CN108703963B - 茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茴香脑(Anethole)在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时，剂量为500mg/kg的茴香脑可以显著缓解坐骨神经慢性压迫性损伤模型诱发的痛觉超敏及痛觉过敏，改善坐骨神经的组织病理学变化并且调控炎性细胞因子的蛋白表达，证明茴香脑具有缓解慢性压迫性损伤所导致的神经病理性疼痛并促进神经功能恢复的作用。

Description

茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途

技术领域

本发明涉及茴香脑的应用，特别涉及茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

背景技术

神经病理性疼痛(neuropathic pain)是一种慢性疼痛综合征，其发病机制较为复杂，一般是由于神经***功能发生异常或者受到损伤而产生的疼痛，常见于自身免疫性疾病(如多发性硬化)、代谢性疾病(如糖尿病性神经病变)、感染(带状疱疹后神经痛)、血管病(如卒中)、神经受压迫、神经创伤和癌症等。神经病理性疼痛困扰着世界上1/6的人，不仅造成躯体本身的疼痛和功能障碍，同时还会伴发抑郁、焦虑等心理精神障碍，对患者的生活和生命质量产生严重影响，并给家庭、社会带来巨大负担。近年来，随着病理学、生理学、分子生物学及疼痛临床治疗技术的迅速发展，神经病理性疼痛的研究已取得较大进展。目前神经病理性疼痛的主要治疗药物多是抗抑郁药、非甾体类抗炎药、阿片类药物等，但这些药物因其各种不良反应，严重影响患者的生活质量，进而限制了在临床上的使用。因此进一步研究神经病理性疼痛的发生机制，在此基础上寻找安全性高，临床疗效好的治疗神经病理性疼痛的药物具有重要的学术价值和现实意义。

中药小茴香为伞形科茴香属植物茴香Foenicu-lum vulgare Mill.的干燥成熟果实。全株均可药用。为常用的重要中药之一，据版《中国药典》(一部)收载有散寒止痛，理气和胃的功效。根据文献报道具有抗炎，抗氧化，镇痛，抗肝纤维化的作用。

目前对小茴香化学成分的研究主要集中于挥发油成分的研究。其提取物小茴香油及主要成分茴香脑、茴香醛。其中，茴香脑(Anethole,AN)又名1-甲氧基-4-丙烯基苯、茴香醚，其分子式为C₁₀H₁₂O。近年来，国内外研究已经证明茴香脑具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗糖尿病代谢异常、免疫调节和神经保护等药理作用，但关于其对神经病理性疼痛的保护作用目前未见文献报道。将其发展为治疗神经病理性疼痛药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是通过对茴香脑的药理作用研究，提供茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，所述茴香脑的结构式如式(1)所示：

具体地，所述神经病理性疼痛为外周神经损伤的神经病理性疼痛。

具体地，所述茴香脑单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

具体地，所述茴香脑单次应用剂量为125-500mg/kg。

优选地，所述茴香脑单次应用剂量为250-500mg/kg。

优选地，所述茴香脑单次应用剂量为500mg/kg。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型或注射剂型。

具体地，所述的茴香脑作为唯一活性成分在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

本发明提供的茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途具有以下有益效果：

(1)茴香脑能显著缓解机械痛觉超敏、冷痛觉超敏和热痛觉过敏；

(2)茴香脑能改善受损的坐骨神经，增加神经传导速度及感觉神经动作电位振幅，显著抑制了脊髓组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白的表达并且促进IL- 10蛋白的表达。

本发明首次证实，茴香脑具有治疗坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经病理性疼痛的作用，可用于制备神经病理性疼痛的治疗药物。

附图说明

图1为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的机械缩足反射阈值图。

图2为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的冷抬足次数图。

图3为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的热缩足反射潜伏期图。

图4为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的机械压痛阈值图。

图5为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经复合动作电位图(图5A为假手术组，图5B为模型组，图5C为普瑞巴林组，图5D为茴香脑(125mg/kg)组，图 5E为茴香脑(250mg/kg)组，图5F为茴香脑(500mg/kg)组)。

图6为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的感觉神经传导速度统计图。

图7为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经复合动作电位振幅统计图。

图8为茴香脑对神经病理性疼痛小鼠行HE染色的坐骨神经结构变化图(图8A为假手术组，图8B为模型组，图8C为普瑞巴林组，图8D为茴香脑(125mg/kg)组，图8E为茴香脑(250mg/kg)组，图8F为茴香脑(500mg/kg)组)。

图9为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织TNF-α蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^*p<0.05，^**p<0.01

)。

图10为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织IL-6蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^*p<0.05，^**p<0.01

)。

图11为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织IL-1β蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^*p<0.05，^**p<0.01

)。

图12为茴香脑对小鼠神经病理性疼痛脊髓组织IL-10蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^*p<0.05，^**p<0.01

)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的茴香脑均为前述式(1)所示的化合物，可通过商购获得。

实施例1

茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的神经病理性疼痛，茴香脑单次应用剂量为小鼠125mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例2

茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的神经病理性疼痛，茴香脑单次应用剂量为小鼠250mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

实施例3

茴香脑在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途，其中，神经病理性疼痛为外周损伤引起的神经病理性疼痛，茴香脑单次应用剂量为小鼠500mg/kg，药物的剂型为口服剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

雄性ICR小鼠，18-22g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：NCXK(宁)2015-0001。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3。

1.2实验药品及仪器

茴香脑(上海源叶生物科技有限公司)，以CMC-Na配制成混悬液，母液浓度 500mg/mL，现配现用。戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich公司),普瑞巴林胶囊(辉瑞制药有限公司),vonFrey Filaments(Danmic Global,美国)，冷板仪(BIOSEB科技仪器公司，法国),PL-200热刺痛仪(成都泰盟科技公司),透射电镜(H-7650日立,日本东京)，兔抗 TNF-α、IL-6(购自Proteintech公司)，兔抗IL-1β及IL-10多克隆抗体(购自Abcam 公司),酶标仪(1510，Thermo Fisher公司)，电泳仪、电转仪(Powerpac basic,美国 Bio-Rad公司)，凝胶成像分析仪(JS-860B,上海培清公司)。

1.3实验动物分组及给药

小鼠随机分为假手术组，慢性压迫性损伤(CCI)模型组，茴香脑不同剂量组(125mg/kg、250mg/kg、500mg/kg)及普瑞巴林阳性药物组。小鼠在手术造模后，茴香脑不同剂量组及普瑞巴林阳性药物组给药(给药量0.1ml/10g体重，灌胃给药，每隔12小时一次)。假手术组和模型组同法给予等量的CMC-Na。在CCI造模后的第0， 7，8，10，12，14天进行行为学、电生理学、组织病理学和分子生物学等药效学评价。

1.4小鼠慢性压迫性损伤(CCI)模型建立

通过对小鼠坐骨神经进行结扎，建立慢性缩窄性损伤致神经病理性疼痛动物模型。小鼠称重后，采用0.8％戊巴比妥钠注射液以0.1ml/10g的剂量腹腔注射对小鼠进行麻醉。麻醉后，将小鼠俯卧位置于消毒后的手术台上，在右侧臀股交界处剪毛备皮，碘伏消毒液进行皮肤表面消毒，用手术剪在此处沿坐骨神经走行方向剪开约1.5cm的切口，顺着肌纹，用玻璃挑针钝性分离股二头肌和臀肌,使坐骨神经主干暴露出来，用消毒并用生理盐水浸泡过的4-0医用铬制羊肠线对暴露的坐骨神经主干进行3个间距为 1mm的松弛结扎，逐层缝合肌肉层及皮肤。为避免结扎力度过大引起组织坏死，应以结扎侧肢发生细微的颤动为准，以避免神经外膜的血液流动受到干扰。

二、实验过程

(一)行为学参数测定

1.1实验方法：

测定机械缩足反射阈值(paw withdrawal threshold,PWT)：将一有机玻璃箱 (22×12×22cm)置于金属筛网上，待小鼠在箱中适应15min后，用von Frey纤毛机械刺激器垂直刺激小鼠后肢足底中部，持续时间≤4秒，小鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。刺激由小到大，每个强度反复刺激10次(次－次间隔 3～5s)，将出现缩足反射5次左右的强度定为PWT。

测定冷抬足次数：于安静环境中，将小鼠放在温度为4℃的冷板仪的金属冷板上，其活动采用玻璃罩加以限制，待其适应约5min左右安静下来后，观察并记录小鼠手术侧肢在5min内的抬足次数，即为冷缩足反射次数。

测定热缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，将小鼠放人有机玻璃箱内，使其自由活动30min以适应测试环境和温度。用PL-200型热痛刺激仪照射小鼠足底。照射开始至小鼠出现抬腿回避时间为 PWL。刺激部位为紧贴玻璃板的手术侧后爪部分。当后爪移动时，停止照射。照射自动切断时间为20sec，以防止组织损伤。整个实验中，热刺激强度保持相同。重复刺激三次，取PWL的平均值。

测定机械压痛阈值：将小鼠置于特制塑料固定筒内，用机械压痛测定仪给鼠后足跖部施加以恒定速率连续递增的压力。当其后足缩回或嘶叫时，即停止加压并读出此时之压力数值，以此压力值作为伤害性感受阈。

1.2实验结果：

手术前各组小鼠的PWT(图1)、冷抬足次数(图2)、PWL(图3)和机械压痛阈值 (图4)均无显著差异。在手术后第7天，与假手术组相比，其余小鼠的PWT，PWL, 机械压痛阈值均明显降低(p﹤0.01)，冷抬足次数明显升高(p﹤0.01)。在造模后8、 10、12、14天，与模型组组相比，茴香脑(500mg/kg)组及普瑞巴林(40mg/kg) 组的PWT、PWL和机械压痛阈值均显著升高，冷抬足次数明显降低(p<0.05)；茴香脑(250mg/kg)组在造模后12、14天，与模型组相比，PWT、PWL和机械压痛阈值均显著升高，冷抬足次数明显降低(*p﹤0.05,**p﹤0.01)；而茴香脑(125mg/kg) 组的各行为学参数均无显著性差异。

(二)电生理学测定

2.1实验方法：

坐骨-腓神经电生理活动的观测：小鼠麻醉后，于造模时相同的部位切口打开，钝性分离肌肉及筋膜，暴露出坐骨神经主干至坐骨切迹及远端羊肠线结扎处，分离过程需用温热的石蜡油对坐骨神经进行保护。将针灸针制成钩状并连接在刺激电极的鳄鱼夹上，将连接在鳄鱼夹上的钩状针灸针钩在接近坐骨切迹处的坐骨神经干上，记录针电极分别插在小鼠足踝部及足底第二与第三趾间肌肉中，参比电极置于受坐骨神经支配的腓肠肌内，两个参比电极的距离约为5mm。测试过程中以生理盐水为导电的介质，并要根据具体情况及时补充。将上述各电极连接BL-420F生物机能实验***，实验项目选择“肌肉神经实验”子选项中的“神经干兴奋传导速度的测定”，设定好参数值。测量并记录一下数据：①两个电极所记录的动作电位潜伏期并计算其差值(两个波峰之间的时间差)，即潜伏期之差△t；②两记录电极之间的距离s；③复合肌肉动作电位振幅(compound muscle action potentialsamplitudes，CMAP amplitudes)即动作电位波峰与波谷间的距离。以上数据中的①和③均选取三个动作电位波形图进行数据统计，取其均值作为最终统计数据。神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV)计算方法为记录电极之间距离比上潜伏期之差，即NCV＝s/△t。根据此公式计算感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity，SNCV)。

坐骨-腓神经电生理活动的观测：将参比电极***小鼠术侧肢的腓骨前肌其余方法同上，引导出坐骨-腓神经的动作电位，即感觉神经动作电位(sensory nerve actionpotentials，SNA)。记录潜伏期之差△t，复合肌肉动作电位振幅(CMAP amplitudes)，及记录电极间的距离s。依照NCV的计算公式，计算出运动神经传导速度(sensory nerveconduction velocity，SNCV)。

2.2实验结果：

各组小鼠在造模后的14天，与假手术组相比，模型组小鼠坐骨-腓神经动作电位的振幅明显下降并且潜伏期明显增长(图5)，a-f分别表示假手术组、模型组、普瑞巴林组、茴香脑组(125、250、500mg/kg)。与假手术组相比，模型组小鼠的复合肌肉动作电位振幅和感觉神经传导速度显著降低(p<0.01)。与模型组相比，茴香脑 (125、250、500mg/kg)组及普瑞巴林(40mg/kg)组小鼠在造模后的14天复合肌肉动作电位振幅和感觉神经传导速度显著增高(*p﹤0.05,**p﹤0.01)；而茴香脑 (125mg/kg)组的小鼠在给药7天后复合肌肉动作电位振幅和感觉神经传导速度并无明显变化(图6、图7)。

(三)HE染色观察坐骨神经组织病理学变化

3.1实验方法：

将坐骨神经组织切片在80℃的恒温箱内烘烤过夜后，进行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE staining)染色：

①脱蜡：依次浸于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(10min)；

②复水：梯度酒精各个2-4分钟进行复水，(无水Ⅰ，无水Ⅱ，95％，85％，80％和70％)，表面的酒精再以蒸馏水洗净；

③染色：在盛有苏木素染料的染缸中浸泡4min，拿出载玻片用流水冲洗，在1％的盐酸酒精溶液中分化5s，流水冲洗，再放入伊红染色缸中2min，水洗3次；

④脱水：依次浸泡于70％乙醇(30s)、80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，无水乙醇Ⅰ(2min)，无水乙醇Ⅱ(2min)；

⑤透明：二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)；

⑥封片：切片上滴加中性树胶，封片，光学显微镜观测组织病理学改变。

3.2实验结果：

如图8：A-F分别表示假手术组、模型组、普瑞巴林组、茴香脑组(125、250、 500mg/kg)。假手术组神经元细胞体饱满，排列紧密，染色均匀；模型组神经元间隙增多，细胞排列疏松，出现大量空泡，胞体缩小，染色不均匀；茴香脑(250、 500mg/kg)组及普瑞巴林(40mg/kg)组神经元改变有所改善，排列较紧密，空泡数量显著减少。而茴香脑(125mg/kg)组与模型组相比没有显著改变。

(四)Western blot检测神经病理性疼痛小鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-10蛋白的表达

4.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，用将硝酸纤维素膜 (NC膜)进行湿法转膜。转膜结束后取出硝酸纤维素膜，将膜置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。封闭结束孵育5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，室温复温1h，洗膜孵育二抗。用PBST洗NC膜3次，每次10min。滴加蛋白化学发光剂(ECL)，NC膜固定于片盒内，压入胶片进行曝光。取出胶片，放入显影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝胶图像分析成像***(培清，JS-860B)对胶片上每个目的条带进行扫描和图像分析。

7.2实验结果：

如图9至图12，与假手术组比较，模型组TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达明显增加，IL-10蛋白表达明显减少(##P<0.01)；如图7至图10所示，与模型组比较，茴香脑(500mg/kg)组小鼠脊髓组织TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达明显减少(*p﹤0.05, **p﹤0.01)；如图10所示，与模型组比较，茴香脑(500mg/kg)组小鼠脊髓组织IL- 10蛋白表达明显减少(*p﹤0.05,**p﹤0.01)。提示茴香脑的保护作用可能通过上调 IL-10蛋白的表达，降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表达与活化，发挥抗炎作用,从而对小鼠慢性压迫性损伤致神经病理性疼痛产生保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.茴香脑作为唯一有效成分在制备治疗坐骨神经慢性压迫性损伤所致神经病理性疼痛的药物中的用途，其特征在于：所述茴香脑的结构式如式(1)所示：

式（1），

所述茴香脑单次应用剂量为500mg/kg，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。

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