CN108700520B - 用于高吞吐量成像的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

用于对样本成像的设备，所述设备包括：照明装置，其用于在线焦点或焦点阵列中同时照明所述样本；以及检测装置，其用于检测在视场阵列中同时从样本发射或散射的光子；其中样本中的在成像期间从其中发射或散射光子的子观察体积的阵列由其中来自照明装置的线焦点或焦点阵列与检测装置的相应视场阵列重叠的空间中的体积限定；样本保持器，优选为圆柱形样本保持器，其被配置为将样本保持在其表面处，所述样本保持器可旋转地布置成使得通过旋转样本保持器可以将所述样本的至少一部分传输通过所述子观察体积中的至少一个。

Description

用于高吞吐量成像的方法和设备
技术领域
本发明提供用于从主要有机物质但不排除无机物质以及从该物质中的化学、生物化学或生物反应、相互作用、途径或序列中检测、监测、成像和获取数据的方法和装置。特别地，本发明提供用于例如在包括活细胞的细胞中、在活组织中和在含有机物质的溶液中以每个样本的较低成本和高吞吐量以在三维中的高空间分辨率来研究所述物质的方法和设备。特别针对的另一个应用是监测包括活细胞的细胞中或溶液中DNA和RNA相关的活性的可能性。
背景
存在用于对生物样本成像的太多的方法和设备。主要地，这些是由Marvin Minsky在1957年获得专利的共聚焦显微镜的变型。共聚焦显微镜的普及性是由于其切片(sectioning)能力，其实现了比常规宽视场显微镜可以实现的三维上的相对高的分辨率和更好的对比度。通常，共聚焦显微镜与荧光光谱结合，其中特定的颗粒(例如，蛋白质)用荧光团标记，并因此可以从背景中辨别。
在大多数共聚焦显微镜中，相同的光学器件(至少相同的物镜)用于照明/激发和用于观察/检测来自所研究的样本的光。这种配置的优点在于其模拟经典宽视场显微镜的设计，并因此可以使用或多或少的相同光学部件。另一个优点在于照明和检测自动对准。另外的优点在于，通过用垂直于样本表面的视场轴线照明和观察，N.A可以是大的，而不会遇到诸如全反射的问题。
然而，常规共聚焦显微镜的这种几何结构引入限制可以被处理的应用的频谱的弱点和权衡。
在共聚焦显微镜中，通过限制允许所发射的光到达检测器的体积(观察体积)来获得分辨率，即两个可区分的辐射点之间的距离。限制观察体积通过结合两种方法来实现：在正交于显微镜的照明(或等效于视场)轴线的维度中，观察体积的扩展由物镜的焦平面中的聚焦宽度确定。在沿着物镜的照明轴线(视场轴线)的维度中，观察体积由放置在检测器前面的光学共轭平面中的针孔的宽度确定。该针孔做得足够小以阻挡沿着照明轴线的方向从距焦平面一定距离之外的点发出的光。这样，通过选择具有非常小的聚焦宽度的物镜和小且正确定位的针孔，可以获得所有三维上的非常高的分辨率。使用针孔的另一个优点在于它增强了对比度，因为从位于观察体积之外的样本的被照射部分发出的散射光或荧光不会到达检测器。
尽管如此，在实践中，这意味着严重权衡：用于滤出从焦平面之外发出的光的针孔限制物镜在该时刻处对在焦平面中的多于一个点进行成像。因此，为了获得图像，必须使样本和观察体积相对于彼此移动(扫描)。图像是逐点合成的，并且1024×1024帧可能花费超过一秒钟来获取。这使得并行化成像并从而实现高吞吐量的可能性复杂化。
如上所述，常规共聚焦显微镜中的观察体积通过将小聚焦宽度与针孔技术组合来确定。在三维空间中创建观察体积的另一种方法是使用所谓的共聚焦θ显微镜，Stelzer、EHK等人于1994年在Opt Commun.111第536-547页上发表的“Fundamental reduction inthe observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonalto the illumination axis:confocal theta microscopy”。在该技术中，通过使用两个物镜来代替地确定观察体积，两个物镜被放置成使得它们的视场的轴线正交并且使得它们的焦平面相交。因此，观察体积由在一个方向上一个检测器的聚焦宽度和在正交的第二方向上第二检测器的聚焦宽度来限制。在这种情况下的照明可以是任意的，只要它照亮感兴趣的观察体积即可。
从观察体积的角度来看，θ共聚焦显微镜消除了对针孔的需要。然而，从对比度的角度来看，需要针孔来抑制到达任一个检测器的从观察体积之外发出的光。
由于共聚焦显微镜基本上是逐点测量设备，因此通过相对于由显微镜的物镜和检测器前方的针孔限定的观察体积移动包含研究中的任何样本的样本体积并且测量每个点的强度值来形成样本的图像。该动作继续，直到收集整个二维(x-y)图像，过程可被重复以随时间生成一系列图像。另外，观察体积也可沿着显微镜轴线步进以获取光学切片的三维(x、y和z)图像堆叠。利用这个值的向量，三维图像可被合成并通常在屏幕上以层析成像(tomographically)的方式被显示。
在共聚焦显微镜的早先的版本中，样本被放置在高精度平移台上，该高精度平移台在三维中***地移动样本，直到生成图像向量。为了产生高帧率，样本必须沿着其预编程路径高速移动，同时保持亚微米精度。由于样本保持器和台的质量的高的加速度，因此这是挑战性且昂贵的任务。
获得高帧率的另一方法是激光扫描共聚焦显微镜。代替移动样本，激发光束被扩展并且被引导到一对振荡电流计扫描镜，该振荡电流计扫描镜光栅扫描穿过样本体积的聚焦光束。来自样本的光通过相同的镜组被去扫描，并在到达检测器之前通过共轭(共焦)针孔。扫描速度被最快的镜子的机械规格限制，该最快的镜子通常以每图像点(有时称为像素或三维空间中的体素)约4至5微秒的速率扫描。因此，对于在单一秒内收集的512x512像素图像，扫描点在每个像素上停留大约4微秒。此外，由于以下事实：镜子将必须被快速地加速，保持在恒定速度同时扫描整个场，接着快速地减速并且行进的方向被反转，对于每个扫描线重复该循环，获得更高的速率是非常困难的，即使不是不可能的。
用于快速扫描样本的另一可选方案是(Nipkow)旋转盘方法。该共聚焦显微镜是基于圆形旋转的盘，该盘具有以螺旋图案布置的一个或更多个针孔阵列，该螺旋图案被设计成在盘的一个旋转期间覆盖样本体积。由于除了旋转盘之外不需要加速，因此这个配置在稳定状态下在机械上是非常稳定的。这个方法的另一个优点是不管旋转盘的针孔，几个点(像素)可以被并行观看。通过使用超出每秒1000帧的这种技术，已经实现了结合高速和并行化非常高的帧率的能力。然而，旋转盘共聚焦显微镜不是没有它们的伪像。一个局限是从焦平面的外面散射或发射的光可通过行进穿过邻近的针孔到达检测器，所谓的针孔串扰。第二局限是穿过盘的针孔的光的低百分比(通常小于10％)。剩余的光被反射并且可以作为检测器中的背景噪声呈现。这两个副作用都限制信噪比。旋转盘方法的第三个限制在于通常用于收集图像的检测器是电荷耦合器件或CMOS传感器。由于这种器件的积分时间在毫秒量级，因此这种类型器件固有的暗电流将在所述积分时间内积累噪声水平，使得几乎不可能检测到单个光子。
Gratton等人(美国专利7973294)提出将样本体积移动通过观察体积。代替使x-y-z平移台围绕样本体积移动，样本被放置在旋转的容器中。因此，非常大的样本体积可以以最小所需的加速度通过共聚焦显微镜的观察体积。当处于稳态时，只有旋转台的摩擦力需要被克服，并且容器还可在其他方向上缓慢移动，以访问样本体积的所有部分。然而Gratton等人使用了一个包含在液体中分解的颗粒的小槽(cuvette)。因此，颗粒四处移动，因此在这种情况下不可能保持亚微米精度。
仍然需要能够以高帧率(高吞吐量)、三维中的高空间分辨率、高灵敏度、大面积和可接受的成本水平实现主要对微生物相关物质的研究、测试等的技术。没有一种现有技术的方法能够同时满足这些要求。
概述
本公开的目的是减轻与现有技术成像技术相关联的至少一些缺点。
本公开的目标是，利用三维中的高空间分辨率和高帧率，以允许基于本发明的方法和装置完成从资金充足的研究实验室到例如及时护理应用中的更广泛的使用的转换的成本水平，实现主要对微生物相关物质的研究、测试等。
根据本公开，上面的目的和目标通过将样本体积如何被传输通过观察体积、所述观察体积如何被限定以及从样本散射或发荧光的光如何被收集和检测的新颖的组合来满足。
根据本文所示的方面，提供了一种用于对样本成像的设备，所述设备包括：
照明装置，其用于在线焦点或焦点阵列中同时照明所述样本；和
检测装置，其用于检测在视场阵列中同时从样本发射或散射的光子；
其中，光子在成像期间从其被发射或散射的、在样本中的子观察体积(sub-observation volume)的阵列由其中来自照明装置的线焦点或焦点阵列和检测装置的相应的视阵列重叠的空间中的体积限定；
其特征在于，该设备包括样本保持器，该样本保持器被配置成将样本保持在其表面处，所述样本保持器被可旋转地布置成使得通过旋转样本保持器，所述样本的至少一部分能够被输送通过所述子观察体积中的至少一个。
在许多应用中，高吞吐量或帧率是非常理想的，例如在筛选应用中或当生化反应的动力学被研究时。本发明的一个目标应用是能够研究包括活细胞的细胞的生物化学。由于活细胞是极其复杂的***，因此辨别特定事件(例如特异性蛋白质-蛋白质相互作用)是非常具有挑战性的任务。为了使这样的事件可见，感兴趣的蛋白质用荧光团标记，当由另一波长的光激发时，荧光团发射特定波长的光。通过使用仅允许特定波长或多个特定波长到达检测器的滤波器，由显微镜产生的图像由荧光而不是原始激发光组成。因此，只有标记的蛋白质出现在图像中。
理想地，荧光团应能够被激发并发出无限次的荧光。不幸的是，荧光团的激发不总是在发射期望的荧光时结束。以某种可能性，被激发的分子反而结束于黑暗状态(例如，所谓的三重态)，这将禁止或从根本上减缓分子返回到基态(所谓的光漂白)。到三重态的转变也使得分子对其环境有毒。为了避免光漂白和毒性，因此高度优选将荧光团的激发保持在最小。同时，在实际应用中荧光的量通常很低。这对检测装置的光学器件、检测器和信号处理提出了非常高的要求。在这方面的重要参数是所谓的停留时间。停留时间被定义为样本(样品)的相同部分在被照射的体素内“停留”的时间。为了获得高信噪比，期望的是仪器的停留时间以至少一个数量级超过荧光团的寿命。这样，荧光团可以在检测装置的积分时间期间多次被激发和发出荧光。
本发明的设备优选地包括具有照明装置和检测装置的共聚焦显微镜装备，该照明装置包括光源、分束器和包括物镜的透镜装备，该检测装置包括一个或更多个针孔。
本发明中的观察体积以类似于传统共聚焦显微镜的方式限定，但是非常重要的区别在于观察体积的阵列由其中来自照明装置的线焦点或焦点阵列与检测装置的相应视场阵列重叠的空间中的体积限定。每个子观察体积由检测器分别通过针孔阵列的单独针孔观察，所述针孔在平行于照明/视场轴线的维度上限定子观察体积。下面，我们有时将子观察体积称为体积像素或体素。
调查研究中的样本或样品被放置在样本保持器中或样本保持器上，该样本保持器接着耦合到旋转生成机构，使得样本旋转并使得子观察体积沿着明确定义的轨迹通过。选择旋转作为平移样本通过观察体积的手段的原因在于，样本仅受到完全平衡的力，即由于旋转产生的离心力，和通过粘附的向心力或来自样本保持器的法向力。这又实现了非常平滑且明确定义的轨迹、保持样本相对于子观察体积的相对非常高的速度的能力以及对非常大的样本区域/体积成像的能力。旋转生成机构优选地被配置为相对于子观察体积以1-100m/s、优选地5-50m/s、更优选10-30m/s的范围的速度旋转样本。
根据实施例，检测装置优选地包括检测***和信号处理单元，该检测***包括针孔阵列或可选的光纤以用于对来自每个子观察体积的光进行空间滤波以及将光转发到检测器的光纤束，该检测器例如为以盖革模式运行的雪崩光电二极管阵列，该信号处理单元用于处理来自检测器的信号。
检测装置可以以等于或短于样本中一个点通过子观察体积所用的时间的检测***上升时间进行时间分辨。优选地，检测装置具有与样本中的一个点通过子观察所用的时间的相同数量级的检测***上升时间，或者更短。
“上升时间”是检测器或检测***的响应速度的广泛使用的量度。术语“上升时间”通常是指对于检测器输出脉冲或信号从其振幅的一个指定值增加到另一个(通常从其振幅的10％到90％)所用的时间。如本文所用，术语“上升时间”适用于正或负阶跃响应，即使所显示的负阶跃有时也被称为“下降时间”。因此，本文的术语“上升时间”可以被“上升时间或下降时间”代替。
本公开的检测装置或检测***的上升时间被定义为响应于检测器上的入射强度的突然上升，信号从其初始值的10％上升到其最终值的90％所用的时间。检测速度的另一个量度是依据检测***带宽，它对应于检测***上升时间乘以0.35的倒数。
由于样本通过子观察体积的阵列的运动，样本在子观察体积中停留有限的时间，即停留时间。当在所述子观察体积中时，样本的部分被照射，且所述照射将引起散射、荧光或类似现象。该光的一些随后将被检测装置捕获，且检测到来自某个子观察体积的光的时间点对应于样本中的某个位置。因此，通过具有足够快的时间分辨检测，并且通过使感兴趣样本的所有部分至少一次通过子观察体积，可以以接近衍射受限的分辨率获得样本的感兴趣部分的完整图像。
检测装置的检测***上升时间优选地选择为与样本的一部分横越子观察体积所用的时间(即停留时间)一样短，或者更短。
典型地，检测装置具有100ns或更少的检测***上升时间，诸如50ns或更少或30ns或更少。优选地，检测装置具有10ns或更少的检测***上升时间。
最大上升时间优选允许获得衍射受限的空间分辨率。
然而，在只有某个位置上的荧光团的存在或不存在将被测量从而计数稀有光子的应用中，从信号处理的观点来看，优选的是上升时间甚至更短，通常短一个数量级。对此的解释是，电子器件中的计数更简单，侧面更陡(steeper flanks)。因此，在一些实施例中，检测装置具有5ns或更少的检测***上升时间，诸如1ns或更少或0.5ns或更少。
通常，只有一个或几个光子会从子观察体积到达检测器。这意味着检测装置不仅需要快速，而且要表现出高灵敏度。优选地，这通过使用在盖革模式下的雪崩光电二极管来实现。这种检测器具有非常高的放大率，且可以设计成具有高带宽。通常，带宽将在10MHz和100MHz之间。
在一些实施例中，检测装置包括盖革模式下的雪崩光电二极管检测器，优选盖革模式下的门控雪崩光电二极管检测器。
此外，为了能够真正利用旋转运动模式且同时能够成像大面积的样本，样本沿着由距样本保持器的旋转轴恒定半径限定的表面附近放置。因此，样本保持器优选为圆柱形。
因此，在一些实施例中，该设备包括圆柱形样本保持器，该圆柱形样本保持器被配置成将样本保持在其侧表面处，所述圆柱形样本保持器被可旋转地布置成使得通过在成像期间旋转圆柱形样本保持器，所述样本的至少一部分能够被输送通过所述子观察体积中的至少一个。典型地，圆柱形样本保持器可以具有在5-30cm范围内的圆周，诸如大约10cm。圆柱形样本保持器通常可以具有1至50cm范围内的高度(即侧表面的宽度)，但是也可以考虑更小以及更大的圆柱。在一些优选实施例中，圆柱形样本保持器的高度在5至20cm的范围内，诸如在5至15cm的范围内。
在本发明的实施例中，子观察体积相对于显微镜物镜是固定的，并且通过相对于这些固定的子观察体积旋转样本来完成运动。例如，具有带宽为30MHz的快速检测器、对应于大约10ns的检测器上升时间以及借助于以20m/s的速度旋转平移样本，与当前技术相比，允许使用在盖革模式下的单个雪崩光电检测器(APD)实现大约1000倍的图像点数。对于M个检测器，每秒M个图像点的另一个因子是可能的。因此，包括旋转作为运动手段，本发明能够显著增加设备的吞吐量。
为了覆盖更大的面积/体积，多个焦点优选地布置为等距焦点的阵列，或者是线性阵列，或者优选地是二维阵列。两个后续焦点之间的距离优选地远大于各个焦点的宽度。然后选择样本的运动轨迹(运动向量)，使得优选地，被研究样本的每个相关部分至少一次通过子观察体积。在二维中，这是通过选择在沿着阵列中的一行这样的子观察体积绘制的虚拟线和样本的运动向量之间的合适的角度来实现的。在第三维中，这优选地通过在样本被传输通过观察体积的同时选择样本的运动向量来实现，该运动向量不垂直于通过子观察体积的阵列绘制的虚拟平面的法向量。可以添加的是，行和列之间的距离不一定相同。
在一些实施例中，所述子观察体积的阵列被布置在优选等距的观察体积的至少一行中。沿着子观察体积的所述至少一行绘制的虚拟线和传输通过该行的至少一个子观察体积的样本的运动向量之间的角度优选大于零。
在一些实施例中，所述子观察体积的阵列被布置在优选等距的观察体积的平面网格中。子观察体积的所述网格的虚拟平面的法向量和传输通过该行的子观察体积的至少一个的样本的运动向量优选是非垂直的。
照明装置可以包括一个或更多个光源，优选一个或更多个激光二极管。照明装置还可以例如包括用于在焦点阵列中同时照明所述样本的微透镜阵列。
为了获得最佳成像性能，样本轨迹的精度是一个重要参数，且应该特别注意旋转是如何生成和保持的。例如，现有技术的滚珠轴承可能不够好。相反，空气轴承是优选的解决方案。在一些实施例中，在旋转期间，样本被布置在离样本保持器的旋转轴近恒定的径向距离处。在一些实施例中，样本保持器由空气轴承悬挂。
在一些实施例中，该设备还包括用于测量样本和子观察体积的阵列之间的相对、切向和/或径向位置的装置，样本保持器的每旋转一圈至少测量一次，以便将检测到的信号与样本内的相应绝对位置相关联。了解样本相对于子观察体积的阵列的精确位置作为时间的函数通常会很有意义。不仅在连续几圈之间，而且在单个圈期间。精度应该优选在0.1微米的数量级。旋转运动具有明显的优势在于，它能够实现样本通过子观察体积的非常平滑的轨迹。尽管如此，即使使用精密空气轴承，也不可能获得足够平滑的运动来满足上述位置的精度。出于这个原因，可能有用的是引入装置以测量样本和子观察体积的阵列的相对位置，并使用该数据来映射在检测装置中生成的信号，使得它们与样本中作为空间和时间函数的正确位置相关。这优选在逐步提高精度的几个步骤中来实现。第一步是测量旋转样本保持器和固定的照明***的相对角度位置。该数据既可用于生成将检测装置信号映射到正确角度位置所需的校正信号，也可用于调节样本保持器的角速度。第二步是测量样本保持器的旋转轴位置与理想位置的径向偏差，并使用该数据生成将检测信号映射到径向维度中的正确位置所需的校正信号。最后，通过比较圈之间的图像，可以生成第三校正信号，以进一步改善映射。
在一些实施例中，圆柱形样本保持器沿着其旋转轴可移动地布置，使得样本保持器和样本可以在旋转期间沿着样本保持器的旋转轴传输。通过布置子观察体积阵列使得子观察体积均匀分布在显微镜的整个视场上，并且利用如上所述布置的运动，使得每圈可以成像250微米宽的条带。通过沿着旋转轴逐渐平移样本保持器并使用50Hz的旋转频率，每秒可以成像大约10平方厘米的区域。这允许对例如用于病理学应用的大组织样本进行前所未有的成像和分析。
在一些实施例中，圆柱形样本保持器包括样本容器保持器和可拆卸的板状样本容器，该可拆卸的板状样本容器被配置成缠绕并附接到样本容器保持器。在一些实施例中，圆柱形样本保持器包括用于保持样本的凹槽、阱等。在一些实施例中，圆柱形样本保持器还包括覆盖所述凹槽、阱等的薄板或薄膜形式的盖子，以便在其中容纳样本，所述盖子优选具有接近水的折射率的折射率。
在一些实施例中，该设备还包括布置成紧邻圆柱形样本保持器的面向外的表面的涂覆设备，用于在旋转期间在该表面上铺展液体层。在一些实施例中，涂覆设备由附接到显微镜物镜的显微镜载玻片形成，其中显微镜载玻片被布置成紧邻圆柱形样本保持器的面向外的表面。
根据本文所示的其他方面，提供了一种对样本成像的方法，包括：
a)在可旋转地布置的样本保持器的表面处提供待成像的样本；
b)在线焦点或焦点阵列中同时照射所述样本，并检测在视场阵列中同时从样本发射或散射的光子，使得样本中的子观察体积的阵列(光子在成像期间从其中发射或散射)由其中来自照明装置的线焦点或焦点阵列与检测装置的相应视场阵列重叠的空间中的体积限定；和
c)通过在成像期间旋转样本保持器，将所述样本的至少一部分传输通过所述子观察体积的至少一个。
该方法可以有利地在如上文所述的设备中执行，并且参考该设备描述的特征和优点同样适用于该方法。
在一些实施例中，所述检测具有与样本中的一个点通过子观察所用的时间的相同数量级的检测***上升时间，或者更短。
在一些实施例中，所述样本保持器是圆柱形的，并且待成像的样本布置在圆柱形样本保持器的侧表面处。
在一些实施例中，样本相对于子观察体积以1-100m/s、优选地5-50m/s、更优选10-30m/s的范围内的速度旋转。
在一些实施例中，所述子观察体积的阵列被布置在优选等距的观察体积的至少一行中。沿着子观察体积的所述至少一行绘制的虚拟线和传输通过该行的至少一个子观察体积的样本的运动向量之间的角度优选大于零。
在一些实施例中，所述子观察体积的阵列被布置在优选等距的观察体积的平面网格中。子观察体积的所述网格的虚拟平面的法向量和传输通过该行的子观察体积的至少一个的样本的运动向量优选是非垂直的。
在一些实施例中，检测是使用盖革模式下的雪崩光电二极管检测器、优选盖革模式下运行的门控雪崩光电二极管检测器来进行。
在一些实施例中，在旋转期间，样本被布置在离样本保持器的旋转轴近恒定的径向距离处。在一些实施例中，样本保持器通过空气轴承悬挂。
在一些实施例中，该方法还包括测量样本和子观察体积的阵列之间的相对、切向和/或径向位置，样本保持器每旋转一圈至少测量一次，以便将检测到的信号与样本内的相应绝对位置相关联。
在一些实施例中，在旋转期间，样本沿着圆柱形样本保持器的旋转轴传输。
布置在样本保持器上的样本的厚度通常可以高达约250μm，更典型地高达约150μm，诸如高达约100μm或高达约50μm。布置在样本保持器上的样本的厚度将通常大于1μm，通常大于5μm。
在一些实施例中，样本包括有机物。在一些实施例中，样本包括生物材料。在一些实施例中，样本包括一个或更多个细胞，例如活细胞。
在一些实施例中，该方法还包括在旋转期间在圆柱形样本保持器的面向外的表面上展铺液体层。
从下面的详细描述和所附权利要求中，本发明的其它方面和优选实施例将是明显的。
附图简述
在下面跟随的详细描述中，将对附图进行参考，其中
图1示意性地示出根据本发明的实施例的装置的一般设置；
图2a和2b示意性地图示根据本发明的实施例照明和检测如何协作地限定子观察体积阵列；以及
图3a和3b示意性地示出用于探测样本的发明性布置的放大视图。
详细描述
图1中示意性地描绘了本发明的实施例。来自一个或更多个光源101(优选为激光二极管)的准直光束经由二向色分束器102合并成同一光束。然后，所述准直光束可选地经由反射镜103入射到微透镜阵列104上，在所述微透镜阵列的另一侧上的焦平面105中生成焦点阵列。焦距为ft的镜筒透镜106放置成其焦平面与微透镜阵列104的焦平面重合。因此，所述镜筒透镜在不同角度处生成相应的准直光束阵列。然后，这个准直光束阵列被呈45度角的第二分色镜(dichroic mirror)107反射，且随后入射到物镜108上。所述物镜优选被放置成使得所述物镜的孔径被放置在镜筒透镜106的焦平面处。这样，最大光落在物镜108的孔径内。光通过物镜的通路生成焦点阵列，该焦点阵列限定了正在研究的旋转样本109经过的体积中的子观察体积。子观察体积的数量可以很容易地达到一百或甚至一千，从而允许共聚焦显微镜的大规模并行化。
然后，来自照射样本109中的子观察体积的散射光或荧光被同一物镜108收集并将再次准直通过第二分色镜107，该照射样本109被布置在可选地由样本容器110a和样本容器保持器110b组成的样本保持器110上。然后，第二镜筒透镜106b在针孔阵列111(或可选的光纤)上生成子观察体积的图像，该针孔阵列在来自每个子观察体积的光经由光纤束112入射到检测器113上之前对光进行空间滤波，该检测器优选为以盖革模式运行的雪崩光电二极管阵列。来自检测器113的信号在信号处理单元114中处理。
根据应用，用于生成照射光的激光二极管可以在连续波模式下运行或者在脉冲模式下运行。如果照射光用于激发荧光团，脉冲光有时是有利的。此外，选择高功率二极管激光器是有益的。然而，这种激光器通常在一个方向上表现出多模行为。为了避免所述多模行为恶化图像质量，将激光束准直为大直径光束是有利的。激光二极管的准直优选通过物镜来实现。用于准直到大直径光束的原因在于，激光器的图像随后落入所述微透镜阵列的焦平面中的微透镜的衍射极限内，因此被镜筒透镜视为点源。换句话说，微透镜还充当空间滤波器。
所谓的微透镜阵列的功能实质上是在随后的镜筒透镜的焦平面中实现虚拟点源阵列。所述功能可以以多种方式实现。一种方法是使用微透镜阵列，基本上是集成了小透镜阵列的平板。另一种方法是依次使用两组正交定向的柱面透镜，它们共享一个公共焦平面。这样就有可能调整观察体积中焦点之间的距离。
因此，光学设置产生子观察体积(体素)的线性或二维阵列，如图2a和2b示意性所示。在图2a中，子观察体积201a的线性阵列被布置在优选等距的观察体积的至少一行202a中。沿着子观察体积的所述至少一行绘制的虚拟线203a和传输通过该行的子观察体积的至少一个的样本的运动向量“v样本”之间的角度“α”大于零。在图2b中，子观察体积201b的二维阵列被布置在优选等距的观察体积的平面网格202b中。子观察体积的所述网格的虚拟平面203b的法向量“n”和传输通过该行的子观察体积的至少一个的样本的运动向量“v样本”是非垂直的。
由于样本移动通过体素阵列，因此在不同时间处会观察到样本的不同部分。每个体素平移通过比由体素(子观察体积)本身所覆盖的体积大许多数量级的体积。因此，通过将高带宽时间分辨检测器与所研究样本的匹配高平移速度相结合，可以对样本中的非常大量点进行成像或分析。
如上面所概括的，通过旋转的方式使得样本通过观察体积。这种布置用于实现几个有利的特性。一旦样本保持器达到期望的转速并且该速率保持恒定，那么作用于样本的仅有的力是离心力和由保持器的内壁作用于样本的法向力，也就是说如果样本放置在样本保持器内部的话。如果样本反而被放在样本保持器的外部，那么仅有的力是离心力以及样本和样本保持器之间的粘附力。这种粘附力惊人地大，并且只要样本层很薄，则转速仍然可能远远超过3000rpm。因此，样本在受控位置中被保持在机械平衡的状态中。此外，作为运动手段的旋转在精度方面是有利的。通过使用现有技术的轴承技术并通过仔细平衡样本保持器，可以实现样本的足够受控的轨迹。在稳态下，即在恒定转速处，在通过观察体积时样本容器保持器的位置可以被很好地控制在单个体素的尺寸内，即，大约为所检测的光的波长的一半。
在本发明的优选实施例中，样本保持器的旋转通过以下布置实现：旋转生成机构，其通常是无刷DC电动机，优选通过感应力或磁力将其转子轴的角动量传送给样本保持器，使所述样本保持器以相同的速率旋转。优选地由金属或玻璃制成的样本保持器理想地是空心或实心圆柱体，即管或杆。为了实现平滑且精确的旋转，优选的是，所述样本保持器被设计和制造为使得它围绕轴线沿着其长度是对称的，并且使得质量在从轴线开始的所有径向方向上被均匀分布。
还为了确保围绕其轴线的平滑且可重复的旋转，旋转的样本保持器通过轴承(优选地为空气轴承或电动力轴承)被保持在适当位置，以实现无接触悬挂，所述轴承被组装在所述旋转的样本保持器和内部或外部的固定零件之间。
在一些实施例中，圆柱形样本保持器包括用于保持样本的凹槽、阱等。在一些实施例中，圆柱形样本保持器还包括覆盖所述凹槽、阱等的薄板或薄膜形式的盖子，以便在其中容纳样本，所述盖子优选具有接近水的折射率的折射率。在一些实施例中，样本保持器由样本容器保持器和可拆卸样本容器组成。样本容器通常可以是板状的，并且被配置成缠绕并附接到样本容器保持器。
样本保持器的一部分可以延伸到零件的外部，使得对于样本容器的手动或自动附接或直接对样本同样是可接入的。
样本保持器可以以多种方式设计。然而，样本容器在理想情况下应该容易地附接到样本容器保持器、以使得其不偏移样本保持器的重心的方式成型、在化学上是惰性的、提供对样本或样品的保护以及与工业的测定的标准程序兼容。
在本发明的一个实施例中，样本容器包括板状机构。所述机构的厚度被选择为使得在没有冒着断裂的危险的情况下机构可以弯曲到与样本容器保持器的至少一部分的外表面相同的半径。板状机构的一侧可以装备有阱、凹槽、脊或类似的图案，其中可以装配样本或样品和/或用液体冲洗样本以执行测定。
在一个实施例中，样本从旋转轴面向外放置，并通过样本和样本容器之间的粘附力保持就位。
在又一个实施例中，在所述板状机构上，优选惰性聚合物的光学透明薄板或膜作为盖子附接在板状机构的图案化侧上，以封闭和保护已经放在同一侧上的样本或样品。盖子的另一个功能是用作最外层，当样本由于旋转的离心力被向外推动时在样本上提供法向力。聚合物盖的第三功能是使样本或样品与样本容器之间的反射最小化。在一个实施例中，盖子被选择为具有的折射率接近水的折射率的材料，例如，Cytop。在另一实施例中，盖子被选择为接近与显微镜载玻片302的折射率相同的折射率。
从上面明显的是，照明装置和检测装置两者的大数值孔径(N.A.)是优选地以获得高分辨率成像。大N.A.的另一个优点在于它增加了检测装置捕获从调查研究中的样本散射或发射的光的能力。考虑到可能需要检测低水平的光，特别是在荧光光谱学应用中，这可能是重要的。然而，高N.A.引入了挑战，因为这意味着从照明装置进入样本体积的光和从样本体积散射或发射的光需要能够以相对于旋转的样本保持器的表面的法向量的大角度这样做。这意味着，除非耦合以某种方式减轻，否则光将由于反射而损失。装置可优选地被引入以便于以大角度将到达样本容器和来自样本容器的光耦合。
图3a中描绘了光学耦合装置的一个实施例。离开物镜301的光将在所述物镜的出射表面处受到折射率变化。物镜可以被设计成最小化由于该折射率变化引起的反射和像差，并且在优选实施例中，物镜被设计用于近似为水的折射率的外部折射率。在适当地在物镜的工作距离内的一段距离处，显微镜载玻片302(即，玻璃、石英或其他透明材料的平片)被固定到物镜301上。具有的折射率接近于水的折射率的一滴浸油303填充物镜301的出射表面和载玻片302之间的空间。旋转的样本保持器304然后被定位成使得布置在样本保持器304的样本容器304a处的样本305通过如上所述的紧邻载玻片302的子观察体积。随后，样本被水或折射率接近水的液体的液体层306覆盖，使得在样本的旋转期间所述显微镜载玻片可以在所述液体层上滑动。所述液体层306通过在样本上沉积适量的所述液体来实现。由于样本的旋转，液滴将分散以形成围绕圆柱形样本保持器304的带状层。为了避免所述液体层带进一步变窄并逐渐从旋转样本上脱落，液体层带通过涂覆设备进一步分散，以形成围绕样本保持器的更宽且更薄的液体带。所述液体涂覆设备可以附接到物镜上，或者放置在靠近旋转样本的面向外的表面的某个地方。在优选实施例中(如图3a所示)，液体涂覆设备由安装在物镜301上的固定载玻片302组成。在另一个实施例中，液体涂覆设备由细刷组成。
得到的均匀液体层用作物镜和样本之间的折射率匹配，从而减少照明光或待检测的期望光信号的杂散散射，其否则将会使图像显著模糊。此外，所述液体层防止样本变干燥。
为了最小化附接到物镜301的固定载玻片302和样本顶部上的旋转液体层306之间的摩擦，载玻片面向水的表面优选覆盖有薄疏水层307，例如一层Cytop。显微镜载玻片产生光束的轻微视差，但这也可以通过选择与所述显微镜载玻片的厚度相匹配的合适显微镜物镜来补偿。
在图3b中描绘的另一个实施例中，样本305并非是面向液体层306，而是被保持样本就位的盖子308覆盖。盖子308优选由板制成，该板的折射率优选接近于水的折射率，且其厚度使得其能够容易地围绕样本保持器304弯曲。该设置在其他方面与图3a中所描绘的设置相同。液体层以与上述相同的方式沉积，但是现在沉积在盖子308的外表面上。
如上所述，样本相对于子观察体积的阵列的运动轨迹优选地被选择成使得在沿着阵列中的子观察体积的一个这样的行绘制的虚拟线和样本的运动向量之间有适当的角度。并且如果需要，相应地在第三维中，即样本的深度维度，这可以通过在样本以适当角度传输通过观察体积的同时选择样本的运动向量来实现，该运动向量不垂直于通过子观察体积的阵列绘制的虚拟平面的法向量。这要求旋转样本保持器的旋转轴可以相对于子观察体积阵列的轴转动，且物镜的轴可以相对于样本保持器的法向量倾斜。优选地，该装置包括调节这些角度的装置。
在又一实施例中，深度维度可以通过改变物镜和样本之间的距离来覆盖。然而，深度不能在一次通过中被覆盖，而必须在连续的旋转圈中被覆盖。
如前所提及，在优选实施例中，检测器是以盖革模式操作的雪崩光电二极管检测器(APD)。APD有时也被称为SPAD(单光子雪崩二极管)。当荧光标记用于实现特异性时，这一点尤为重要。在这种应用中，来自体素内的荧光团的光子被检测到的复合可能性相当小。增加这种可能性的方法是增加停留时间，即荧光团停留在照射的体素内的时间。这样，荧光团可以以增加的次数被激发并且发出荧光，并且因此检测到光子的可能性增加。然而，还如以上所讨论的，增加停留时间降低了吞吐量，并且尽管这可以通过增加并行化程度来补偿，但是这种方法存在限制。增加停留时间还意味着增加检测装置的积分时间，这意味着我们增加包括放大器级的检测器的暗计数。事实上，噪声电平随积分时间线性增加。在盖革模式中的APD具有非常大的内部放大(通常大约为106以上)，并且这意味着即使单个光子也能产生强信号。在一些实施例中，停留时间被选择为约100ns。在这个时间期间一个光子被检测到的可能性约为一。由于当光子将到达时在小于100ns内是已知的，所以积分时间仅需要为该量级或更小。因此，积分噪声将相对较低。在具有1kHz的帧率的旋转盘中，积分时间需要长10000倍，具有低得多的放大率、针孔串扰等。因此，本发明的方法优于具有低光级的应用。
使用在盖革模式下的APD的一个可能的缺点在于响应与到达检测器的光量不是线性的。这意味着成像中没有灰度。每个体素不是黑色就是白色。然而，在目标应用中，这不是问题。本发明的装置确定体素中是否存在分子、荧光团等。
当在盖革模式下运行时，APD以高于APD的击穿电压的反向电压操作。结果，放大率可以高达10到6的幂。然而，通过将反向电压降低到击穿电压以下几伏，放大率下降到小于1。事实上，盖革模式操作的APD需要对其信号电流进行限制并迅速减小。原因在于一旦触发，雪崩最终电流会继续流动，从而使该设备无法用于后续检测。因此，雪崩过程必须停止，之后设备必须恢复到其静止状态。在优选实施例中，有源和无源电流淬火技术都被用于这个目的。
在本发明的一些实施例中，待检测的信号源自单个激光脉冲。在这些情况下，信号仅出现在激光脉冲之后的明确定义的时间间隔中，因此仅在该时间间隔中激活检测器可能是方便的。此外，在激光诱导荧光的情况下，激光脉冲可以如此强烈以至于完全淹没了信号。同样，在激光脉冲存在的情况下，二极管可以保持不活动，并在之后立即重新激活。这种操作模式被称为门控模式，并且在于保持偏置电压低于击穿电压，并在与预期信号到达一致的明确定义的时间段内将其增加到预期电平。
本发明的另一目的是在使用该方法或设备时保持工作流程简单。样本的成像通常仅是测定中的许多步骤中的一个步骤。在大多数测定中，在成像之前，样本已经通过了许多制备程序，诸如扩增、沉淀、洗涤等。在工业应用中，这种测定是使用板、皿、微阵列或一些其他类型的样本容器的自动化程序，以有效地限制样本和将其运输通过过程的各个部分。所述样本容器通常包括大量***排列的阱，以能够以多种组合测试许多目标(分析物)和试剂。在许多实验室中，存在满足测定的自动化的设备的大的安装基础，并因此如果在本发明中使用的样本容器遵守这些标准程序，则是有利的。为此，在本发明的实施例中，样本被放置在平面或板状样本容器上。所述样本容器优选地由材料或材料的组合制成，并且具有适当的尺寸，以便足够柔性地附接到样本容器保持器上，使得其遵循样本容器保持器的曲率或形状。以这种方式，样本容器可以在处于平面形式时与标准制备程序兼容，并且然后认为样本容器保持器的形状符合本发明的意图。
利用本发明的另一个显著优点在于其从观察体积中的体素或体素集获取强度的快照，即现场记录。与当前现有技术不同，当样本在观察体积中时，不需要记录强度的时间分布。这意味着样本通过观察体积的速度可以达到比迄今为止可能的量级高的数量级。(通常，转速将约为每秒100转，并且样本通过观察体积的速度约为每秒几米至几十米。)通过以高速(通常为10m/s)移动样本体积通过观察体积，与当前现有技术例如常规共聚焦显微镜相比较，本发明因此能够筛选大的样本体积。
由本发明提供的另外的优点是不需要任何模式识别算法来接收或分析检测到的信号。由于每个体素的位置被称为时间的函数，并且来自每个体素的光的强度被瞬时检测，所产生的数据表示已经通过观察体积的整个体积的高分辨率三维图。
相同体积可以被一圈又一圈观察到的旋转的高精度实现了对细胞中或溶液中的颗粒的运动(至少统计上)的连续观察。由于向心力或由于施加的电场，运动可能是预期的随机游动。关于样本或样品的非常重要的信息可以从运动数据特别是从运动的缺乏中推断出。
与使用CCD或CMOS传感器的现有技术方法相比，利用本发明的另一个明显优点是改进了光功率预算。为了从荧光团获得最大数量的荧光光子，这在低浓度应用中至关重要，通常需要用激发光(照明光)使荧光团饱和。这意味着一旦被激发的荧光团发射出光子，它将很可能会立即再次被激发。这样荧光团将发射最大数量的光子。在本发明中，检测装置当时仅观察有限的体积，即复合子观察体积。也是在同一时间期间，只有所述复合子观察体积被照射。因此，用于照明的光源所需的总功率是使单个子观察体积中的荧光团饱和所需的功率乘以所使用的子观察体积的数量。假设100个子观察体积和每个子观察体积大约0.5mWatts的饱和功率，照明源的功率需要大约1瓦特，包括50％的损耗。在成像的技术现状下，用大约100万像素的CMOS或CCD传感器达到饱和需要1kW的功率。这需要昂贵得多的光源和复杂的冷却装置。
本领域中的技术人员认识到，本发明决不限于本文所述的优选实施例。相反，很多修改和变化在所附权利要求的范围内是可能的。另外，技术人员在实践所要求保护的本发明时通过研究附图、本公开及所附权利要求书能够理解并实现所公开实施例的变型。在权利要求中，词语“包括(comprising)”不排除其它元件或步骤，并且不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”不排除多个。某些措施在相互不同的从属权利要求中列出的不争事实并不指示这些措施的组合不能有利地被使用。

Claims (30)

1.一种用于对样本成像的设备，所述设备包括：
照明装置，其用于在线焦点或焦点阵列中同时照明所述样本；和
检测装置，其用于检测在视场阵列中同时从样本发射或散射的光子；
其中，光子在成像期间从其被发射或散射的、在样本中的子观察体积的阵列由其中来自所述照明装置的所述线焦点或焦点阵列与所述检测装置的相应的视场阵列重叠的空间中的体积限定；
其特征在于，所述设备包括圆柱形样本保持器，所述圆柱形样本保持器包括旋转轴和围绕所述旋转轴径向对称的向外的侧表面，所述圆柱形样本保持器被配置成将所述样本保持在其侧表面处，所述圆柱形样本保持器被可旋转地布置，使得通过围绕所述旋转轴旋转所述圆柱形样本保持器，所述样本的至少一部分能够被传输通过所述子观察体积中的至少一个，来自所述照明装置的所述线焦点或焦点阵列和所述检测装置的相应的视场阵列的中心轴线基本上平行，
所述设备还包括涂覆装备，所述涂覆装备被布置为在旋转期间将液体层铺展在所述圆柱形样本保持器的向外的侧表面上。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，所述检测装置具有与所述样本中的一个点通过子观察体积所用的时间相同数量级或者更短的检测***上升时间。
3.根据权利要求1所述的设备，其中，所述子观察体积的阵列被布置在观察体积的至少一行中。
4.根据权利要求3所述的设备，其中，在沿着子观察体积的所述至少一行绘制的虚拟线和传输通过所述行的子观察体积中的至少一个子观察体积的样本的运动向量之间的角度大于零。
5.根据权利要求1所述的设备，其中，所述子观察体积的阵列被布置在观察体积的平面网格中。
6.根据权利要求5所述的设备，其中，子观察体积的所述网格的虚拟平面的法向量和传输通过所述网格的行的子观察体积中的至少一个子观察体积的样本的运动向量是非垂直的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述照明装置包括微透镜阵列。
8.根据权利要求1-6中的任一项所述的设备，其中，所述检测装置包括针孔阵列或者光纤阵列。
9.根据权利要求8所述的设备，其中，每个子观察体积由所述检测装置分别通过所述针孔阵列或光纤阵列的单独针孔或光纤来观察，所述针孔或光纤在平行于所述照明装置的所述线焦点或焦点阵列的维度中限定每个子观察体积。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述检测装置包括盖革模式下的雪崩光电二极管检测器。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，在旋转期间，所述样本被布置在离所述样本保持器的旋转轴接近恒定的径向距离处。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述样本保持器通过空气轴承悬挂。
13.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，还包括用于所述样本保持器每旋转一圈对所述样本和所述子观察体积的阵列之间的相对位置和/或切向位置和/或径向位置至少测量一次以便将检测到的信号与所述样本内的相应绝对位置相关联的装置。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述圆柱形样本保持器沿着其旋转轴可移动地布置，使得所述样本保持器能够在旋转期间沿着所述样本保持器的旋转轴传输。
15.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述圆柱形样本保持器包括样本容器保持器和可拆卸的板状样本容器，所述可拆卸的板状样本容器被配置成缠绕并附接到所述样本容器保持器。
16.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述圆柱形样本保持器包括用于保持所述样本的凹槽或阱。
17.根据权利要求16所述的设备，其中，所述圆柱形样本保持器还包括覆盖所述凹槽或阱的薄板或薄膜形式的盖子，以便将所述样本容纳在其中，所述盖子具有接近水的折射率的折射率。
18.根据权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述涂覆装备由附接到显微镜物镜的显微镜载玻片形成，其中所述显微镜载玻片被布置成紧邻所述圆柱形样本保持器的面向外的表面。
19.一种对样本成像的方法，包括：
a)在可旋转地布置的样本保持器的表面处提供待成像的样本；其中所述样本保持器是圆柱形的并且包括旋转轴和围绕所述旋转轴径向对称的向外的侧表面，并且其中待成像的样本布置在所述圆柱形样本保持器的侧表面处；
b)在线焦点或焦点阵列中同时照射所述样本，并检测在视场阵列中同时从样本发射或散射的光子，使得光子在成像期间从其发射或散射的样本中的子观察体积的阵列由其中来自照明装置的所述线焦点或焦点阵列与检测装置的相应视场阵列重叠的空间中的体积限定；其中，来自所述照明装置的所述线焦点或焦点阵列和所述检测装置的相应的视场阵列的中心轴线基本上平行；
c)通过在成像期间围绕所述旋转轴旋转所述样本保持器，将所述样本的至少一部分传输通过所述子观察体积中的至少一个；以及
d)在旋转期间将液体层铺展在所述圆柱形样本保持器的向外的侧表面上。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述检测具有与所述样本中的一个点通过子观察体积所用的时间的相同数量级或者更短的检测***上升时间。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述子观察体积的阵列被布置在观察体积的至少一行中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，在沿着子观察体积的所述至少一行绘制的虚拟线和传输通过所述行的所述子观察体积中的至少一个子观察体积的样本的运动向量之间的角度大于零。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，所述子观察体积的阵列被布置在观察体积的平面网格中。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，子观察体积的所述网格的虚拟平面的法向量和传输通过所述网格的行的子观察体积中的至少一个子观察体积的样本的运动向量是非垂直的。
25.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，检测是使用在盖革模式中的雪崩光电二极管检测器来进行的。
26.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，在旋转期间，所述样本被布置在离所述样本保持器的旋转轴接近恒定的径向距离处。
27.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，所述样本相对于所述子观察体积以1-100m/s的范围内的速度旋转。
28.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，还包括所述样本保持器每旋转一圈对所述样本和所述子观察体积的阵列之间的相对位置和/或切向位置和/或径向位置至少测量一次，以便将检测到的信号与所述样本内的相应绝对位置相关联。
29.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，在旋转期间，所述样本沿着所述圆柱形样本保持器的旋转轴传输。
30.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，还包括在旋转期间在所述圆柱形样本保持器的面向外的表面上展铺液体层。
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