CN108707679B

CN108707679B - 基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法

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Publication number: CN108707679B
Application number: CN201810348990.6A
Authority: CN
Inventors: 刘柱; 唐燕琼; 马香; 唐鸿倩; 胡新文; 杜明伦
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-04-18
Also published as: CN108707679A

Abstract

本发明涉及用于检测维氏气单胞菌的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列，所述引物对的反向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2或由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列。本发明还涉及包含所述引物对或引物对组合的试剂、试剂盒及其在检测维氏气单胞菌中的应用。本发明还涉及开发用于检测维氏气单胞菌的引物的方法。

Description

基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法

技术领域

本发明涉及一种基于特异性序列的维氏气单胞菌的检测引物、包含该引物的试剂、试剂盒、维氏气单胞菌的检测方法以及开发维氏气单胞菌的检测引物的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)又被称为维罗纳气单胞菌、维隆气单胞菌、凡隆气单胞菌，是一种革兰氏阴性杆状细菌，属无芽孢兼性厌氧型。该菌散在分布，普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，两端钝圆，大小约为0.3-0.7μm×1.2-2.5μm，具鞭毛，能运动(Kirov SM,Tassell BC,Semmler AB,O'Donovan LA,Rabaan AA等.“Lateral flagellaand swarming motility in Aeromonas species”[J].J Bacteriol.2002,184(2):547-555)。

维氏气单胞菌属于强毒病原菌，致病过程主要包括黏附-侵袭-宿主体内定殖以及毒素分泌等过程，期间产生一系列毒力因子，如气溶素(aerolysin)、肠毒素(enterotoxin)和粘附因子(adherence factor)等，这些毒力因子在水产动物、人类甚至畜禽感染中起着举足轻重的作用(袁旦一,汪开毓,陈德芳,黄凌远,王均等.“维氏气单胞菌在人工感染斑点叉尾鮰体内的组织定位和动态分布研究”[C].中国南方渔业论坛暨第二十九次学术会议论文集.广西北海,2013)。

该菌侵染宿主范围十分广泛。首先，该菌是已知最古老的鱼类病原菌之一，感染多种淡水鱼类、海水鱼类等，给水产养殖鱼类以及野生鱼类带来了严重威胁(Bossi-KüpferM,Genini A,Peduzzi R,Demarta A.“Tracheobronchitis caused by Aeromonas veroniibiovar sobria after near-drowning”[J].J Med Microbiol.2007,56(Pt 11):1563-1564)。例如，草鱼感染维氏气单胞菌时局部出血、有腹水、脾脏肿大等症状(王浩,权可艳,徐丽娟,李梦影,吕利群.“恩诺沙星控制草鱼维氏气单胞菌的用药方案”[J].淡水渔业,2013,43(2):47-53)。

同时，维氏气单胞菌还可以感染节肢动物和爬行类动物，如中华绒螯蟹(房海,陈翠珍,张晓君,巩元芳,葛幕湘.“中华绒螯蟹病原维氏气单胞菌的检验”[J].中国***共患病学报.2008,24(1):45-49)、中华鳖(钱明明.“中华鳖群体死亡症病原菌的分离鉴定及其预防的研究”[D].河北师范大学.硕士论文,2010)等。此外，该菌也能导致小鼠和正常人及免疫功能低下人群感染性并发症，引起包括关节炎、伤口感染、肠胃炎、菌血症、脑膜炎和心内膜炎等在内的多种感染病症(Lye DJ.“Gastrointestinal colonization rates forhuman clinical isolates of Aeromonas veronii using a mouse model”[J].CurrMicrobiol.2011,63(4):332-336)。

近年来，日益增多的病例表明，维氏气单胞菌已成为一种重要的人-鱼共患致病菌，其分布广泛，致病性较强，并在食品安全方面占据举足轻重的地位，部分国家已经将其规定为食品安全的检疫对象(吴同垒,单晓枫,孟庆峰,郭伟生,王伟利,钱爱东等.“维氏气单胞菌研究进展”[J].中国兽药杂志,2011(07):41-44)。

目前，维氏气单胞菌的鉴定和检测方法主要依靠根据细菌的营养需求和代谢产物的不同而设计的常规生理生化检测，但是该方法费时费力，且结果不可靠(LamyB,LaurentF,Verdier L等.“Accuracy of 6 Commercial Systems forIdentifying ClinicalAeromonas Isolates”[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2010,67:9-14)。也有依赖表观病理观察和细菌分离鉴定等一般细菌学方法来检测维氏气单胞菌的，但维氏气单胞菌引发疾病的病理现象与其他气单胞菌极为相似，很难肉眼判定，而常规的细菌分离鉴定又耗时耗力。此外，也可应用分子生物学和免疫学方法。分子生物学方法基于特定保守序列，如16s rDNA(Chacón M R,Castro-Escarpulli G,Soler L等.“A DNAProbe Specific for Aeromonas Colonies”[J].Diagnostic Microbiology andInfectious Disease,2002,44:221-225)或16S-23S rRNA的基因间隔区(ISR)(LaganowskaM,Kaznowski A.“Restriction Fragment Length Polymorphism of 16S-23S rDNAIntergenic Spacer of Aeromonas spp”[J].System ApplMicrobiol,2004,27:549-557)的长度和序列变化进行细菌的鉴别和分类，但是该方法使用的一般探针假阳性率偏高、价格昂贵。

另外，维氏气单胞菌的ISR种类较多，不利于检测，也有研究表明维氏气单胞菌的ISR相似性很高(LAGANOWSKA M,KAZNOWSKI A.“Restriction fragment lengthpolymorphism of 16S-23SrDNA intergenic spacer of aeromonasspp”[J]Syst ApplMicrobiol,2004,27(5):549－557)，分歧尚未统一。

可见，维氏气单胞菌的分子生物学鉴定方法尚不成熟。免疫学方法，即通过特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细菌特异的抗原性蛋白质，也研究不足，尚未鉴定出能够特异鉴定维氏气单胞菌的大量抗原(Arora S,Agarwal R K,Bist B.“Comparison of ELISAand PCR vis-à-vis Cultural Methods for Detecting Aeromonas spp.in FoodsofAnimal Origin”[J].International Journal of Food Microbiology,2006,106:177-183)

因此，总体而言，维氏气单胞菌的检测方法仍处于滞后阶段，以致于水产动物特别是人类感染致病菌时经常发生误诊，往往引起严重的后果——养殖水产动物大量死亡和病人病情持续甚至死亡。

因此，发展一种能够快速、简便地检测维氏气单胞菌的方法，是今后对维氏气单胞菌引起的疾病开展预防和治疗的关键和重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种维氏气单胞菌的检测引物对，该引物对特异性强、灵敏度高，能够快速、准确地检测维氏气单胞菌。

本发明的另一个目的是提供一种检测维氏气单胞菌的试剂或试剂盒，其灵敏度高、快速、简便、成本低。

本发明的另一个目的是提供一种检测维氏气单胞菌的方法，该方法使用本发明的上述引物对、试剂或试剂盒，可以快速、方便、准确地鉴定维氏气单胞菌的存在。

或者，本发明另一目的是提供本发明上述引物对、试剂或试剂盒在制备用于检测维氏气单胞菌的存在的检测剂中的用途，从而可以快速、方便、准确地鉴定维氏气单胞菌的存在。

本发明的再一个目的是提供一种开发用于检测维氏气单胞菌的引物的方法，从而提供特异性强、灵敏度高，能够快速、准确地检测维氏气单胞菌的引物。

本发明的第一方面提供了用于检测维氏气单胞菌的引物对，其中：

(1)所述引物对的正向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列；以及

(2)所述引物对的反向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2或由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明所述的引物对是ANB69580.1引物对，其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一个实施方案中，上述引物对中的一条引物被可检测地标记。标记方法是本领域熟知的。所述标记包括本领域常用的那些，例如，所述标记包括但不限于放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质或生物素等。优选地，所述标记是荧光标记，更优选地，所述荧光标记包括但不限于FAM、HEX、TAMRA、ROX等荧光染料。在另外的实施方案中，所述引物对中的正向引物被标记，或者所述引物对中的反向引物被标记。在另一个实施方案中，所述引物可经本领域技术人员已知的任意修饰手段进行修饰而发生变化，从而提高所述引物的特异性和/或方便所述引物的检测。

本发明的第二方面提供了用于检测维氏气单胞菌的试剂，所述试剂包含本发明上文所述的任意引物。在一个实施方案中，本发明的试剂中包含的每一对引物被单独包装。

本发明的第三方面提供了用于检测维氏气单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含本发明上文所述的任意引物或试剂。

在一个实施方案中，本发明所述的试剂盒还包含至少一种荧光探针，例如TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标。在一个优选的实施方案中，所述荧光探针是基于SEQ ID NO.3，在本发明所述的引物之间设计的TaqMan探针。设计TaqMan探针的方法是本领域技术人员已知的。

在进一步的实施方案中，所述TaqMan探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团，如TAMRA等。

在一个实施方案中，本发明所述的试剂盒还包含2×PCR master Mix、阳性对照以及10×PCR菌落增强剂。在一个实施方案中，所述阳性对照包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。优选地，所述阳性对照是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明的第四方面提供了使用本发明所述的任意引物对、试剂或试剂盒检测维氏气单胞菌的方法。或者，本发明的第四方面提供了本发明所述的任意引物对、试剂或试剂盒在制备用于检测维氏气单胞菌的检测剂中的用途。

在一个实施方案中，检测维氏气单胞菌包括以下步骤：

a.以待检测样本基因组DNA或单菌落为PCR模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带判定为阳性，其中所述阳性对照是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

在进一步的实施方案中，本发明的上述方法还包括以下步骤：

b.回收阳性扩增产物，进行测序分析，并与SEQ ID NO.3所示序列进行比对；和

c.基于比对结果，将序列同源性达99％以上(例如99％、99.5％、100％或其间的任何数值)的检测样本判定为维氏气单胞菌阳性，即，检测到维氏气单胞菌的存在。

在进一步的实施方案中，所述所述步骤a中的PCR反应体系为：

待检测样品DNA(200ng/ul)：1μl；

正反向引物(10μM)：各1μl；

2×PCR master Mix：25μl；

双蒸水：22μl；

总计50μl。

在进一步的实施方案中，所述阳性对照为包含SEQ ID NO.3所示的核酸序列的阳性对照物或由SEQ ID NO.3所示的核酸序列组成，或者所述阳性对照为经鉴定的野生型维氏气单胞菌。

在进一步的实施方案中，其中所述步骤a中的PCR扩增程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s；

58℃退火30s；

72℃延伸30s；

共25个循环；

72℃继续延伸7min。

在一个实施方案中，本发明所述的方法或用途是用于检测人类、小鼠、畜禽、节肢动物、爬行类动物(例如中华绒螯蟹、中华鳖等)、水产动物等物种中维氏气单胞菌的存在，尤其是用于检测水产动物等物种(例如罗非鱼、泥鳅、锦鲤、斑点叉尾鮰等)中维氏气单胞菌的存在，特别用于检测菌物混合物中维氏气单胞菌的存在。

在进一步的实施方案中，本发明所述的方法或用途是用于检测维氏气单胞菌菌株CB51、B565、AVNIH1或TH0426中的一种或多种。优选地，本发明所述的方法或用途是用于检测维氏气单胞菌菌株CB51。

本发明的第五方面提供了一种开发用于检测维氏气单胞菌的引物的方法，所述方法包括下述步骤：

1)用生物信息学手段，通过编写python程序脚本，分析NCBI中收录的所有蛋白质序列，从而获得维氏气单胞菌特异性核苷酸序列；

2)基于步骤1)中得到的维氏气单胞菌特异性核苷酸序列，针对各段特异性序列分别设计至少一对引物；和

3)利用步骤2)中设计得到的引物，针对维氏气单胞菌基因组DNA进行PCR扩增，从中筛选出能够特异性扩增维氏气单胞菌特异性序列的引物。

在一个实施方案中，所述方法还包括步骤4)：通过测序确定目标PCR产物的核酸序列。

在一个实施方案中，上述步骤1)包括如下步骤(参考图1)：

(a)从NCBI数据库获得数据子集1和数据子集2，其中所述数据子集1包括NCBI数据库收录的气单胞属(属的水平)所有蛋白序列，但不包括维氏气单胞菌(种的水平)的任何蛋白序列，所述数据子集2包括NCBI数据库收录的维氏气单胞菌(种的水平)的所有蛋白序列；并将数据子集1和数据子集2中的序列进行Blast比对，从而得到序列子集A和序列子集a(这相当于在属的水平筛选种特异性的蛋白序列)，其中所述序列子集A由数据子集2中不能与数据子集1匹配的序列组成，所述序列子集a由数据子集2中能够与数据子集1匹配的序列组成；

(b)从NCBI数据库获得数据子集3，其中所述数据子集3包括NCBI数据库收录的所有物种的蛋白序列，但不包括维氏气单胞菌属(属的水平)的任何蛋白序列；并将所述序列子集A与数据子集3中的序列进行Blast比对，从而得到序列子集B和序列子集b(这相当于在所有物种水平筛选维氏气单胞菌物种的特异性蛋白序列)，其中所述序列子集B由序列子集A中不能与数据子集3匹配的序列组成，所述序列子集b由序列子集A中能够与数据子集3匹配的序列组成；

(c1)当序列子集B中序列的数目不为零时，将序列子集B中的序列转换为核酸序列，从而产生序列子集B’，并将序列子集B’中的所有核酸序列与NCBI数据库收录的所有物种的核酸序列进行Blast比对(这相当于在物种水平筛选维氏气单胞菌物种特异性的核酸序列)，从而筛选出维氏气单胞菌(物种水平)特异性的蛋白序列X1；或

(c2)当序列子集B中序列的数目为零时，则从NCBI数据库获得数据子集4，所述数据子集4包括NCBI数据库收录的气单胞科(科的水平)所有蛋白序列，但不包括维氏气单胞菌属(属的水平)的任何蛋白序列；并将所述序列子集a与数据子集3中的序列进行Blast比对，从而得到序列子集C和序列子集c(这相当于在科水平筛选维氏气单胞菌属的特异性蛋白序列)，其中所述序列子集C由序列子集a中不能与数据子集4匹配的序列组成，所述序列子集c由序列子集a中能够与数据子集4匹配的序列组成；

(d2)从NCBI数据库获得数据子集5，其中所述数据子集5包括NCBI数据库收录的所有物种的蛋白序列，但不包括维氏气单胞菌科(科的水平)的任何蛋白序列；并将所述序列子集C与数据子集5中的序列进行Blast比对，从而得到序列子集D和序列子集d(这相当于在所有物种水平筛选维氏气单胞菌属的特异性蛋白序列)，其中所述序列子集D由序列子集C中不能与数据子集5匹配的序列组成，所述序列子集d由序列子集C中能够与数据子集5匹配的序列组成；

(e2)当序列子集D中序列的数目不为零时，将序列子集D中的序列转换为核酸序列，从而产生序列子集D’，并将序列子集D’中的所有核酸序列与NCBI数据库收录的所有物种的核酸序列进行Blast比对(这相当于在属水平筛选维氏气单胞菌物种特异性的核酸序列)，从而筛选出维氏气单胞菌属特异性的蛋白序列X2；或

(e3)当序列子集D中序列的数目为零时，则进入第三轮循环，依照前述思路设定相应的数据子集，逐一启动在目的水平筛选科的特异性的蛋白序列、在纲的水平筛选目的特异性蛋白、在门的水平筛选纲的特异性蛋白序列，并各自在所有物种水平进行进一步筛选，最终筛选出科、目、纲、或者门特异性的蛋白序列X3、X4、X5或者X6。

经过上述的完整循环，最佳的情况就是通过第一轮循环即可筛选出维氏气单胞菌物种特异性的蛋白序列X1；最复杂的情况就是通过种、属、科、目、纲、门六轮循环后筛选到X1-X6共六段代表不同分类水平的特异性序列，共同组合用于鉴定维氏气单胞菌的存在。在本发明中，发明人通过第一轮循环幸运地筛选到了维氏气单胞菌物种特异性的蛋白序列X1。

在一个实施方案中，上述步骤1)还包括将获得的维氏气单胞菌(物种水平)特异性的蛋白序列与NCBI核酸数据库中的序列进行TBLASTn(protein→nucleotide，即将库中的核酸序列翻译成蛋白质序列，再同所查序列作蛋白与蛋白的比对)比对，从而进一步确定得到的蛋白序列是特异性存在于维氏气单胞菌中的。进一步地，所述步骤1)还包括选取Blast检测获得的匹配度为100％的一段核酸序列作为维氏气单胞菌(物种水平)特异性的核酸序列。

在一个实施方案中，上述步骤2)包括采用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件进行引物设计。

在一个实施方案中，上述步骤3)中的PCR反应体系还包含作为阴性对照的其它细菌的基因组DNA。进一步地，所述其它细菌选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或其任意组合。

在优选的实施方案中，本发明所述的方法筛选得到了SEQ ID NO.4所示的维氏气单胞菌(物种水平)特异性的蛋白质序列或SEQ ID NO.3所示的维氏气单胞菌(物种水平)特异性的核酸序列，所述蛋白质和核酸序列特征如下表1所示。

表1.维氏气单胞菌特异性蛋白质及其对应的核酸序列的特征

更优选地，本发明所述的方法获得了由SEQ ID NO.1-2所示的引物序列，所述引物序列信息如下表2所示。

表2.由SEQ ID NO.1-2所示的引物序列信息

在一个实施方案中，由引物ANB69580.1F和ANB69580.1R进行PCR反应得到的产物具有如SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

在本发明中，除非上下文另有说明，否则术语“引物”和“引物对”可互换使用。术语“维菌”和“维氏气单胞菌”可以互换使用，均指拉丁名为Aeromonas veronii的维氏气单胞菌细菌。

前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详细说明，进一步的方面、实施方式和特征将更容易被理解。

附图说明

通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。

图1示出寻找维氏气单胞菌物种特异性序列的逻辑图。

图2示出本发明获得的维氏气单胞菌(物种水平)特异性的蛋白质序列SEQ IDNO.4在NCBI核酸数据库中进行TBLASTn比对的结果。

图3A示出ANB69580.1引物对的特异性PCR检测结果，其中，M：DNA Marker DL2000；1：枯草芽孢杆菌；2：副溶血弧菌；3：维氏气单胞菌；4：迟缓爱德华氏菌；5：溶藻弧菌；6：大肠杆菌；7：铜绿假单胞菌。

图3B示出16s rDNA通用引物对的特异性PCR检测结果，其中，M：DNA MarkerDL2000；1：枯草芽孢杆菌；2：副溶血弧菌；3：维氏气单胞菌；4：迟缓爱德华氏菌；5：溶藻弧菌；6：大肠杆菌；7：铜绿假单胞菌。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1.维氏气单胞菌物种水平特异性序列的挖掘

采用生物信息学手段，通过编写python程序脚本，依据图1所示流程，分析NCBI中收录的所有蛋白质序列。

图1所示流程包括以下步骤：

(e2)当序列子集D中序列的数目不为零时，将序列子集D中的序列转换为核酸序列，从而产生序列子集D’，并将序列子集D’中的所有核酸序列与NCBI数据库收录的所有物种的核酸序列进行Blast比对(这相当于在属水平筛选维氏气单胞菌物种特异性的核酸序列)，从而筛选出维氏气单胞菌属特异性的蛋白序列X2；或(e3)当序列子集D中序列的数目为零时，则进入第三轮循环，依照前述思路设定相应的数据子集，逐一启动在目的水平筛选科的特异性的蛋白序列、在纲的水平筛选目的特异性蛋白、在门的水平筛选纲的特异性蛋白序列，并各自在所有物种水平进行进一步筛选，最终筛选出科、目、纲、或者门特异性的蛋白序列X3、X4、X5或者X6。

经过上述的完整循环，最佳的情况就是通过第一轮循环即可筛选出维氏气单胞菌物种特异性的蛋白序列X1；最复杂的情况就是通过种、属、科、目、纲、门六轮循环后筛选到X1-X6共六段代表不同分类水平的特异性序列，共同组合用于鉴定维氏气单胞菌的存在。

在本实施例中，由于筛选到的序列子集B中包含由SEQ ID NO.4所示的蛋白质序列，即，序列子集B中序列的数目不为零，因此，上述分析过程仅涉及步骤(a)至(c1)。

将上述步骤(c1)获得的维氏气单胞菌(物种水平)特异性的蛋白序列与NCBI核酸数据库中的序列进行TBLASTn比对，进一步确定得到的蛋白序列是特异性存在于维氏气单胞菌中的，比对结果如图2所示。然后，选取Blast检测获得的匹配度为100％的一段核酸序列(如SEQ IDNO.3所示)作为维氏气单胞菌(物种水平)特异性的核酸序列。所述蛋白质和核酸序列特征如表1所示。

实施例2.试验材料、试验方法和设备

1.试验材料和设备

菌株：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)均由本实验室保存。

培养基及试剂：

细菌基因组DNA快速提取试剂盒(货号N1152)和PCR反应试剂购自广州东胜生物科技有限公司(Dongsheng Biotech Co.,Ltd)；

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖购于广东威佳生物有限公司；

1)LB液体培养基，含有以下物质：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、NaCl 0.5g、蒸馏水100mL，用10mol/L NaOH调pH至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。

2)LB固体培养基，含有以下物质：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、NaCl 0.5g、琼脂糖1.5g、蒸馏水100mL，用10mol/L NaOH调pH至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板，保存备用。

3)100mg/ml Amp(氨苄青霉素)

Amp 100mg，溶于1ml无菌水，用直径0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存。

4)25mg/ml Cam(卡那霉素)

Cam 50mg溶于2ml无水乙醇溶液，分装成0.5ml每份，-20℃保存。

5)琼脂糖凝胶电泳试剂

50×TAE缓冲液：Tris碱242g、Na₂EDTA·2H₂O 37.2g、冰乙酸57.1ml，添加去离子水充分溶解至1000ml，室温保存。

6)1％琼脂糖溶液：称取0.2g琼脂糖，加入至20ml TAE缓冲液中，加热溶解。

仪器设备

QYC-2102C全温培养摇床购自宁波市科技园区新江南仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂；HPX-9272MBE数显电热培养箱购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；WH-861旋涡混合器购自太仓市华利达实验设备有限公司，SW--CJ--2D双人单面净化工作台购自苏州净化设备有限公司；Centrifuge5417R台式高速离心机购自德国Eppendorf公司；Nanodrop2000核酸蛋白检测仪购自美国Thermo公司；CP214电子天平购自奥豪斯仪器(上海)有限公司；AG 22331 Hamburg型PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司；1600R全自动数码凝胶成像分析***购自上海天能科技有限公司。

2.试验方法

(1)基因组DNA模板提取

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(货号N1152)，根据说明书指示提取所有菌系的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶确定DNA质量，并使用Nanodrop2000核酸蛋白检测仪测定DNA的浓度。

(2)菌落PCR模板制备

刮取少量菌落，加入100uL无菌水并用移液器吹打成均匀的菌液，沸水浴5min，之后12,000rpm离心1min，上清液即可作为菌落PCR的模板。

(3)特异片段产物的PCR扩增

以细菌基因组DNA或者单菌落粗提物为模板，用引物分别扩增特异序列产物。

取5μl PCR扩增产物，用30g/L琼脂糖凝胶进行电泳分离，以DNA marker DL2000作为分子量标记，电压5V/cm，电泳20min后，用凝胶图像扫描仪进行分析拍照。

(4)PCR反应体系和反应程序。

PCR反应体系(50μl)：

PCR反应程序：25个循环

实施例3.基于维氏气单胞菌物种水平特异性序列设计引物和引物筛选

采用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件，针对实施例1获得的特异性核酸序列设计多组引物，设计的引物由上海生工生物有限公司合成。

以维氏气单胞菌基因组DNA为模板，用设计合成的不同引物对，分别按照实施例2的方法进行PCR反应。通过30g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。

根据凝胶电泳结果(未示出)，选取扩增条带清晰、单一的引物对，以便进一步进行引物特异性分析。共得到一对引物，其序列由SEQ ID No.1-2所示，所述引物序列信息如表2所示。进一步将扩增产物进行测序，确定目标片段与SEQ ID NO.3所示的序列是一致的。

实施例4.维氏气单胞菌特异性引物的验证

利用实施例3得到的引物对，以枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，按照实施例2的方法分别进行PCR反应。通过30g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。

凝胶电泳结果显示，本发明的引物对仅能在维氏气单胞菌中扩增出预期大小的目的片段，且产物浓度高，在其他阴性对照菌株中则无法获得或者仅能获得及少量的目的片段(图3A)。作为内对照，采用16s rDNA通用引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以上述同样的基因组DNA为模板分别进行PCR扩增，在每个样本中均可获得大小和浓度一致的产物，进一步证明本发明的引物对对于维氏气单胞菌具有特异性(图3B)。

将扩增得到的片段进一步进行测序，经序列比对分析，确认扩增得到的片段是维氏气单胞菌的特异性核酸序列。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 海南大学

<120> 基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法

<130> 1号序列

<141> 2018-03-18

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tatgcagctc ctgacggtga ag 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

atgggcaagc cagctttggc 20

<210> 3

<211> 231

<212> DNA

<213> 维氏气单胞菌(Ameromonas veronii)

<400> 3

tatgcagctc ctgacggtga aggtgatggc aacaacgcac cactcgcccg gcaggatagc 60

ggctgggaat gacagggaaa tgacaaaaat cacttgtaaa aaggcaactg gcggtggcga 120

ggaaaagccg aaacagttca catattcggc gaaatcatcc tgaaagcggt cacaaatctg 180

caggttgtgg attgcagcac atcctgttcc cgccaaagct ggcttgccca t 231

<210> 4

<211> 77

<212> PRT

<213> 维氏气单胞菌(Ameromonas veronii)

<400> 4

Met Gly Lys Pro Ala Leu Ala Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ile His Asn

1 5 10 15

Leu Gln Ile Cys Asp Arg Phe Gln Asp Asp Phe Ala Glu Tyr Val Asn

20 25 30

Cys Phe Gly Phe Ser Ser Pro Pro Pro Val Ala Phe Leu Gln Val Ile

35 40 45

Phe Val Ile Ser Leu Ser Phe Pro Ala Ala Ile Leu Pro Gly Glu Trp

50 55 60

Cys Val Val Ala Ile Thr Phe Thr Val Arg Ser Cys Ile

65 70 75

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

agagtttgat catggctcag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tagggttacc ttgttacgac tt 22

Claims

1.一种引物对在制备用于检测维氏气单胞菌的检测剂中的用途，其中：

(1)所述引物对的正向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1；以及

(2)所述引物对的反向引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述引物对中的一条引物被可检测地标记。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述标记选自放射性同位素、酶、发光物质或生物素。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述发光物质为荧光物质。