CN108707666B - Dgkz基因作为白血病检测的生物标志物的应用 - Google Patents

Dgkz基因作为白血病检测的生物标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明发现并确认了DGKZ基因作为白血病检测的生物标志物的应用，具体可用于制备检测白血病的试剂或含有该试剂的试剂盒；相应的，某试剂中含有检测DGKZ基因的相应试剂，或者包含有上述某试剂的试剂盒，即能够用于检测白血病。应用本发明检测白血病，灵敏度高、特异性强、快速简便，有望成为白血病早期诊断和预后预测的重要手段。

Description

DGKZ基因作为白血病检测的生物标志物的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种特定基因作为检测白血病的标志物的应用。
背景技术
白血病是一类常见的造血干祖细胞恶性克隆性疾病，因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停留在细胞发育的不同阶段。白血病的发病率在中国为3-4/10万，在恶性肿瘤所致的死亡率位居第六位(男)、第七位(女)；在儿童及35岁以下成人中死亡率更是名列前茅，是严重危害人类身体健康的恶性疾病之一。我国急性白血病较慢性白血病多见(约5.5:1)，其中急性髓系白血病(AML)发病率最高(1.62/10万)。
细胞遗传学、分子生物学及治疗靶点识别技术的发展，推动了靶向治疗及分层治疗水平的进步，明显提高了AML临床疗效及总体生存率。但临床仍有部分难治性病例无法得到根治，同时对有些预后良好者又存在不同程度的过度治疗问题。
随着研究的不断深入，细胞遗传学和分子生物学技术在临床白血病患者的诊断及治疗中的应用越来越广泛，已经成为白血病患者的常规检测项目之一。在疾病的诊断、治疗、微小残留病(mininal residual disease，MRD)的监测及预后判断等多个方面均发挥了重要作用。
NCCN的AML指南和中国AML(非APL)诊疗指南中专家共识均指出AML预后分组中预后良好组细胞遗传学包括t(8；21)(q22；q22)、inv(16)(p13；q22)、t(16；16)(p13；q22)、t(15；17)，分子生物学包括正常核型伴NPM1突变，但在临床治疗中这类患者仍有部分难治和复发病例；预后不良组分子异常包括正常核型伴有单独的FLT3-ITD，而高危的FLT3-ITD阳性AML患者仍有明显的异质性，部分患者经常规诱导治疗可达完全缓解(completeremission，CR)，后续行造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)可长期生存。因此需探究目前尚未明确的其他复杂因素的影响，如免疫因素、粘附分子及炎症因子表达等的作用。
发明内容
申请人对DGKZ基因进行了研究，具体如下：
DGKZ基因属于二酰甘油激酶家族，在细胞中过表达DGKZ，可逆转由于γ射线所导致的细胞周期阻滞，提示DGKZ在细胞周期进程及促进细胞增殖中发挥关键作用。在TNF-α的刺激下，DGKZ敲减的细胞一方面直接促进了IKB的磷酸化和P65亚基的磷酸化，最终导致IKK激活，另一方面促进了P65亚基与CBP复合体的形成，增强了NF-KB的反式激活，这是因为NF-KBp65亚单位和肿瘤抑制因子p53竞争含有CBP/p300共激活蛋白的复合物的数量；沉默DGKZ可显著上调p53蛋白的表达水平，同时抑制p53的转录活性。在关于脑胶质瘤与DGKZ基因关系的研究中发现，沉默DGKZ基因后，脑胶质瘤细胞U87形成的集落数目减少，并且集落中的细胞数目也减少。DGKZ在正常的肝组织中不表达，而在癌旁组织和癌组织中高表达，且癌组织中DGKZ的阳性率明显高于癌旁组织且其表达与蛋白激酶C的表达成正相关。研究表明，DGKZ可通过调节细胞内信号级联反应中的二酰甘油水平和信号转导来减弱蛋白激酶C的活性，而蛋白激酶C是一种细胞质酶，主要分布在细胞质中，能够作用于细胞核中的转录因子，参与基因的表达和调控。
在以上研究结论的基础上，本发明确立了DGKZ基因可作为检测白血病的标志物，进而得出以下方案：
第一方面，提供了DGKZ基因的一种用途，用于制备检测白血病的试剂或试剂盒。
进一步的，所述的检测为血清学检测或血液学检测。
进一步的，所述的试剂包括引物、探针、核酸芯片等。
第二方面，提供了一种用于检测白血病的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒中含有检测DGKZ基因的相应试剂。
进一步的，所述的检测DGKZ基因的相应试剂选自下组：PCR检测试剂、分子杂交检测试剂等。
可在试剂盒中添加标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测白血病。
本发明的效果如下：
应用本发明进行白血病检测，灵敏度高、特异性强、快速简便，有望成为白血病早期诊断和预后预测的重要手段。
附图说明
图1.DGKZ基因在Jurkat，HL-60，THP-1和K562四种白血病模式细胞中mRNA的表达。
图2.CCK8检测DGKZ对于白血病模式细胞HL-60增殖的影响。
图3.FACS检测DGKZ基因对白血病模式细胞HL-60细胞周期的影响。
图4.FACS检测DGKZ基因对白血病模式细胞HL-60凋亡的影响。
图5.DGKZ基因对白血病模式细胞HL-60Caspase3/7活性的影响。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以通过常规方法获得DGKZ基因的核苷酸序列，例如从NCBI、Genebank等数据库获取。
1.DGKZ基因在白血病模式细胞中mRNA的表达
使用含10％FBS的RPMI-1640培养液培养；白血病模式细胞使用含10％FBS的DMEM培养。培养条件均为37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱。HL-60细胞呈悬浮生长，293TN细胞为贴壁生长。细胞接种密度为每毫升1×105个，每2-3d传代1次。
收集细胞到一个离心管中，然后加入1-2倍吸取量的PBS充分混匀，室温1500rpm离心5min。离心结束后弃上清，重新加入1ml PBS重悬离心管中的细胞团块，并移至1.5ml的EP管中，室温1500rpm离心5min。尽可能的去除残留的PBS，根据EP管中团块的量进行分装。分别用于mRNA和蛋白质的检测。
将需要提取总RNA的细胞室温静置5分钟，用12000g转速4℃离心5分钟，而后将上清转移至新的1.5ml RNase-free的EP管中。在新的EP管中加入200μl的氯仿，振荡混匀，室温静置5分钟，用12000g转速4℃离心15分钟。吸取上清液转移至新的1.5ml RNase-free的EP管中，加入600μl的异丙醇。上下颠倒数次后室温静置10分钟，用12000g转速4℃离心15分钟。小心弃去上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀，用7500g转速4℃离心5分钟。轻轻弃上清保留沉淀，打开EP管盖，室温干燥10分钟左右。而后加入适量的RNase-free水溶解沉淀。进行RNA纯度和浓度的测定。
RNA纯度和浓度测定后，即可进行逆转录实验。按照PrimeScriptTM RT MasterMix(Perfect Real Time)试剂盒说明步骤将RNA逆转录为cDNA。逆转录的反应条件如下：37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃，10秒。样本保存于-80℃冰箱中以供后续实验检测。
结果：以GAPDH为内参的QPCR结果提示DGKZ基因在模式细胞HL-60中表达较高(图1)。上图纵坐标为ΔCt，ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔCt相对较大的细胞，目的基因表达丰度相对较低。
2.DGKZ基因对白血病模式细胞增殖的影响
NADPH氧化酶亚单位等参与白血病细胞凋亡的分子机制研究需要设计合成特异性siRNA，转染方法参照HiPerFect transfection reagent试剂盒说明书进行。本研究所用的目的基因siRNA以及阴性对照siRNA由美国Invitrogen公司设计和合成。进行siRNA转染时，参照转染试剂HiPerFect transfection reagent使用说明书，将50nM的siRNA与12μl的转染试剂轻轻混匀，室温静置5-10分钟后，将转染试剂与siRNA混合物均匀滴加在6孔细胞培养板相应孔中，轻轻摇晃孔板混匀，置于细胞培养箱中继续培养。3天后经Real-time PCR和Western blotting检测干扰效率。经B-myb siRNA转染细胞不同时间时检测细胞增殖以及细胞凋亡的情况。使用抑制剂进行实验时，预先用抑制剂刺激细胞1小时，而后转染针对目的基因的特异性siRNA，在含有抑制剂的条件下继续培养细胞至适当时间进行相关实验研究。
结果：经shRNA慢病毒感染3天后，CCK8连续检测5天，发现实验组HL-60细胞的增殖速率受到显著抑制。提示DGKZ基因与HL-60细胞的增殖能力显著相关(图2)。
3.DGKZ基因对白血病模式细胞周期的影响
将急性髓系白血病单个核细胞和HL-60细胞及分别经过P38、JNK、ERK1/2、ERK5的抑制剂处理的两种细胞，加入最适浓度蟾酥培养24小时，另设空白对照组和DMSO对照组，1000rpm离心5min弃去培养液，收集细胞，PBS清洗，调整各组细胞数为2×10 6/ml，取400μl细胞悬液，加入200μl PBS洗涤，弃上清，加入400μl binding buffer和0μl AnnexinV-FITC(20μg/ml)，混匀，4℃避光孵育15分钟，再加5μl碘化丙啶(PI)(20μg/ml)于细胞悬液中，混匀，4℃避光孵育5分钟，室温放置10分钟，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。该实验重复三次，最后数据做统计学分析。
结果：shRNA慢病毒感染4天后，实验组处在G1期的细胞增多，处于S期的细胞减少，处于G2/M期的细胞增多，提示DGKZ基因与HL-60细胞的周期分布显著相关(图3)。
4.DGKZ基因对白血病模式细胞凋亡的影响
将白血病模式细胞及分别经过P38、JNK、ERK1/2、ERK5的抑制剂处理的两种细胞，加入最适浓度蟾酥培养24小时，另设空白对照组和DMSO对照组，1000rpm离心5min弃去培养液，收集细胞，PBS清洗，调整各组细胞数为2×10 6/ml，取400μl细胞悬液，加入200μl PBS洗涤，弃上清，加入400μl binding buffer和0μl AnnexinV-FITC(20μg/ml)，混匀，4℃避光孵育15分钟，再加5μl碘化丙啶(PI)(20μg/ml)于细胞悬液中，混匀，4℃避光孵育5分钟，室温放置10分钟，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。该实验重复三次，最后数据做统计学分析。
结果：shRNA慢病毒感染5天后，实验组发生凋亡的HL-60细胞显著增加，提示DGKZ基因与HL-60细胞的凋亡显著相关(图4)。
5.DGKZ基因对白血病模式细胞Caspase3/7活性的影响
将白血病模式细胞及分别经过P38、JNK、ERK1/2、ERK5的抑制剂处理的两种细胞，培养24小时，另设空白对照组和DMSO对照组，1000rpm离心5min弃去培养液，收集细胞；用Caspase3/7检测试剂盒，检测Caspase3/7的活性。该实验重复三次，最后数据做统计学分析。
结果：shRNA慢病毒感染4天后检测Caspase3/7活性，结果显示：实验组Caspase3/7活性增加，提示DGKZ基因与HL-60细胞的凋亡显著相关(图5)。
以上实验充分表明，DGKZ基因可作为白血病检测的生物标志物，用于白血病的临床分子诊断标志物及药物开发、体外诊断试剂及相关试剂盒的开发。其中涉及的特异性检测DGKZ基因的引物、探针以及核酸芯片的设计方法属于常规技术手段。

Claims (3)

1.DGKZ基因的用途，用于制备检测急性髓系白血病的试剂或含有该试剂的试剂盒。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的检测为血清学检测或血液学检测。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的试剂为引物、探针或核酸芯片。
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