CN108699141B - 高亲和性抗vegf抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供一种对VEGF具有显著高于现有技术的亲和性的抗体。本发明提供一种针对VEGF的单克隆抗体，其以1x10‑11mol/L以下的解离常数与血管内皮生长因子(VEGF)结合。

Description

高亲和性抗VEGF抗体
技术领域
本发明涉及高亲和性抗VEGF抗体。
背景技术
发明的背景
血管内皮生长因子(VEGF)是能够在生物体内诱导血管形成(血管新生)、在血管内皮细胞中特异性表达的肝素结合型的生长因子。人VEGF蛋白于1989年得到纯化及鉴定，此外，已经克隆了其基因，并对其基因序列进行了测序。
VEGF能够促进血管形成，属于VEGF家族的所有成员通过与存在于细胞膜表面上的对应于各家族分子的受体(VEGFR)结合而对细胞进行活化。这些受体组通过结合VEGF而二聚体化，结果受到自磷酸化而被活化。VEGFR包含7个免疫球蛋白样细胞外结构域、1个跨膜结构域及包含酪氨酸激酶区域的1个细胞内结构域。VEGF-A能够与VEGF受体-1(受体Flt-1)及VEGF受体-2(KDR/Flk-1)结合。VEGF受体、尤其是VEGF受体-2介导了VEGF的几乎全部已知的生物学功能。关于VEGF的生理活性及其受体，Marti等(非专利文献1：Angiogenesis inischemic desease.Thromb.Haemost.1999.補遺1：44-52)及Matsumoto等(非专利文献2：VEGF Receptor Signal Transduction.Sci.STKE.2001.re21)进行了详细研究。
在美国及欧洲，在结肠直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、中枢神经系的神经胶质瘤及老年黄斑变性(AMD)的治疗中使用作为基因重组型抗VEGF人源化单克隆抗体的阿瓦斯汀(注册商标)(贝伐珠单抗)。阿瓦斯汀的2013年度销售额达到67亿4600万美元，但是对VEGF不具有高亲和性(非专利文献3：Aflibercept as a Treatment for Age-related MacularDegeneration.US Ophthalimic Rev.2013.6:58-63)。进而，由于阿瓦斯汀的独占性的制造、销售方式，需要使用其的患者要支付高昂的医疗费。因此，从减轻患者的负担、削减其治疗费的观点出发，也需要开发新的抗VEGF单克隆抗体。
并且，截止目前为止，已经开发出对VEGF的亲和性高于阿瓦斯汀的抗体，该抗体与阿瓦斯汀相比显示出优异的高肿瘤抑制(专利文献1：日本特表2013-502445号公报)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2013-502445号公报
非专利文献
非专利文献1：Marti et al.,Thromb.Haemost.1999.增补1：44-52
非专利文献2：Matsumoto et al.,VEGF Receptor SignalTransduction.Sci.STKE.2001.re21
非专利文献3：US Ophthalimic Rev.,2013.6:58-63
发明内容
发明要解决的问题
本发明是鉴于这种状况而作出的，其所要解决的技术问题在于，提供一种新抗体，其以高于现有技术的亲和性与血管内皮生长因子(VEGF)结合，抑制VEGF与VEGF受体的结合，从而抑制VEGF的生理活性。
用于解决问题的方案
本发明人们为了解决上述技术问题反复进行了研究，结果制作出以高亲和性与VEGF结合的抗体，发现该抗体抑制VEGF的生理作用，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)一种针对VEGF的单克隆抗体，其以1x10-11mol/L以下的解离常数与血管内皮生长因子(VEGF)结合。
(2)根据上述(1)所述的单克隆抗体，其抑制血管内皮生长因子(VEGF)与选自由血管内皮生长因子受体-1(VEGFR1)及血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)组成的组中的至少1种受体的结合。
(3)一种单克隆抗体，其与上述(1)或(2)所述的单克隆抗体所结合的部位进行结合。
(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体，其中，单克隆抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其包含：含有序列号14的氨基酸序列的CDR-H1、含有序列号16的氨基酸序列的CDR-H2及含有序列号18的氨基酸序列的CDR-H3。
(6)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其包含：含有序列号20的氨基酸序列的CDR-L1、含有氨基酸序列Trp-Ala-Ser的CDR-L2及含有序列号22的氨基酸序列的CDR-L3。
(7)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其包含含有序列号14的氨基酸序列的CDR-H1、含有序列号16的氨基酸序列的CDR-H2及含有序列号18的氨基酸序列的CDR-H3，并且包含含有序列号20的氨基酸序列的CDR-L1、含有氨基酸序列Trp-Ala-Ser的CDR-L2及含有序列号22的氨基酸序列的CDR-L3。
(8)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其包含：含有序列号24的氨基酸序列的CDR-H1、含有序列号26的氨基酸序列的CDR-H2及含有序列号28的氨基酸序列的CDR-H3。
(9)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其包含：含有序列号30的氨基酸序列的CDR-L1、含有氨基酸序列Gly-Thr-Asn的CDR-L2及含有序列号32的氨基酸序列的CDR-L3。
(10)根据上述(1)～(4)中任一项所述的抗体，其包含含有序列号24的氨基酸序列的CDR-H1、含有序列号26的氨基酸序列的CDR-H2及含有序列号28的氨基酸序列的CDR-H3，并且包含含有序列号30的氨基酸序列的CDR-L1、含有氨基酸序列Gly-Thr-Asn的CDR-L2及含有序列号32的氨基酸序列的CDR-L3。
(11)根据上述(7)或(10)所述的抗体，其还含有源自人IgG1重链恒定区的氨基酸序列及源自人IgG1轻链恒定区的氨基酸序列。
(12)根据上述(11)所述的抗体，其中，源自人IgG1重链恒定区的氨基酸序列含有序列号42的氨基酸序列，并且源自人IgG1轻链恒定区的氨基酸序列含有序列号44的氨基酸序列。
(13)根据上述(12)所述的抗体，其包含：含有序列号34或38的氨基酸序列及序列号42的氨基酸序列的重链、及含有序列号36或40的氨基酸序列及序列号44的氨基酸序列的轻链。
(14)根据上述(7)或(10)所述的抗体，其还含有源自犬IgGB重链恒定区的氨基酸序列及源自犬Ig轻链(κ链)恒定区或犬Ig轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
(15)根据上述(14)所述的抗体，其中，源自犬IgGB重链恒定区的氨基酸序列含有序列号46的氨基酸序列，源自犬Ig轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列含有序列号48的氨基酸序列，并且源自犬Ig轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列含有序列号50的氨基酸序列。
(16)根据上述(15)所述的抗体，其包含：含有序列号34或38的氨基酸序列及序列号46的氨基酸序列的重链、及含有序列号36或40的氨基酸序列及序列号48或50的氨基酸序列的轻链。
(17)一种上述(1)～(16)中任一项所述的单克隆抗体的片段。
(18)根据上述(17)所述的片段，其中，片段为抗原结合片段。
(19)根据上述(18)所述的片段，其中，抗原结合片段为单链抗体或双链抗体。
(20)一种杂交瘤，其产生上述(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体。
(21)一种药物组合物，其含有上述(1)～(19)中任一项所述的单克隆抗体或其片段。
(22)根据上述(21)所述的药物组合物，其用于VEGF介导性疾病的治疗或预防。
(23)根据上述(22)所述的药物组合物，其中，VEGF介导性疾病为癌症或VEGF介导性眼科疾病。
(24)根据上述(23)所述的药物组合物，其中，癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防基于血管新生或血管通透性亢进的抑制。
(25)根据上述(24)所述的药物组合物，其中，血管新生为病理性血管新生。
(26)根据上述(23)或(24)所述的药物组合物，其中，癌症为实体癌或血液肿瘤。
(27)根据上述(23)或(24)所述的药物组合物，其中，癌症选自由结肠直肠癌、直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、类癌瘤(carcinoid)、头颈部癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤(Mesothelioma)及多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)组成的组。
(28)根据上述(23)或(24)所述的药物组合物，其中，VEGF介导性眼科疾病为选自老年黄斑变性、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、血管新生性青光眼、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、继发于病理性近视的脉络膜血管新生性疾病、翼状胬肉(pterygium)、虹膜红变、角膜翳(Pannus)、皮肤粘膜眼综合症(mucocutaneous-ocularsyndrome)及眼部的移植组织免疫排斥中的至少1种。
(29)一种血管新生抑制剂，其含有上述(1)～(19)中任一项所述的单克隆抗体或其片段。
(30)一种试剂，其含有上述(1)～(19)中任一项所述的单克隆抗体或其片段。
(31)一种试剂盒，其含有上述(1)～(19)中任一项所述的单克隆抗体或其片段。
(32)一种癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法，其包含如下步骤：将治疗上有效量的上述(1)～(19)中任一项所述的抗体或其片段给药于受试者。
(33)根据上述(1)～(19)中任一项所述的抗体或其片段，其用于在癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法中使用。
(34)根据上述(1)～(19)中任一项所述的抗体或其片段，其用于在用来治疗或预防癌症或VEGF介导性眼科疾病的药物的制造中使用。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种针对VEGF的新的抗体，其以与现有技术相比非常高的亲和性与血管内皮生长因子(VEGF)结合，抑制与其受体的结合。
附图说明
图1是示出本发明的抗体的、VEGF和VEGFR2的结合抑制能力的研究结果的图。
图2是示出本发明的抗体的细胞生长抑制效果的研究结果的图。
图3是示出作为本发明的抗体的KLHa505的体内肿瘤增殖抑制效果的研究结果的图。
图4是示出作为本发明的抗体的KLHb1501的体内肿瘤增殖抑制效果的研究结果的图。
图5是示出作为本发明的人源嵌合抗体的KLHb1501HC的体内肿瘤增殖抑制效果的研究结果的图。
图6是示出作为本发明的犬源嵌合抗体的KLHb1501CC与犬VEGFA结合的结果的图。
图7是示出作为本发明的犬源嵌合抗体的KLHb1501CC在体内对源自人的癌细胞的肿瘤增殖抑制效果的研究结果的图。
图8是示出作为本发明的犬源嵌合抗体的KLHb1501CC在体内对源自犬的癌细胞的肿瘤增殖抑制效果的研究结果的图。
图9是示出作为本发明的人源嵌合抗体的KLHa505HC对VEGF165、VEGF121及VEGF165b的结合能力的研究结果的图。
图10是示出作为本发明的人源嵌合抗体的KLHb1501HC对VEGF165、VEGF121及VEGF165b的结合能力的研究结果的图。
具体实施方式
以下详细说明本发明。以下的实施的方式是用于说明本发明的例示，主旨并非使本发明仅限定于该实施方式。只要不脱离其主旨，则本发明可以以各种方式实施。另外，本说明书包含作为本申请优先权请求基础的2016年1月6日申请的日本专利申请(日本特愿2016-001277号)的说明书及附图中记载的内容。
1.概要
目前，作为对癌症、老年黄斑变性的治疗有效的抗VEGF抗体，已知有阿瓦斯汀，但是，已知阿瓦斯汀对VEGF的亲和性低。
针对这一点，本发明人开发了与现有技术相比对VEGF的亲和性显著高的抗体，并发现该抗体对血管新生的抑制及癌症的治疗有效。
本发明是基于这样的见解完成的。
2.血管内皮生长因子(VEGF)
VEGF是在血管新生中发挥重要作用的蛋白。VEGF通过与其受体结合而在细胞内传递信号，参与细胞***、迁移、分化诱导、血管通透性的亢进、单核细胞和巨噬细胞的活化等。
在本发明中，作为VEGF，可列举例如：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF-1、PIGF-2等，优选VEGF-A。
本发明中的VEGF可以源自任意哺乳动物，作为这样的哺乳动物，可列举例如：小鼠、大鼠、兔、犬、山羊、猴、人，优选小鼠、大鼠、犬、人。
另外，作为人VEGF-A，可列举例如：由165个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF165)、作为其亚型的由121个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF121)、由145个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF145)、由183个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF183)、由189个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF189)、由206个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF206)、与前述VEGF165的C末端区域的氨基酸序列不同的VEGF(VEGF165b)、以及它们的天然产生的等位基因型及加工型。在本发明中，作为人VEGF-A，优选VEGF121、VEGF165。VEGF由染色体6p12编码，mRNA长度为16272bp。VEGF包含外显子1～5以及6a、6b、7a、7b、8a和8b。VEGF165与NRP1、VEGFR1及VEGFR2中的每一个结合。
进而，作为犬VEGF，可列举例如：由164个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF164)、由120个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF120)、由144个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF144)、由147个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF147)、由162个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF162)、由182个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF182)、由188个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF188)、由205个氨基酸残基构成的VEGF(VEGF205)、与前述VEGF164的C末端区域的氨基酸序列不同的VEGF(VEGF164b)、以及它们的天然产生的等位基因型及加工型，但不限于这些。
在本发明中，小鼠、大鼠、犬及人的VEGF以及VEGF121和VEGF165的氨基酸序列分别示于序列号2、4、6、8、10及12。另外，编码小鼠、大鼠、犬及人的VEGF以及VEGF121和VEGF165的DNA的碱基(核苷酸)序列分别示于序列号1、3、5、7、9及11。各氨基酸序列及碱基序列分别以规定的登录号(Accession No.)登录于GenBank数据库。
小鼠VEGF的氨基酸序列：NP_001020421.2(序列号2)
大鼠VEGF的氨基酸序列：NP_114024.2(序列号4)
犬VEGF的氨基酸序列：NP_001003175(序列号6)
人VEGF-A的氨基酸序列：NP_001020537.2(序列号8)
VEGF121的氨基酸序列：ABO26344.1(序列号10)
VEGF165的氨基酸序列：AAM03108.1(序列号12)
编码小鼠VEGF的DNA的碱基序列：NM_001025250.3(序列号1)
编码大鼠VEGF的DNA的碱基序列：NM_031836.2(序列号3)
编码犬VEGF的DNA的碱基序列：NM_001003175.2(序列号5)
编码人VEGF-A的DNA的碱基序列：NM_001025366.2(序列号7)
编码VEGF121的DNA的碱基序列：EF424789.1(序列号9)
编码VEGF165的DNA的碱基序列：AF486837.1(序列号11)
本发明中使用的VEGF包括以下的(a)～(c)的蛋白质。
(a)含有序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列的蛋白质
(b)含有在序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列，并且具有与VEGF受体结合的活性的蛋白质，
(c)含有相对于序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性(homology)的氨基酸序列，并且具有与VEGF受体结合的活性的蛋白质。
在本发明中，“含有序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列的蛋白质”中包括由序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列构成的蛋白质。
另外，作为“在序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列”，可列举例如：
(i)序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中的1～10个(例如1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个)氨基酸缺失了的氨基酸序列、
(ii)序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中的1～10个(例如1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个)氨基酸被其它氨基酸置换了的氨基酸序列、
(iii)在序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中添加了1～10个(例如1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个)氨基酸的氨基酸序列、
(iv)通过上述(i)～(iii)的组合而变异的氨基酸序列，等。
在本发明中，“VEGF受体”为选自由血管内皮生长因子受体-1(VEGFR1(别名Flt-1))、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2(别名KDR))及血管内皮生长因子受体-3(VEGFR3)组成的组中的至少1种VEGF受体，优选血管内皮生长因子受体-1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)，更优选血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)。另外，“与VEGF受体结合的活性”是指与VEGF受体特异性结合的活性。关于该结合活性的有无，可以通过使用公知方法、例如免疫沉降法、蛋白质印迹、EIA(enzyme immunoassay，酶免疫测定)、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)等免疫学手法、Pull-down assay(蛋白质体外结合实验)等方法来测定。另外，“与VEGF受体结合的活性”是指：与将由序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列构成的蛋白质的活性设为100时相比，至少具有10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、优选90％以上的活性。
另外，作为本发明中的VEGF，可列举出除了序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列以外还具有与序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性(homology)的氨基酸序列、且具有与VEGF受体结合的活性的蛋白质。作为这种蛋白质，还包括具有相对于序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列有约80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同源性的氨基酸序列、且具有与VEGF受体结合的活性的蛋白质(与序列号2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列)。关于同源性，可利用使用互联网的同源检索网站，例如日本DNA数据银行(DDBJ)中的FASTA、BLAST、PSI-BLAST等同源检索。另外，还可以在National Center forBiotechnology Information(NCBI)中进行使用BLAST的检索。
为了制备上述具有变异的蛋白质而向编码该蛋白质的DNA中导入变异时，可以使用利用了Kunkel法、Gapped duplex法等定点突变诱导法的变异导入用试剂盒进行，所述试剂盒有例如QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：宝生物公司制)等。另外，可以使用“Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)”(Cold SpringHarbor Laboratory Press(2012))等中记载的定点诱变法等方法。
3.针对VEGF的抗体
在本发明中，针对VEGF的抗体(以下也称为“抗VEGF抗体”。)是指与上述VEGF特异性结合的抗体。本发明的抗VEGF抗体以高于现有技术的亲和性与VEGF结合，抑制VEGF与VEGF受体(VEGFR)的结合。
需要说明的是，已知作为抗VEGF抗体而众所已知的贝伐珠单抗(阿瓦斯汀(注册商标))与VEGF的解离常数为47.9nmol/L。
在本发明中，“抑制结合”不意味着必需100％地抑制VEGF与VEGFR的结合。本发明的抗体例如50％以上、优选60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上地抑制VEGF与VEGFR的结合。
结合抑制效果可以使用关于结合抑制试验的公知方法、例如本说明书的实施例2中使用的方法来评价。
本发明的抗体为与VEGF特异性结合、从而中和VEGF的活性的中和抗体。在本发明中，“特异性结合”是指：与靶标分子结合(反应)而与靶标分子以外的分子实质上不结合(不反应)。另外，在本发明中，“中和”是指：至少妨碍(抑制)VEGF结合于VEGFR的活性。关于结合是否为特异性的这一点的确认，可以通过免疫学手法、例如ELISA法、蛋白质印迹法或免疫组织学染色等来确认。
以下对抗VEGF抗体的制备方法进行说明。
(1)抗原的制备
使用VEGF作为用于制作本发明的抗体的免疫原。
在使用VEGF作为免疫原时，也可以使用含有VEGF的全长序列中的部分氨基酸序列的肽。关于作为抗原或免疫原使用的VEGF及变异的导入方法等的说明，如上述“2.VEGF”中的记载。
VEGF既可以是从小鼠、大鼠、犬、人等的组织、细胞中纯化出的天然型VEGF，也可以是通过基因工程学方式生产的VEGF。例如，将已确认到VEGF的生物试样用各种表面活性剂例如Triton-X、Sarkosyl等分级为可溶性级分和不溶性级分。进而，将不溶性级分溶解于尿素、盐酸胍等，使其结合于各种柱、例如肝素柱或结合树脂，从而可以得到VEGF。另外，作为抗原使用的VEGF也可以对其氨基酸序列进行测序并使用固相法等公知的蛋白质合成法或市售的蛋白质合成装置进行合成。使所合成的肽结合于匙孔戚血蓝蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin，KLH)或甲状腺球蛋白等载体蛋白质，则可以作为免疫原使用。
(2)多克隆抗体的制作
将按照前述方式制作的VEGF或部分肽的本身或与载体、稀释剂一起给药于非人哺乳动物例如兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、山羊等，从而进行免疫。使用佐剂时，每只动物的抗原给药量为0.1～10mg。作为佐剂，可列举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要通过注入静脉内、皮下或腹腔内等来进行。另外，对免疫的间隔不作特别限定，以数天至数周的间隔、优选1～2周的间隔进行2～10次、优选3～5次免疫。免疫的间隔可以由本领域技术人员在考虑所得到的抗体效价的基础上来设定。优选在进行了3～4次皮下免疫的时刻进行试采血并测定抗体效价。血清中的抗体效价的测定可通过ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)、EIA(enzyme immunoassay，酶免疫测定)、放射性免疫测定法(RIA；radioimmuno assay)等来进行。可以在确认抗体效价已充分上升之后进行放血，利用常规方法分离纯化抗体。分离纯化可以通过适宜选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等公知方法或将这些组合来进行纯化。具体而言，可以使含有目标抗体的血清通过结合有除VEGF以外的蛋白质的柱，并收集直接通过的级分，从而得到提高了对VEGF的特异性的多克隆抗体。
(3)单克隆抗体的制作
(i)抗体产生细胞的收集
与多克隆抗体的制作同样地，将VEGF或部分肽本身或与载体及稀释剂一起给药于非人哺乳动物，从而进行免疫。每只动物的抗原给药量、所使用的佐剂的种类、免疫方法、免疫的间隔与多克隆抗体的制作时相同。从最终免疫日起1～30天后、优选2～5天后选择可确认到抗体效价的个体并采集抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可列举脾细胞、淋巴细胞、末梢血细胞等，优选脾细胞或淋巴细胞。
(ii)细胞融合
为了得到杂交瘤，进行抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。融合操作可以按照已知的方法、例如Kohler等的方法实施。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的能够常规获得的细胞株化细胞。作为所使用的细胞株，优选具有药剂选择性且具有在未融合的状态下在HAT选择培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中不能生存、仅在与抗体产生细胞融合的状态下能生存的性质的细胞株。作为骨髓瘤细胞，可列举例如：P3-x63-Ag8U.1、SP2/O-Ag14、PAI、P3U1、NSI/1-Ag4-1、NSO/1等小鼠骨髓瘤细胞株、YB2/0等大鼠骨髓瘤细胞株等。
就上述骨髓瘤细胞与抗体产生细胞的细胞融合而言，可以在不含血清的DMEM、RPMI-1640培养基等动物细胞培养用培养基中将1×108～5×108个抗体产生细胞与2×107～10×107个骨髓瘤细胞混合(抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比为10：1～1：1)，在细胞融合促进剂存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以使用平均分子量为1000～6000道尔顿的聚乙二醇或仙台病毒等。另外，也可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。
(iii)杂交瘤的筛选及克隆
从细胞融合处理后的细胞中筛选作为目标的杂交瘤。作为其方法，将细胞悬浮液用例如含有10～20％的胎牛血清的RPMI-1640培养基等适当稀释后，在微量滴定板上通过有限稀释法以计算值0.3个/孔左右进行播种，向各孔中加入HAT培养基等选择培养基，此后适当更换选择培养基而进行培养。其结果是，可以将用选择培养基开始培养后的10天前后生长出的细胞作为杂交瘤来得到。
然后，对生长出的杂交瘤进行进一步筛选。杂交瘤的筛选按照常规方法即可，没有特别限定。例如，可以采集培养杂交瘤的孔中所含的培养上清的一部分并利用酶免疫测定法、放射免疫测定法等进行筛选。具体而言，使抗原吸附于96孔板后，用小牛血清进行封闭。使杂交瘤细胞的培养上清与固相化的抗原在37℃反应1小时后，使过氧化物酶标记的抗小鼠IgG在37℃下反应1小时，使用邻苯二胺作为底物进行显色。用酸使反应停止后，测定490nm的波长处的吸光度，从而可以进行筛选。通过有限稀释法等，对产生利用上述测定法时显示阳性的单克隆抗体的杂交瘤进行克隆。并且最终建立了产生与VEGF特异性结合的单克隆抗体的细胞、即杂交瘤。
(iv)单克隆抗体的收集
作为从所建立的杂交瘤中收集单克隆抗体的方法，可以采用常规的细胞培养法或腹水形成法等。就细胞培养法而言，将杂交瘤在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养培养基中以常规培养条件(例如37℃、5％CO2浓度)培养7～14天，从其培养上清中取得抗体。在腹水形成法的情况下，向与作为骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种系的动物例如小鼠(BALB/c)的腹腔内给药约5×106～2×107个杂交瘤，使杂交瘤大量增殖。然后，在1～2周后收集腹水。在上述抗体的收集方法中，在需要纯化抗体时，可以适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱、凝胶过滤、亲和色谱等公知方法或将这些组合而进行纯化。
作为本发明的抗体，可列举例如：重链可变区(VH)包含含有序列号14所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链互补决定区(CDR)1(CDR-H1)、含有序列号16所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR2(CDR-H2)和/或含有序列号18所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR3(CDR-H3)并且/或者轻链可变区(VL)包含含有序列号20所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR1(CDR-L1)、含有由色氨酸(W)-丙氨酸(A)-丝氨酸(S)构成的氨基酸序列(也称为“氨基酸序列WAS”、“氨基酸序列Trp-Ala-Ser”)或由该氨基酸序列构成的轻链CDR2(CDR-L2)和/或含有序列号22所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR3(CDR-L3)的抗体，但不限定于这些。
在另一方式中，作为本发明的抗体，可列举例如：重链可变区包含含有序列号24所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR1(CDR-H1)、含有序列号26所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR2(CDR-H2)和/或含有序列号28所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR3(CDR-H3)并且/或者轻链可变区包含含有序列号30所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR1(CDR-L1)、含有由甘氨酸(G)-苏氨酸(T)-天冬酰胺(N)构成的氨基酸序列(也称为“氨基酸序列GTN”、“氨基酸序列Gly-Thr-Asn”)或由该氨基酸序列构成的轻链CDR2(CDR-L2)和/或含有序列号32所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR3(CDR-L3)的抗体，但不限定于这些。
在又一方式中，作为本发明的抗体，可列举例如：重链可变区的氨基酸序列包含序列号34或38所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成并且/或者轻链可变区的氨基酸序列包含序列号36或40所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的抗体，但不限定于该抗体。
(4)基因重组抗体的制作
作为本发明的抗体的优选方式之一，可列举基因重组抗体。作为基因重组抗体，虽然没有限定但可列举例如：嵌合抗体、人源化抗体、犬源化抗体等。
嵌合抗体是指：将不同种动物的免疫球蛋白基因片段连接而制作的抗体。在本发明中，作为嵌合抗体，可列举例如：人源嵌合抗体、犬源嵌合抗体等，但对嵌合抗体的可变区及恒定区所来源的动物的种类不作限定。人源嵌合抗体为例如将源自小鼠的抗体的可变区连接(接合)到源自人的恒定区而成的抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,6851-6855,(1984)等)、犬源嵌合抗体为例如将源自小鼠抗体的可变区连接到源自犬的恒定区而成的抗体。在制作嵌合体时，可以利用基因重组技术容易地进行构建，以得到如此连接的抗体。在此，作为源自小鼠抗体的可变区，重链可变区可列举例如含有序列号34或38所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区，轻链可变区可列举例如含有序列号36或40所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区，但不限定于这些。
在制作人源化抗体时，可以采用被称为CDR嫁接(CDR移植)的手法。CDR嫁接是指：将互补决定区(CDR)从小鼠抗体的可变区移植到人可变区，制作框架区(FR)由源自人的序列构成且CDR由源自小鼠的序列构成的再构建的可变区的方法。然后，将这些人源化的再构建人可变区连接到人恒定区上。这种人源化抗体的制作方法在本领域中是已知的(参照Nature,321,522-525(1986)；J.Mol.Biol.,196,901-917(1987)；Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：10029-10033(1989)；日本专利第2828340号公报等)。
在此，关于在本发明的人源化抗体中能使用的源自小鼠的CDR的氨基酸序列，例如，作为重链可变区的CDR1～3(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，可列举分别含有序列号14、16及18所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区，作为轻链可变区的CDR1～3(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，可列举分别含有序列号20所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区、含有由色氨酸(W)-丙氨酸(A)-丝氨酸(S)构成的氨基酸序列(氨基酸序列Trp-Ala-Ser)或由该氨基酸序列构成的可变区和/或含有序列号22所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区，但不限定于这些。
在另一方式中，关于在本发明的人源化抗体中能使用的源自小鼠的CDR的氨基酸序列，例如，作为重链可变区的CDR1～3(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，可列举分别含有序列号24、26及28所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区，作为轻链可变区的CDR1～3(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，可列举分别含有序列号30所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区、含有由甘氨酸(G)-苏氨酸(T)-天冬酰胺(N)构成的氨基酸序列(氨基酸序列Gly-Thr-Asn)或由该氨基酸序列构成的可变区和/或含有序列号32所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的可变区，但不限定于这些。
关于犬源化抗体，也可以通过与上述人源化抗体的制作方法同样的手法来制作。
在本发明中，作为嵌合抗体及人源化抗体中能使用的人重链恒定区，可列举含有源自人IgG1重链恒定区的氨基酸序列的恒定区、例如含有序列号42所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的人重链恒定区，作为人轻链恒定区，可列举含有源自人IgG1轻链恒定区的氨基酸序列的恒定区、例如含有序列号44所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的人轻链恒定区，但不限定于这些。另外，作为编码人重链恒定区的DNA，可列举例如：含有序列号41所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，作为编码人轻链恒定区的DNA，可列举例如：含有序列号43所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，但不限定于这些。
另外，在本发明中，作为嵌合抗体及犬源化抗体中能使用的犬重链恒定区，可列举含有源自犬IgGB重链恒定区的氨基酸序列的恒定区、例如含有序列号46所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的犬重链恒定区，但不限定于这些。另外，作为嵌合抗体及犬源化抗体中能使用的犬轻链恒定区，可列举含有源自犬Ig轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列或源自犬Ig轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列的恒定区、例如含有序列号48所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的犬轻链(κ链)恒定区或含有序列号50所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的犬轻链(λ链)恒定区，但不限定于这些。另外，作为编码犬重链恒定区的DNA，可列举例如：含有序列号45所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，作为编码犬轻链(κ链或λ链)恒定区的DNA，可列举例如：含有序列号47或49所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，但不限定于这些。
在本发明中，可以以杂交瘤或从该杂交瘤提取出的DNA或RNA等为原料并基于上述已知方法制作嵌合抗体、人源化抗体、犬源化抗体。
进而，融合有本发明的抗体的蛋白质可以使用公知的基因重组方法来制作抗体的可变区和其它的蛋白质。另外，该融合蛋白可以使用交联剂将单克隆抗体和其它蛋白质交联而制作。
(5)抗体片段的制作
本发明中使用的针对VEGF的抗体的片段与VEGF特异性结合。
抗体的片段是指含有本发明的抗体的一部分区域的多肽。作为抗体的片段，优选抗原结合片段。作为抗原结合片段，可列举例如：单链抗体(scFv(single chain Fv))、sc(Fv)2)、双链抗体(Fab、Fab'、双抗体(diabody(dibodies)、dsFv)、F(ab')2等，但不限定于这些。上述抗体片段可以根据目的将本发明的抗体用各种蛋白水解酶切断而得到。
例如，Fab可以将抗体分子用木瓜蛋白酶处理而得到，F(ab')2可以将抗体分子用胃蛋白酶处理而得到。另外，Fab'可以通过切断上述F(ab')2的铰链区的二硫键而得到。
在scFv的情况下，可以取得编码抗体的H链V区域及L链V区域的cDNA并构建编码scFv的DNA。将该DNA***表达载体并将该表达载体导入宿主生物中使其表达，从而能够制造scFv。
在双抗体的情况下，取得编码抗体的H链V区域及L链V区域的cDNA，并按照肽接头的氨基酸序列长度为8个残基以下的方式来构建编码scFv的DNA。将该DNA***表达载体中，将该表达载体导入宿主生物并使其表达，从而可以制造双抗体。
在dsFv的情况下，取得编码抗体的H链V区域及L链V区域的cDNA，构建编码dsFv的DNA。将该DNA***表达载体，将该表达载体导入到宿主生物中使其表达，由此能够制造dsFv。
在本发明中，作为编码重链可变区的DNA的碱基序列，可列举例如：含有序列号33或37所示的碱基序列或由该碱基序列构成的碱基序列，作为编码轻链可变区的DNA的碱基序列，可列举例如：含有序列号35或39所示的碱基序列或由该碱基序列构成的碱基序列，但不限定于这些。
作为本发明的抗体片段的具体例子，可列举例如：重链可变区(VH)包含：含有序列号14所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR1(CDR-H1)、含有序列号16所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR2(CDR-H2)和/或含有序列号18所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR3(CDR-H3)，并且/或者轻链可变区(VL)包含：含有序列号20所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR1(CDR-L1)、含有由色氨酸(W)-丙氨酸(A)-丝氨酸(S)构成的氨基酸序列(氨基酸序列Trp-Ala-Ser)或由该氨基酸序列构成的轻链CDR2(CDR-L2)和/或含有序列号22所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR3(CDR-L3)的抗体片段，但不限定于这些。
在另一方式中，作为本发明的抗体片段的具体例子，可列举例如：重链可变区包含：含有序列号24所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR1(CDR-H1)、含有序列号26所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR2(CDR-H2)和/或含有序列号28所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的重链CDR3(CDR-H3)，并且/或者轻链可变区包含：含有序列号30所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR1(CDR-L1)、含有由甘氨酸(G)-苏氨酸(T)-天冬酰胺(N)构成的氨基酸序列(氨基酸序列Gly-Thr-Asn)或由该氨基酸序列构成的轻链CDR2(CDR-L2)和/或含有序列号32所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的轻链CDR3(CDR-L3)的抗体片段，但不限定于这些。
进而，作为本发明的抗体片段，可列举：重链可变区含有序列号34或38所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成并且/或者轻链可变区含有序列号36或40所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的抗体片段，但不限定于这些。
含有CDR的抗体片段(肽)含有VH或VL的CDR(CDR1～3)中的至少一个以上区域而构成。含有多个CDR的抗体片段可以直接或借助适当的肽接头而结合。含有CDR的抗体片段可以如下制造：构建编码抗体的VH及VL的CDR的DNA，将该DNA***到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物而使其表达，从而制造。另外，含有CDR的肽还可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)及tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。
作为编码VH的CDR1～3的DNA，可列举例如：分别含有序列号13、15及17所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，作为编码VL的CDR1～3的DNA，可列举例如：分别含有序列号19所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA、含有由胸腺嘧啶(T)-鸟嘌呤(G)-鸟嘌呤(G)-鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)-腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)-胞嘧啶(C)-胞嘧啶(C)构成的碱基序列(也称为“碱基序列TGGGCATCC”)或由该碱基序列构成的DNA以及含有序列号21所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，但不限定于这些。
在另一方式中，作为编码VH的CDR1～3的DNA，可列举例如：分别含有序列号23、25及27所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，作为编码VL的CDR1～3的DNA，可列举例如：分别含有序列号29所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA、含有由鸟嘌呤(G)-鸟嘌呤(G)-胸腺嘧啶(T)-腺嘌呤(A)-胞嘧啶(C)-胞嘧啶(C)-腺嘌呤(A)-腺嘌呤(A)-胞嘧啶(C)构成的碱基序列(也称为“碱基序列GGTACCAAC”)或由该碱基序列构成的DNA以及含有序列号31所示的碱基序列或由该碱基序列构成的DNA，但不限定于这些。
(6)结合亲和性
结合亲和性可以由结合常数(KA)及解离常数(KD)确定。亲和性平衡常数(K)由KA/KD之比来表示。该结合亲和性可以按照以下方式检测。
结合常数(KA)及解离常数(KD)可以使用表面等离子体共振(SPR)来测定，可以实时地检测结合率，进而可以采用用于监测的公知设备及方法(例如Biacore(注册商标)-3000(GE Healthcare公司)、ProteON XPR36(Bio-Rad公司)等)。
本发明的抗体能够以1×10-7mol/L以下(例如1×10-7mol/L以下、1×10-8mol/L以下、1×10-9mol/L以下，优选1×10-10mol/L以下、更优选1x10-11mol/L以下)的IC50抑制其靶标。
本发明提供一种抗体，其与本发明的针对VEGF的抗体所结合的部位结合。具体而言，本发明的针对VEGF的抗体中，包括与以1x10-11mol/L以下的解离常数与VEGF结合的针对VEGF的单克隆抗体所结合的部位结合的抗体。
本发明的抗VEGF抗体所结合的部位只要为作为抗原的VEGF的至少一部分区域即可，没有限定。作为本发明的抗VEGF抗体所结合的部位，可列举选自由外显子1、2、3、4、5、6a、6b、7a、7b、8a组成的组中的至少1区域，优选外显子1～5的区域。本领域技术人员可以基于Genbank等公知信息来确定各种VEGF的外显子1～5的区域。例如，小鼠、大鼠、犬、人的VEGF的外显子1～5的氨基酸序列分别如序列号51、52、53及54所示。
本发明的抗VEGF抗体所结合的部位(区域、表位等)或含有其的多肽可以由本领域技术人员基于本说明书的记载及表位作图、X射线结构分析等公知手法来确定。
另外，与上述单克隆抗体所结合的部位结合的抗体既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，在为单克隆抗体的情况下，可以为基因重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、犬源化抗体。
本发明的与针对VEGF的抗体所结合的部位结合的抗体是在与VEGF的结合方面与本发明的针对VEGF的抗体竞争的抗体。本领域技术人员可以理解，在与VEGF的结合方面与本发明的针对VEGF的抗体竞争的抗体具有与本发明的抗体(即，以1x10-11mol/L以下的解离常数与VEGF结合的、针对VEGF的单克隆抗体)同等的特异性和/或活性。
使用抗体的竞争试验是作为用于调查一组抗体是否与同一(或重复的)部位结合的手法而在抗体技术领域中建立起来的手法(参照Ju-Won Kwak et al.,Journal ofImmunological Methods 191(1996)49-54等)。并且，在竞争试验中，当本发明的针对VEGF的抗体的结合受到试验对象的抗VEGF抗体的竞争性抑制时，可以鉴定为该试验对象的抗VEGF抗体为与本发明的针对VEGF的抗体所结合的部位结合的抗体。另外，在该试验方法中，在调查一组抗体是否与同一(或重复的)部位结合的基础上，不需要该部位为何种结构的信息。
即，与本发明的针对VEGF的抗体所结合的部位结合的抗体可以由本领域技术人员使用本发明的针对VEGF的抗体进行竞争试验而得到，无需进行过度的实验。
4.药物组合物
本发明的药物组合物含有上述“3.针对VEGF的抗体”中记载的抗体或其片段作为有效成分，是针对对象疾病的药物组合物。本发明的药物组合物用于对象疾病的预防或治疗，对于该预防或治疗有效。
成为本发明的药物组合物的对象的疾病只要是VEGF所参与的疾病(包括症状)则没有限定，作为这样的疾病，可列举实体癌、尤其是包含会成为问题的转移性肿瘤的癌症、VEGF介导性眼科疾病，其它免疫性疾病也为其对象。
就肿瘤的血管结构而言，已知是用于供给血液的，但也作为支撑癌干细胞的血管微环境起作用。血管微环境是指与成为血液、血管的基础的造血干细胞的维持、增殖、分化相关的环境，认为其在癌干细胞的增殖中也为重要环境。
癌细胞与正常细胞相比具有高增殖力、细胞***次数没有限制、引起向周边组织的浸润和转移的特征。近年来，逐渐认为，并不是癌组织中的所有癌细胞都具有这种性质，而是仅一部分有限的细胞具有这种性质。即，可以认为：这部分癌细胞为具有能制造与自身完全相同的细胞的自我复制能力和能够分化为多种细胞的多分化能力这样的胚胎干细胞、体干细胞等干细胞所共同可见的特征的细胞，是边在癌组织中通过自我复制来制维持与自身相同的细胞、边通过分化产生周边的能够成为大多数癌细胞的基础的癌干细胞。
认为癌干细胞是癌症复发、转移的主要原因，已经指出了在癌症治疗中以癌干细胞为靶标的重要性。认为如果能够显著抑制肿瘤组织内的癌干细胞的增殖，则能够开发可有效地杀伤癌细胞整体的新的治疗方法。
在本发明中，“癌干细胞性”是指显示癌干细胞的性质的细胞团的性质。即，癌干细胞性是指：具有干细胞所特有的自我复制和多分化能力，具有成为癌症基础的细胞的性质的性质。
在本发明中，作为癌症，可列举：脑瘤、颈癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳腺癌、胰癌、胃癌、小肠癌、十二指肠癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、***癌、子宫癌、***、卵巢癌、甲状腺癌、胆囊癌、咽癌、肉瘤、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。
在本发明中，VEGF介导性眼科疾病是起因于眼部的病理性血管新生或血管通透性亢进的疾病，是VEGF所参与的疾病。即，VEGF介导性眼科疾病能够通过使用抗VEGF抗体抑制VEGF与VEGF受体的结合来治疗或预防。作为这种疾病，可列举例如：老年黄斑变性(包括息肉状脉络膜血管症、视网膜血管瘤样增生等特殊类型)、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、血管新生性青光眼、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、继发于病理性近视的脉络膜血管新生性疾病、翼状胬肉、虹膜红变、角膜翳、皮肤粘膜眼综合症、眼部的移植组织(例如角膜组织等)的免疫排斥等。
在本发明中，“病理性血管新生”是指在病理状态或引起病理状态的状态下，与正常的生理性血管新生(血管形成)相比新血管过度、不充分或不适当(例如血管形成是在医学角度上不希望的位置、时期或发生过程中)生长时所发生的血管新生。
在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明的抗体或其片段或者含有其的药物组合物(以下也称为“本发明的药物组合物等”)，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本发明的药物组合物等，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
本发明的药物组合物除了含有本发明的针对VEGF的抗体以外，还可以含有药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指：适合于针对免疫疾病的药物组合物的任意载体(脂质体、脂质囊泡、胶束等)、稀释剂、赋形剂、润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、乳化剂、崩解剂、吸收剂、储存剂、表面活性剂、着色剂、着香剂或甜味剂。
本发明的药物组合物等可以采取注射剂、冷冻干燥品、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、糖浆剂、栓剂、巴布剂、软膏剂、霜剂、滴眼剂等剂型。注射剂等液体制剂可以是在使用前用生理盐水等进行溶解的使用时制备用粉末(例如冷冻干燥粉末)的方式。
本发明的药物组合物等可以通过本领域技术人员已知的任意手段局部或全身性地给药。作为本发明的药物组合物的给药途径，可以为经口给药及非经口给药中的任一种，在非经口给药的情况下，可以进行组织内给药(皮下给药、腹腔内给药、肌肉内给药、静脉内给药等)、皮内给药、局部给药(经皮给药等)或经直肠给药。本发明的药物组合物可以以适合于这些给药途径的给药方式来进行给药。
本发明的药物组合物等的给药量根据受试者的年龄、体重、健康状态、性别、症状、动物种属、给药途径、给药次数、剂型等因素而改变，具体的给药步骤可以由本领域技术人员来设定。作为用于癌症治疗的本发明的抗体的给药量，相对于受试者的每1kg体重为例如0.1mg～100mg/天、优选1mg～15mg/天、更优选2-12mg/天，但不限定于该量。作为给药次数，可以一天给药1～5次。作为用于治疗VEGF介导性眼科疾病的本发明的抗体的给药量，为例如0.01mg～100mg/只眼睛，更优选为0.1mg～10mg/只眼睛。作为给药次数，可以1天～2个月给药1次，但不限于该次数。
给药期可根据症状适当设定，可以同时地或间隔时间地分别给药多次。另外，本发明的药物组合物既可以在疾病罹患前给药于受试者，也可以在疾病罹患后给药。
本发明的药物组合物可以以哺乳动物为受试者进行给药。作为哺乳动物，可列举例如：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、犬、山羊、猪、绵羊、牛、马、猴、人等。
5.癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法
在本发明中，可以通过将针对VEGF的抗体或其片段或者含有其的药物组合物给药于受试者来治疗或预防癌症或VEGF介导性眼科疾病。即，本发明提供一种癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法，其包含如下步骤：将治疗上有效量的本发明的抗体或其片段或者含有其的药物组合物给药于受试者。本发明的抗体或其片段或者含有其的药物组合物的治疗上的有效量根据受试者的年龄、体重、健康状态、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等因素而改变。本领域技术人员可以容易地确定治疗或预防癌症或VEGF介导性眼科疾病所需要的治疗上的有效量。在本发明中，“受试者”包括需要进行癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防的受试者。另外，作为“受试者”的、成为治疗或预防对象的哺乳动物如上所述。
在本发明的癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法中，“癌症”、“VEGF介导性眼科疾病”、“治疗”及“预防”的相关说明如上所述。另外，本发明的抗体或其片段或者含有其的药物组合物的剂形、给药途径、给药量、给药时期等的相关说明也如上所述。
6.血管新生抑制剂
本发明的抗体由于抑制VEGF与VEGF受体的结合而能够抑制由该结合所发生的血管新生。即，本发明提供一种血管新生抑制剂，其含有上述“3.针对VEGF的抗体”中记载的抗体或其片段作为有效成分。
本发明的血管新生抑制剂可以作为试剂使用或用于哺乳动物的治疗中，其给药方式、添加物、给药途径、给药对象、给药量等可以基于上述“4.药物组合物”的记载而适当选择。其中，本发明的血管新生抑制剂可以仅含有本发明的抗体或其片段。
7.抗体的应用
本发明的抗体或其片段可以在癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法或者在用来治疗或预防癌症或VEGF介导性眼科疾病的药物的制造中使用。即，本发明提供本发明的抗VEGF抗体或其片段，其用于在癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防方法中使用。另外，本发明提供本发明的抗VEGF抗体或其片段，其用于在用来治疗或预防癌症或VEGF介导性眼科疾病的药物的制造中使用。进而，本发明提供抗VEGF抗体或其片段，其用于在血管新生抑制剂的制造中使用。
这些方式中的“癌症”、“VEGF介导性眼科疾病”、“治疗”及“预防”的相关说明如上所述。
8.联合使用疗法
本发明的药物组合物可以用于与至少1种其它抗癌剂联合给药。作为本发明中使用的抗癌剂，可列举例如：索拉非尼(多吉美(注册商标))、舒尼替尼(索坦(注册商标))、贝伐珠单抗(阿瓦斯汀(注册商标))、顺铂(cDDP)、卡铂(伯尔定(注册商标))、紫杉醇(泰素(注册商标))、多西紫杉醇(泰索帝(注册商标))、盐酸吉西他滨(健择(注册商标))、吉非替尼(易瑞沙(注册商标))、埃罗替尼(特罗凯(注册商标))、盐酸伊立替康(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)等。
通过将本发明的药物组合物和至少1种抗癌剂联合给药，可期待与分别单独使用时相比更为优异的效果。作为优异的效果，包括维持治疗效果且与以往相比副作用减轻的效果。
在本发明中，“联合使用”是指将本发明的药物组合物和至少1种前述抗癌剂同时或分别地给药。“同时”是指在一个给药程序中在同一时机给药，给药的时刻不需要完全相同。“分别”是指在一个给药程序中的不同时机给药。
对本发明的联合使用疗法中使用的药物组合物等及抗癌剂的给药方式、给药途径、给药对象不作特别限定，可以基于上述“4.药物组合物”的记载适当选择。另外，所联合使用的药剂的给药方式或给药量可以彼此不同，可以根据其所联合使用的组合适当调整。
在将本发明的药物组合物与其它抗癌剂联合使用时，还能够适当减少给药量。因此，就本发明的药物组合物与其它抗癌剂的组合而言，可以采用如下组合：
(i)本发明的药物组合物的有效量与其它抗癌剂的有效量、
(ii)本发明的药物组合物的有效量与其它抗癌剂的非有效量、
(iii)本发明的药物组合物的非有效量与其它抗癌剂的有效量、及
(iv)本发明的药物组合物的非有效量与其它抗癌剂的非有效量。
在即使药物组合物及抗癌剂中的一者或两者为非有效量的使用方式下也能够通过联合使用而发挥药理效果时，可以通过这样的方式来联合给药。
9.试剂、试剂盒
本发明的单克隆抗体或其片段可以包含在VEGF的检测试剂或试剂盒中。即，本发明提供一种试剂及试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体或其片段。本发明的试剂及试剂盒例如可以作为VEGF的检测用试剂或试剂盒使用。
就本发明的试剂及试剂盒而言，可以在简单地通过例如冷冻等方法处理本发明的单克隆抗体或其片段之后保持原状或与赋形剂、增量剂、结合剂、润滑剂等公知的药学上可接受的载体、公知的添加剂(包括缓冲剂、等渗剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等)等混合。
本发明的试剂盒中，除了含有本发明的单克隆抗体或其片段以外，还可以含有缓冲液、酶液、二抗、稀释用溶液、使用说明书等。
以下通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。
实施例1
单克隆抗体的制作
(1)抗原的制备
使用在CHO细胞中表达的人重组体VEGF165(以下也称为“VEGF”、“rhVEGF165”或“rhVEGF”)(PROSPEC公司)作为抗原。为了抑制VEGF对小鼠的影响，而准备了结合于KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin，匙孔戚血蓝蛋白)的抗原。此时，VEGF和KLH在按照以摩尔比计达到4:1的方式在PBS(-)(0.01M磷酸钠缓冲液(sodium-phosphate buffer)、0.138MNaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)中混合后，添加1％的戊二醛，在室温下反应1小时而使KLH和rhVEGF165交联。以下也将如此制备的蛋白质称为“KLH-VEGF”。
(2)免疫
将rhVEGF或KLH-VEGF与弗氏完全佐剂等量混合，以100μl(约40μg/小鼠)给药于BALB/c小鼠的腹腔内。然后，对于动物，3周一次地将约40μg的KLH-VEGF或rhVEGF与不完全弗氏佐剂一起给药于腹腔内，从而实施追加免疫。追加免疫以不超过12次的范围来进行。最终免疫刺激在摘出脾的前3天将含有约40μg的KLH-VEGF或rhVEGF的生理盐水通过尾静脉内给药而实施。
(3)细胞融合
将分离出的脾细胞和作为小鼠骨髓瘤细胞株的P3-x63-Ag8U.1(DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.)按照5:1的细胞数混合，用50％聚乙二醇3350(Sigma公司)进行细胞融合。将细胞悬浮于HAT培养基(添加有1/2×HT(MP公司)、1/2×HAT(MP公司)、10％FBS、50ng/L小鼠IL-6、500mg/mLD-葡萄糖的RPMI1640培养基)中，分注到96孔的微型培养板中培养。
(4)ELISA
将杂交瘤已增殖的孔的培养上清回收，选择产生与rhVEGF165反应的单克隆抗体的杂交瘤。将rhVEGF165用PBS(-)稀释，按照每1孔中达到1μg的量分注到96孔ELISA板(Nunc公司)中，在4℃放置一晚，从而使其结合于板表面。然后，用含有0.05％Tween 20的PBS(-)(以下记作“PBS-T”)350μL洗涤3次后，将含有1％脱脂乳的PBS-T向各孔中各分注300μL，在室温下封闭1小时。用PBS-T洗涤后，将杂交瘤的培养上清分注到固相化有rhVEGF165的ELISA板中，在室温下反应1小时。用PBS-T洗涤后，向各孔中分注100μL的将过氧化物酶(以下记作“POD”)标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(BETHYL公司制)稀释10000倍而得的液体，在室温下反应1小时。进行同样的洗涤后，加入制备成1mg/mL POD的POD底物，在室温下显色5分钟。用1.5N的硫酸使反应停止后，用酶标仪(Molecular Devices公司)测定490nm的吸收。
(5)抗VEGF单克隆抗体的建立
以未固相化rhVEGF165的板的吸光度为基准，将吸光度为3倍以上的孔作为阳性，通过有限稀释法进行克隆。通过上述(4)的方法调查含有单一集落的孔的细胞上清的抗体活性，在选择后进行培养，从而建立产生与rhVEGF165反应的单克隆抗体的杂交瘤株。从由此而建立的杂交瘤中选择2个阳性克隆，将这些杂交瘤所产生的抗体分别命名为KLHa505及KLHb1501。
实施例2
由单克隆抗体产生的VEGF与其受体的结合抑制能力的评价
抗VEGF抗体能够通过结合于VEGF而阻断VEGF与作为其受体的VEGFR-1和/或VEGFR-2的结合，抑制VEGF介导的信号转导。
使用蛋白G从2个阳性克隆的培养上清中分别分离、纯化KLHa505及KLHb1501。
然后，在96孔ELISA板上固相化IgG Fc-VEGFR-1或IgG Fc-VEGFR2，用2％牛血清白蛋白进行封闭，向其中添加与rhVEGF混合后的纯化抗体后，在室温下反应1小时。制备混合有rhVEGF的溶液，用含有0.05％TWEEN(注册商标)20的TBS(TBS：50mM Tris-HCl(pH7.4)、500mM NaCl；以下称为“TBS-T”)洗涤3次。然后使用兔抗人VEGF多克隆抗体-HRP显色，由此确定rhVEGF含量。
其结果是，KLHa505抗体在VEGF与VEGFR-1和VEGFR-2的结合中显示出竞争性抑制，KLHb1501抗体在VEGF与VEGFR-2的结合中显示出竞争性抑制(图1)。
即，本实施例显示，作为本发明的抗体的KLHa505及KLHb1501能够阻断与VEGF相关的信号转导。
实施例3
KLHa505及KLHb1501与rhVEGF的解离常数的测定
使用BIAcore-3000确定KLHa505及KLHb1501与VEGF的Kd。在CM5芯片上固相化rhVEGF，用HBS-EP缓冲液进行2次梯度稀释后，将各抗体以30μL/分钟的流速注入。Kd为Koff/Kon。
结果显示，KLHa505与rhVEGF的解离常数为4.23pmol/L，KLHb1501与rhVEGF的解离常数为0.60pmol/L。
与已有抗体的解离常数(例如阿瓦斯汀(贝伐珠单抗)的解离常数为47.9nmol/L)相比，本发明的抗体的解离常数均为1/1000以下，因此该抗体与VEGF的结合活性非常强。
即，本实施例能够得到对VEGF具有极高亲和性的抗体(高亲和性抗VEGF抗体)。
实施例4
单克隆抗体KLHa505及KLHb1501的HUVEC增殖抑制效果的研究
研究了KLHa505及KLH1501是否抑制源自正常人脐带静脉的内皮细胞(以下称为“HUVEC”)的VEGF的活性。试验中使用的HUVEC以传代次数不超过8次的范围来使用。使用含有1％胎牛血清的Medium 200，在96孔细胞培养用板中各播种10000个细胞，添加终浓度50ng/mL的rhVEGF及终浓度2500ng/mL的KLHa505或KLHb1501，在培养24小时后测定细胞数。
结果显示，与阳性对照(VEGF及同种型对照抗体(图2中的“对照IgG”))相比，含有KLHa505或KLHb1501的细胞的细胞数显著减少(图2)。
因此，本实施例显示，本发明的高亲和性抗体能够抑制由VEGF带来的源自血管的细胞的细胞生长活性，从而能够抑制血管新生。
实施例5
单克隆抗体KLHa505及KLHb1501的体内细胞生长抑制效果的研究
在实验的2周前，将于液氮中冻存的人结肠腺癌LS174T细胞的1个株系(约1X107细胞)在37℃温浴中解冻。然后，向添加有预先加热到37℃的含有10％胎牛血清的McCoy's 5A培养基的100mm细胞用培养盘中添加解冻的细胞悬浮液，使细胞增殖至80％铺满。然后以1：5对细胞进行传代培养，连续传代培养3次。在总细胞数达到接种所需要的细胞数时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从培养盘剥离，用PBS洗涤细胞。然后向洗涤后的细胞中加入含有50％MatriGel(注册商标)的生理盐水而制备成2X107/mL，以每1只100μL、即2X106细胞/小鼠接种于Balb/C裸小鼠的腹部皮下。
接种细胞之后，从第二天开始给药KLHa505及KLHb1501。就抗体的给药量而言，每组对5只小鼠进行给药，制作(i)模型对照组(仅生理盐水)、(ii)5mg/kgKLHa505组、(iii)2.5mg/kgKLHa505组及(iv)0.5mg/kgKLHa505组。另外，对于KLHb1501，也制作同样的给药组。
关于给药方法，将溶解于生理盐水的KLHa505或KLHb1501以每只小鼠200μL的体积以每周2天且5天1次地通过腹腔内注射而给药，对于模型对照组，在同样的时间通过同样的方法给药200μL的生理盐水。
就给药期而言，KLHa505时持续18天，KLHb1501时持续22天。在抗体给药时，测定裸小鼠的肿瘤小结节的最大直径a及最小直径b，按照式V＝0.5×a×b2计算肿瘤体积。
结果显示，KLHa505及KLHb1501具有在体内中显著抑制肿瘤增殖的能力(图3及图4)。
即，本实施例显示，本发明的高亲和性抗体对于癌症的治疗或预防有效。
实施例6
单克隆抗体的可变区的碱基序列及氨基酸序列的确定
由产生KLHa505及KLHb1501的杂交瘤提取mRNA，用反转录酶制备各cDNA。使用这些cDNA作为模板，通过PCR法扩增小鼠IgG抗体的重链及轻链可变区的核苷酸序列，对核苷酸序列进行分析，从而确定了轻链及重链可变区中所含的互补决定区的氨基酸序列。
进而，使用IMGT/V-QUEST软件、版本3.3.0在“the internationalImMunoGeneTics information system(注册商标)”(IMGT/GENE-DB)的免疫球蛋白数据库上确定KLHa505及KLHb1501的可变区的CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列。
将其结果分别示于下述表1及2。
[表1]
KLHa505
Figure BDA0001720903930000351
Figure BDA0001720903930000352
[表2]
KLHb1501
Figure BDA0001720903930000361
Figure BDA0001720903930000362
实施例7
人-IgG1嵌合KLHa505抗体(KLHa505HC抗体)的制作
由产生KLHa505抗体的杂交瘤克隆KLHa505抗体的重链可变区基因(碱基序列：序列号33、氨基酸序列：序列号34)及轻链可变区基因(碱基序列：序列号35、氨基酸序列：序列号36)。然后，将这些基因分别以同框(inframe)方式连接在人IgG1的重链恒定区基因或轻链(κ链)恒定区基因的碱基序列上。使用具有重链可变区的5’末端碱基序列、Kozak序列和限制酶MluI序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶NheI序列的反义引物实施PCR。然后，使用具有轻链可变区基因的5’末端碱基序列和限制酶BamHI序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶BsiWI序列的反义引物实施PCR。将得到的扩增产物用限制酶MluI及NheI或BamHI及BsiWI处理，重组到人IgG1重链恒定区表达质粒(pEF6/G1)的MluI-NheI位点或人Ig的轻链(κ链)恒定区表达质粒(pEF1/G1k)的BamHI-BsiWI位点。pEF6/G1在质粒pEF6/myc-His(Invitrogen公司)中克隆有人IgG1的重链恒定区基因(碱基序列：序列号41、氨基酸序列：序列号42)，此外pEF1/G1-k在质粒pEF1/myc-His(Invitrogen公司)中克隆有人Ig的轻链(κ链)恒定区基因(碱基序列：序列号43、氨基酸序列：序列号44)。通过限制酶NheI连接了小鼠重链可变区和人重链恒定区，通过限制酶BsiWI序列连接了小鼠轻链可变区和人轻链恒定区。
使用FreeStyleTM 293Expression System(Thermo Fischer Scientific K.K.)将质粒pEF6/G1-KLHa505及pEF1/G1-K-KLHa505导入到293F细胞，使其瞬时表达人IgG1嵌合KLHa505抗体(以下也称为“KLHa505HC抗体”)。然后，从导入有该嵌合基因的293F细胞的培养上清中，使用Protein G Sepharose 4 Fast Flow(通用电气医疗集团日本公司)纯化KLHa505HC抗体。使用Amicon Ultra-15离心式过滤单元(Merck Millipore公司)将溶剂置换为D-PBS(-)。纯化后的KLHa505HC抗体的浓度用Nano drop 1000(Thermo FischerScientific K.K.)来进行定量。通过上述“单克隆抗体的纯化(4)ELISA”记载的方法评价KLHa505HC抗体对VEGF的结合，结果确认，KLHa505HC抗体与VEGF特异性结合。
即，本实施例能够得到本发明的高亲和性抗VEGF抗体的嵌合抗体。
实施例8
人-IgG1嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501HC抗体)的制作
从产生KLHb1501抗体的杂交瘤中克隆KLHb1501抗体的重链可变区基因(碱基序列：序列号37、氨基酸序列：序列号38)及轻链可变区基因(碱基序列：序列号39、氨基酸序列：序列号40)。然后，将这些基因分别以同框方式连接在人IgG1的重链恒定区基因或轻链(λ链)恒定区基因的碱基序列上。使用具有重链可变区的5’末端碱基序列、Kozak序列和限制酶XhoI序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶NheI序列的反义引物实施PCR。然后，使用具有轻链可变区基因的5’末端碱基序列和限制酶EcoRI序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶AvrII序列的反义引物实施PCR。将得到的扩增产物用限制酶XhoI及NheI或EcoRI及AvrII处理，重组到人IgG1重链恒定区表达质粒(pFUSE-CHIg-hG1；InvivoGen公司)的XhoI-NheI位点或人Ig的轻链(λ链)恒定区表达质粒(pFUSE2ss-CLIg-hl2；InvivoGen公司)的EcoRI-AvrII位点。pFUSE-CHIg-hG1克隆有人IgG1的重链恒定区基因(碱基序列：序列号41、氨基酸序列：序列号42)，此外pFUSE2ss-CLIg-hl2中克隆有人Ig的轻链(λ链)恒定区基因(碱基序列：序列号43、氨基酸序列：序列号44)。通过限制酶NheI连接了小鼠重链可变区和人重链恒定区，通过限制酶AvrII序列连接了小鼠轻链可变区和人轻链恒定区。
实施例9
人IgG1嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501HC抗体)的体内肿瘤增殖抑制效果
以每只小鼠2x106细胞的比例将人大肠癌细胞株LS174T细胞皮下注射到20只免疫缺陷小鼠的右侧腹部。注射的第二天，将0.9％NaCl(对照组A)或KLHb1501HC抗体(对照组B)中的某一种给药到腹腔内。对于对照组B的小鼠，以0.5mg/Kg、2.5mg/Kg或5mg/Kg每周2次给药KLHb1501HC抗体。另外，与抗体同样地，将0.9％NaCl每周2次给药于对照组A的小鼠。在接种细胞后第1、5、8、12、15、19及22天测定肿瘤直径，用式：V(mm3)＝(d:短径)2x(D:长径)/2计算肿瘤体积(Tumor Volume)。将结果示于图5。图5中，A组(0.9％NaCl对照)以(◇)表示，B组(接种了抗VEGF抗体的小鼠)以(□：0.5mg/Kg)、(△：2.5mg/Kg)、(○：5.0mg/Kg)中的某一种表示。如图5所示，在接种了KLHb1501HC抗体的小鼠中观察到肿瘤体积的显著减少。这些结果显示，本发明的KLHb1501HC抗体在体内也妨碍(抑制)肿瘤的增殖。这显示，含有本发明的人IgG1嵌合抗VEGF抗体的药物组合物对于癌症的治疗或预防非常有效。
实施例10
犬-IgGB嵌合KLHa505抗体(KLHa505CC抗体)的制作
从产生KLHa505抗体的杂交瘤中克隆KLHa505抗体的重链可变区基因(碱基序列：序列号33、氨基酸序列：序列号34)及轻链可变区基因(碱基序列：序列号35、氨基酸序列：序列号36)。然后，将这些基因分别以同框的方式连接在犬IgGB的重链恒定区基因或轻链(κ链)恒定区基因的碱基序列上。使用具有重链可变区的5’末端碱基序列、Kozak序列和限制酶EcoRV序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶NheI序列的反义引物实施PCR。然后，使用具有轻链可变区基因的5’末端碱基序列和限制酶EcoRI序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶XhoI序列的反义引物实施PCR。将得到的扩增产物用限制酶EcoV和NheI或EcoRI及XhoI处理，重组到犬IgGB重链恒定区表达质粒(pFUSE2ss-CHIg-dGB)的EcoRV-NheI位点或犬Ig轻链恒定区表达质粒(pFUSE2ss-CHIg-dK)的EcoRI-XhoI位点。pFUSE2ss-CHIg-dGB在质粒pFUSE2ss-CLIg-hl2(InvivoGen公司)中克隆有犬IgGB的重链恒定区基因(碱基序列：序列号45、氨基酸序列：序列号46)，此外pFUSE2ss-CHIg-dK中在质粒pFUSE2ss-CLIg-hl2中克隆有犬Ig的轻链(κ链)恒定区基因(碱基序列：序列号47、氨基酸序列：序列号48)。通过限制酶NheI连接了小鼠重链可变区和犬重链恒定区，通过限制酶XhoI序列连接了小鼠轻链可变区和犬轻链恒定区。
实施例11
犬-IgGB嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501CC抗体)的制作
从产生KLHb1501抗体的杂交瘤中克隆了KLHb1501抗体的重链可变区基因(碱基序列：序列号37、氨基酸序列：序列号38)及轻链可变区基因(碱基序列：序列号39、氨基酸序列：序列号40)。然后，将这些基因分别以同框的方式连接在犬IgGB的重链恒定区基因或轻链(λ链)恒定区基因的碱基序列上。使用具有重链可变区的5’末端碱基序列、Kozak序列和限制酶EcoRV序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶NheI序列的反义引物实施PCR。然后，使用具有轻链可变区基因的5’末端碱基序列和限制酶EcoRI序列的引物及具有3’末端碱基序列的互补序列和限制酶ScaI序列的反义引物实施PCR。将得到的扩增产物用限制酶EcoV和NheI或EcoRI及ScaI处理，重组到犬IgGB重链恒定区表达质粒(pFUSE2ss-CHIg-dGB)的EcoRV-NheI位点或犬Ig轻链恒定区表达质粒(pFUSE2ss-CHIg-dK)的EcoRI-ScaI位点。pFUSE2ss-CHIg-dGB在质粒pFUSE2ss-CLIg-hl2(InvivoGen公司)中克隆有犬IgGB的重链恒定区基因(碱基序列：序列号45、氨基酸序列：序列号46)，此外pFUSE2ss-CHIg-dK中在质粒pFUSE2ss-CLIg-hl2中克隆有犬Ig的轻链(λ链)恒定区基因(碱基序列：序列号49、氨基酸序列：序列号50)。通过限制酶NheI连接了小鼠重链可变区和犬重链恒定区，通过限制酶ScaI序列连接了小鼠轻链可变区和犬轻链恒定区。
实施例12
犬-IgGB嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501CC抗体)与人VEGF165及犬VEGFA的交叉性
通过ELISA确认了所制作的犬-IgGB嵌合抗体是否具有与人VEGF165及犬VEGFA(VEGF164)的结合能力。将人VEGF165或犬VEGFA用TBS稀释，以每1孔20ng的量分注到96孔的ELISA板(Nunc公司)中，在37℃孵育1小时，从而使其结合于板表面。然后，用含有0.02％Tween 20的PBS(-)(以下记作“PBS-T”)300μL洗涤3次后，将含有3％脱脂乳的PBS(-)向各孔中各分注300μL，在37℃封闭1小时。用PBS-T洗涤后，将从1μg/ml的浓度起梯度稀释后的犬-IgGB嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501CC抗体)分注到固相化有VEGF的ELISA板中，在37℃反应1小时。用PBS-T洗涤后，将调整为100ng/ml的过氧化物酶标记抗犬免疫球蛋白抗体(BETHYL公司制)向各孔中分注100μL，在37℃反应1小时。进行同样的洗涤后加入TMB SingleSolution，在室温下显色。用1N的硫酸使反应停止后，用酶标仪(Molecular Devices公司)测定450nm的吸收。将结果示于图6。显示KLHb1501CC抗体以与人VEGF165同程度的亲和性与犬VEGFA结合。
这显示，含有本发明的犬IgGB嵌合抗VEGF抗体的药物组合物能够用于犬的疾病的治疗或预防。
实施例13
犬IgGB嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501CC抗体)在体内对人癌细胞株的肿瘤增殖抑 制效果
以每只小鼠2x106细胞的比例将人大肠癌细胞株LS174T细胞皮下注射到20只免疫缺陷小鼠的右侧腹部。注射的第二天，将0.9％NaCl(对照组A)或KLHb1501CC抗体(对照组B)中的某一种给药到腹腔内。对于对照组B的小鼠，以0.5mg/Kg、2.5mg/Kg或5mg/Kg每周2次给药KLHb1501CC抗体。另外，与抗体同样地，将0.9％NaCl每周2次给药于对照组A的小鼠。在接种细胞后第5、8、12、15、19及22天测定肿瘤直径，用式：V(mm3)＝(d：短径)2x(D：长径)/2计算肿瘤体积(Tumor Volume)。将结果示于图7。图7中，将A组(0.9％NaCl对照)以(■)表示，将B组(接种抗VEGF抗体的小鼠)以(●：0.5mg/Kg)、(▲：2.5mg/Kg)、(△：5.0mg/Kg)中的某一种表示。如图7所示，在接种了KLHb1501CC抗体的小鼠中观察到肿瘤体积的显著减少。
这些结果显示，本发明的KLHb1501CC抗体在体内也妨碍(抑制)人肿瘤的增殖。另外，这显示，含有本发明的犬IgGB嵌合抗VEGF抗体的药物组合物对于癌症的治疗或预防非常有效。
实施例14
犬IgGB嵌合KLHb1501抗体(KLHb1501CC抗体)在体内对犬癌细胞株的肿瘤增殖抑 制效果
以每只小鼠1x107细胞的比例将犬骨肉瘤细胞株D-17细胞皮下注射到20只免疫缺陷小鼠的右侧腹部。在平均肿瘤体积达到150mm3后，向腹腔内给药0.9％NaCl(对照组A)或KLHb1501CC抗体(对照组B)中的任一种。对于对照组B的小鼠，以0.5mg/Kg、2.5mg/Kg或5mg/Kg每周给药2次KLHb1501CC抗体。另外，与抗体同样地，将0.9％NaCl每周2次给药于对照组A的小鼠。在接种细胞后第50、54、57、61、64、67、70、74、77及81天测定肿瘤直径，用式：V(mm3)＝(d：短径)2x(D：长径)/2计算肿瘤体积(Tumor Volume)。将结果示于图8。图8中，将A组(0.9％NaCl对照)以(■)表示，将B组(接种了抗VEGF抗体的小鼠)以(●：0.5mg/Kg)、(▲：2.5mg/Kg)、(△：5.0mg/Kg)中的某一种表示。如图8所示，在接种了KLHb1501CC抗体的小鼠中观察到肿瘤体积的显著减少。
这些结果显示，本发明的KLHb1501CC抗体在体内也妨碍(抑制)犬肿瘤的增殖。另外，这显示，含有本发明的犬IgGB嵌合抗VEGF抗体的药物组合物对于犬癌症的治疗或预防非常有效。
实施例15
关于本发明的抗体的抗原结合部位的研究
为了调查本发明的抗体与VEGF的结合部位，如下所述地进行了基于ELISA法的结合实验。
在本实施例中，作为抗VEGF抗体，使用了包括实施例7及8中得到的KLHa505HC及KLHb1501HC在内的3个抗VEGF抗体。
另外，作为VEGF，使用了(i)含有作为VEGF的C末端区域的外显子8a的VEGF165、(ii)肝素结合区域缺失的VEGF121、(iii)具有与VEGF165的C末端区域不同的氨基酸序列(外显子8b)的VEGF165b这3种类型的VEGF。
结合实验具体如下实施。
将人VEGF165(由外显子1、2、3、4、5、7和8a构成)人VEGF165b(由外显子1、2、3、4、5、7和8b构成)或人VEGF121(由外显子1、2、3、4、5和8a构成)用TBS稀释，以每1孔20ng的量分注到96孔的ELISA板(Nunc公司)中，在37℃孵育1小时，从而使其结合在板表面。然后，用含有0.02％Tween 20的PBS(-)(以下记作“PBS-T”)300μL洗涤3次后，将含有3％脱脂乳的PBS(-)向各孔中各分注300μL，在37℃下封闭1小时。用PBS-T洗涤后，将从1ug/ml的浓度起梯度稀释的KLHa505HC抗体或KLHb1501HC抗体分注到固相化有VEGF的ELISA板中，在37℃下反应1小时。用PBS-T洗涤后，向各孔中分注调整为100ng/ml的过氧化物酶标记抗人免疫球蛋白抗体(BETHYL公司制)100μL，在37℃下反应1小时。进行同样的洗涤后，加入TMB SingleSolution，在室温下显色。用1N的硫酸使反应停止后，用酶标仪(Molecular Devices公司)测定450nm的吸收。
其结果是，包括作为本发明的抗VEGF抗体的KLHa505HC及KLHb1501HC在内的3种抗VEGF抗体均与上述VEGF165、VEGF121及VEGF165b中的每一个结合(图9、图10)。
该结果显示，本发明的抗体与VEGF的外显子1～5的区域结合。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供以显著高于现有技术的亲和性与VEGF结合的新的抗体。
序列表独立文本
序列号13：合成DNA
序列号14：合成肽
序列号15：合成DNA
序列号16：合成肽
序列号17：合成DNA
序列号18：合成肽
序列号19：合成DNA
序列号20：合成肽
序列号21：合成DNA
序列号22：合成肽
序列号23：合成DNA
序列号24：合成肽
序列号25：合成DNA
序列号26：合成肽
序列号27：合成DNA
序列号28：合成肽
序列号29：合成DNA
序列号30：合成肽
序列号31：合成DNA
序列号32：合成肽
序列号33：合成DNA
序列号34：合成肽
序列号35：合成DNA
序列号36：合成肽
序列号37：合成DNA
序列号38：合成肽
序列号39：合成DNA
序列号40：合成肽
序列号41：合成DNA
序列号42：合成肽
序列号43：合成DNA
序列号44：合成肽
序列号45：合成DNA
序列号46：合成肽
序列号47：合成DNA
序列号48：合成肽
序列号49：合成DNA
序列号50～54：合成肽
序列表
<110> 定制药品研究株式会社(Order-made Medical Research Inc.)
参天制药株式会社(Santen Pharmaceutical Co., Ltd）
<120> 高亲和性抗VEGF抗体
<130> G1354WO
<150> JP 2016-001277
<151> 2016-01-06
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3487
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
cggcggcagc ggagctctgt cgcgagacgc agcgacaagg cagactattc agcggactca 60
ccagcccggg agtctgtgct ctgggatttg atattcaaac ctcttaattt ttttttctta 120
aactgtattg ttttacgctt taatttattt ttgcttccta ttcccctctt aaatcgtgcc 180
aacggtttga ggaggttggt tcttcactcc ctcaaatcac ttcggattgt ggaaatcagc 240
agacgaaaga ggtatcaaga gctccagaga gaagtcaagg aagagagaga gagaccggtc 300
agagagagcg cgctggcgag cgaacagaga gagggacagg ggcaaagtga ctgacctgct 360
tttgggggtg accgccagag cgcggcgtga gccctccccc ttgggatctt gcatcggacc 420
agtcgcgctg acggacagac agacagacac cgcccccagc cccagcgccc acctcctcgc 480
cggcgggctg ccgacggtgg acgcggcggc gagccgcgag gaaccgaagc ccgcgcccgg 540
aggcggggtg gagggggtcg gggctcgcgg gattgcacgg aaacttttcg tccaacttct 600
gggctcttct cgctccgtag tagccgtggt ctgcgccgca ggagacaaac cgatcggagc 660
tgggagaagt gctagctcgg gcctggagaa gccggggccc gagaagagag gggaggaaga 720
gaaggaagag gagagggggc cgcagtgggc gctcggctct caggagccga gctcatggac 780
gggtgaggcg gccgtgtgcg cagacagtgc tccagccgcg cgcgcgcccc aggccccggc 840
ccgggcctcg gttccagaag ggagaggagc ccgccaaggc gcgcaagaga gcgggctgcc 900
tcgcagtccg agccggagag ggagcgcgag ccgcgccggc cccggacggg cctccgaaac 960
catgaacttt ctgctctctt gggtgcactg gaccctggct ttactgctgt acctccacca 1020
tgccaagtgg tcccaggctg cacccacgac agaaggagag cagaagtccc atgaagtgat 1080
caagttcatg gatgtctacc agcgaagcta ctgccgtccg attgagaccc tggtggacat 1140
cttccaggag taccccgacg agatagagta catcttcaag ccgtcctgtg tgccgctgat 1200
gcgctgtgca ggctgctgta acgatgaagc cctggagtgc gtgcccacgt cagagagcaa 1260
catcaccatg cagatcatgc ggatcaaacc tcaccaaagc cagcacatag gagagatgag 1320
cttcctacag cacagcagat gtgaatgcag accaaagaaa gacagaacaa agccagaaaa 1380
aaaatcagtt cgaggaaagg gaaagggtca aaaacgaaag cgcaagaaat cccggtttaa 1440
atcctggagc gttcactgtg agccttgttc agagcggaga aagcatttgt ttgtccaaga 1500
tccgcagacg tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct 1560
tgagttaaac gaacgtactt gcagatgtga caagccaagg cggtgagcca ggctgcagga 1620
aggagcctcc ctcagggttt cgggaaccag acctctcacc ggaaagaccg attaaccatg 1680
tcaccaccac gccatcatcg tcaccgttga cagaacagtc cttaatccag aaagcctgac 1740
atgaaggaag aggagactct tcgaggagca ctttgggtcc ggagggcgag actccggcag 1800
acgcattccc gggcaggtga ccaagcacgg tccctcgtgg gactggattc gccattttct 1860
tatatctgct gctaaatcgc caagcccgga agattagggt tgtttctggg attcctgtag 1920
acacacccac ccacatacac acatatatat atattatata tataaataaa tatatatgtt 1980
ttatatataa aatatatata tattcttttt tttaaattaa ctctgctaat gttattggtg 2040
tcttcactgg atatgtttga ctgctgtgga cttgtgttgg gaggaggatg tcctcactcg 2100
gatgccgaca cgggagacaa tgggatgaaa ggcttcagtg tggtctgaga gaggccgaag 2160
tccttttgcc tgccggggag caagcaaggc cagggcacgg gggcacattg gctcacttcc 2220
agaaacacga caaacccatt cctggccctg agtcaagagg acagagagac agatgatgac 2280
agagaaagag ataaagatgc cggttccaac cagaagtttg gggagcctca ggacatggca 2340
tgctttgtgg atccccatga tagtctacaa aagcaccccg cccctctggg cactgcctgg 2400
aagaatcggg agcctggcca gccttcagct cgctcctcca cttctgaggg gcctaggagg 2460
cctcccacag gtgtcccggc aagagaagac acggtggtgg aagaagaggc ctggtaatgg 2520
cccctcctcc tgggacccct tcgtcctctc cttaccccac ctcctgggta cagcccagga 2580
ggaccttgtg tgatcagacc attgaaacca ctaattctgt ccccaggaga cttggctgtg 2640
tgtgtgagtg gcttaccctt cctcatcttc ccttcccaag gcacagagca atggggcagg 2700
acccgcaagc ccctcacgga ggcagagaaa agagaaagtg ttttatatac ggtacttatt 2760
taatagccct ttttaattag aaattaaaac agttaattta attaaagagt agggtttttt 2820
tcagtattct tggttaatat ttaatttcaa ctatttatga gatgtatctc tcgctctctc 2880
ttatttgtac ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtatga 2940
aatctgtgtt tccaatctct ctctcccaga tcggtgacag tcactagctt gtcctgagaa 3000
gatatttaat tttgctaaca ctcagctctg ccctcccttg tccccaccac acattccttt 3060
gaaataaggt ttcaatatac atttacatac tatatatata tttggcaact tgtgtttgta 3120
tataaatata tatatatata tatatgttta tgtatatatg tgattctgat aaaatagaca 3180
ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aatagagaat tctacatact 3240
aaatctctct ccttttttaa ttttaatatt tgttatcatt tatttattgg tgctactgtt 3300
tatccgtaat aattgtgggg gaaaaagata ttaacatcac gtctttgtct ctagagcagt 3360
tttccgagat attccgtagt acatatttat ttttaaacag caacaaagaa atacagatat 3420
atcttaaaaa aaaaagcatt ttgtattaaa gaattgaatt ctgatctcaa aaaaaaaaaa 3480
aaaaaaa 3487
<210> 2
<211> 392
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Ala His Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gly Gly Leu Pro Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Glu Glu
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg Gly
35 40 45
Ile Ala Arg Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Ser Ser Arg Ser Val
50 55 60
Val Ala Val Val Cys Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ile Gly Ala Gly Arg
65 70 75 80
Ser Ala Ser Ser Gly Leu Glu Lys Pro Gly Pro Glu Lys Arg Gly Glu
85 90 95
Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Ala Leu Gly Ser Gln
100 105 110
Glu Pro Ser Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp Ser Ala
115 120 125
Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Pro Ala Arg Ala Ser Val Pro Glu
130 135 140
Gly Arg Gly Ala Arg Gln Gly Ala Gln Glu Ser Gly Leu Pro Arg Ser
145 150 155 160
Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Ala Ser
165 170 175
Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu
180 185 190
Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr
195 200 205
Glu Gly Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr
210 215 220
Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln
225 230 235 240
Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro
245 250 255
Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val
260 265 270
Pro Thr Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro
275 280 285
His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg
290 295 300
Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Lys Lys Ser
305 310 315 320
Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg
325 330 335
Phe Lys Ser Trp Ser Val His Cys Glu Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
340 345 350
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
355 360 365
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
370 375 380
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
385 390
<210> 3
<211> 3561
<212> DNA
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 3
ttggggcagc cgagctgcag cgaggccgcg gcgctggggg cgagctgagc ggcggcagcg 60
gagctctgtc gcgagacgca gcgacaaggc agactattca acggactcat cagccaggga 120
gtctgtgctc tgggatttga tattcaaacc tctttttttt ttcttaaact gtattgtttt 180
acgctttaat ttatttttgc ttcctattcc cctcttaaat cgtgccaacg gtttggagag 240
gttgctcctt cactccctca aattacttcg gattttggaa atcagcagag gaaagaggta 300
gcaggagctc cagagagaag tcaaggaaga gagagagaga gagagaccgg tcagagagcg 360
cgctggcgag cgaacagaga gagggacagg ggcaaagtga ctgacctgct tttgggggtg 420
accgccagag cgcggcgtga gccctccccc ttgggatctt tcatcggacc agtcgcgctg 480
acggacagac agacagacac cgcccccagc cccagcgccc acctcctcgc cggcgggcag 540
ccgacggtgg acgcggcggc gagccgcgag caggagccga agcccgcgcc cggaggcggg 600
gtggaggggg tcggggctcg cgggattgca cggaaacttt tcgtccaact tctgggctct 660
tctctctccg gagtagccgt ggtctgcgcc gcaggaggca aaccgatcgg agctgggaga 720
agtgctagct cgggcctgga gaagccgggg cccgagaaga gaggggagaa agagaaggaa 780
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ccgagccgga gagggagcgc gagccgcgcc ggccccggac gggcctctga aaccatgaac 1020
tttctgctct cttgggtgca ctggaccctg gctttactgc tgtacctcca ccatgccaag 1080
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cagcatagca gatgtgaatg cagaccaaag aaagatagaa caaagccaga aaaaaaatca 1440
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cacaccacca tcgtcaccgt cgacagaaca gtccttaatc cagaaagcct gacatgaagg 1800
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cccgggcagg tgaccaagca cggtggtccc tcgtggaact ggattcgcca ttttcttata 1920
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gaggagccta ggaggcctcc cacaggggtc ctggcaaaga gaagacacag tggtggaaga 2580
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accacacatt cctttgaaat aaggtttcaa tatacattta catactatat atatatttgg 3180
caacttgtgt ttgtatataa atatatatat atatatatgt ttatgtatat atgtgattct 3240
gataaaatag acattgctat tctgtttttt atatgtaaaa acaaaacgag aaaaaataga 3300
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gaaatacaga tatatcttaa gaaaaaaaaa gcattttgta ttaaagaatt gaattctgat 3540
ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3561
<210> 4
<211> 393
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 4
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1 5 10 15
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100 105 110
Arg Glu Pro Gly Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp Ser
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Pro Ala Arg Ala Ser Val Pro
130 135 140
Glu Gly Arg Gly Ala Arg Gln Gly Ala Gln Glu Ser Gly Leu Pro Arg
145 150 155 160
Ser Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg Ala
165 170 175
Ser Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala
180 185 190
Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr
195 200 205
Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val
210 215 220
Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe
225 230 235 240
Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val
245 250 255
Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys
260 265 270
Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys
275 280 285
Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser
290 295 300
Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Lys Lys
305 310 315 320
Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser
325 330 335
Arg Phe Lys Ser Trp Ser Val His Cys Glu Pro Cys Ser Glu Arg Arg
340 345 350
Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys
355 360 365
Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg
370 375 380
Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
385 390
<210> 5
<211> 2828
<212> DNA
<213> 犬(Canis lupus familiaris)
<220>
<221> CDS
<222> (278)..(922)
<400> 5
ggaggagggg gaggaggaag aagagaagga agaggagagg gggccgcggt ggcgactcgg 60
cgttcgggag ccgggctcat ggacgggtga ggcggctgtg tgcgcagaca gagctccagc 120
cgcgcgcgcg ccccaggccc cggccccggc cccggcccgg gcctcggctc cgggaggaag 180
aggagcccgc ctaggcgccg aggagagcgg gccgccccgc agcccgagcg ggagagggag 240
cgcgagccgc gccggccccg gccgggcctc cgaaacc atg aac ttt ctg ctc tcc 295
Met Asn Phe Leu Leu Ser
1 5
tgg gtg cat tgg agc ctt gcc ttg ctg ctc tac ctc cac cat gcc aag 343
Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys
10 15 20
tgg tcc cag gct gcg cct atg gca gga gga gag cac aaa ccc cac gaa 391
Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Gly Gly Glu His Lys Pro His Glu
25 30 35
gtg gtg aag ttc atg gac gtc tac cag cgc agc tac tgc cgt ccc att 439
Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile
40 45 50
gag acc ctg gtg gac atc ttc cag gag tac cct gac gag atc gag tac 487
Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr
55 60 65 70
atc ttc aag cca tcc tgc gtg ccc ctg atg cgg tgt ggg ggc tgc tgt 535
Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys
75 80 85
aat gat gag ggc cta gag tgc gtg ccc act gag gag ttc aac atc acc 583
Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Phe Asn Ile Thr
90 95 100
atg cag att atg cgg atc aaa cct cat caa ggc cag cac ata ggg gag 631
Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu
105 110 115
atg agt ttc ctg cag cat agc aaa tgt gaa tgc aga cca aag aaa gat 679
Met Ser Phe Leu Gln His Ser Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp
120 125 130
aga gca agg caa gaa aaa aaa tca att cga gga aag ggg aag ggg caa 727
Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Ile Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln
135 140 145 150
aaa aga aag cgc aag aaa tcc cgg tat aaa ccc tgg agc gtt ccc tgt 775
Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Pro Trp Ser Val Pro Cys
155 160 165
ggg cct tgc tca gag cgg aga aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag 823
Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln
170 175 180
acg tgt aaa tgt tcc tgc aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg 871
Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg
185 190 195
cag ctt gag tta aac gaa cgt act tgc aga tgt gac aag ccc agg cgg 919
Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
200 205 210
tga gccgggctgg aagaaggagc ctccctcagg gtttcgggaa ccagacctct 972
215
caccaggaaa gcctgattca gaatgaccgc tacagaaacc acgccgccgc caccaccacc 1032
acaccaccat caccagaaca atccttaatc cagaaacctg aaatgaagga agaggagact 1092
ctgcgcagag cactttgggt ccggagggcg caactccggc agaagcattc ccgggcaggt 1152
gaccaagcac ggtccctctt ggaattggat cgccattgta tttttcttgc tgctaaatca 1212
ccgagcccgg aagattagag agttttattt ctgggattcc tgtagacaca cccacccaca 1272
tacatacttt tatatatata tataaaatat atatataaaa ataaatatat atattttata 1332
tatacgtaaa atatatatat tctttttttt taaattaaca ttgctaatgt tattggtgtc 1392
ttcactggat atatttgact gctgtggact taagttggga ggaggctgtc cccacccaga 1452
tcccaacagg gaagaggatg ggaggggaga ctctggcatg atcttttggt ccctcgtagg 1512
aaggccaggg tccccttccc tgcccaggaa cgtgcttggc cagggcacgg gggcaaattt 1572
ggcctgcttt tggggacact gacaaaccca gccctggccc caagcctcta ccccgagtca 1632
aatggacaga cgacaggtac agggacgagg acactggctc tgactaggag ttcggggagc 1692
ctcaggacac tgctgtactt tgaggatcct ctccacatgc tgcacggacg ggcatcttgc 1752
ccccaggggc actgcctgga agattcagga gactgggcag ccttcaccta ctcttcactt 1812
gctcctgaca agcccagggt gccgccaaca gaggtcttgg cgaaaagaag agagacattg 1872
gtggaggaag ggccgcctgg tggcagcttg tcctccgagg gaagggcccc ctgccttggc 1932
catctcccag ctctccttcc ctggtgcagc ccaggagggc ctgacgtcct cagaccattg 1992
aaaccactag ttctgtcccc ccaggagacc tggctgcgtg tgtgtgagtg gttcaccctc 2052
ctctgtcccc agacccgacc cttcccgcgg cacagagaga cagggcagga tccacgtgcc 2112
caccatggag gcagagaaag tgttttatat acgataatta tttaatatcc ctttttaatt 2172
agaaattaaa acagttaatt taattaaaga gtagggtttt tttcagtatt cttggttaat 2232
atttaatttc aactatttat gagatgtatc tctctattgc tctctcttgc gctcttatat 2292
gtaccggtct ttgtgtttaa gattcatgtt tccaatctct ctctccctga tcggtgacag 2352
tcactagctt gtcctgagca gatatttaat tttgctaaca ctcagctctg ccctcccctt 2412
gcccccggct ccccaccaca cattcctttg aaataaggtt tcaatataca tctacagact 2472
atatatatat ttggcaactt gcgtttgtgt gtatatatat atatatatat atatatatat 2532
atgtttatgt atatatgtga ttctgataaa atagacattg ctattctgtt ttttatatgt 2592
aaaaacaaaa caagaaaaaa tagagaattc tacatactaa atctctctcc ttttttaatt 2652
ttaatatttg ttatcattta tttattggtg ctactgttta tccgtaataa ttgtggggga 2712
aaaagatatt aacatcacat ctttgtctct agtacagttt ttcgagatat tccgtagtac 2772
atatttattt ttaaacaaca acaaagaaat acagatatat cttaaaaaaa aaaaaa 2828
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 犬(Canis lupus familiaris)
<400> 6
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Gly Gly
20 25 30
Glu His Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg
35 40 45
Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr
50 55 60
Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met
65 70 75 80
Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr
85 90 95
Glu Glu Phe Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln
100 105 110
Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Lys Cys Glu
115 120 125
Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Ile Arg
130 135 140
Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys
145 150 155 160
Pro Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu
165 170 175
Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp
180 185 190
Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg
195 200 205
Cys Asp Lys Pro Arg Arg
210
<210> 7
<211> 3677
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 7
tcgcggaggc ttggggcagc cgggtagctc ggaggtcgtg gcgctggggg ctagcaccag 60
cgctctgtcg ggaggcgcag cggttaggtg gaccggtcag cggactcacc ggccagggcg 120
ctcggtgctg gaatttgata ttcattgatc cgggttttat ccctcttctt ttttcttaaa 180
catttttttt taaaactgta ttgtttctcg ttttaattta tttttgcttg ccattcccca 240
cttgaatcgg gccgacggct tggggagatt gctctacttc cccaaatcac tgtggatttt 300
ggaaaccagc agaaagagga aagaggtagc aagagctcca gagagaagtc gaggaagaga 360
gagacggggt cagagagagc gcgcgggcgt gcgagcagcg aaagcgacag gggcaaagtg 420
agtgacctgc ttttgggggt gaccgccgga gcgcggcgtg agccctcccc cttgggatcc 480
cgcagctgac cagtcgcgct gacggacaga cagacagaca ccgcccccag ccccagctac 540
cacctcctcc ccggccggcg gcggacagtg gacgcggcgg cgagccgcgg gcaggggccg 600
gagcccgcgc ccggaggcgg ggtggagggg gtcggggctc gcggcgtcgc actgaaactt 660
ttcgtccaac ttctgggctg ttctcgcttc ggaggagccg tggtccgcgc gggggaagcc 720
gagccgagcg gagccgcgag aagtgctagc tcgggccggg aggagccgca gccggaggag 780
ggggaggagg aagaagagaa ggaagaggag agggggccgc agtggcgact cggcgctcgg 840
aagccgggct catggacggg tgaggcggcg gtgtgcgcag acagtgctcc agccgcgcgc 900
gctccccagg ccctggcccg ggcctcgggc cggggaggaa gagtagctcg ccgaggcgcc 960
gaggagagcg ggccgcccca cagcccgagc cggagaggga gcgcgagccg cgccggcccc 1020
ggtcgggcct ccgaaaccat gaactttctg ctgtcttggg tgcattggag ccttgccttg 1080
ctgctctacc tccaccatgc caagtggtcc caggctgcac ccatggcaga aggaggaggg 1140
cagaatcatc acgaagtggt gaagttcatg gatgtctatc agcgcagcta ctgccatcca 1200
atcgagaccc tggtggacat cttccaggag taccctgatg agatcgagta catcttcaag 1260
ccatcctgtg tgcccctgat gcgatgcggg ggctgctgca atgacgaggg cctggagtgt 1320
gtgcccactg aggagtccaa catcaccatg cagattatgc ggatcaaacc tcaccaaggc 1380
cagcacatag gagagatgag cttcctacag cacaacaaat gtgaatgcag accaaagaaa 1440
gatagagcaa gacaagaaaa aaaatcagtt cgaggaaagg gaaaggggca aaaacgaaag 1500
cgcaagaaat cccggtataa gtcctggagc gtgtacgttg gtgcccgctg ctgtctaatg 1560
ccctggagcc tccctggccc ccatccctgt gggccttgct cagagcggag aaagcatttg 1620
tttgtacaag atccgcagac gtgtaaatgt tcctgcaaaa acacagactc gcgttgcaag 1680
gcgaggcagc ttgagttaaa cgaacgtact tgcagatgtg acaagccgag gcggtgagcc 1740
gggcaggagg aaggagcctc cctcagggtt tcgggaacca gatctctcac caggaaagac 1800
tgatacagaa cgatcgatac agaaaccacg ctgccgccac cacaccatca ccatcgacag 1860
aacagtcctt aatccagaaa cctgaaatga aggaagagga gactctgcgc agagcacttt 1920
gggtccggag ggcgagactc cggcggaagc attcccgggc gggtgaccca gcacggtccc 1980
tcttggaatt ggattcgcca ttttattttt cttgctgcta aatcaccgag cccggaagat 2040
tagagagttt tatttctggg attcctgtag acacacccac ccacatacat acatttatat 2100
atatatatat tatatatata taaaaataaa tatctctatt ttatatatat aaaatatata 2160
tattcttttt ttaaattaac agtgctaatg ttattggtgt cttcactgga tgtatttgac 2220
tgctgtggac ttgagttggg aggggaatgt tcccactcag atcctgacag ggaagaggag 2280
gagatgagag actctggcat gatctttttt ttgtcccact tggtggggcc agggtcctct 2340
cccctgccca ggaatgtgca aggccagggc atgggggcaa atatgaccca gttttgggaa 2400
caccgacaaa cccagccctg gcgctgagcc tctctacccc aggtcagacg gacagaaaga 2460
cagatcacag gtacagggat gaggacaccg gctctgacca ggagtttggg gagcttcagg 2520
acattgctgt gctttgggga ttccctccac atgctgcacg cgcatctcgc ccccaggggc 2580
actgcctgga agattcagga gcctgggcgg ccttcgctta ctctcacctg cttctgagtt 2640
gcccaggaga ccactggcag atgtcccggc gaagagaaga gacacattgt tggaagaagc 2700
agcccatgac agctcccctt cctgggactc gccctcatcc tcttcctgct ccccttcctg 2760
gggtgcagcc taaaaggacc tatgtcctca caccattgaa accactagtt ctgtcccccc 2820
aggagacctg gttgtgtgtg tgtgagtggt tgaccttcct ccatcccctg gtccttccct 2880
tcccttcccg aggcacagag agacagggca ggatccacgt gcccattgtg gaggcagaga 2940
aaagagaaag tgttttatat acggtactta tttaatatcc ctttttaatt agaaattaaa 3000
acagttaatt taattaaaga gtagggtttt ttttcagtat tcttggttaa tatttaattt 3060
caactattta tgagatgtat cttttgctct ctcttgctct cttatttgta ccggtttttg 3120
tatataaaat tcatgtttcc aatctctctc tccctgatcg gtgacagtca ctagcttatc 3180
ttgaacagat atttaatttt gctaacactc agctctgccc tccccgatcc cctggctccc 3240
cagcacacat tcctttgaaa taaggtttca atatacatct acatactata tatatatttg 3300
gcaacttgta tttgtgtgta tatatatata tatatgttta tgtatatatg tgattctgat 3360
aaaatagaca ttgctattct gttttttata tgtaaaaaca aaacaagaaa aaatagagaa 3420
ttctacatac taaatctctc tcctttttta attttaatat ttgttatcat ttatttattg 3480
gtgctactgt ttatccgtaa taattgtggg gaaaagatat taacatcacg tctttgtctc 3540
tagtgcagtt tttcgagata ttccgtagta catatttatt tttaaacaac gacaaagaaa 3600
tacagatata tcttaaaaaa aaaaaagcat tttgtattaa agaatttaat tctgatctca 3660
aaaaaaaaaa aaaaaaa 3677
<210> 8
<211> 412
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 8
Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Tyr His Leu
1 5 10 15
Leu Pro Gly Arg Arg Arg Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Gly Gln
20 25 30
Gly Pro Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg
35 40 45
Gly Val Ala Leu Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Cys Ser Arg Phe
50 55 60
Gly Gly Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Ala Glu Pro Ser Gly Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ser Ala Ser Ser Gly Arg Glu Glu Pro Gln Pro Glu Glu Gly Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Arg Leu Gly
100 105 110
Ala Arg Lys Pro Gly Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp
115 120 125
Ser Ala Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Leu Ala Arg Ala Ser Gly
130 135 140
Arg Gly Gly Arg Val Ala Arg Arg Gly Ala Glu Glu Ser Gly Pro Pro
145 150 155 160
His Ser Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg
165 170 175
Ala Ser Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu
180 185 190
Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro
195 200 205
Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met
210 215 220
Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp
225 230 235 240
Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser
245 250 255
Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu
260 265 270
Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg
275 280 285
Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln
290 295 300
His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu
305 310 315 320
Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys
325 330 335
Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys
340 345 350
Leu Met Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser
355 360 365
Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys
370 375 380
Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu
385 390 395 400
Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
405 410
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<400> 9
gccccgatgg cggaaggtgg tggtcaaaac catcacgagg tagtcaaatt tatggacgtt 60
taccagcgct cttattgcca cccaatcgaa acgctggttg atattttcca ggaatatccg 120
gatgaaatcg aatacatttt caaaccgtct tgtgtcccac tgatgcgctg tggtggctgc 180
tgcaatgacg agggcctgga gtgcgttcca accgaagaat ccaatattac gatgcaaatt 240
atgcgtatta aaccgcacca aggccaacac atcggtgaaa tgtctttcct gcagcacaac 300
aaatgtgaat gtcgcccgaa gaaagaccgt gcacgccagg aaaagtgtga caagccgcgt 360
cgttaa 366
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成肽
<400> 10
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg
115 120
<210> 11
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<400> 11
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 60
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 120
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 180
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 240
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 300
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 360
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 420
aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg 480
tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac 540
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<210> 12
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成肽
<400> 12
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly
130 135 140
Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr
145 150 155 160
Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln
165 170 175
Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
180 185 190
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 13
ggg tat acc ttc aca aac tat gga 24
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 14
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 15
ata aac acc tac act gga gag cca 24
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 16
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(39)
<400> 17
gca aga ttt tcc tac ggt att acc tgg ttc ttc gat gtc 39
Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 18
Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(36)
<400> 19
cag agt ctg ctc aac agt aga acc cga aag aac tac 36
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 20
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 21
aag caa tct tat aat ctg tac acg 24
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 22
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
<400> 23
ggc tac tca atc acc agt gat tat gcc 27
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 25
ata agc tac agt ggt agc act 21
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 26
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(45)
<400> 27
gca aga ggg ggg gat tac tac ggt agt cgc ccc tgg ttt gct tac 45
Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 28
Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
<400> 29
act ggg gct gtt aca att agt aac tac 27
Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 30
Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(27)
<400> 31
gct ctc tgg tac agc aac cat ttg gtg 27
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 32
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Leu Val
1 5
<210> 33
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 33
cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc aca aac tat 96
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
gga atg aac tgg gtg aag cag gct cca gga aag ggt tta aag tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
ggc tgg ata aac acc tac act gga gag cca aca tat ctt gat gac ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Leu Asp Asp Phe
50 55 60
aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc tac 240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg tct aca tat ttc tgt 288
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
gca aga ttt tcc tac ggt att acc tgg ttc ttc gat gtc tgg ggc gca 336
Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 360
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 34
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Leu Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Ser Tyr Gly Ile Thr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<400> 35
gac att gtg atg tca cag tct cca tcc tcc ctg gct gtg tca gca gga 48
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
gag aag gtc act atg agc tgc aaa tcc agt cag agt ctg ctc aac agt 96
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
aga acc cga aag aac tac ttg gct tgg tac cag cag aaa cca ggg cag 144
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
tct cct aaa ctg ctg atc tac tgg gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agt gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat tac tgc aag caa 288
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
tct tat aat ctg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa c 337
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 36
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(366)
<400> 37
gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag 48
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
tct ctg tcc ctc acc tgc act gtc act ggc tac tca atc acc agt gat 96
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
tat gcc tgg acc tgg atc cgg cag ttt cca gga gac aaa ctg gag tgg 144
Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp
35 40 45
atg ggc tac ata agc tac agt ggt agc act cgc tac aac cca tct ctc 192
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
aaa agt cga atc tct atc act cga gac aca tcc aag aac cag ttc ttc 240
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
ctg cac ttg aat tct gtg act act gag gac acg gcc aca tat ttc tgt 288
Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
gca aga ggg ggg gat tac tac ggt agt cgc ccc tgg ttt gct tac tgg 336
Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca g 367
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 38
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Thr Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 39
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(327)
<400> 39
cag gct gtt gtg act cag gaa tct gca ctc acc aca tca cct ggt gaa 48
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
aca gtc aca ctc act tgt cgc tca agt act ggg gct gtt aca att agt 96
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser
20 25 30
aac tac gcc aac tgg gtc caa gaa aaa cca gat cat tta ttc act ggt 144
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
cta ata ggt ggt acc aac aac cga gct cca gat gtt cct gcc aga ttc 192
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Asp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct gcc ctc acc atc aca ggg gca 240
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
cag act gag gat gag gca ata tat ttc tgt gct ctc tgg tac agc aac 288
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
cat ttg gtg ttc ggt gaa gga acc aaa ctg act gtc cta g 328
His Leu Val Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 40
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 40
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Asp Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Leu Val Phe Gly Glu Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 41
<211> 1004
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<400> 41
gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tgagtcctag ctgg 1004
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 42
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 43
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 43
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 48
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 96
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 144
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 192
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 240
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 288
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 321
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 44
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 44
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 45
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1008)
<400> 45
gcc tcc acc acg gcc ccc tcg gtt ttc cca ctg gcc ccc agc tgc ggg 48
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
tcc act tcc ggc tcc acg gtg gcc ctg gcc tgc ctg gtg tca ggc tac 96
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
ttc ccc gag cct gta act gtg tcc tgg aat tcc ggc tcc ttg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
ggt gtg cac acc ttc ccg tcc gtc ctg cag tcc tca ggg ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc atg gtg aca gtg ccc tcc agc agg tgg ccc agc gag acc 240
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
ttc acc tgc aac gtg gcc cac ccg gcc agc aaa act aaa gta gac aag 288
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
cca gtg ccc aaa aga gaa aat gga aga gtt cct cgc cca cct gat tgt 336
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
ccc aaa tgc cca gcc cct gaa atg ctg gga ggg cct tcg gtc ttc atc 384
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
ttt ccc ccg aaa ccc aag gac acc ctc ttg att gcc cga aca cct gag 432
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
gtc aca tgt gtg gtg gtg gat ctg gac cca gaa gac cct gag gtg cag 480
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
atc agc tgg ttc gtg gac ggt aag cag atg caa aca gcc aag act cag 528
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
cct cgt gag gag cag ttc aat ggc acc tac cgt gtg gtc agt gtc ctc 576
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
ccc att ggg cac cag gac tgg ctc aag ggg aag cag ttc acg tgc aaa 624
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
gtc aac aac aaa gcc ctc cca tcc ccg atc gag agg acc atc tcc aag 672
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
gcc aga ggg caa gcc cat cag ccc agt gtg tat gtc ctg ccg cca tcc 720
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
cgg gag gag ttg agc aag aac aca gtc agc ttg aca tgc ctg atc aaa 768
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
gac ttc ttc cca cct gac att gat gtg gag tgg cag agc aat gga cag 816
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
cag gag cct gag agc aag tac cgc acg acc ccg ccc cag ctg gac gag 864
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
gac ggg tcc tac ttc ctg tac agc aag ctc tct gtg gac aag agc cgc 912
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
tgg cag cgg gga gac acc ttc ata tgt gcg gtg atg cat gaa gct cta 960
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
cac aac cac tac aca cag gaa tcc ctc tcc cat tct ccg ggt aaa tga 1008
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 46
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 46
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 47
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(342)
<400> 47
ctc gag ata aaa aat gat gcc cag cca gcc gtc tat ttg ttc caa cca 48
Leu Glu Ile Lys Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro
1 5 10 15
tct cca gac cag tta cac aca gga agt gcc tct gtt gtg tgt ttg ctg 96
Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
20 25 30
aat agc ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aaa gtg gat ggt 144
Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly
35 40 45
gtc atc caa gac aca ggc atc cag gaa agt gtc aca gag cag gac aag 192
Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys
50 55 60
gac agt acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg atg tcc agt act gag 240
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu
65 70 75 80
tac cta agt cat gag ttg tac tcc tgt gag atc act cac aag agc ctg 288
Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu
85 90 95
ccc tcc acc ctc atc aag agc ttc caa agg agc gag tgt cag aga gtg 336
Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val
100 105 110
gac tag 342
Asp
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 48
Leu Glu Ile Lys Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro
1 5 10 15
Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
20 25 30
Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly
35 40 45
Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys
50 55 60
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu
65 70 75 80
Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu
85 90 95
Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val
100 105 110
Asp
<210> 49
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> gene
<223> 合成 DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<400> 49
cag ccc aag gcc tcc ccc tcg gtc aca ctc ttc ccg ccc tcc tct gag 48
Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
gag ctc ggc gcc aac aag gcc acc ctg gtg tgc ctc atc agc gac ttc 96
Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
tac ccc agc ggc gtg acg gtg gcc tgg aag gca agc ggc agc ccc gtc 144
Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Ser Gly Ser Pro Val
35 40 45
acc cag ggc gtg gag acc acc aag ccc tcc aag cag agc aac aac aag 192
Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gac aag tgg aaa tct 240
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser
65 70 75 80
cac agc agc ttc agc tgc ctg gtc acg cac gag ggg agc acc gtg gag 288
His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
aag aag gtg gcc ccc gca gag tgc tct tag 318
Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 50
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成构建体
<400> 50
Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Ser Gly Ser Pro Val
35 40 45
Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 51
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成肽
<400> 51
Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met
65 70 75 80
Arg Ile Lys Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu
85 90 95
Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro
100 105 110
Glu Asn
<210> 52
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成肽
<400> 52
Ala Pro Thr Thr Glu Gly Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Cys Val Pro Thr Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln Ile Met
65 70 75 80
Arg Ile Lys Pro His Gln Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu
85 90 95
Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro
100 105 110
Glu Asn
<210> 53
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成肽
<400> 53
Ala Pro Met Ala Gly Gly Glu His Lys Pro His Glu Val Val Lys Phe
1 5 10 15
Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val
20 25 30
Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro
35 40 45
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly
50 55 60
Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Phe Asn Ile Thr Met Gln Ile Met
65 70 75 80
Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu
85 90 95
Gln His Ser Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln
100 105 110
Glu Asn
<210> 54
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 合成肽
<400> 54
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65 70 75 80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gln Glu Asn
115

Claims (21)

1.一种单克隆抗体，其为针对VEGF的单克隆抗体，其以1x10-11mol/L以下的解离常数与血管内皮生长因子(VEGF)结合，
所述单克隆抗体包含：
(i)由序列号14的氨基酸序列构成的CDR-H1、由序列号16的氨基酸序列构成的CDR-H2、由序列号18的氨基酸序列构成的CDR-H3，由序列号20的氨基酸序列构成的CDR-L1、由氨基酸序列Trp-Ala-Ser构成的CDR-L2及由序列号22的氨基酸序列构成的CDR-L3；或者
(ii)由序列号24的氨基酸序列构成的CDR-H1、由序列号26的氨基酸序列构成的CDR-H2、由序列号28的氨基酸序列构成的CDR-H3、由序列号30的氨基酸序列构成的CDR-L1、由氨基酸序列Gly-Thr-Asn构成的CDR-L2及由序列号32的氨基酸序列构成的CDR-L3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其抑制血管内皮生长因子(VEGF)与选自由血管内皮生长因子受体-1(VEGFR1)及血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)组成的组中的至少1种受体的结合。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中，单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或犬源化抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体，其还含有源自人IgG1重链恒定区的氨基酸序列及源自人IgG1轻链恒定区的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中，源自人IgG1重链恒定区的氨基酸序列含有序列号42的氨基酸序列、并且源自人IgG1轻链恒定区的氨基酸序列含有序列号44的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体，其包含：含有序列号34或38的氨基酸序列及序列号42的氨基酸序列的重链、及含有序列号36或40的氨基酸序列及序列号44的氨基酸序列的轻链。
7.根据权利要求1所述的抗体，其还含有源自犬IgGB重链恒定区的氨基酸序列及源自犬Igκ轻链恒定区或犬Igλ轻链恒定区的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，源自犬IgGB重链恒定区的氨基酸序列含有序列号46的氨基酸序列，源自犬Igκ轻链恒定区的氨基酸序列含有序列号48的氨基酸序列，并且源自犬Igλ轻链恒定区的氨基酸序列含有序列号50的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的抗体，其包含：含有序列号34或38的氨基酸序列及序列号46的氨基酸序列的重链、及含有序列号36或40的氨基酸序列及序列号48或50的氨基酸序列的轻链。
10.一种权利要求1～9中任一项所述的单克隆抗体的片段，其为抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的片段，其中，抗原结合片段为单链抗体或双链抗体。
12.一种药物组合物，其含有权利要求1～11中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.一种血管新生抑制剂，其含有权利要求1～11中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
14.一种试剂，其含有权利要求1～11中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
15.一种试剂盒，其含有权利要求1～11中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求1～11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防癌症或VEGF介导性眼科疾病的药物中的用途，
其中，所述癌症是VEGF所参与的癌症。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，癌症或VEGF介导性眼科疾病的治疗或预防基于血管新生或血管通透性亢进的抑制。
18.根据权利要求17所述的用途，其中，血管新生为病理性血管新生。
19.根据权利要求16所述的用途，其中，癌症为实体癌或血液肿瘤。
20.根据权利要求16所述的用途，其中，癌症选自由结肠直肠癌、直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌瘤、头颈部癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤及多发性骨髓瘤组成的组。
21.根据权利要求16所述的用途，其中，VEGF介导性眼科疾病为选自老年黄斑变性、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、血管新生性青光眼、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、继发于病理性近视的脉络膜血管新生性疾病、翼状胬肉、虹膜红变、角膜翳、皮肤粘膜眼综合症及眼部的移植组织免疫排斥中的至少一种。
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