号之前解除了接触面的测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

发明效果

根据本发明，能够基于免疫突触形成能力来分析免疫细胞对各种免疫刺激的应答性。

附图说明

图1是实施方式的工序(i)～(iii)的示意图。

图2是示出实施方式1的细胞分析装置的构成的图。

图3是示出实施方式1的测定装置的构成的图。

图4是示出实施方式1的拍摄部的构成的图。

图5是示出实施方式1的相机的受光面上的区域的示意图。

图6是示出实施方式1的信息处理装置的构成的图。

图7是示出实施方式1的被检体的测定处理和分析处理的流程。

图8是示出实施方式1的测定数据的图像。

图9是示出基于实施方式1的测定数据的计量过程的示意图。

图10是示出实施方式1的分析处理的流程。

图11是示出实施方式1(a、b和c)和实施方式2(d)的分析处理的2D散点图。

图12是用于说明由共刺激分子的分布状态不同的细胞得到的荧光信号的脉冲数据的示意图。

图13是用于说明由荧光信号的脉冲数据得到的分析用参数的2D散点图的示意图。

图14是示出在无刺激时(a)和有刺激时(b)的、CD28在T细胞中的分布的透射光图像、荧光图像和它们的叠加图像。

图15是示出T细胞中的CD28的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的微分干涉图像(DIC)、荧光图像(CD28)和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的、表示细胞中的显示荧光信号的区域(X轴)和细胞的尺寸(Y轴)的2D散点图。

图16是示出T细胞中的细胞因子分泌和免疫突触的形成的相关性的坐标图。

图17是示出无刺激时(a和c)和有刺激时(b和d)的、CD3和CD40L在T细胞中的分布的荧光图像。

图18是示出CD3在T细胞中的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的透射光像、荧光图像和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的、表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和显示荧光信号的区域(Y轴)的2D散点图。

图19是示出CD40L在T细胞中的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的透射光像、荧光图像和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的、表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和显示荧光信号的区域(Y轴)的2D散点图。

图20是示出实施例2中的计量处理和分析处理的一例的2D散点图。a为表示细胞的尺寸(X轴)和长宽比(Y轴)的2D散点图。b为表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和计数(Y轴)的2D散点图。

图21是示出无刺激时(a、c、e和g)和有刺激时(b、d、f和h)的CD3、CD28、CD40L和OX40在T细胞中的分布的透射光图像与荧光图像的叠加图像。

图22是示出CD3在T细胞中的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的透射光像、荧光图像和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的、表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和显示荧光信号的区域(Y轴)的2D散点图。

图23是示出CD28在T细胞中的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的透射光像、荧光图像和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的、表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和显示荧光信号的区域(Y轴)的2D散点图。

图24是示出CD40L在T细胞中的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的透射光像、荧光图像和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和显示荧光信号的区域(Y轴)的2D散点图。

图25是示出OX40在T细胞中的分布的图像和2D散点图。为无刺激时(a)和有刺激时(c)的T细胞的透射光像、荧光图像和它们的叠加图像(Merge)。为无刺激时(b)和有刺激时(d)的、表示细胞的总荧光信号强度(X轴)和显示荧光信号的区域(Y轴)的2D散点图。

具体实施方式

本发明的一方式涉及测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法。在该方式中，工序(i)和(ii)包含：在免疫刺激因子存在下，使测定对象的免疫细胞在与不同于测定对象的免疫细胞的物质之间形成接触面。在该实施方式中，可以在使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序(i)之后，进行使测定对象的免疫细胞形成与前述物质的接触面的工序(ii)。或者，当前述物质的表面存在免疫刺激因子时，也可以同时进行工序(i)和工序(ii)。即使是这种情况，严格来说也是在工序(i)之后进行工序(ii)。通过进行工序(i)和(ii)，在活化后的免疫细胞的上述接触面形成免疫突触。

在工序(iii)中，为了检测所形成的免疫突触，使能和接触面的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体(以下也简称为“捕捉体”)与形成有上述接触面的免疫细胞接触。该捕捉体优选与接触面的表面抗原中的构成免疫突触的分子进行结合。通过进行工序(iii)，在免疫细胞中形成构成免疫突触的分子与捕捉体的复合体。

然后，在工序(iv)中，检测来自免疫细胞上的该复合体所含的捕捉体的光学信号。对光学信号的检测手段没有特别限定，优选能够对各细胞进行分析的手段。作为这种光学信号的检测手段，可列举例如流式细胞仪和成像细胞仪等。在优选的实施方式中，工序(iv)使用流式细胞仪或成像细胞仪来检测由与免疫细胞的表面抗原结合的捕捉体所产生的光学信号。

在后述的工序(v)中要对解除了接触面的免疫细胞判定免疫刺激应答性，因此可以在工序(vi)的进行光学信号的检测之前，对免疫细胞进行后述的解除接触面的操作。当使用后述的非生物材料的物质(例如容器、多孔板、载玻片等)作为不同于免疫细胞的物质、利用流式细胞仪或成像细胞仪进行工序(iv)时，本实施方式的方法优选包含解除接触面的工序。根据需要而解除接触面之后，可以利用常规方法对免疫细胞进行固定。通过固定，能够使解除了接触面的免疫细胞维持表面抗原的局部存在。在细胞的固定中，优选使用含有多聚甲醛、低级低级醇等的固定液。

在进一步的实施方式中，可以基于所检测出的光学信号来判别免疫细胞是否为解除了接触面的免疫细胞。由此可以抽取来自解除了接触面的免疫细胞的光学信号用于工序(v)的判定。例如，在使用异体细胞作为不同于免疫细胞的物质时，在利用流式细胞仪的测定中，解除了接触面的免疫细胞与维持着与异体细胞的接触的免疫细胞之间会在与细胞的大小相关的光学信号(例如前方散射光的强度或脉冲宽度)方面产生差异。在利用成像细胞仪的测定中，可以根据所拍摄的细胞图像来区别解除了接触面的免疫细胞和维持着与异体细胞的接触的免疫细胞。

参照出于例示的目的而示意性示出本实施方式的工序(i)～(iii)的图1a。图1a示出使用后述的免疫刺激抗体作为免疫刺激因子、使用平板作为不同于免疫细胞的物质的例子。该平板相当于例如细胞培养中使用的容器的底面、多孔板的孔底面、显微镜观察中使用的载玻片的表面等。在图1a中，工序(i)中使免疫细胞与免疫刺激抗体接触。在该例中，免疫刺激抗体为与作为免疫细胞的表面抗原之一的共刺激分子结合的抗体。在工序(i)之后，工序(ii)中使处于与免疫刺激抗体接触的状态的免疫细胞接触平板，使免疫细胞形成与平板之间的接触面。在工序(iii)中，为了检测免疫细胞中的共刺激分子，使用针对工序(i)中所用的免疫刺激抗体的二抗。该二抗标记有可产生光学信号的物质。在该例中，在工序(iii)中接触面已经解除，但也可以在维持接触面的状态下使免疫细胞与捕捉体接触。需要说明的是，图1a为本发明的1个实施方式中的工序(i)～(iii)的例示，本发明不限定于该例示。

在工序(v)中，基于工序(iv)中检测出的光学信号来判定解除了接触面的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。在本实施方式中，工序(v)基于检测出的光学信号对反映表面抗原在免疫细胞中的分布的值进行计量，将计量的值与阈值进行比较，从而可以判定免疫细胞是否有免疫刺激应答性。在此，作为反映表面抗原的分布的值，当捕捉体包含荧光物质时可列举例如：来自与表面抗原结合的捕捉体的荧光信号的脉冲宽度、该荧光脉冲的高度和脉冲面积等。

在捕捉体包含荧光物质时，在工序(v)中也可以基于工序(iv)中检测出的荧光信号取得荧光图像、基于该荧光图像进行判定。即，在荧光图像中对显示反映表面抗原的分布的荧光信号的区域进行计量，将计量的值与阈值进行比较，从而判定免疫细胞是否有免疫刺激应答性。在本说明书中，“显示荧光信号的区域”是指在荧光图像中显示超过规定阈值的亮度值的像素(pixel)数。在该实施方式中，虽然不进行限定，但当前述区域比阈值小时可以判定为免疫细胞有免疫刺激应答性。

在进一步的实施方式中，工序(v)可以包含：进一步计量选自包括前述区域内的总荧光信号强度、免疫细胞的尺寸和其长宽比在内的组中的至少1种，将其计量值与阈值进行比较。在本说明书中，前述区域的或细胞的“总荧光信号强度”是指：荧光图像中显示超过规定阈值的亮度值的区域内的各像素的亮度值的积分值。在本说明书中，“细胞的尺寸”是指：在透射光图像中检测显示低于规定阈值的亮度值的细胞膜区域，反映了由检测出的细胞膜围住的细胞的图像的像素数。在本说明书中，细胞的“长宽比”是指：透射光图像中的反映细胞粒子的图像的纵向长度与横向长度(像素数)之比。

在进一步的实施方式中，基于检测出的光学信号的、免疫细胞是否有免疫刺激应答性的判定包含：计量选自荧光信号的脉冲宽度、散射光信号的脉冲宽度、每一细胞的反映荧光信号区域的值和反映细胞大小的值中的至少1种，将其计量值与阈值进行比较，从而判定免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

在本说明书中，“免疫突触”是指：在免疫细胞与靶细胞之间的接触面处，形成于该免疫细胞的、作为在免疫细胞活化中发挥作用的部分的分子复合体。已知该分子复合体是受体(例如，T细胞受体(TCR)或NK细胞受体)、该受体的辅助因子(例如CD3)、各种共刺激分子(例如CD28)、粘附分子(例如整联蛋白)和信号分子集合而形成的。

在本说明书中，“接触面”是指：测定对象的免疫细胞与不同于测定对象的免疫细胞的物质进行接触的区域。在此，测定对象的免疫细胞与不同于测定对象的免疫细胞的物质的接触也包含介由存在于测定对象的免疫细胞的表面上的分子与存在于不同于测定对象的免疫细胞的物质的表面上的分子的相互作用的间接接触。如上所述，在本实施方式的方法中，在接触面处形成免疫突触。因此，免疫细胞上的接触面也可以称为形成了免疫突触的区域。虽然不进行限定，但接触面也可以通过测定对象的免疫细胞自发地接触不同于自身的物质而形成。或者，接触面也可以通过使测定对象的免疫细胞接触不同于测定对象的免疫细胞的物质而形成。

在本说明书中，“测定对象的免疫细胞”是指：负责识别自己和非己并排除非己的机制的细胞种类。虽然不进行限定，但测定对象的免疫细胞可以是T细胞、自然杀伤(NK)细胞和它们的混合物。需要说明的是，抗原递呈细胞不包含在本说明书中所述的测定对象的免疫细胞中，而是包含在后述的“不同于测定对象的免疫细胞的物质”中。

在本说明书中，“不同于测定对象的免疫细胞的物质”是指：当与免疫细胞接触时，可对该免疫细胞提供接触面的物质。不同于测定对象的免疫细胞的物质既可以是非生物材料，也可以是生物材料。虽然不进行限定，但作为非生物材料的物质可以是容器、多孔板、载玻片、珠子等。虽然不进行限定，但作为生物材料的物质可以是异体细胞、抗原递呈细胞、癌细胞等。异体细胞、抗原递呈细胞和癌细胞可以是株化细胞。另外，异体细胞和癌细胞也可以是包含它们的组织的形态。“异体细胞”为非己的细胞，可以是T细胞、自然杀伤(NK)细胞和它们的混合物。

在本实施方式中，对使测定对象的免疫细胞与不同于测定对象的免疫细胞的物质接触的手法没有特别限定。例如，可以将测定对象的免疫细胞与培养基一起加入到容器或多孔板的孔中而使其沉降，从而使其接触。此时，也可以对加入有测定对象的免疫细胞的容器或多孔板进行离心。另外，也可以将免疫细胞载于载玻片上而使其接触。在进一步的实施方式中，当不同于测定对象的免疫细胞的物质为珠子、异体细胞、抗原递呈细胞、癌细胞等颗粒状时，也可以通过对测定对象的免疫细胞添加这些物质而使其接触。接触面可以通过维持测定对象的免疫细胞与不同于测定对象的免疫细胞的物质相接触的状态而形成。作为维持接触状态的时间，为例如2分钟以上且60分钟以下，优选为10分钟以上且45分钟以下，更优选为20分钟以上且40分钟以下，特别优选为30分钟。

在本说明书中，“表面抗原”为存在于细胞膜上的蛋白质、糖链、脂质和它们的组合。关于表面抗原的种类，只要存在能够与表面抗原结合的捕捉物质或能够制造这种捕捉物质则没有特别限定。优选的表面抗原为免疫细胞的构成免疫突触的分子。作为这种分子，可列举例如TCRα/β、CD3、CD28、CD40L(CD40ligand)、OX40、CTLA4(cytolytic T lymphocyteassociated antigen-4)、PD-1(programmed cell death-1)和ICOS(inducible co-stimulatory molecule)等。后述的共刺激分子也是免疫细胞的表面抗原之一。

在本实施方式中，测定对象的免疫细胞为选自T细胞和NK细胞中的至少1种。在进一步的实施方式中，测定对象的免疫细胞为T细胞或NK细胞。在优选的实施方式中，测定对象的免疫细胞为T细胞。

虽然不进行限定，但T细胞可以是辅助性T细胞(也称为“CD4⁺T细胞”)、抑制性T细胞、调节性T细胞、细胞杀伤T细胞(cytotoxic T lymphocyte(CTL)、也称为“CD8⁺T细胞”)等效应T细胞、天然T细胞、和经过基因改造的细胞。虽然不进行限定，但效应T细胞可以为在体内和体外活化后的细胞。这些T细胞可以单独使用1种，或者也可以以含有2种以上的T细胞亚群形式使用。

在本实施方式中，测定对象的免疫细胞可以由生物试样来制备。例如，可以由血液(例如末梢血和脐带血)或骨髓液中利用公知的细胞分离法分离免疫细胞。作为这种细胞分离法，可列举基于细胞的大小、凝集度和/或比重从包含细胞的生物试样中分取期望细胞的方法。例如，如果使用市售的细胞分选仪则可以基于细胞的大小或凝集度来分取细胞。另外，利用比重梯度离心法可以基于细胞的比重来分取细胞。在本实施方式中，可以按照常规方法培养由生物试样分离出的细胞而使其增殖。在进一步的实施方式中，免疫细胞可以以生物试样、例如血液(例如末梢血和脐带血)或骨髓液的形态使用。虽然不进行限定，但生物试样可以是由哺乳动物、例如人和非人哺乳动物(例如狗、猫等伴侣动物；马、牛等家畜动物)得到的试样。

在进一步的实施方式中，测定对象的免疫细胞可以存在于试样中。因此，该实施方式提供一种方法，其对包含测定对象的免疫细胞的试样实施本发明的方法。更具体而言，该实施方式提供一种测定包含免疫细胞的试样的免疫应答性的方法，其包含：(i)使前述试样中的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；(ii)使前述试样中的免疫细胞形成与不同于前述免疫细胞的物质的接触面的工序；(iii)使前述试样中的免疫细胞与能和接触面的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由前述捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定前述试样中的解除了接触面的免疫细胞是否为免疫刺激应答性的工序。包含免疫细胞的试样可以为上述生物试样。

在该实施方式中，工序(v)基于工序(iv)中检测出的光学信号对反映免疫细胞中的、被捕捉体结合的表面抗原的分布的值进行计量，将计量的值与阈值进行比较，从而可以判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性。当捕捉体包含荧光物质时，在工序(v)中也可以基于工序(iv)中检测出的荧光信号取得荧光图像，基于该荧光图像进行判定。还可以在荧光图像中对显示反映表面抗原的分布的荧光信号的区域进行计量，基于该区域算出例如前述试样中的有免疫刺激应答性细胞的比例。然后，将该比例与将来自健康人的试样标准化而得的有免疫刺激应答性免疫细胞的比例进行比较，从而进行判定。例如，当该试样的前述比例为高于标准化时的比例的值的情况下，可以判定为该试样的免疫应答性高或有免疫应答性。

在本说明书中，对免疫细胞的“免疫刺激”包括：使免疫细胞与免疫刺激因子接触；以及使该免疫细胞形成与不同于免疫细胞的物质的接触面。在本实施方式中，免疫刺激可以通过使免疫细胞与单独的免疫刺激因子接触来进行。在进一步的实施方式中，免疫刺激可以通过使免疫细胞与存在于前述物质上的免疫刺激因子接触来进行。此时，免疫细胞在接触免疫刺激因子的同时，也与前述物质接触。

在本说明书中，“免疫刺激因子”是指：作用于免疫细胞而能够诱导该免疫细胞的活化的物质。免疫细胞的活化是指例如免疫细胞的增殖、其运动性的亢进或分泌细胞因子。虽然不进行限定，但免疫刺激因子可以是免疫刺激抗体、免疫刺激肽、主要组织相容性分子(Major histocompatibility molecule(MHC分子))以及异体细胞、抗原递呈细胞和癌细胞上存在的各种免疫刺激因子。免疫刺激因子可以使用单独1种或将2种以上组合使用，或者可以以免疫刺激因子单独或其它物质或者与物质的复合体的形态使用。免疫刺激因子例如可以为：MHC分子与抗原肽的复合体的形态；固定在珠子、容器等非生物材料上的形态；被递呈到抗原递呈细胞上的形态。

在本实施方式中，免疫刺激因子为选自免疫刺激抗体、免疫刺激肽、MHC分子、和MHC分子与抗原肽的复合体中的至少1种。在进一步的实施方式中，免疫刺激因子可以为免疫刺激抗体、免疫刺激肽、MHC分子、或MHC分子与抗原肽的复合体。在特定的实施方式中，免疫刺激因子为免疫刺激抗体。

在本说明书中，“免疫刺激抗体”是指：能够特异性刺激免疫细胞、从而诱导免疫细胞的活化的抗体。虽然不进行限定，但免疫刺激抗体可以为抗TCRα/β抗体、抗CD3抗体、抗CD40L抗体、抗OX40抗体、抗CD2抗体、抗CD28抗体、抗CD137抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗ICOS抗体和抗整联蛋白抗体(抗CD2抗体)。这些免疫刺激抗体可以单独使用1种或将2种以上组合使用。免疫刺激抗体可以以单独抗体的形态使用，或以固相化于其它物质、例如珠子、多孔板、载玻片、容器等非生物材料上的状态使用。

在1个实施方式中，免疫刺激抗体为选自抗TCRα/β抗体、抗CD3抗体、抗CD40L抗体、抗OX40抗体、抗CD2抗体、抗CD28抗体、抗CD137抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗ICOS抗体和抗整联蛋白抗体(抗CD2抗体)中的至少1种。在进一步的实施方式中，免疫刺激抗体为选自抗CD3抗体和抗CD28抗体中的至少1种。在特定的实施方式中，免疫刺激抗体为抗CD3抗体和抗CD28抗体。

对抗体没有特别限定，可以为单克隆抗体和多克隆抗体中的任一种。另外，抗体也可以是抗体片段、单链抗体和它们的衍生物。

在本说明书中，“免疫刺激肽”是指：能够刺激免疫细胞、从而诱导免疫细胞的活化的肽。免疫刺激肽为例如抗原肽(结核菌的抗原肽等)。

在本实施方式中，免疫刺激肽为抗原肽。抗原肽可以单独使用1种或将2种以上组合使用。在特定的实施方式中，抗原肽可以以递呈到MHC分子上的与MHC分子的复合体形态使用。

在本说明书中，“主要组织相容性分子(MHC分子)”是指：在脏器、组织和细胞的同种移植时，负责引起最强排斥反应的同种抗原性的分子。在人类中HLA分子相当于MHC分子，在小鼠中H-2分子相当于MHC分子。MHC分子中包括I类分子和II类分子。MHC I类分子在几乎全部的有核细胞中表达，与细胞内产生的肽形成复合体并将其提呈至CTL(CD8阳性T细胞)的受体。MHC II类分子仅在巨噬细胞、B细胞等所谓的抗原递呈细胞中表达，将来自外来抗原的肽递呈至辅助性T细胞(CD4阳性T细胞)的受体。

在本实施方式中，当免疫刺激因子为MHC分子或MHC分子与抗原肽的复合体时，该MHC分子可以为MHC I类分子和MHC II类分子中的任一种。MHC分子或MHC分子与抗原肽的复合体例如也可以以存在于抗原递呈细胞、癌细胞等的细胞膜的形态使用。

在本说明书中，“和表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体”包含与免疫细胞的表面抗原结合的物质、和能产生光学信号的物质。作为与表面抗原结合的物质，虽然不进行限定，但可例示与免疫细胞的表面抗原结合的抗体、抗体片段、单链抗体、适体等。在本实施方式中，捕捉体包含能产生光学信号的物质和与表面抗原结合的抗体、抗体片段、单链抗体或适体。

与表面抗原结合的物质既可以直接与表面抗原结合，或者，也可以间接与表面抗原结合。在本说明书中，“与表面抗原间接结合”是指：介由一或多个分子与表面抗原结合。虽然不进行限定，但与表面抗原间接结合的物质结合在与表面抗原结合的其它物质之上。即，与表面抗原间接结合的物质介由该其它物质间接地与表面抗原结合。

作为能产生光学信号的物质，虽然不进行限定，但可例示荧光物质。作为荧光物质，可以没有特别限制地使用公知的荧光色素、荧光蛋白等。虽然不进行限定，但能产生光学信号的物质可以通过化学方式结合在与表面抗原结合的捕捉体上。作为这种捕捉体，例如，可列举与表面抗原直接结合的荧光标记抗体等(参照图1b和c的捕捉体)。

在本实施方式中，和表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体包含与表面抗原直接结合的物质和能够产生光学信号的物质。在该实施方式中，虽然不进行限定，但捕捉体可以是结合有能够产生光学信号的物质且与表面抗原直接结合的抗体、抗体片段、单链抗体、或适体。

或者，捕捉体可以包含与表面抗原间接结合的物质和能够产生光学信号的物质。在该实施方式中，捕捉体可以是结合有能够产生光学信号的物质且结合于与表面抗原结合的其它物质的抗体、抗体片段、单链抗体、或适体。虽然不进行限定，但例如将与表面抗原特异性结合的抗体作为一抗并使其与表面抗原结合，并且将与该一抗特异性结合的抗体作为二抗使其进行结合。在此，能够产生光学信号的物质结合在该二抗上。在该例中，二抗成为和表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体(参照图1a的捕捉体)。另外，一抗可以是免疫刺激抗体。

上述捕捉体所结合的表面抗原可以是免疫细胞的共刺激分子。在本说明书中，“共刺激分子”是指：除了当免疫细胞活化时能够给予T细胞受体(TCR)介导的抗原特异性信号以外，还能够对T细胞给予用于活化T细胞的辅助信号的存在于T细胞中的物质。在本说明书中，当存在于NK细胞中时，“共刺激分子”除了包含能够给予NK细胞的活化受体介导的靶细胞的配体特异性信号以外，还包含能够对NK细胞给予用于活化NK细胞的辅助信号的物质。虽然不进行限定，但共刺激分子可以是CD28、OX40、CD40L、CTLA4、PD-1和ICOS。

在本实施方式中，不同于免疫细胞的物质为选自生物材料、例如异体细胞、抗原递呈细胞、和癌细胞中的至少1种。在进一步的实施方式中，不同于免疫细胞的物质为异体细胞、抗原递呈细胞或癌细胞。在特定的实施方式中，不同于免疫细胞的物质为异体细胞。在特定的实施方式中，不同于免疫细胞的物质为抗原递呈细胞。在特定的实施方式中，不同于免疫细胞的物质为癌细胞。

当使用异体细胞、抗原递呈细胞、癌细胞等的免疫细胞以外的细胞作为不同于免疫细胞的物质时，工序(i)中的免疫刺激因子为存在于前述细胞上的MHC分子等各种免疫刺激因子。例如，当不同于免疫细胞的物质为异体细胞时，虽然不进行限定，但免疫刺激因子至少包含MHC分子。当不同于免疫细胞的物质为抗原递呈细胞时，虽然不进行限定，但免疫刺激因子至少包含MHC II类分子与抗原肽的复合体。当不同于免疫细胞的物质为癌细胞时，虽然不进行限定，但免疫刺激因子至少包含MHC I类分子与癌抗原肽的复合体。

工序(i)包含：通过使免疫细胞与选自异体细胞、抗原递呈细胞和癌细胞中的至少1种不同于免疫细胞的物质接触，从而使前述免疫细胞与前述物质上的免疫刺激因子接触。工序(ii)包含：通过维持工序(i)中相接触的免疫细胞与前述物质的接触状态，使前述免疫细胞形成与前述物质的接触面。

在本实施方式中，不同于免疫细胞的物质优选非生物材料，例如生命科学领域中通常使用的器具。作为这种器具，可列举容器、多孔板、载玻片、或珠子等。作为容器，可列举例如盘、瓶、管等。根据该实施方式，前述物质为非生物材料，因此与使用生物材料作为前述物质时相比，具有易于处理、此外能长期保管等产业上的优点。在特定的实施方式中，作为前述物质的容器、多孔板、载玻片或珠子在其表面包含免疫刺激因子。例如，在免疫刺激因子为免疫刺激抗体时，可以在容器、多孔板、载玻片或珠子的表面固相化有该抗体。或者，作为前述物质的容器、多孔板、载玻片或珠子可以在其表面包含免疫刺激因子。

在本实施方式中，在工序(i)中在使免疫刺激因子与免疫细胞接触后，工序(ii)中的不同于前述免疫细胞的物质也可以在其表面包含进一步的免疫刺激因子。在该实施方式中，出于追加免疫刺激的目的，在工序(ii)中可以使用在其表面具有与工序(i)的免疫刺激因子同种或异种的免疫刺激因子的物质。例如，可以在工序(i)中使用针对共刺激分子的抗体作为免疫刺激因子、在工序(ii)中使用在孔表面固相化有抗CD3抗体的多孔板来作为不同于免疫细胞的物质。或者，工序(ii)中的前述物质也可以在其表面不含进一步的免疫刺激因子。

在本实施方式中，当使用免疫刺激抗体作为工序(i)的免疫刺激因子时，该免疫刺激因子也可以作为工序(iii)的捕捉体被共用。在该实施方式中，免疫刺激因子为例如在抗CD28抗体、抗CD3抗体、抗CD40L抗体、抗OX40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗ICOS抗体、它们的抗体片段、单链抗体、和它们中的1种以上的组合上标记有能够产生光学信号的物质的复合体。如果使用这种带有标记的免疫刺激抗体，则能够同时进行工序(i)中的对免疫细胞的免疫刺激、和工序(iii)中的该免疫细胞的表面抗原的捕捉。

因此，本发明的进一步的实施方式提供一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其包含：(i)使免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；(ii)使免疫细胞形成与不同于前述免疫细胞的物质的接触面的工序；(iv)检测由前述捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序，前述免疫刺激因子为用能够产生光学信号的物质标记的免疫刺激抗体。根据该实施方式，免疫刺激因子作为与免疫细胞中的表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体而发挥作用，因此能够减少试剂数量和工序数。因此，该实施方式具有成本方面和劳动量方面的优点。

在本实施方式中，工序(i)的免疫刺激因子可以存在于工序(ii)中的不同于免疫细胞的物质上。在该实施方式中，免疫刺激因子优选为免疫刺激抗体、免疫刺激肽、MHC分子等分子或MHC分子与抗原肽等的复合体。虽然不进行限定，但前述免疫刺激因子可以固相化于容器、多孔板、载玻片或珠子上。例如，当免疫刺激因子为免疫刺激抗体或免疫刺激肽时，对固相化的方式不进行特别限定，例如可以为物理性吸附。或者，如果用生物素修饰免疫刺激因子、并在不同于免疫细胞的物质的表面固定亲和素(或链霉亲和素)，则能够介由生物素与亲和素(或链霉亲和素)的结合而将免疫刺激因子固相化于前述物质。另外，当免疫刺激因子为异体细胞、抗原递呈细胞、癌细胞等所具有的MHC分子或MHC分子与抗原肽等的复合体时，可以将使细胞粘附或堆积于容器、多孔板、载玻片或珠子。在该实施方式中，前述物质上的免疫刺激因子可与免疫细胞接触并诱导前述免疫细胞的活化。根据该实施方式，工序(i)包含：使免疫细胞与表面固相化有免疫刺激因子的前述物质接触，从而使前述免疫细胞与前述物质上的免疫刺激因子接触。工序(ii)通过维持工序(i)中相接触的前述免疫细胞与前述物质的接触状态，从而能够使前述免疫细胞形成与前述物质的接触面。

因此，本发明的进一步的实施方式提供一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其包含：(i)使免疫细胞与不同于前述免疫细胞的物质上的免疫刺激因子接触的工序；(ii)使免疫细胞形成与前述物质的接触面的工序；(iii)使前述免疫细胞与和表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由前述捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定解除了接触面的前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序。根据该实施方式，仅仅使免疫细胞与表面固相化有免疫刺激因子的物质接触，就能够实质上同时进行工序(i)和工序(ii)。因此，该实施方式具有能够减少工序数的优点。

图1b是示意性示出上述实施方式的工序(i)～(iii)的图。在图1b中示出：免疫刺激因子为免疫刺激抗体，不同于免疫细胞的物质为平板，免疫刺激抗体固相化于平板上。如图1b所示，通过使免疫细胞与固相化有免疫刺激抗体的平板接触，从而能够实质上同时进行利用该抗体的免疫刺激(工序(i))和接触面的形成(工序(ii))。接着，工序(iii)中，使与表面抗原直接结合且能够产生光学信号的捕捉体与免疫细胞上的免疫突触结合。在该例中，在工序(iii)中接触面已经解除，但也可以在维持接触面的状态下使免疫细胞与捕捉体接触。图1b为本发明的1个实施方式的工序(i)～(iii)的例示，本发明不限定于该例示。

在进一步的实施方式中，虽然不进行限定，但免疫刺激因子也可以固相化于珠子上。例如，如果使用固相化有免疫刺激抗体的珠子则能够同时进行免疫细胞的刺激和免疫细胞的分离。当免疫细胞包含在生物试样中时，如果对该试样添加上述珠子则该试样中的免疫细胞被免疫刺激抗体捕捉到珠子上。然后对包含珠子的生物试样进行离心分离，从而能够从该试样中分离免疫细胞。如果珠子为磁性珠子，则可以对包含珠子的生物试样进行磁分离。此时，分离出的免疫细胞被珠子上的免疫刺激抗体进行了免疫刺激。在该实施方式中，免疫细胞与上述珠子的接触面在测定前和测定中可以被解除。

图1c是示意性示出上述实施方式的工序(i)～(iii)的图。在图1c中示出：免疫刺激因子为免疫刺激抗体，不同于免疫细胞的物质为珠子，免疫刺激抗体固相化在珠子上。如图1c所示，通过使免疫细胞与固相化有免疫刺激抗体的珠子接触，从而能够实质上同时进行利用该抗体的免疫刺激(工序(i))和接触面的形成(工序(ii))。接着，工序(iii)中，使与表面抗原直接结合且能够产生光学信号的捕捉体与免疫细胞中的免疫突触结合。在该例子中，在工序(iii)中接触面尚未解除，但也可以使解除了接触面的免疫细胞与捕捉体接触。图1c是本发明的1个实施方式的工序(i)～(iii)的例示，本发明不限定于该例示。

在本说明书中，“解除了接触面的免疫细胞”是指：处于在免疫细胞与不同于免疫细胞的物质之间形成的接触区域已消失的状态的免疫细胞。即，是指处于免疫细胞从不同于免疫细胞的物质分离的状态。作为解除接触面的手法，虽然不进行限定，但可以是：对包含免疫细胞和培养液等的容器的吸吐(ピペッティング)、叩打(タッピング)、搅拌、振荡、超声波处理等物理处理；使用表面活性剂等化学药品的化学处理；和使用酶等生物化学制品的生物化学处理。

在优选的实施方式中，通过吸吐、叩打、搅拌、振荡、超声波处理等物理处理使接触面解除。在特定的实施方式中，前述手法为吸吐。在本实施方式中，在解除了接触面的情况下，工序(iv)也可以使用流式细胞仪检测由捕捉体产生的光学信号。

在本说明书中，“流式细胞仪”是指：用于对水流中的细胞照射激发光并测定由各个细胞发出的荧光、散射光、从而测定细胞团中的各个细胞的大小、膜蛋白的表达量的分布的测定装置。流式细胞仪通常具有如下优点：与常规荧光显微镜观察相比，客观上能够在短时间内对很多数量的细胞进行测定(最多为数万细胞/秒)；能够以高灵敏度进行定量测定，同时能够取得多重参数等。在本说明书中，流式细胞仪具有流路***，其能够在使细胞按照逐个地测定细胞的方式排列于液体中的状态下进行细胞测定。这种流路***可以通过被称为流动池的基于流体力学的部件而实现。流动池通常通过流体动力学聚焦(hydrodynamicfocusing)来实现，所述流体动力学聚焦利用包含试样液的液流(sample flow)之类的鞘液的液流(sheath flow)，但不限定于此。例如，也可以通过微毛细管、声波聚焦(acousticfocusing)实现。

在本发明中，流式细胞仪可以没有特别限定地使用市售品。在本说明书中，流式细胞仪包含所谓的“成像流式细胞仪”，其具备利用相机的拍摄部，能够取得在液体中流动的细胞的图像。如后述实施方式1所述，利用成像流式细胞仪能够基于所拍摄的细胞图像得到包括细胞的尺寸、长宽比在内的多重参数。在本说明书中，流式细胞仪包含成像流式细胞仪或不进行拍摄的流式细胞仪两者。在优选的实施方式中，流式细胞仪为成像流式细胞仪。在本发明中，流式细胞仪只要是市售品就可以没有特别限制地使用。

在本实施方式中，在工序(iv)中，当不同于免疫细胞的物质为选自异体细胞、抗原递呈细胞、和癌细胞中的至少1种或珠子时，可以用流式细胞仪或成像细胞仪测定免疫细胞、不同于免疫细胞的物质和捕捉体的复合体，取得由该复合体中的捕捉体产生的光学信号。或者，当不同于免疫细胞的物质为容器、多孔板或载玻片时，可以解除免疫细胞与不同于免疫细胞的物质的接触面，用流式细胞仪或成像细胞仪测定免疫细胞与捕捉体的复合体，取得由该复合体中的捕捉体产生的光学信号。

在本说明书中，“成像细胞仪”是指：能够在短时间(数秒至数分钟)内取得、定量测定很多个(数千个至数百万个)细胞各自的荧光影像或散射光、透射光影像的统计学精度高的细胞测定装置。是能够通过细胞图像处理抽取每1个细胞的信息的测定装置。在本发明中，成像细胞仪可以没有特别限制地使用市售品。

在进一步的实施方式中，提供一种对对象中的免疫***的活化状态进行评价的方法。该实施方式包含：对由前述对象得到的包含免疫细胞的生物试样实施上述本发明的工序。即，该实施方式的评价方法包含：(i)使生物试样中的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；(ii)使生物试样中的免疫细胞形成与不同于前述免疫细胞的物质的接触面的工序；(iii)使生物试样中的免疫细胞与和免疫细胞中的表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体接触的工序；(iv)检测由前述捕捉体产生的光学信号的工序；和(v)基于所检测出的光学信号，判定前述试样是否为免疫刺激应答性的工序。

进而，该实施方式的评价方法可以为：捕捉体包含荧光物质，在工序(v)中基于工序(iv)中检测出的荧光信号取得荧光图像、基于该荧光图像进行判定。也可以在荧光图像中计量显示反映表面抗原的分布的荧光信号的区域，基于该区域算出例如前述生物试样中的有免疫刺激应答性免疫细胞的比例。然后，将该比例与将来自健康人的生物试样标准化而得的有免疫刺激应答性免疫细胞的比例进行比较，从而进行判定。在该实施方式中，例如，当该试样的前述比例为高于标准化的比例的值的情况下，可以判定为该试样的免疫应答性高或有免疫应答性。或者，在该评价方法中，也可以将由对象得到的包含免疫细胞的生物试样中的有免疫刺激应答性免疫细胞的比例、与来自相同对象的以往的生物试样的比例进行比较。例如，当该试样的前述比例为高于以往的比例的值的情况下，可以判定为该对象的免疫应答性提高或有免疫应答性。

本发明的另一方式涉及一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其使用与免疫细胞中的共刺激分子结合且能够产生光学信号的捕捉体。

在该方式的方法中，使用与免疫细胞中的共刺激分子结合且能够产生光学信号的捕捉体作为捕捉体，除此以外与上述方式的方法的记载相同。作为捕捉体所结合的共刺激分子，可列举例如：CD28、OX40、CD40L、CTLA4、PD-1和ICOS。

本发明的另一方式涉及用于分析免疫细胞的活化状态的细胞分析装置。对于本发明的该方式的实施方式，参照附带的附图来进行说明。需要说明的是，以下的说明均为例示而非限制性说明，对附带的权利要求书中记载的发明没有任何限制。

＜细胞分析装置的实施方式1＞

参照图2，细胞分析装置1具备测定装置2和信息处理装置3。测定装置2利用流式细胞仪通过光学方式对和免疫细胞的表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体与免疫细胞的复合体的试样进行测定。信息处理装置3对测定装置2得到的测定结果进行分析，将分析结果显示于显示部320。

参照图3，测定装置2具有：导入部201、拍摄部203、信号处理部210、CPU204、通信接口205和存储器206。信号处理部210具有：模拟信号处理部211、A/D转换器212、数字信号处理部213和存储器214。

在该实施方式中，导入部201具备容器和泵(未图示)。容器中的试样通过泵与鞘液一起被供给到拍摄部203的流动池203c(参照图4)。导入部201按照CPU204的指示向拍摄部203供给试样。在实施方式1中，测定试样使用如下得到的复合体：对来自人末梢血的克隆T细胞给予包括与抗CD28抗体接触在内的免疫刺激后，对细胞进行固定化，用与前述抗CD28抗体结合的藻红蛋白(PE)标记抗小鼠IgG抗体进行2次染色。

拍摄部203对由导入部201供给的试样照射激光并拍摄复合体，将生成的透射光图像和荧光图像的图像信息以电信号形式输出到模拟信号处理部211。模拟信号处理部211按照CPU204的指示对由拍摄部203输出的电信号进行增幅并输出到A/D转换器212。

A/D转换器212将由模拟信号处理部211增幅后的电信号转换为数字信号并输出到数字信号处理部213。数字信号处理部213按照CPU204的指示对由A/D转换器212输出的数字信号实施规定的信号处理，生成测定数据。生成的测定数据存储于存储器214。

存储于存储器214的测定数据包含基于复合体通过流动池203c时产生的透射光和荧光的透射光图像和荧光图像。

CPU204将存储于存储器214的测定数据输出到通信接口205。CPU204介由通信接口205从信息处理装置3接收控制信号，按照该控制信号对测定装置2的各部进行控制。

通信接口205将由CPU204输出的测定数据传输到信息处理装置3、接收由信息处理装置3输出的控制信号。存储器206作为CPU204的作业区域而使用。

参照图4，拍摄部203具备：光源203a、203b；流动池203c；聚光透镜203d、203e；物镜203f；光学单元203g；聚光透镜203h；和相机203i。

在该实施方式中，光源203a为半导体激光光源。由光源203a照射的光为波长λ1的激光。聚光透镜203d将由光源203a照射的光聚光并引导至流动池203c中的试样。由光源203a照射的波长λ1的光照射到从流动池203c的内部通过的试样，由此由免疫细胞产生波长λ1的透射光。

光源203b为半导体激光光源。由光源203b照射的光为波长λ2的激光。在该实施方式中，波长λ2为约488nm。聚光透镜203e将由光源203b照射的光聚光并引导至流动池203c中的试样。由光源203b照射的波长λ2的光照射到从流动池203c的内部通过的试样，由此由PE产生波长λ3的荧光。

物镜203f将波长λ1的透射光和波长λ3的荧光进行聚光。光学单元203g具有组合有2片分色镜的构成。光学单元203g的2片分色镜以彼此不同的角度将波长λ1的透射光和波长λ3的荧光反射，在后述的相机203i的受光面203ia(参照图5)上被分离。聚光透镜203h将波长λ1的透射光和波长λ3的荧光进行聚光。相机203i接收波长λ1的透射光和波长λ3的荧光，将流动池203c中的试样的图像信息以电信号形式输出到模拟信号处理部211。相机203i可以是TDI(Time Delay Integration)相机。如果为TDI相机则能够取得更高精度的图像信息。

如图5所示，相机203i在受光面203ia上的受光区域203ib、203ic中分别接收波长λ1的透射光和波长λ3的荧光。受光面203ia为配置于相机203i的CMOS图像传感器等的拍摄元件的受光面。照射到受光面203ia的光的位置随着试样在流动池203c的移动而如箭头所示那样分别在受光区域203ib、203ic内移动。从而，利用光学单元203g将2束光在受光面203ia上分离，因此CPU204能够由相机203i所输出的图像信号中抽取与各光对应的信号。

参照图6，信息处理装置3由主体300、输入部310和显示部320构成。主体300具有CPU301、ROM302、RAM303、硬盘304、读取装置305、输入输出接口306、图像输出接口307和通信接口308。

CPU301执行存储于ROM302的计算机程序和载入RAM303的计算机程序。RAM303用于读出ROM302和硬盘304中记录的计算机程序。RAM303在执行这些计算机程序时也可以作为CPU301的作业区域来利用。

硬盘304存储有操作***和应用程序等用于使CPU301执行的各种计算机程序和计算机程序的执行中使用的数据。另外，硬盘304中存储有从测定装置2接收到的测定数据。

硬盘304中存储有：用于基于测定数据计量包括试样中所含的免疫细胞的数量、细胞的尺寸、长宽比、显示荧光信号的区域、前述区域内的总荧光信号强度等在内的分析用参数并进行试样的分析的程序；将分析结果显示在显示部320的显示程序。通过存储这些程序，进行后述的分析处理、显示处理。即，CPU301通过前述程序而被赋予执行后述的图7b的处理的功能。

读取装置305由CD驱动器、DVD驱动器等构成。读取装置305能够读出记录在CD、DVD等记录介质中的计算机程序和数据。

输入输出接口306与由鼠标、键盘等构成的输入部310连接，用户使用输入部310输入对信息处理装置3的指示。图像输出接口307与由显示器等构成的显示部320连接，将与图像数据对应的影像信号输出到显示部320。显示部320基于所输入的影像信号显示图像。

信息处理装置3能够通过通信接口308接收由测定装置2传输的测定数据。所接收的测定数据被存储在硬盘304中。

图7是示出测定装置2的CPU204和信息处理装置3的CPU301的控制的流程。图7a是示出基于测定装置2的CPU204的控制处理的流程，图7b是示出基于信息处理装置3的CPU301的控制处理的流程。

关于信息处理装置3的CPU301的控制处理请参照图7b。CPU301在介由输入部310而收到来自用户的测定开始指示时(步骤S11：YES)，向测定装置2传输测定开始信号(步骤S12)。然后，CPU301判定是否接收到测定数据(步骤S13)。如果没有接收到测定数据(步骤S13：NO)，则处理处于待机状态。

关于测定装置2的CPU204的控制处理请参照图7的a。CPU204从信息处理装置3接收测定开始信号(步骤S21：YES)则进行前述试样的测定(步骤S22)。在测定处理(步骤S22)中，从导入部201向流动池203c与鞘液一起供给包含前述捕捉体与免疫细胞的复合体的测定试样，在流动池203c中形成包含在鞘液中的测定试样的试样液流。对形成的试样流照射来自光源203a、203b的激光束，在流动池203c中形成光束光斑(ビームスポット)。当前述免疫细胞从光束光斑通过时，产生透射光和荧光。利用相机203i分别拍摄透射光和荧光并将其转换为电信号。

这些电信号被A/D转换器212转换为数字信号，被数字信号处理部213实施信号处理。由此，对于每一从流动池203c通过的复合体，得到包含透射光图像和荧光图像的测定数据。测定数据被存储在存储器214中。当结束试样的测定时，CPU204将通过测定处理而生成的测定数据传输给信息处理装置3(步骤S23)，结束处理。

再次参照图7b。信息处理装置3的CPU301从测定装置2接收测定数据时(步骤S13：YES)，将测定数据存储在硬盘304中，基于所述测定数据进行分析处理(步骤S14)。然后，CPU301将在S14中取得的分析结果显示在显示部320(步骤S15)。然后处理结束。

参照图8～图10进一步说明信息处理装置3的CPU301基于测定数据进行的分析处理(图7b的步骤S14)的1例。图8示出对前述免疫细胞进行测定而得到的测定数据中的透射光图像、荧光图像(CD28)和它们的叠加图像。如图8a的荧光图像所示，在未给予免疫刺激时，共刺激分子CD28在免疫细胞的细胞膜上显示出同样的分布倾向。如图8b的荧光图像所示，在给予免疫刺激时，显示出共刺激分子CD28局部存在于免疫细胞的细胞膜上的倾向。虽然并非意图在理论上进行限制，但可认为：显示出共刺激分子局部存在的细胞膜部分为在与不同于该免疫细胞的物质之间形成于该免疫细胞中的接触面。即，可认为显示出该共刺激分子局部存在的部分表示该细胞与不同于其的物质之间形成的免疫突触。

CPU301基于图7a的步骤S22中拍摄的全部细胞的透射光图像和荧光图像计量分析用参数(图7b的步骤S14)。虽然不进行限定，但分析用参数可列举细胞的尺寸(像素数)、细胞的长宽比、细胞中的显示荧光信号的区域(像素数)、前述区域内的总荧光信号强度(细胞的总荧光信号强度)和它们的比值。图9示出信息处理装置3的CPU301进行图8b所示的透射光图像和荧光图像的计量处理(图7的b的步骤S14)的示意图。得到的测定数据被存储在硬盘304中。需要说明的是，细胞的尺寸、长宽比、显示荧光信号的区域、和总荧光信号强度等各术语的含义如上所述。

图10是示出信息处理装置3的CPU301在步骤S15中的分析处理的流程。CPU301将步骤S14中计量的分析用参数分别分配给X轴和Y轴而制作2维直方图(2D散点图)，抽取与存在于规定范围内的点对应的细胞的测定数据并进行分析。

在该实施方式中，CPU301首先将细胞尺寸分配给X轴、将细胞的长宽比分配给Y轴而制作2D散点图(图11的a)，抽取位于规定范围(R1)的细胞的测定数据(步骤S51)。就范围(R1)而言，在细胞尺寸(X轴)中，以反映单个细胞的大小的规定范围设置门控；且在长宽比(Y轴)中，以反映细胞单独存在的规定范围设置门控。由此排除来自比细胞小的细胞碎片等物质、比单个细胞大的细胞聚集块的数据。

2D散点图中示出的每一个点都表示各个细胞的计量值。CPU301抽取出图像中的、显示位于以R1所示的区域内的计量值的细胞的测定数据。需要说明的是，在该实施方式中，2D散点图中示出的点映射着图7a的步骤S22中测得的各个细胞的测定数据。在用户指定2D散点图中示出的点时，CPU301将与该点对应的细胞的测定数据(透射光图像和/或荧光图像)从硬盘304读出并显示在显示部320。

对于步骤S51中抽取的细胞的测定数据，CPU301将细胞的总荧光信号强度分配给X轴、将荧光图像的锐度(图像的清晰度)分配给Y轴而制作2D散点图(图11的b)，进一步抽取位于规定范围(R2)内的细胞的测定数据(步骤S52)。就范围(R2)而言，在细胞的总荧光信号强度(X轴)中，以反映规定量的共刺激分子CD28的表达量的范围设置门控；在锐度(Y轴)中，以反映规定的图像锐度的范围设置门控。由此，抽取表达规定量的共刺激分子CD28的细胞的数据，将未表达规定量的共刺激分子CD28的细胞的数据排除。

然后，对于步骤S52中抽取的细胞的测定数据，CPU301将显示荧光信号的区域分配给X轴、将细胞的尺寸分配给Y轴而制作2D散点图(图11c)，对位于规定范围(R4)的点的数量进行计数(步骤S53)。就范围(R4)而言，在显示荧光信号的区域(X轴)中，以反映共刺激分子CD28的局部存在的规定范围设置门控；且在细胞尺寸(Y轴)中，以反映单个细胞的大小的规定范围设置门控。通过对位于范围(R4)内的点的数量进行计数，从而计数对免疫刺激有应答性的免疫细胞的数量。在该实施方式中，与位于范围(R4)的点对应的细胞有形成免疫突触的倾向，判定该细胞对该实施方式中的免疫刺激有应答性。

CPU301进一步对图11c整体中示出的点的数量(与位于图11的b的范围(R2)中的点的数量对应)进行计数，算出范围(R4)内的点的数量相对于范围(R2)内的点的数量的比例([范围(R4)内的点数]/[范围(R2)内的点数])(步骤S54)。由此算出表达规定量的共刺激分子CD28的各个免疫细胞中有免疫刺激应答性免疫细胞的比例。

将关于由以上的分析处理得到的各范围内的点数、比例的分析结果显示在显示部320中。

通过与例如对来自健康人的生物试样标准化而得的有免疫刺激应答性免疫细胞的比例进行比较，可以对该分析结果进一步进行分析。在该进一步的分析中，例如当该试样的前述比例为高于标准化的比例的值时，可判定为该试样的免疫应答性高。另外，通过与关于来自同一对象的以往的生物试样的免疫刺激应答性的免疫细胞的比例进行比较，可以对该分析结果进一步进行分析。在该进一步的分析中，例如当该试样的前述比例为高于以往的比例的值时，可判定为该对象的免疫应答性提高。

由此，在1个实施方式中提供一种细胞分析装置，其包含：导入部，其导入复合体；拍摄部，其对由前述导入部供给的前述复合体进行拍摄；和分析部，其基于由前述拍摄部拍摄的图像判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性，其中，所述复合体为免疫细胞与和前述免疫细胞中的表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体的复合体。在特定的实施方式中，前述分析部基于前述图像取得反映前述表面抗原的分布的值，将取得的值与阈值进行比较，从而判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性。在另一实施方式中，提供一种细胞分析装置，其中，前述捕捉体包含荧光物质，前述图像包含荧光图像，前述反映表面抗原的分布的值包含基于前述荧光图像的显示反映表面抗原的分布的荧光信号的区域，当前述区域比前述阈值小时，判定为前述免疫细胞有免疫刺激应答性。在另一实施方式中，提供一种细胞分析装置，其中，前述图像包含透射光图像，前述分析部基于前述透射光图像取得反映前述免疫细胞的大小的值，基于前述反映免疫细胞的大小的值和前述反映表面抗原的分布的值判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

以上所示的分析处理不过是基于测定数据的分析处理的一例，也可以使用不同的分析处理。

＜细胞分析装置的实施方式2＞

作为实施方式1的分析处理的步骤S53的替代，对于步骤S52中抽取的测定数据，CPU301也可以将细胞的总荧光信号强度分配给X轴、将显示荧光信号的区域分配给Y轴而制作2D散点图(图11d)，并对位于规定范围(R3)内的测定数据数进行计数。就范围(R3)而言，在细胞的总荧光信号强度(X轴)中，以反映每一细胞的共刺激分子CD28的规定表达量的范围设置门控；且在显示荧光信号的区域(Y轴)中，以反映共刺激分子CD28的局部存在的规定范围设置门控。通过对范围(R3)中的测定数据进行计数，从而计数对免疫刺激有应答性的免疫细胞的数量。在该实施方式中，与位于范围(R3)中的点对应的细胞有形成免疫突触的倾向，判定该细胞对该实施方式中的免疫刺激具有应答性。

在该实施方式中，进一步地作为步骤S54的替代，CPU301可以对位于图11d整体中示出的点的数量(与位于图11b的范围(R2)中点的数量对应)进行计数，算出范围(R3)内的点的数量相对于范围(R2)内的点的数量的比例([范围(R3)内的点数]/[范围(R2)内的点数])。由此算出表达规定量的共刺激分子CD28的各个免疫细胞中有免疫刺激应答性免疫细胞的比例。

<细胞分析装置的实施方式3>

作为实施方式1的分析处理的步骤S53的替代，对于步骤S52中抽取的细胞的测定数据，CPU301可以将关于显示荧光信号的区域的组值(階級值)分配给x轴、将度数分配给Y轴而制作直方图，并显示在显示部320。进一步地作为步骤S54的替代，CPU301可以由该直方图算出在步骤S52中抽取的测定数据的显示荧光信号的区域的平均值、中央值、频度最高的值。可以通过将得到的平均值、中央值、频度最高的值与例如由来自健康人的生物试样得到的、将免疫细胞中显示荧光信号的区域标准化而得的平均值、中央值、频度最高的值进行比较，从而进一步进行分析。在该进一步的分析中，例如当该试样的表示前述频度最高的值的组值(显示荧光信号的区域)小于标准化的表示频度最高的值的组值(显示荧光信号的区域)时，其提示共刺激分子CD28局部存在，结果可判定为该试样对免疫刺激的应答性高。

如实施方式3所示，在测定数据的分析中，也可以不制作2D散点图而分析免疫细胞的免疫应答性。但是，如实施方式1所说明的那样，2D散点图中示出的点能够映射各个免疫细胞的测定数据，例如，指定各点则能够显示该免疫细胞的包括透射光图像和荧光图像在内的测定数据。因此，在能够追加地对各个细胞实施基于图像的详细分析方面，利用2D散点图的分析是优选的分析处理方法。

<细胞分析装置的实施方式4>

在以上的分析处理中例示出基于所拍摄的图像数据进行分析，但也可以由拍摄的图像数据以外的测定数据分析免疫刺激应答性的免疫细胞。例如，在实施方式1中的测定装置2(图4)中使用分色镜203j、203k以及前方散射受光部203l、荧光受光部203m，来代替光学单元203g和相机203。由光源203a照射的波长λ1的光照射到在流动池203c的内部通过的试样，由此由免疫细胞产生波长λ1的前方散射光。由光源203b照射的波长λ2的光照射到在流动池203c的内部通过的试样，由此由PE产生波长λ3的荧光。需要说明的是，实施方式4中的试样为实施方式1中所用的复合体。波长λ1的前方散射光被分色镜203j反射，并被前方散射受光部203l接收。波长λ3的荧光透过分色镜203j，被分色镜203k反射并被荧光受光部203k接收。前方散射受光部203l和荧光受光部203m为光电倍增管。在该例中，在图7的a的步骤S22中得到的光学信号为前方散射光信号和荧光信号，在图7的b的步骤S14中得到作为分析用参数的“脉冲宽度(w)”、“脉冲面积(A)”和“脉冲的高度(H)”。参照图12对这些分析用参数进行说明。

图12是作为例示而分别示出共刺激分子CD28在细胞膜上均匀分布的细胞(图12a)和显示出在细胞膜上局部存在的细胞(图12b)沿着箭头方向从检测荧光信号的区域(未图示)通过期间所检测出的荧光信号的示意图(图12c和图12d)。

在本说明书中，在图12c和图12d所示的荧光强度的脉冲中，超过作为阈值的基线而得到荧光信号的时间称为“脉冲宽度(w)”，将荧光强度中显示出脉冲的峰时的荧光强度称为“脉冲的高度(H)”。“脉冲面积(A)”是指基线与荧光信号强度曲线之间的面积。

在该例中，图12a的细胞和图12b的细胞在细胞膜上表达等量的共刺激分子CD28，图12c和图12d的脉冲面积(A)为相等的值。在此，脉冲宽度(w)和脉冲高度(H)由于共刺激分子的分布模式而不同。与共刺激分子在细胞膜上均匀分布时相比(图12a)，共刺激分子在细胞膜上局部存在时(图12b)，其脉冲宽度(w)变窄，另一方面脉冲的高度(H)变高(图12c和12d)。

图13是在该实施方式中测定多个免疫细胞并制作2D散点图时的示意图。图13a是将脉冲的高度(H)分配给X轴、将脉冲宽度(w)分配给Y轴而成的2D散点图，图13b是将脉冲的高度(H)分配给X轴、将脉冲面积(A)分配给Y轴而成的2D散点图。

如上所述，当共刺激分子在细胞膜上均匀分布时(图12a)，与共刺激分子在细胞膜上局部存在时相比(图12b)，其脉冲宽度(w)显示出变宽的倾向，脉冲的高度(H)显示出变低的倾向(图12的c和12的d)。因此，在图13a所示的2D散点图中显示出如下倾向：进入被虚线圆形包围的区域中的数据为反映共刺激分子在细胞膜上均匀分布的细胞的数据，另一方面，进入被实线正方形包围的区域的数据为反映共刺激分子在细胞膜上局部存在的细胞的数据。在图13b所示的2D散点图中显示出如下倾向：进入被虚线正方形包围的区域的数据为反映共刺激分子在细胞膜上均匀分布的细胞的数据，另一方面，进入被实线正方形包围的区域的数据为反映共刺激分子在细胞膜上局部存在的细胞的数据。

由此，在1个实施方式中提供一种细胞分析装置，其包含：导入部，其导入复合体；检测部，其对由前述导入部供给的前述复合体照射光，检测所产生的来自前述复合体的光学信号；和分析部，其基于所检测出的光学信号判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性，其中，所述复合体为免疫细胞与和前述免疫细胞中的表面抗原结合且能够产生光学信号的捕捉体。在特定的实施方式中，提供一种细胞分析装置，其中，前述捕捉体包含荧光物质，前述检测部检测由前述复合体产生的荧光信号，前述分析部基于前述荧光信号取得反映前述表面抗原的分布的值，对取得的值与阈值进行比较，从而判定前述免疫细胞是否有免疫刺激应答性，前述反映表面抗原的分布的值包括来自前述复合体的荧光信号的脉冲宽度、该荧光脉冲的高度和脉冲面积中的至少一种。

如实施例所示，显示出捕捉体所结合的表面抗原、共刺激分子局部存在于细胞膜上的细胞可判定为显示免疫应答性的免疫细胞。因此，在图13a和图13b中，显示出进入被实线正方形包围的区域的数据的细胞可判定为显示免疫应答性的细胞。如该实施方式中例示那样，可以理解，不仅基于所拍摄的图像数据的分析处理，还可利用上述那样的分析处理测定有免疫刺激应答性免疫细胞。

需要说明的是，在此示出的分析用参数和分析处理不过是一例，可以由测定数据计量不同的分析用参数，此外也可以对所计量的分析用参数进行不同的分析处理。例如，脉冲面积只要为反映脉冲的时间曲线下面积的值则也可以为近似值，不限于时间积分值。脉冲面积既可以是脉冲宽度和峰高度之积，也可以是由脉冲宽度和峰高度求出的三角形的面积。另外，在计量时间积分值的方式中，底边也可以不是基线而适当进行设定。例如，也可以将相对于基线超过规定阈值的值作为底边。

以下记载具体的实施例，它们是示出本发明的优选实施方式的例子，对附带的权利要求书中记载的发明没有任何限定。并意在使由本说明书中记载的具体实施方式、材料、组合物和方法容易识别的等同方案或者变更、改变或变形包含在本发明的范围内。

【实施例】

实施例1：以CD28为指标的免疫细胞的免疫刺激应答性的测定

(1)克隆T细胞的制备

将5×10⁶的CD4阳性细胞(Stemcell Technologies:ST-70026)和CD8阳性细胞(フナコシ:0508-100,Cosmo Bio:PB08C-1)接种到添加有1μg/mL的LEAF(商标)纯化的抗人CD3抗体(Biolegend:317315)、10ng/mL的重组人IL-2(rhIL-2)(R&D systems:202-IL-500)、0.2μg/mL的植物凝集素-L(PHA)(SIGMA:L4144-5MG)和2％人血清(SIGMA:H4522-100ML)的Yssel’s培养基(Gemini Bio-Products：400102)中，与1×10⁶的末梢血单核细胞和1×10⁴的JY细胞共培养14天。14天后，将T细胞通过有限稀释法按照0.3、1.0和3.0细胞/孔的量接种到96孔板中，培养到与1×10⁴的末梢血单核细胞形成集落为止。从形成了集落的孔中回收T细胞，得到克隆T细胞。以下也将得到的T细胞称为“制备克隆T细胞”。

(2)抗体的固相化

向24孔板中以每孔300μl添加抗CD3抗体(BioLegend#300414Clone：UCHT1)的溶液(0.01mg/ml)，将抗CD3抗体固相化于孔表面。以下也将得到的平板称为“抗CD3抗体固相化平板”。

(3)免疫细胞的刺激和测定

向抗CD3抗体固相化平板中以每孔约5×10⁵cells的方式加入制备克隆T细胞。然后对孔中的细胞以终浓度达到0.01mg/ml的方式加入抗CD28抗体(BioLegend#302914Clone：CD28.2)。将该平板离心分离后(200G、30秒)，在37℃温育30分钟。通过移液从孔表面回收制备克隆T细胞。将回收的T细胞用含有1％多聚甲醛(PFA)的固定液进行固定化。对固定化后的T细胞，用PE标记抗小鼠IgG抗体(BioLegend#405307)进行免疫染色。对于染色后的T细胞(5×10⁵cells/20μl)，用Imaging FCM(ImageStreamX MarkII ImagingFlow Cytometer：Amnis)进行测定。

为了比较，对于不对细胞给予免疫刺激的情况也进行了研究，其中所述免疫刺激是指与结合于T细胞的表面抗原的抗体(抗CD28抗体和抗CD3抗体)的接触以及与不同物质(平板的孔)的接触所引起的免疫刺激。将上述(1)中制备的克隆T细胞在未进行上述免疫刺激的情况下用上述固定液进行固定后，使用抗CD28抗体进行染色。将固定后的T细胞用PE标记抗小鼠IgG抗体进行2次染色并测定。

未对T细胞给予上述免疫刺激时，在T细胞中CD28在细胞膜上均匀分布(参照图14的a)。给予上述免疫刺激后解除T细胞与孔的接触面时，显示CD28局部存在于T细胞的细胞膜上(参照图14的b)。从而，即使在给予上述免疫刺激后解除了T细胞与孔的接触面的状态下，也能够通过以共刺激分子CD28为指标来检测免疫突触。

(4)数据分析

对使用Imaging FCM测得的、包含上述无免疫刺激的T细胞的样品的测定数据(图15的a和b)和包含上述有免疫刺激的T细胞的样品的测定数据(图15的c和d)进行多重参数分析。

详细的计量处理和分析处理已示于实施方式1中。简单而言，基于使用ImagingFCM测得的透射光图像、荧光图像(CD28)进行图像分析(图9)，计量细胞的尺寸(像素数)、细胞的长宽比、细胞中的显示荧光信号的区域(像素数)和前述区域内的总荧光信号强度(细胞的总荧光信号强度)。首先将细胞尺寸分配给X轴、将细胞的长宽比分配给Y轴而制作2D散点图，抽取与位于规定范围(R1)内的点对应的细胞的测定数据(图10的步骤S51)。然后，对于范围(R1)内的测定数据，进一步抽取与细胞的总荧光信号强度位于规定范围(R2)内的点对应的测定数据(图10的步骤S52)。对于范围(R2)内的测定数据，分别对位于表示为R4的区域内(图15的b和15的d)内的点的数量进行计数(图10的步骤S53)。另外，对位于图15的b和15的d的散点图上的点的数量(位于范围(R2)内的点的数量)进行计数。然后通过下述式(1)算出范围(R4)内的点的数量相对于范围(R2)内的点的数量的比例(图10的步骤S54)。将该结果汇总于以下的表1。

[比例(R4/R2)]＝{[范围(R4)内的点数]/[范围(R2)内的点数]}×100···式(1)

【表1】

根据本说明书的实施例可知，关于对免疫细胞给予包括与免疫刺激因子的接触和与不同物质之间形成接触面在内的免疫刺激时所能形成的免疫突触，如果以共刺激分子为指标对其进行检测，则即使在未维持该接触面的状态下也能准确地得到该免疫细胞所具有的免疫应答性信息。如果考虑到免疫突触是在与靶细胞的结合面处、形成于免疫细胞的松散结合，则这是令人惊讶的结果。

由此，根据本发明，能够基于免疫突触来测定免疫细胞的免疫刺激应答性，因此可以理解：与以往的基于细胞因子的产生的免疫细胞的应答性分析方法相比，能够迅速且简便地测定免疫细胞的活化状态。

在本说明书的实施例中已经证实：由于能够使用成像流式细胞仪测定免疫细胞的免疫刺激应答性，而能够对多个细胞进行测定，能够进行统计学精度高的免疫应答性测定。上述实施例中使用了成像流式细胞仪测定免疫细胞的免疫刺激应答性，但可以理解：利用与实施例中所用的测定装置同样地能够对多个细胞进行测定的成像细胞仪，也能够进行测定。另外可以理解：如上述实施方式4所示，利用不进行拍摄的流式细胞仪，也能够与实施例中所用的测定装置同样地测定多个免疫细胞的免疫刺激应答性。由此，根据本发明，能够用多个细胞迅速且简便地测定免疫细胞的活化状态，因此可以理解：其在统计学精度高的药效评价中是有用的。

上述实施例使用了成像流式细胞仪，因此在各细胞的测定数据的分析中能够使各个细胞的图像数据映射至各测定数据。因此，在基于测定数据进行规定的分析处理而筛选细胞后，可以进一步地合并该细胞的图像数据来评价免疫刺激应答性。例如，在上述实施例的、用于筛选形成免疫突触的倾向高的细胞的分析处理中，在有免疫刺激的样品中存在约81％的落入范围(R4)的细胞(表1)。在此，在图15的d中指定与落入范围(R4)的细胞对应的点并显示该细胞的图像数据、合并该图像数据进行评价，从而能够更详细地评价免疫细胞对免疫刺激的应答性。可以理解：该进一步的评价也能够利用与成像流式细胞仪同样地进行细胞图像的拍摄的成像细胞仪来进行评价。

根据本发明的测定方法和细胞分析装置，例如在使用免疫刺激抗体作为免疫刺激因子时，能够迅速且简便地评价与癌免疫、自身免疫性疾病等相关的对象体内的免疫细胞的活化状态；在使用特异性抗原肽作为免疫刺激因子时，能够迅速且简便地评价与感染症、过敏性疾病等相关的对象体内的免疫细胞的活化状态；进而在使用异体细胞或异体MHC作为免疫刺激因子时，能够迅速且简便地评价对象对于移植医疗、再生医疗的免疫应答性，因此是有用的。如上所述，可以理解：在分析处理中能够进一步利用各个细胞的图像数据的成像流式细胞仪和成像细胞仪具有进一步的优点。

参考例：免疫细胞的免疫突触形成与细胞因子产生之间的相关性(1)细胞因子产生细胞的测定

与实施例1同样地在平板的各孔中固相化抗CD3抗体，制作抗CD3抗体固相化平板。另外，与实施例1同样地由人末梢血制备克隆T细胞。向抗CD3抗体固相化平板以每孔约5×10⁵cells的方式加入克隆T细胞。然后对孔中的细胞以终浓度0.01mg/ml的方式加入抗CD28抗体(BioLegend#302914Clone：CD28.2)，在37℃温育4小时。然后，向各孔中以终浓度10μg/ml的方式加入布雷菲德菌素A，温育2小时。然后，将平板在冰上静置，回收各孔中的细胞。将回收的T细胞用含有1％PFA的固定液固定，然后用含有0.5％皂素和1％BSA的PBS溶液进行膜透过性处理。将处理后的细胞用Alexa Fluor(注册商标)488标记抗IFN-γ抗体(BioLegend#502517Clone:4S.B3)进行免疫染色。用流式细胞仪(BD biosciences：Accuri(商标))对染色后的T细胞进行测定。利用常规方法对测定数据进行分析，取得所测定的T细胞中的IFN-γ阳性细胞的比例。

(2)形成了免疫突触的细胞的测定

使用与上述(1)所用的T细胞相同的从孔中所接种的T细胞，以CD28为指标对形成了免疫突触的细胞进行测定。对测定数据进行分析，取得所测定的T细胞中的形成了免疫突触的细胞的比例。需要说明的是，测定和数据分析与实施例1同样地进行。

(3)结果

将纵轴设为IFN-γ阳性细胞的比例(％)、将横轴设为免疫突触形成细胞的比例(％)而将数据作图。将得到的坐标图示于图16。由图16可知，在受到免疫刺激的克隆T细胞中，在免疫突触形成与INF-γ产生之间确认到相关性(R²＝0.8371)。因此表明，通过检测解除了接触面的免疫细胞的免疫突触，能够与基于细胞因子的产生的以往方法同样地检测由于免疫刺激而被活化的免疫细胞。

实施例2：以CD3和CD40为指标测定免疫细胞的免疫刺激应答性(1)免疫细胞的刺激和测定

与实施例1同样地在平板的各孔中固相化抗CD3抗体，制作抗CD3抗体固相化平板。另外，与实施例1同样地由人末梢血制备克隆T细胞。向抗CD3抗体固相化平板中以每孔约5×10⁵cells的方式加入制备克隆T细胞。然后对孔中的细胞分别以终浓度为0.01mg/ml和0.01mg/ml的方式加入抗CD28抗体(BioLegend#302914Clone：CD28.2)和PE标记抗CD40L抗体(BD biosciences#340477Clone:89-76)。对该平板进行离心分离后(200G、60秒)，在37℃温育30分钟。除去孔中的上清后，通过吸吐使制备克隆T细胞分散并从孔表面回收。将回收的T细胞用含有1％PFA的固定液进行固定化。将固定化的T细胞用APC标记抗CD3抗体(BioLegend#300411Clone:UCHT1)进行免疫染色。需要说明的是，该T细胞由于用PE标记抗CD40L抗体进行了免疫刺激，因此也处于用抗CD40L抗体进行了免疫染色的状态。用ImagingFCM(ImageStreamX MarkII Imaging Flow Cytometer：Amnis)对染色后的T细胞(5×10⁵cells/20μl)进行测定。

为了比较，对于未对细胞给予因与抗CD40L抗体、抗CD28抗体和抗CD3抗体接触和与平板的孔接触所导致的免疫刺激的情况也进行了研究。将上述(1)中制备的克隆T细胞在不进行上述免疫刺激情况下在冰上用上述固定液固定。将固定后的T细胞用APC标记抗CD3抗体和PE标记抗CD40L抗体进行免疫染色，用Imaging FCM进行测定。

在对制备克隆T细胞不给予上述免疫刺激时，在T细胞中CD3和CD40L均在细胞膜上均匀分布(参照图17的a和c、图18的a和b、图19的a和b)。显示出：在给予上述免疫刺激后解除了T细胞与孔的接触面时，CD3和CD40L均在T细胞的细胞膜上局部存在(参照图17的b和d、图18的c和d、图19的c和d)。从而，即使在给予上述免疫刺激后、T细胞与孔的解除了接触面的状态下，通过以作为T细胞的表面抗原的CD3或CD40L为指标也能够检测免疫突触。

(2)数据分析

对用Imaging FCM测得的、包含上述无免疫刺激的T细胞的样品的测定数据(图18的a和b)和包含上述有免疫刺激的T细胞的样品的测定数据(图18c和d)进行多重参数分析。将实施例2中的计量处理和分析处理的一例示于图20。简单而言，基于用Imaging FCM测得的透射光图像、荧光图像(CD3和CD40L)进行图像分析，计量细胞的尺寸(像素数)、细胞的长宽比、细胞中的显示荧光信号的区域(像素数)和该区域内的总荧光信号强度(细胞的总荧光信号强度)。首先将细胞尺寸分配给X轴、将细胞的长宽比分配给Y轴而制作2D散点图(参照图20的a)，抽取与位于规定范围(Cells)的点对应的细胞的测定数据。然后，对于范围(Cells)内的测定数据，进一步抽取与细胞的总荧光信号强度位于规定范围(Tcells)内的点对应的测定数据(参照图20的b)。对于范围(Tcells)内的测定数据，分别对位于表示为IS_CD3和IS_CD40L的区域内(参照图18的c和d、图19的c和d)的点的数量进行计数。另外，对位于图18的c和d、图19的c和d的散点图上的点的数量(位于范围(Tcells)内的点的数量)进行计数。然后通过下述式(2)算出范围(IS_CD3或IS_CD40L)内的点的数量相对于范围(Tcells)内的点的数量的比例。将结果示于以下的表2和表3。需要说明的是，IS为免疫突触(Immune Synapse)的缩写。

[比例(IS形成细胞/T cells)]＝{[范围(IS_CD3或IS_CD40L)内的点数]/[范围(Tcells)内的点数]}×100···(2)

【表2】

CD3

【表3】

CD40L

如表2和3所示，表明了：与未进行免疫刺激时相比，使用免疫刺激抗体进行了刺激的T细胞中形成了免疫突触的T细胞的比例明显提高。因此表明，通过以CD3或CD40L为指标的免疫突触检测，能够测定免疫细胞对用免疫刺激抗体进行的免疫刺激的应答性。

实施例3：对用异体细胞的免疫刺激进行应答的免疫细胞的测定(1)异体细胞和克隆T细胞

作为异体细胞，使用由来自规定供体的iPS细胞(异体iPS细胞)制作的视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)。RPE细胞由株式会社Healios提供。向24孔板中以每孔约5×10⁵cells的方式接种RPE细胞，在37℃、5％CO₂下温育7天。由此，得到在孔底面粘附有RPE细胞的平板。克隆T细胞用以下的方法制备。将5×10⁶的CD4阳性细胞(Stemcell Technologies:ST-70026)和CD8阳性细胞(Funakoshi:0508-100,Cosmo Bio:PB08C-1)接种在添加有1μg/mL的LEAF(商标)纯化的抗人CD3抗体(Biolegend:317315)、10ng/mL的重组人IL-2(rhIL-2)(R&Dsystems:202-IL-500)、0.2μg/mL的植物凝集素-L(PHA)(SIGMA:L4144-5MG)和2％人血清(SIGMA:H4522-100ML)的Yssel’s培养基(Gemini Bio-Products：400102)中，与1.2×10⁵的RPE细胞共培养14天。

14天后，将T细胞通过有限稀释法按照0.3、1.0和3.0细胞/孔的方式接种到96孔板中，培养至与1×10⁴的RPE细胞形成集落为止。从形成了集落的孔中回收T细胞，得到克隆T细胞。

(2)免疫细胞的刺激和测定

向接种有RPE细胞的平板中以每孔约5×10⁵cells的方式加入制备克隆T细胞。对该平板进行离心分离后(200G、120秒)，在37℃温育30分钟。除去孔中的上清后，通过吸吐使制备克隆T细胞分散并从孔表面回收。将回收的T细胞用含有1％PFA的固定液进行固定化。将固定化后的T细胞用APC标记抗CD3抗体(BioLegend#300411Clone:UCHT1)、抗CD28抗体(BioLegend#302914Clone：CD28.2)、PE标记抗CD40L抗体(BD biosciences#340477Clone:89-76)或PE标记抗OX40抗体(BioLegend#350003Clone:Ber-ACT35)进行免疫染色。用抗CD28抗体进行了免疫染色的T细胞进一步用PE标记抗小鼠IgG抗体(BioLegend#405307)进行免疫染色。用Imaging FCM(ImageStreamX MarkII Imaging Flow Cytometer：Amnis)对染色后的T细胞(5×10⁵cells/20μl)进行测定。

为了比较，对于未对细胞给予因与异体细胞接触所导致的免疫刺激的情况也进行了研究。将上述(1)中制备的克隆T细胞在未进行与异体细胞接触的情况下在冰上用上述固定液进行固定。将固定后的T细胞用APC标记抗CD3抗体、抗CD28抗体、PE标记抗CD40L抗体或PE标记抗OX40抗体进行免疫染色，用Imaging FCM进行测定。

未对制备克隆T细胞给予因与异体细胞接触所导致的免疫刺激时，在T细胞中，CD3、CD28、CD40L和OX40均在细胞膜上均匀分布(参照图21的a、c、e和g、图22的a和b、图23的a和b、图24的a和b、图25的a和b)。显示出：在给予上述免疫刺激后解除了T细胞与异体细胞的接触面时，CD3、CD28、CD40L和OX40在T细胞的细胞膜上局部存在(参照图21的b、d、f和h、图22的c和d、图23的c和d、图24的c和d、图25的c和d)。从而，即使在给予因与异体细胞接触所导致的免疫刺激后、解除了T细胞与该异体细胞的接触面的状态下，也能够以作为T细胞的表面抗原的CD3、CD28、CD40L或OX40为指标检测免疫突触。

(3)数据分析

对用Imaging FCM测得的、包含上述无免疫刺激的T细胞的样品的测定数据(图18的a和b)和包含上述有免疫刺激的T细胞的样品的测定数据(图18的c和d)进行多重参数分析。计量处理和分析处理与实施例2相同。简单而言，基于使用Imaging FCM测得的透射光图像、荧光图像(CD3、CD28、CD40L或OX40)进行图像分析，对细胞的尺寸(像素数)、细胞的长宽比、细胞中的显示荧光信号的区域(像素数)和该区域内的总荧光信号强度(细胞的总荧光信号强度)进行计量。首先将细胞尺寸分配给X轴、将细胞的长宽比分配给Y轴而制作2D散点图，抽取与位于规定范围(Cells)内的点对应的细胞的测定数据。然后，对于范围(Cells)内的测定数据，进一步抽取与细胞的总荧光信号强度位于规定范围(T cells)的点对应的测定数据。对于范围(T cells)内的测定数据，对于位于表示为IS_CD3、IS_CD28、IS_CD40L和IS_OX40的区域内(参照图22的b和d、图23的b和d、图24的b和d、图25的b和d)内点的数量分别进行计数。另外，对位于各散点图上的点的数量(位于范围(T cells)内的点的数量)进行计数。然后，通过下述式(3)算出范围(IS_CD3、IS_CD28、IS_CD40L和IS_OX40)内的点的数量相对于范围(T cells)内的点的数量的比例。将结果示于以下的表4～7。

[比例(IS形成细胞/T cells)]＝{[范围(IS_CD3、IS_CD28、IS_CD40L或IS_OX40)内的点数]/[范围(T cells)内的点数]}×100···(3)

【表4】

CD3

【表5】

CD28

【表6】

CD40L

【表7】

0X40

如表4～7所示，表明：与未进行免疫刺激时相比，用异体细胞进行了免疫刺激的T细胞中形成了免疫突触的T细胞的比例明显提高。因此，通过以CD3、CD28、CD40L或OX40为指标的免疫突触检测能够测定免疫细胞对用异体细胞进行的免疫刺激的应答性。

Claims

1.一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其包含：

(i)使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；

(ii)使所述测定对象的免疫细胞上形成与不同于所述测定对象的免疫细胞的物质的接触面的工序；

(iii)使所述测定对象的免疫细胞与和所述接触面上的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体接触的工序；

(iv)检测由所述捕捉体产生的光学信号的工序；和

(v)基于所检测出的光学信号，判定在检测出所述光学信号之前解除了所述接触面的所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序，

其中所述不同于测定对象的免疫细胞的物质是当与所述免疫细胞接触时，能对该免疫细胞提供接触面的物质，且

其中所述免疫刺激因子是作用于所述免疫细胞而能够诱导该免疫细胞的活化的物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，工序(i)的免疫刺激因子存在于工序(ii)的所述不同于测定对象的免疫细胞的物质上。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包含在检测所述光学信号之前解除所述接触面的工序。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，利用搅拌、超声波处理或化学处理解除所述接触面。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包含：基于细胞的大小、凝集度和/或比重从包含细胞的试样中分取所述测定对象的免疫细胞的工序。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面抗原包含TCRα/β、CD3、CD40L、OX40、CD28、CTLA4、PD-1和ICOS中的至少1种。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面抗原为共刺激分子。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述捕捉体包含：

能产生光学信号的物质；以及

与所述接触面上的表面抗原结合的抗体、抗体片段、单链抗体或适体。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫刺激因子包含免疫刺激抗体、免疫刺激肽、主要组织相容性分子以及主要组织相容性分子与抗原肽的复合体中的至少1种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述不同于测定对象的免疫细胞的物质为异体细胞、抗原递呈细胞、癌细胞、容器、多孔板、载玻片或珠子。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测定对象的免疫细胞为T细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，在工序(v)中，基于所述光学信号计量反映所述接触面上的、捕捉体所结合的表面抗原的分布的值，将计量值与阈值进行比较，从而判定所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，

所述捕捉体包含荧光物质，

在工序(iv)中检测由所述捕捉体产生的荧光信号，

在工序(v)中基于所述检测出的荧光信号取得荧光图像，计量所述荧光图像中显示反映表面抗原的分布的荧光信号的区域，将所述区域与阈值进行比较，从而判定所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，在工序(v)中，在所述区域小于阈值时判定为所述测定对象的免疫细胞有免疫刺激应答性。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，

在所述不同于测定对象的免疫细胞的物质为异体细胞、抗原递呈细胞、癌细胞、或珠子时，用流式细胞仪或成像细胞仪对所述测定对象的免疫细胞、不同于所述测定对象的免疫细胞的物质与所述捕捉体的复合体执行工序(iv)；或者，

在所述不同于测定对象的免疫细胞的物质为容器、多孔板或载玻片时，解除所述不同于测定对象的免疫细胞的物质与所述测定对象的免疫细胞的接触面，用流式细胞仪或成像细胞仪对从不同于所述测定对象的免疫细胞的物质分离的、所述测定对象的免疫细胞与所述捕捉体的复合体执行工序(iv)。

16.一种测定免疫细胞的免疫刺激应答性的方法，其包含：

(i)使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；

(iii)使所述测定对象的免疫细胞与和所述接触面上的共刺激分子结合且能产生光学信号的捕捉体接触的工序；

(iv)检测由所述捕捉体产生的光学信号的工序；和

(v)基于所检测出的光学信号，自动判定在检测所述光学信号之前解除了所述接触面的所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性的工序，

17.一种判定免疫细胞的免疫突触形成能力的方法，其包含：

(i)使测定对象的免疫细胞与免疫刺激因子接触的工序；

(iv)检测由所述捕捉体产生的光学信号的工序；和

(v)基于所检测出的光学信号，判定在检测所述光学信号之前解除了所述接触面的所述测定对象的免疫细胞中的表面抗原的局部存在的工序，

18.一种细胞分析装置，其包含：

导入部，其导入复合体，所述复合体为受到免疫刺激因子的免疫刺激的测定对象的免疫细胞与和所述免疫细胞的表面抗原结合且能产生光学信号的捕捉体的复合体，所述捕捉体与所述免疫细胞上的和不同于所述免疫细胞的物质的接触面上的表面抗原结合；

拍摄部，其对由所述导入部供给的所述复合体进行拍摄；和

分析部，其基于由所述拍摄部拍摄的图像判定在实施所述拍摄之前解除了接触面的所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性，

19.根据权利要求18所述的装置，其中，所述分析部通过基于所述图像取得反映所述接触面上的表面抗原的分布的值、将取得的值与阈值进行比较，从而判定所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

20.根据权利要求19所述的装置，其中，

所述捕捉体包含荧光物质，

所述图像包含荧光图像，

所述反映表面抗原的分布的值包含基于所述荧光图像的显示反映表面抗原的分布的荧光信号的区域，

在所述区域小于所述阈值时，判定为所述测定对象的免疫细胞有免疫刺激应答性。

21.根据权利要求19或20所述的装置，其中，

所述图像包含透射光图像，

所述分析部基于所述透射光图像取得反映所述测定对象的免疫细胞的大小的值，基于所述反映测定对象的免疫细胞的大小的值与所述反映表面抗原的分布的值判定所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性。

22.一种细胞分析装置，其包含：

检测部，其对由所述导入部供给的所述复合体照射光，并检测所产生的来自所述复合体的光学信号；和

分析部，其基于所检测出的光学信号，判定在检测所述光学信号之前解除了接触面的所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性，

23.根据权利要求22所述的装置，其中，

所述捕捉体包含荧光物质，

所述检测部检测由所述复合体产生的荧光信号，

所述分析部基于所述荧光信号取得反映所述表面抗原的分布的值，将取得的值与阈值进行比较，从而判定所述测定对象的免疫细胞是否有免疫刺激应答性，

所述反映表面抗原的分布的值包含来自所述复合体的荧光信号的脉冲宽度、脉冲高度和脉冲面积中的至少一种。