CN108715826B

CN108715826B - 一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法

Info

Publication number: CN108715826B
Application number: CN201810560919.4A
Authority: CN
Inventors: 许平; 倪俊; 陶飞; 吴雨桐; 唐鸿志
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN108715826A

Abstract

本发明公开了一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，芳香化合物的催化合成是以木质素来源的分别以阿魏酸等木质素来源的酚酸为底物，所述全细胞为转入芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad的重组大肠杆菌，在高温和碱性条件下，重组大肠杆菌可以将这些酚酸转化为相应的高价值芳香化合物。这种方法用全新的全细胞催化剂来合成高价值芳香化合物，避免了辅因子的添加，大大提高了效率和节约了成本。本发明为木质素资源的利用开辟了新的技术，具有重要的应用前景。

Description

一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法

技术领域

本发明涉及芳香化合物的合成领域，尤其涉及一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法。

背景技术

近年来，基于木质纤维素资源和农业废弃物的生物炼制为石化资源短缺和日益凸显的环境问题提供了一条综合的解决方案。然而，传统的生物炼制以及造纸行业每年会产生超过3亿吨的木质素废弃物，其中，超过98％的木质素废弃物被用作燃烧产热，这一过程造成了资源的大量浪费以及严重的环境污染。随着利用木质纤维素来生产生物乙醇的生物炼制过程的快速发展，到2030年后每年将多产生超过2.2亿吨的木质素废弃物，这成为了当下生物炼制发展的最大挑战。另一方面，占据木质纤维素15％-30％量的木质素是最大的天然芳香化合物资源，最近，对于这类可再生资源的利用受到越来越多的关注。阿魏酸和对香豆酸是木质素中含量最大芳香单体，可以简单的通过热化学解聚或者酶解木质素得到。因此，为了发展更加可持续和具有竞争力的生物炼制，开发将这些易获取的木质素来源的酚酸转化为高价值芳香化合物的绿色技术显得极为关键。阿魏酸是生物法合成香兰素的主要原料，而对香豆酸可以用于四乙烯基苯酚的制备。香兰素具有“香料皇后”的美誉，被广泛的应用于食品、香精香料、饮料及医药领域，其年需求量高达16,000吨。同时，香兰素也越来越多的用于热固树脂和热固塑料的合成。四乙烯基苯酚可以用于聚合材料的生产，应用于光电导管和半导体制造领域。然而，包括香兰素在内这些高价值芳香化合物在植物中的含量非常低，同时，分离和提取过程复杂，使得它们的产量不能满足日益增长的需求量。化学合成法依赖于石油化工产品和能源，并会对生态环境造成一定危害。基于这些原因，利用阿魏酸等木质素来源的羧酸通过生物法生产香兰素等高价值芳香化合物是一条理想的途径。

温和的反应条件、快速高效的生产过程和清洁无污染等优势使得微生物发酵生产高价值芳香化合物成为了最具潜力的合成方法。以香兰素为例，包括链霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌和大肠杆菌在内的多种微生物可以转化阿魏酸生成香兰素。尽管如此，负责这类芳香羧酸转化的阿魏酰辅酶A合酶依赖于ATP和辅酶A，因此，对于ATP和辅酶A的需求严重限制了阿魏酸等木质素来源的酚酸的利用效率。Lee等人尝试通过在大肠杆菌中构建辅酶A循环***来提高阿魏酸的转化效率，然而能源的需求仍然限制了该途径。最近，Furuya等人发现了一个辅酶A不依赖的脱羧酶可以将四乙烯基愈创木酚转化为香兰素，但是该酶对碱性环境的依赖使得其不能与将阿魏酸转化为四乙烯基愈创木酚的酚酸脱羧酶配合使用，需要进行两步法反应才能得到香兰素。这其中，对于酸碱性条件的更换和两种休止细胞的制备等繁琐过程影响了该方法的应用。同时，这个辅酶A不依赖的脱羧酶的活性很低，使得香兰素的生产效率低下，不能满足商业化的需求。因此，需要构建新的生物转化体系，可以在不依赖辅因子的条件下将阿魏酸和对香豆酸等木质素来源的酚酸一步高效转化为高价值芳香化合物。然而，目前并未有不依赖辅因子的这种生物催化剂的报道。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有生物催化体系对辅因子的依赖，该依赖严重降低了生物转化的效率，同时解决不依赖辅因子需要切换酸碱环境和制备多种休止的细胞的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香化合物的催化合成是以木质素来源的羧酸为底物，所述全细胞为转入芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad的重组大肠杆菌，所述香酚单加氧酶基因来源于Thermothelomyces thermophila，蛋白序列为SEQ ID NO.1，所述酚酸脱羧酶基因来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，蛋白序列为SEQ ID NO.2，所述全细胞催化合成不依赖于辅因子，具体包括如下步骤：

第一步：重组质粒的构建，将芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad连接入大肠杆菌表达质粒中，

第二步：基因工程菌的构建，将重组质粒转入大肠杆菌中，筛选并验证阳性大肠杆菌重组菌株；

第三步：全细胞催化液反应液制备，活化并诱导细胞表达芳香酚单加氧酶和酚酸脱羧酶，离心后用的NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液重悬菌体，获得全细胞催化反应液；

第四步：以木质素来源的羧酸为底物，以全细胞催化剂生产芳香化合物；

进一步地，所述第一步大肠杆菌表达质粒为pETDuet-pad，所述第一步中构建的重组质粒为pETDuet-amp-pad。

进一步地，所述以木质素来源的羧酸为阿魏酸或对香豆酸，所述芳香化合物对应为香兰素或4-乙烯基苯酚。

进一步地，将第三步中用NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液重悬菌体至OD₆₀₀＝300。

进一步地，所述芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad根据大肠杆菌密码子的偏好性，使用JCat在线软件进行优化，所述优化后的序列分别为SEQ ID NO.3何SEQ IDNO.4。

进一步地，所述第二步中的验证是通过酶切或PCR或测序验证的。

进一步地，所述第三步中NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液的pH为9.5。

进一步地，所述具体步骤还包括用GC-MS鉴定样品芳香化合物的纯度和结构。

进一步地，所述第四步具体包括：向全细胞催化反应液中加入终浓度为100mM的阿魏酸或对香豆酸，45-75℃搅拌16-20h，用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，离心后得到的上层液体含有的产物分别为香兰素和4-乙烯基苯酚。

在本发明的一个较佳实施例中，离心的转速为5000rpm，离心时间为15min，搅拌温度为50℃。

本发明还提供了按照上述任意一项所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法合成的芳香化合物。

本发明的实质性特点体现为，通过本发明的技术方案可以实现不依赖辅因子生物催化木质素来源酚酸合成高价值芳香化合物，高活性的芳香酚单加氧酶是最直接的原因。

本发明提供了一种利用不依赖辅因子的全细胞催化剂制备高价值芳香化合物的技术。本发明所述的应用方法避免了辅因子的依赖，因而可以利用构建的全细胞催化剂转化木质素源的酚酸来高效合成多种高价值芳香化合物，极大的提高了生产效率，获得的香兰素产量超过了目前全细胞催化体系所能获得的最大产量，具有重要的现实意义和工业应用价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明实施例5利用全细胞催化剂转化阿魏酸和对香豆酸过程中香兰素和4-乙烯基苯酚浓度随时间的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

重组质粒和重组大肠杆菌的构建

本实施例中所用的培养基的组成如下：

LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。

LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。

(1)合成芳香酚单加氧酶基因(amp)和酚酸脱羧酶基因(pad)片段：

依据大肠杆菌的密码子偏好性，利用JCat在线软件对Thermothelomycesthermophila中芳香酚单加氧酶的编码基因amp和Bacillus coagulans中酚酸脱羧酶的编码基因pad的序列进行密码子优化，并提交金开瑞公司(GeneCreate BiologicalEngineering Co.,Ltd.)进行基因合成。

利用PCR技术，以合成的amp基因和pad基因为模板，扩增得到含有酶切位点的芳香酚单加氧酶基因和酚酸脱羧酶基因；

PCR引物：amp基因上游引物amp-F：5′-catgggatccgctcacatccacgacctg-3′，下游引物amp-R：5′-catggcggccgcttaaacaccgttagaaccgttctg-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是BamHI和NotI的酶切位点。pad基因上游引物pad-F：5′-catgcatatgatgaaaaccctggaagaattcctg-3′，下游引物pad-R：5′-catgctcgagttaagagaatttcagtttaccagaacg-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是NdeI和XhoI的酶切位点。

将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收。

(2)将含有pETDuet-1质粒的大肠杆菌Trans1-T1按照1％接种量，接种至5mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中培养10h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。

利用内切酶分别对步骤(1)中得到的amp基因片段和pETDuet-1质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为BamHI和NotI；将酶切后的amp基因片段和pETDuet-1质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收。

(3)将步骤(2)中回收的amp基因片段和质粒用T4 DNA连接酶(购买自New EnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pETDuet-amp。

(4)将步骤(1)中得到的pad基因片段和步骤(3)中得到的pETDuet-pad质粒分别利用NEB的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切。将酶切后的pad基因片段和pETDuet-amp质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行回收。

(5)将步骤(4)中回收的pad基因片段和质粒用T4 DNA连接酶(购买自New EnglandBiolabs公司)进行连接，反应时间为10h，获得连接后的重组质粒pETDuet-amp-pad。

(6)将5μL步骤(5)中得到重组质粒pETDuet-amp-pad通过热激的方法转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。将热激后的菌液涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养12小时。在平板上挑取单菌落至5mL LB液体培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)中，30℃摇床中培养，摇床转速为200转/分钟；将培养后的菌液进行PCR扩增验证，获得基因工程菌株。

(7)基因工程大肠杆菌的保存：将步骤(6)获得的基因工程大肠杆菌接种于含有100mg/L氨苄霉素的LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡培养过夜，摇床转速为200转/分钟；在无菌操作下，取过夜培养物1mL加入到灭菌的1.5mL离心管中，5000转/分钟离心3min。丢弃上清，用灭菌的15％甘油溶液将菌体沉淀重悬，制备成为甘油保藏管，于-20℃冰箱中可保存半年至一年。每隔半年，取出甘油保藏管中保存的基因工程大肠杆菌进行活化，并重新保存甘油保藏管。

实施例2

全细胞催化剂制备

本实施例中所用的培养基的组成如下：

本实施例的全细胞催化剂的制备步骤如下：

(1)固体培养：将实施例1中的基因工程大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素的LB固体培养基斜面上(含有100mg/L氨苄青霉素)，37℃培养12-14小时；

(2)活化培养：将步骤(1)培养的基因工程菌株，用接种环接种到50mL LB液体培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)中进行菌株活化，37℃过夜培养；

(3)蛋白诱导表达：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到5L LB液体培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)中，37℃，200rpm，培养3-5小时至OD600达到0.6-0.8，加入0.2mM IPTG和1mM FeCl2，16℃，200rpm，诱导培养12h；

(4)全细胞催化剂：收集步骤(3)所得的培养液，离心15分钟收集菌体，离心条件为4℃，3500rpm，随后用磷酸盐缓冲液将菌体洗涤2次后，用pH9.5的NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液重悬菌体至OD600＝300，获得全细胞催化剂；

实施例3

全细胞催化剂转化阿魏酸生产香兰素

(1)在实施例2所得的全细胞催化剂中添加阿魏酸至终浓度为100mM进行催化反应，反应条件为50℃，搅拌转速为200rpm，18h；

(2)香兰素的提取：将步骤(1)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的产物即为香兰素；

(3)样品检测：将步骤(2)制得的产物，用GC-MS鉴定样品结构，鉴定结果为香兰素。用GC检测，香兰素的最高产量为13.3g/L，产率为0.74g/L/h。

GC方法使用Agilent 7890A气相色谱仪，色谱柱为30-m HP-5毛细管柱(30m×0.320mm×0.25μm)，进样器和检测器的温度均为280℃。柱温箱温度在140℃维持2分钟，之后以15℃/分钟的速度升温至220℃，在该温度下停留2分钟。GC–MS分析利用Agilent 6850/5975C GC-MS***。

实施例4

全细胞催化剂转化对香豆酸生产4-乙烯基苯酚

(1)在实施例2所得的全细胞催化剂中添加对香豆酸至终浓度为100mM进行催化反应，反应条件为50℃，搅拌转速为200rpm，2h；

(2)四乙烯基苯酚的提取：将步骤(1)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后上层液体中含有的产物即为四乙烯基苯酚；

(3)样品检测：将步骤(2)制得的产物，用GC-MS鉴定样品结构，鉴定结果为4-乙烯基苯酚。用GC检测，4-乙烯基苯酚的最高产量为11.3g/L，产率为5.65g/L/h。

实施例5

全细胞催化剂同时转化阿魏酸和对香豆酸生产香兰素和4-乙烯基苯酚

(1)在实施例2所得的全细胞催化剂中添加100mM阿魏酸和180mM 4-乙烯基苯酚进行催化反应，反应条件为50℃，搅拌转速为200rpm，18h；

(2)香兰素和4-乙烯基苯酚的提取：将步骤(1)中制得的转化液分别用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后，上层液体即为含有香兰素和4-乙烯基苯酚的产物；

(3)样品检测：将步骤(2)制得的产物，分别用GC-MS鉴定样品结构，鉴定结果为香兰素和4-乙烯基苯酚。用GC检测，图1为转化培养中香兰素和4-乙烯基苯酚浓度随时间的变化图，香兰素的最高产量为13.3g/L，4-乙烯基苯酚最高产量为20.5g/L。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 603

<212> PRT

<213> 嗜热真菌(Thermothelomyces thermophila)

<400> 1

Met Ala His Ile His Asp Leu Ala Pro Glu Val Ser Asn Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Gly Arg Leu Thr Pro Pro Thr Pro Val Arg Phe Pro Arg Thr Pro Val

20 25 30

Phe Ala Ser Met Asn Lys Pro Cys Arg Phe Glu Gly Asp Val Phe Asp

35 40 45

Leu Glu Val Ser Gly Ala Ile Pro Pro Asp Ile Asp Gly Thr Phe Phe

50 55 60

Arg Val Gln Pro Asp His Arg Phe Pro Pro Leu Phe Glu Asp Asp Ile

65 70 75 80

His Phe Asn Gly Asp Gly Ser Val Thr Ala Ile Arg Ile Ser Gly Gly

85 90 95

His Ala Asp Leu Arg Gln Arg Tyr Val Arg Thr Glu Arg Tyr Leu Leu

100 105 110

Glu Thr Arg Ala Arg Arg Ser Leu Phe Gly Arg Tyr Arg Asn Pro Trp

115 120 125

Thr Asp Asn Glu Ser Val Arg Gly Val Ile Arg Thr Ala Ser Asn Thr

130 135 140

Asn Val Val Phe Trp Arg Gly Ala Leu Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly

145 150 155 160

Pro Pro Phe Ala Met Asp Pro Val Thr Leu Glu Thr Leu Gly Arg Tyr

165 170 175

Asp Phe Glu Gly Gln Ile Leu Ser Pro Thr Phe Thr Ala His Pro Lys

180 185 190

Ile Asp Pro Asp Thr Gly Glu Met Val Cys Phe Ala Tyr Glu Ala Gly

195 200 205

Gly Asp Gly Ser Asp Cys Ser Val Asp Val Ala Val Trp Thr Val Asp

210 215 220

Ala Asp Gly Lys Lys Val Glu Glu Cys Trp Tyr Lys Ala Pro Phe Ala

225 230 235 240

Gly Met Ile His Asp Cys Gly Ile Thr Lys Asn Trp Val Val Leu Pro

245 250 255

Leu Thr Pro Ile Lys Met Asp Leu Glu Arg Met Lys Arg Gly Gly Asn

260 265 270

Lys Phe Ala Trp Asp Pro Ser Glu Asp Gln Trp Tyr Gly Val Val Pro

275 280 285

Arg Arg Gly Ala Lys Ser Asp Asp Ile Ile Trp Phe Arg Ala Asp Asn

290 295 300

Gly Phe His Gly His Val Ala Gly Cys Tyr Glu Leu Pro Ser Gly Glu

305 310 315 320

Ile Val Phe Asp Leu Thr Val Ala Asp Gly Asn Val Phe Phe Phe Phe

325 330 335

Pro Pro Asp Asp Asn Ile Thr Pro Pro Ala Asp Gly Val Ala Lys Arg

340 345 350

Asn Arg Leu Ser Ser Pro Thr Val Arg Trp Ile Phe Asp Pro Lys Ala

355 360 365

Lys Lys Ser Ala Ile Arg Thr Glu Ala Ala Gly Asp Ala Asp Ile Trp

370 375 380

Val Ala Asp Glu Arg Val Lys Pro Ala Leu Thr Trp Pro Thr Asn Gly

385 390 395 400

Glu Phe Ser Arg Ile Asp Asp Arg Tyr Val Thr Lys Pro Tyr Arg His

405 410 415

Phe Trp Gln Ala Val Val Asp Pro Thr Arg Pro Tyr Asp Phe Glu Lys

420 425 430

Cys Gly Pro Pro Ala Gly Gly Leu Phe Asn Cys Leu Gly His Tyr Thr

435 440 445

Trp Ser Asp Gln Asn Tyr His His Gly His Asn Thr Gly Asp Pro Ser

450 455 460

Gly Asp Gly Arg Ser Asn Gly Ser Ala Glu Glu Ala Thr Ala Gly Lys

465 470 475 480

Phe Gly Leu Gln Asp Val Tyr Phe Ala Gly Pro Thr Met Thr Phe Gln

485 490 495

Glu Pro Thr Phe Ile Pro Arg Gln Gly Ala Ala Glu Gly Glu Gly Tyr

500 505 510

Leu Ile Ala Leu Leu Asn His Leu Asp Glu Leu Arg Asn Asp Val Val

515 520 525

Ile Phe Glu Ala Arg Asn Leu Gly Lys Gly Pro Leu Ala Val Ile His

530 535 540

Leu Pro Leu Lys Leu Lys Leu Gly Leu His Gly Asn Trp Val Asp Ser

545 550 555 560

Arg Glu Ile Glu Ala Trp Arg Arg Arg Arg Ala Glu Asn Gly Asp Val

565 570 575

Gly Pro Leu Arg Val Ala Lys Glu Pro Leu Pro Trp Gln Lys Lys Phe

580 585 590

Ala Ala Ala Ala Gln Asn Gly Ser Asn Gly Val

595 600

<210> 2

<211> 167

<212> PRT

<213> 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)

<400> 2

Met Lys Thr Leu Glu Glu Phe Leu Gly Thr His Met Ile Tyr Thr Tyr

1 5 10 15

Glu Asn Gly Trp Glu Tyr Glu Phe Tyr Val Lys Asn Gln Asn Thr Val

20 25 30

Asp Tyr Arg Ile His Ser Gly Met Val Gly Gly Arg Trp Val Arg Gly

35 40 45

Gln Lys Ala Asp Ile Val Lys Ile Thr Asp Gly Val Phe Lys Val Ser

50 55 60

Trp Thr Glu Pro Thr Gly Thr Asp Val Ser Leu Asn Phe Met Pro Asp

65 70 75 80

Asp Lys Arg Met His Gly Val Ile Phe Phe Pro Lys Trp Val His Glu

85 90 95

His Pro Glu Ile Thr Val Cys Tyr Gln Asn Asp His Ile Asp Leu Met

100 105 110

Glu Glu Ser Arg Glu Lys Tyr Glu Thr Tyr Pro Lys Tyr Val Val Pro

115 120 125

Glu Phe Ala Asp Ile Thr Tyr Ile Lys Asn Glu Gly Ile Asn Asn Glu

130 135 140

Lys Val Ile Ser Glu Ala Pro Tyr Ala Thr Met Ala Asp Asp Ile Arg

145 150 155 160

Ser Gly Lys Leu Lys Phe Ser

165

<210> 3

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctcaca tccacgacct ggcgccggaa gtaagcaact actcttctgg tcgcctgacc 60

ccgccgaccc cagttaggtt cccgcgcacc ccagtgttcg catctatgaa caaaccgtgc 120

cgcttcgaag gtgacgtttt cgacctggaa gtttctggtg ctatcccgcc ggacatcgac 180

ggtaccttct tccgcgttca gccggaccac cgcttcccgc cgctgttcga agacgacatc 240

cacttcaacg gtgacggttc tgttaccgct atccgcatct ctggtggtca cgctgacctg 300

cgccagcgct acgttcgcac cgaacgctac ctgctggaaa cccgcgctcg ccgctctctg 360

ttcggtcgct accgcaaccc gtggaccgac aacgaatctg ttcgcggtgt tatccgcacc 420

gcttctaaca ccaacgttgt tttctggcgc ggtgctctgc tggctatgaa agaagacggt 480

ccgccgttcg ctatggaccc ggttaccctg gaaaccctgg gtcgctacga cttcgaaggt 540

cagatcctgt ctccgacctt caccgctcac ccgaaaatcg acccggacac cggtgaaatg 600

gtttgcttcg cttacgaagc tggtggtgac ggttctgact gctctgttga cgttgctgtt 660

tggaccgttg acgctgacgg taaaaaagtt gaagaatgct ggtacaaagc tccgttcgct 720

ggtatgatcc acgactgcgg tatcaccaaa aactgggttg ttctgccgct gaccccgatc 780

aaaatggacc tggaacgcat gaaacgcggt ggtaacaaat tcgcttggga cccgtctgaa 840

gaccagtggt acggtgttgt tccgcgccgc ggtgctaaat ctgacgacat catctggttc 900

cgcgctgaca acggcttcca cggtcacgtt gctggttgct acgaactgcc gtctggtgaa 960

atcgttttcg acctgacagt tgcggacggc aacgtcttct tcttcttccc gccggacgac 1020

aacatcaccc cgccggctga cggtgttgct aaacgcaacc gcctgtcttc tccgaccgtt 1080

cgctggatct tcgacccgaa agctaaaaaa tctgctatcc gcaccgaagc tgctggtgac 1140

gctgacatct gggttgctga cgaacgcgtt aaaccggctc tgacctggcc gaccaacggt 1200

gaattctctc gcatcgacga ccgctacgtt accaaaccgt accgccactt ctggcaggct 1260

gttgttgacc cgacccgccc gtacgacttc gaaaaatgcg gtccgccggc tggtggtctg 1320

ttcaactgcc tgggtcacta cacctggtct gaccagaact accaccacgg tcacaacacc 1380

ggtgacccgt ctggtgacgg tcgctctaac ggttctgctg aagaagctac cgctggtaaa 1440

ttcggcctgc aggacgtata cttcgccggt ccgaccatga ccttccagga accgaccttc 1500

atcccgcgcc agggtgctgc tgaaggtgaa ggttacctga tcgctctgct gaaccacctg 1560

gacgaactgc gcaacgacgt tgttatcttc gaagctcgca acctgggtaa aggtccgctg 1620

gctgttatcc acctgccgct gaaactgaaa ctgggtctgc acggtaactg ggttgactct 1680

cgcgaaatcg aagcttggcg ccgccgccgc gctgaaaacg gtgacgttgg tccgctgcgc 1740

gttgctaaag aaccgctgcc gtggcagaaa aaattcgctg ctgctgctca gaacggttct 1800

aacggtgttt aa 1812

<210> 4

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaaccc tggaagaatt cctgggtacc cacatgatct acacctacga aaacggttgg 60

gaatacgaat tctacgttaa aaaccagaac accgttgact accgtatcca ctctggtatg 120

gttggtggtc gttgggttcg tggtcagaaa gctgacatcg ttaaaatcac agacggtgtg 180

ttcaaagtgt cttggaccga accgaccggt accgacgttt ctctgaactt catgccggac 240

gacaaacgta tgcacggtgt tatcttcttc ccgaaatggg ttcacgaaca cccggaaatc 300

accgtttgct accagaacga ccacatcgac ctgatggaag aatctcgtga aaaatacgaa 360

acctacccga aatacgttgt tccggaattc gctgacatca cctacatcaa aaacgaaggt 420

atcaacaacg aaaaagttat ctctgaagct ccgtacgcta ccatggctga cgacatccgt 480

tctggtaaac tgaaattctc ttaa 504

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgggatcc gctcacatcc acgacctg 28

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> catgggatcc gctcacatcc acgacctg

<400> 6

catggcggcc gcttaaacac cgttagaacc gttctg 36

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catgcatatg atgaaaaccc tggaagaatt cctg 34

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catgctcgag ttaagagaat ttcagtttac cagaacg 37

Claims

1.一种不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香化合物的催化合成是以木质素来源的阿魏酸为底物，所述芳香化合物为香兰素；所述全细胞为转入芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad的重组大肠杆菌，所述香酚单加氧酶基因amp来源于Thermothelomyces thermophila，蛋白序列为SEQ ID NO.1，所述酚酸脱羧酶基因pad来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，蛋白序列为SEQ ID NO.2，具体包括如下步骤：

第四步：以木质素来源的所述阿魏酸为底物，以全细胞催化剂生产所述芳香化合物香兰素。

2.如权利要求1所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述芳香酚单加氧酶基因amp和酚酸脱羧酶基因pad根据大肠杆菌密码子的偏好性进行优化，所述优化后的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

3.如权利要求1所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述第三步中NaHCO₃/Na₂CO₃碱性缓冲液的pH为9.5。

4.如权利要求1所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述第四步具体包括：向全细胞催化反应液中加入终浓度为100mM的所述阿魏酸，45-50℃搅拌16-20h，用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，离心后得到的上层液体含有的产物为所述香兰素。

5.如权利要求4所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述离心的转速为5000rpm，离心时间为15min，搅拌温度为50℃。

6.一种按照权利要求1-5任意一项所述的不依赖辅因子的全细胞催化合成芳香化合物的方法在合成芳香化合物香兰素中的应用。