CN108717129A - 一种适用于生物样本的sem检测样品制备试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了适用于生物样本的SEM检测样品制备试剂盒及其应用，该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片，及处理样本的试剂等。将该试剂盒用于生物样本的SEM检测，主要有以下步骤：将生物样本溶液滴加在多孔板内的多聚赖氨酸修饰的硅片上；去除多余的生物样本溶液；然后用缓冲液孵育，再用磷钨酸处理后，并经含六甲基二硅氮烷的乙醇处理干燥，获得SEM检测样品，并进行SEM检测。该试剂盒可用于生物样本的SEM检测使用，具有实验结果重复性好，分析结果准确性高等优点。

Description

一种适用于生物样本的SEM检测样品制备试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于检测试剂盒领域，具体是指一种适用于外泌体，细胞，细菌，病毒或生物组织等生物样本进行SEM(扫描电子显微镜)检测用的检测样品制备制剂盒及其应用。

背景技术

扫描电子显微镜(SEM)是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观形貌观察工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射效应，基于二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。

现有技术中，很多生物样本(例如外泌体，细胞，细菌，病毒或生物组织)不能很好的直接用扫描电子显微镜或原子力显微镜观察，需要对生物样本进行处理，让生物样本能够匹配SEM，才能观察分析。已有的可以利用喷金等手段，对生物样本表面喷镀金属，使得生物样本表面具有导电性，更好的观察。然而，喷镀金属可能导致生物样本细微结构的损失，喷镀不均匀也可能导致是实验结果重复性差，分析结果出现偏差。因此有必要对此进行改进。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒。通过该试剂盒对生物样本进行处理成检测样品，可以保持生物样本的原结构形态，而且检测实验结果一致性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案是该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片及SEM检测试剂。

SEM检测试剂包括有PBS缓冲液、戊二醛、PFA多聚甲醛、磷钨酸水溶液、六甲基二硅氮烷和乙醇。

本发明提供了一种基于所述的SEM样品试剂盒的SEM检测方法，包括有以下步骤：

1)将多聚赖氨酸修饰的硅片置于多孔板的一个孔中；

2)将待测生物样本溶液滴加在多孔板内的的多聚赖氨酸修饰的硅片上，孵育；

3)除多余的生物样本溶液；

4)加入1X PBS缓冲液，并在1X PBS缓冲液中添加2wt％戊二醛、4wt％PFA多聚甲醛，4℃孵育30min-16h；

5)用1X PBS缓冲液清洗；

6)加入0.1-1％磷钨酸处理；

7)超纯水清洗；

8)再依次用30％、50％、70％、90％的乙醇处理5min；

9)100％乙醇处理5min，重复2次；

10)含50％体积比六甲基二硅氮烷的乙醇处理15-30s；

11)100％六甲基二硅氮烷处理15-30s；

12)去除六甲基二硅氮烷；

13)置于在真空干燥器中干燥；

14)然后将经上述步骤处理后的多聚赖氨酸修饰的硅片置于SEM上检测。

进一步设置是所述的待测生物样本溶液为含有外泌体，细胞，细菌，病毒或生物组织的生理缓冲溶液。

本发明的优点是：

(1)通过本发明提供了多聚赖氨酸的硅片，具有非常优秀的亲水性，有利于生物样本在硅片表面吸附，提高制样成功率，便于观察；

(2)通过本发明的检测步骤，采用磷钨酸处理，使得生物膜结构具有更好的导电性，有利于SEM观察。

(3)采用不同浓度的六甲基二硅氮烷分断处理，六甲基二硅胺与空气接触后迅速水解，生成能溶于多种有机溶剂的六甲基二硅醚和三甲硅烷醇，这种性质决定其能迅速将样品中的脱水剂及残留水份进行置换，快速充分地干燥样品，免受大气压力对组织的损伤，从而使得组织的三维立体微细结构保存在活体状态；

(4)本发明能够有效保持待测生物样品形貌的稳定性，从而使得SEM检测实验结果重复性好，分析结果准确性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1原始Si的接触角测试图；

图2经过本发明工艺处理后的Si的接触角测试图；

图3本发明三个实施例的SEM检测图(从左到右依次排列)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

制备实施例

1.外泌体的SEM检测：

1)将Poly L-Lysine-硅片置于孔板的一个孔中

2)将10μL含外泌体的生理缓冲液滴加在PLL包被的Si片上，4℃孵育一晚

3)除多余的含外泌体的生理缓冲液

4)加入1X PBS(含2％戊二醛、4％PFA多聚甲醛)，4℃孵育30min

5)用1X PBS清洗2次

6)加入磷钨酸处理

7)超纯水清洗3次

8)分别用30％-50％-70％-90％的乙醇处理5min

9)100％乙醇处理5min，重复2次

10)含50％HMDS的乙醇处理15～30s

11)100％HMDS处理15～30s

12)去除HMDS

13)置于在真空干燥器中干燥过夜

14)SEM测试，SEM检测外泌体的图片，参见图1(左边)所示。

实施例2培养的细胞观察

1)在培养皿中细胞覆盖率达到70-80％时，去除培养皿中培养基；

2)加入2％戊二醛、4％多聚甲醛)(1XPBS配置)，4℃，过夜；

3)去除固定液，用1xPBS快速清洗2遍

4)加1％磷钨酸(用超纯水配置)，4℃，4h

5)用超纯水快速清洗3遍

6)30％-50％-70％-90％乙醇梯度脱水，4℃，15min

7)无水乙醇，室温，2次各15min

8)依次用50％HMDS的乙醇溶液、100％HMDS处理2min

9)去除HMDS后置于真空干燥箱中

10)激光切割皿底得到8×8mm聚苯乙烯片(激光切割参数：最大/最小功率：30％,速度：10mm/s)

11)将有细胞的一面朝上，固定在金属底座上，用SEM成像。

实施例3组织样本SEM成像

1)将小鼠麻醉处死，取出眼球在预冷固定液中固定5-10min；

2)在体式显微镜下，找到小梁网组织，去除晶状体和玻璃体。在取材时要注意避免挤压损伤、避免外力对观察面的损伤和破坏。

3)分离的小梁网组织先用预冷0.1M PBS冲洗后，立刻放入0.1M PH7.4PBS(含2％戊二醛+4％多聚甲醛)中，4℃固定12h。

4)固定后用刀切出平整的小梁网截断面。

5)固定后，用0.1M PBS(PH 7.4)清洗3遍，4℃每次10min。

6)再用1％磷钨酸4℃处理过夜。

7)用0.1M PBS(PH 7.4)清洗3遍，4℃每次10min。

8)30％-50％-70％-90％乙醇梯度脱水，均为10min、4℃。

9)100％乙醇脱水两次，均为10min、4℃。

10)再用含50％HMDS的乙醇、而后100％HMDS处理，分别2min，室温。

11)除去HMDS后，在真空干燥器冷冻干燥器中干燥1晚，后干燥保存待用。

12)用导电胶将组织固定于金属底座上，横断面朝上，利用SEM成像。

本发明的试剂盒还可以分别用于SEM检测细胞，细菌，病毒或生物组织等生物样品。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括有多孔板，多孔板的孔内设置有多聚赖氨酸修饰的硅片，及SEM检测的试剂。

2.根据权利要求1所述的一种适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：所述的多聚赖氨酸修饰的硅片通过以下步骤制备：

(1)切割出统一尺寸规格的硅片；

(2)将硅片进行清洗；

(3)对硅片进行亲水处理，分别在硫酸、氨水水溶液中水浴加热处理10min；

(4)将(3)所得硅片用氮气吹干；

(5)将干燥的硅片置于培养板中，并加入0.1-1％多聚赖氨酸，孵育；

(6)将(5)所得硅片用1X PBS缓冲液清洗，得到多聚赖氨酸修饰的硅片。

3.根据权利要求1所述的适用于生物样本检测的SEM样品试剂盒，其特征在于：所述的步骤(2)为分别在洗涤灵、甲醇、丙酮、去离子水中依次超声清洗15min。

4.一种基于权利要求1所述的SEM样品试剂盒的SEM检测方法，其特征在于包括有以下步骤：

1)将多聚赖氨酸修饰的硅片置于多孔板的一个孔中；

2)将待测生物样本溶液滴加在多孔板内的多聚赖氨酸修饰的硅片上，孵育；

3)除多余的生物样本溶液；

4)加入1X PBS缓冲液，并在1X PBS缓冲液中添加2wt％戊二醛、4wt％PFA多聚甲醛，4℃孵育30min-16h；

5)用1X PBS缓冲液清洗；

6)加入1％磷钨酸处理；

7)超纯水清洗；

8)再依次用30％、50％、70％、90％的乙醇处理5min；

9)100％乙醇处理5min，重复2次；

10)含50％体积比六甲基二硅氮烷的乙醇处理15-30s；

11)100％六甲基二硅氮烷处理15-30s；

12)去除六甲基二硅氮烷；

13)置于在真空干燥器中干燥；

14)然后将经上述步骤处理后的多聚赖氨酸修饰的硅片置于SEM上检测。

5.根据权利4所述的SEM检测方法，其特征在于：所述的待测生物样本为外泌体、细胞、细菌、病毒或生物组织。