CN108699139B - 人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合焦谷氨酸化淀粉样蛋白β(AβN3pE)肽N‑末端表位的人源化抗体以及涉及与淀粉样蛋白肽的积累和沉积相关疾病和疾病状况的预防性和治疗性治疗，所述疾病和疾病状况如淀粉样变性，与焦谷氨酸化淀粉样蛋白肽相关的一组病症和异常，如阿尔茨海默病、唐氏综合征、大脑淀粉样血管病以及其他相关方面。更具体地，其涉及使用人源化单克隆抗体结合血浆、脑和脑脊液中的焦谷氨酸化淀粉样蛋白β肽以防止大脑内和外周各种组织中AβN3p的积累或逆转其沉积，以及缓解淀粉样变性。本发明进一步涉及利用本发明的人源化抗体诊断淀粉样变性的诊断测定。

Description

人源化抗体
发明领域
本发明涉及结合焦谷氨酸化(pyroglutamated)淀粉样蛋白β(AβN3pE)肽N-末端处的表位的人源化抗体以及涉及疾病和疾病状况的预防性和治疗性治疗，所述疾病和疾病状况涉及淀粉样蛋白肽的积累和沉积，如淀粉样变性，与焦谷氨酸化淀粉样蛋白肽相关的一组病症和异常，如阿尔茨海默病、唐氏综合征、大脑淀粉样血管病以及其他相关方面。更具体地，其涉及使用人源化单克隆抗体结合血浆、脑和脑脊液中的焦谷氨酸化淀粉样蛋白β肽以防止大脑内和外周各种组织中AβN3p的积累或逆转其沉积，以及缓解淀粉样变性。本发明进一步涉及利用本发明的人源化抗体诊断淀粉样变性的诊断测定。
背景技术
淀粉样变性不是单一疾病实体而是一组不同的进行性疾病过程，其特征在于称作淀粉样蛋白的蜡状、淀粉样的蛋白的胞外组织沉积，所述淀粉样蛋白在一个或多个器官或身体***中积累。随着淀粉样蛋白沉积积累，它们开始***官或身体***的正常功能。有至少15种不同类型的淀粉样变性。主要形式是没有已知前提的原发性淀粉样变性、一些其他疾病状况之后的继发性淀粉样变性和遗传性淀粉样变性。
继发性淀粉样变性在慢性感染或炎性疾病期间发生，如结核病、称作家族性地中海热的细菌感染、骨感染(骨髓炎)、类风湿性关节炎、小肠的炎症(肉芽肿性回肠炎)、霍奇金病和麻风。
淀粉样蛋白沉积包括淀粉样蛋白P(五角形)组分(AP)，涉及正常血清淀粉样蛋白P(SAP)的糖蛋白，以及硫酸化糖胺聚糖(GAG)，***的复杂碳水化合物。占淀粉样物质约90％的淀粉样蛋白纤维包含几种不同类型的蛋白之一。这些蛋白能够折叠为所谓的“β-折叠”纤维，具有刚果红结合位点的独特蛋白构型，导致淀粉样蛋白的独特染色特性。
衰老的许多疾病是基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关，并且部分特征在于有助于发病机理以及疾病发展的淀粉样蛋白或淀粉样物质胞外沉积的建立。这些疾病包括但不限于神经***病症如轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或者家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性，路易体痴呆，具有淀粉样变性的遗传学脑出血(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征。基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关的其他疾病是进行性核上性麻痹，多发性硬化；Creutzfeldt-Jacob病，帕金森病，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，成人发病型糖尿病；老年性心脏淀粉样变性；内分泌肿瘤等，包括黄斑变性。
虽然这些疾病的发病机理可能不同，但是它们的特征性沉积常包含许多共同的分子组分。在很大程度上，这可以归因于促炎途径的局部激活，从而导致激活的补体组分、急性期反应物、免疫调节剂和其他炎症介质的同时沉积(McGeer et al.,Tohoku J ExpMed.174(3):269-277(1994))。
最近，越来越多的证据证明N-末端修饰的Aβ肽变体参与阿尔茨海默病。针对性活组织检查显示Aβ1-40和Aβ1-42不仅存在于阿尔茨海默病患者的脑中，而且还存在于未受影响的对象的老年斑中。但是，N-末端截短和pyroGlu修饰的AβN3pE-40/AβN3pE-42几乎仅根深蒂固在阿尔茨海默病患者的斑块内，使得这种Aβ变体成为合格的诊断标记和药物开发的潜在靶标。
目前，几个商业制造商提供ELISA试剂盒，其允许检测低皮克(pg)范围中的Aβ1-40/1-42和AβN3pE-40/AβN3pE-42。
阿尔茨海默病(AD)患者脑的形态学特征在于存在神经原纤维缠结和新皮层脑结构中Aβ肽的沉积(Selkoe,D.J.&Schenk,D.Alzheimer's disease:molecularunderstanding predicts amyloid-based therapeutics.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.43,545-584(2003))。β-和γ-分泌酶顺序切割后，Aβ肽从淀粉样蛋白前体蛋白(APP)释放。γ-分泌酶切割导致产生Aβ1-40和Aβ1-42肽，其不同之处在于它们的C-末端，并且表现出不同的聚集、纤维形成和神经毒性潜能(Shin,R.W.et al.Amyloid beta-protein(Abeta)1-40but not Abeta 1-42contributes to the experimental formation of Alzheimerdisease amyloid fibrils in rat brain.J.Neurosci.17,8187-8193(1997)；Iwatsubo,T.et al.Visualization of Abeta 42(43)and Abeta 40in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals:evidence that an initially deposited species isAbeta 42(43).Neuron 13,45-53(1994)；Iwatsubo,T.,Mann,D.M.,Odaka,A.,Suzuki,N.&Ihara,Y.Amyloid beta protein(Abeta)deposition:Abeta42(43)precedes Abeta 40inDown syndrome.Ann.Neurol.37,294-299(1995)；Hardy,J.A.&Higgins,G.A.Alzheimer'sdisease:the amyloid cascade hypothesis.Science 256,184-185(1992)；Roβner,S.,Ueberham,U.,Schliebs,R.,Perez-Polo,J.R.&Bigl,V.The regulation of amyloidprecursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophinreceptor signaling.Prog.Neurobiol.56,541-569(1998))。
弥漫性斑块中沉积的大部分Aβ肽是N-末端截短或修饰的。Piccini和Saido的研究已显示老年斑和血管沉积的核心结构由50％焦谷氨酸(pyroGlu)修饰的肽组成(Picciniet al.,J Biol Chem.2005Oct 7；280(40):34186-92；Saido et al.,Neuron.1995Feb；14(2):457-66)。PyroGlu修饰的肽具有比其他Aβ种类更强的细胞毒性，并且对氨肽酶稳定(Russo et al.,J Neurochem.2002Sep；82(6):1480-9)。因此，pyroGlu Aβ种类具有较长半衰期，从而这些种类的积累以及神经毒性寡聚体和聚集体的形成是有益的(Saido,Neurobiol Aging.1998Jan-Feb；19(1Suppl):S69-75)。由于谷氨酸环化至pyroGlu，带电荷的氨基酸会丢失，这强烈降低肽的溶解度并导致聚集趋势增加。体外研究已显示例如Aβ3(pE)的初始寡聚化与未修饰的肽相比快很多(Schilling et al.,Biochemistry.2006Oct17；45(41):12393-9)。AβN3pE-42肽与Aβ1-40/1-42肽共存(Saido,T.C.et al.Dominantand differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species,AbetaN3pE,in senile plaques.Neuron 14,457-466(1995)；Saido,T.C.,Yamao,H.,Iwatsubo,T.&Kawashima,S.Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloidpeptides deposited in human brain.Neurosci.Lett.215,173-176(1996))，并且基于许多观察，可以在AD的发病机理中起重要作用。例如，AβN3pE-42肽的特定神经毒性已列出(Russo,C.et al.Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival.J.Neurochem.82,1480-1489(2002)，并且N-截短的Aβ肽的pE-修饰赋予对大多数氨肽酶以及Aβ-降解内肽酶降解的抗性(Russo,C.et al.Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides--AbetaN3(pE)--strongly affect cultured neuron and astrocyte survival.J.Neurochem.82,1480-1489(2002)；Saido,T.C.Alzheimer's disease as proteolytic disorders:anabolism and catabolism of beta-amyloid.Neurobiol.Aging 19,S69-S75(1998))。谷氨酸环化至pE导致丢失N-末端电荷，导致与未修饰的Aβ肽相比AβN3pE的聚集加速(He,W.&Barrow,C.J.The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found insenile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities invitro than full-length Abeta.Biochemistry 38,10871-10877(1999)；Schilling,S.etal.On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides(in vitro).Biochemistry 45,12393-12399(2006))。因此，AβN3pE-42形成的减少应当通过使肽更容易降解来使它们不稳定，并且转而防止较高分子量Aβ聚集体的形成并增加神经元存活。
但是，很长时间不知道Aβ肽的pE-修饰怎样发生。最近，据发现谷氨酰胺酰基环化酶(QC)能够在弱酸性条件下催化AβN3pE-42形成，并且特异性QC抑制剂在体外防止AβN3pE-42产生(Schilling,S.,Hoffmann,T.,Manhart,S.,Hoffmann,M.&Demuth,H.-U.Glutaminylcyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions.FEBSLett.563,191-196(2004)；Cynis,H.et al.Inhibition of glutaminyl cyclase alterspyroglutamate formation in mammalian cells.Biochim.Biophys.Acta 1764,1618-1625(2006))。
所有事实表明pyroGlu Aβ是开始纤维形成的一类种子。在进一步的研究中(Piccini et al.,2005,supra)，由于Aβ-种类的特征量，具有斑块沉积但没有AD特异性病理的志愿者可以与AD患者区分。因此N-末端截短、pyroGlu修饰的肽的量在AD患者的脑中显著较高。
在Aβ-肽的位置3或11处pyroGlu的翻译后形成表明N-末端谷氨酸残基的环化。谷氨酰胺酰基环化酶(QC)在pyroGlu肽的产生中起重要作用。QC在植物界和动物界中广泛存在，参与肽激素的成熟。通过释放氨环化谷氨酰胺和通过释放水环化谷氨酸成pyroGlu是通过QC进行的。与谷氨酰胺环化相反，谷氨酸环化不是自发发生的。QC催化从谷氨酸至pyroGlu的高效(不需要的)副反应。产生的pyroGlu残基保护蛋白免受蛋白水解降解。有几个参考文献显示QC在pyroGlu Aβ的产生中起重要作用：
1.在几个研究中显示QC催化从Aβ的N-末端处的谷氨酸形成pyroGlu残基(Cyniset al.,Biochim Biophys Acta.2006Oct；1764(10):1618-25,Schilling et al.,FEBSLett.2004Apr 9；563(1-3):191-6)；
2.Aβ肽和QC在海马和皮层中大量表达。这些大脑区域在AD尤其危险(Pohl etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.1991Nov 15；88(22):10059-63,Selkoe,PhysiolRev.2001Apr；81(2):741-66)；
3.APP在转运至质膜期间被β-分泌酶切割，从而可以产生具有游离谷氨酸残基的Aβ的N-末端(Greenfield et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1999Jan 19；96(2):742-7)。在分泌囊泡中确定了加工的APP和QC的共定位。所以在囊泡的弱酸性环境中可以发生加速的谷氨酸残基至焦谷氨酸的修饰。
4.而且其他神经变性疾病(家族性丹麦型(FDD)或英国型痴呆(FBD))与N-末端pyroGlu修饰的肽如Bri2相关，但是相反在一级结构方面它们与Aβ无关(Vidal R.et al.,1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,4920-4925)。
可能QC催化的pyroGlu Aβ形成参与神经变性疾病的发生和发展。N-末端修饰的淀粉样蛋白肽的形成当然代表Aβ聚集过程中的基本因素，并且可以是疾病的开始。通过抑制QC抑制pyroGlu Aβ形成可能代表治疗方法。QC抑制剂能够防止pyroGlu Aβ形成，减少大脑中的焦谷氨酸Aβ浓度，并且因此延迟Aβ-肽的寡聚化。Schilling等人显示QC表达在AD患者的皮层中上调，并且与pyroGlu修饰的Aβ-肽的外观相关。QC抑制剂的口服应用在AD的两种不同转基因小鼠模型和新果蝇(Drosophila)模型中导致焦谷氨酸修饰的AβpE(3-42)水平降低(Schilling et al.,2008Biol.Chem.(389),983-991)。
路易体痴呆(LBD)是可以发生在65岁以上的人中的神经变性病症，并且通常引起认知(思维)障碍和异常行为改变的症状。症状可以包括认知障碍、神经***体征、睡眠障碍和自主神经衰竭。在大多数情况下认知障碍是LBD的呈现特征。患者具有逐渐恶化的反复发作的意识错乱。认知能力的波动常与注意力和警惕性的转移程度相关。认知障碍和思维的波动可以在分钟、小时或天数变化。路易体形成自磷酸化和非磷酸化的神经丝蛋白；它们包含突触蛋白α-突触核蛋白以及泛素，其参与消除损伤或异常的蛋白。除了路易体，路易神经突也可能存在，其是神经细胞的细胞过程中的包涵体。淀粉样斑块可以在患有DLB的患者大脑中形成，但是它们在数量上倾向于比在患有阿尔茨海默病的患者中看到的少。AD的另一显微病理特征神经原纤维缠结不是LBD的主要特征，但是除淀粉样斑块以外经常存在。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的特征在于上和下运动神经元的变性。在一些ALS患者中，可能存在痴呆或失语症(ALS-D)。痴呆最常见的是额颞叶痴呆(FTD)，并且许多这些病例在齿状回以及额叶和颞叶表层的神经元中具有泛素阳性、tau阴性的包涵体。
包涵体肌炎(IBM)是通常在50岁以上的人中发现的一种严重疾病，其中肌纤维发展炎症并开始萎缩—但是其中大脑幸免，并且患者保留他们的全部智力。据发现参与产生淀粉样蛋白-β蛋白的两种酶在患有这种最常见的、老年人进行性肌肉疾病的患者的肌细胞内增加，其中淀粉样蛋白-β也增加。
基于淀粉样蛋白的积累和沉积或与淀粉样蛋白的积累和沉积相关的另一疾病是黄斑变性。黄斑变性是引起黄斑恶化的常见眼疾病，黄斑是视网膜的中心区域(在眼后部的像纸一样薄的组织，在这里光敏细胞向大脑发出视觉信号)。清晰、明亮、“笔直”的视觉通过黄斑加工。对黄斑的损伤导致盲点的发展以及模糊或扭曲的视觉。年龄相关性黄斑变性(AMD)是美国视力损伤的主要原因，并且对于65岁以上的人，其是白种人中法定失明的主要原因。约1.8×106个40岁及以上的美国人患有晚期AMD，并且另外7.3×106个患有中度AMD的人有很大的视力丧失风险。政府估计到2020年会有2.9×106个人患有晚期AMD。AMD的受害者经常感到惊讶和沮丧的发现对这种失明状况的原因和治疗知之甚少。
有两种形式的黄斑变性：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。85％的黄斑变性病例诊断为干性形式，其中黄斑细胞慢慢开始破裂。两只眼通常受干性AMD影响，虽然一只眼可以失去视力而另一只眼不受影响。视网膜下的黄色沉积物玻璃疣是干性AMD的常见早期征兆。发展晚期干性AMD或湿性AMD的风险随着玻璃疣的数量或大小的增加而增加。干性AMD可能发展并引起视觉丧失而不转变为疾病的湿性形式；但是，早期干性AMD也可能突然变为湿性形式。
虽然其仅占15％的病例，但是湿性形式导致90％的失明，并且考虑为晚期AMD(没有早期或中期的湿性AMD)。湿性AMD之前通常是疾病的干性形式。随着干性形式恶化，一些人开始在黄斑后面有异常血管生长。这些血管非常脆弱并且会渗漏流体和血液(因此“湿性”黄斑变性)，对黄斑造成快速损伤。
AMD的干性形式最初常造成略微模糊的视力。特别是视觉中心可能然后变得模糊，并且这个区域随着疾病发展长大。如果仅一只眼受到影响，可能没有注意到任何症状。在湿性AMD中，直线可能看来是波浪形的，并且中心视力丧失可以很快发生。
黄斑变性的诊断通常包括散瞳眼检查、视觉敏感度测试以及利用称作眼底检查的过程观察眼睛后面以帮助诊断AMD，以及—如果怀疑湿性AMD—还可以进行荧光素血管造影术。如果干性AMD达到晚期阶段，目前没有防止视力丧失的治疗。但是，特别高剂量配方的抗氧化剂和锌可以延迟或防止中期AMD发展为晚期阶段。
Figure GDA0003445579340000051
(哌加他尼钠注射液)、激光光凝和光动力学疗法可以控制黄斑中的异常血管生长和出血，这有助于一些患有湿性AMD的人；但是，已丧失的视力不会通过这些技术恢复。如果视力已丧失，存在可以帮助改善生活质量的低视力辅助器。
年龄相关性黄斑变性(AMD)的最早表现之一是视网膜色素上皮(RPE)的基底层和布鲁赫膜(BM)之间已知为玻璃疣的胞外沉积物的积累。Anderson等人进行的最近研究证实玻璃疣包含淀粉样蛋白β。(Experimental Eye Research 78(2004)243-256).
已显示焦谷氨酸化Aβ肽在Aβ肽的积累和阿尔茨海默病中的斑块形成中起关键作用。由于它们的疏水势，已显示这些肽促进聚集和斑块形成。在神经元中表达AβN3pE-42的转基因小鼠模型中已进一步显示这种肽在体内是神经毒性的，并且导致神经元丢失(Wirths et al.(2009)Acta Neuropatho/118,487-496)。
据信对Aβ肽的N-末端焦谷氨酸具有特异性的抗体是有利的，因为它们的特异性仅针对在N-末端携带焦谷氨酸的Aβ致病种类，但是不检测没有N-末端焦谷氨酸的APP或其他Aβ种类。因此据信与针对其他Aβ种类而非焦谷氨酸化变体的抗体相比，通过使用本发明的抗体会减少潜在副作用的风险，如不受控制的大脑炎症。
靶向AβN3pE肽的抗体是已知的(Acero et al(2009)J Neuroimmunol 213,39-46；Saido et al.(1996)Neuron 14,457-466；US 7,122,374和WO 2012/136552)。
但是，需要对AβN3pE肽具有特异性的人源化抗体，其可以用于人治疗并积极影响淀粉样变性，特别是AβN3pE可能参与的疾病和疾病状况中的认知，如临床或临床前阿尔茨海默病、唐氏综合征以及临床或临床前大脑淀粉样血管病。
发明概述
本发明提供新的方法和组合物，其包含高度特异性和高度有效的抗体，包括嵌合抗体及其片段，包括部分或完全人源化抗体及其片段，具有特异性识别并结合至来自一系列β-淀粉样蛋白抗原的特异性表位的能力，特别是AβN3pE肽，其可以以单体、二聚体、三聚体等或多聚体形式，以聚集体、纤维、丝的形式或者以斑块的缩合形式呈递至抗体。
特别地，本发明涉及人源化抗体或其功能变体，其中所述抗体轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLX1SDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLX2YLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:7)，
其中
X1选自Y和H；并且
X2选自A、I和T；
或者包含选自以下的氨基酸序列、基本上由选自以下的氨基酸序列组成或由选自以下的氨基酸序列组成
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSDGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:28)；和
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYVVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:36)，
和/或
其中所述抗体重链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGX3TMNWVRQAPGQGLEWMGLINPX4NX5VTRYNQKFX6GRVTX7X8RDTSTTTVX9MELTSLTSEDTAX10YYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)；
其中
X3选自Y和H；
X4选自Y和S；
X5选自G、T、A和E；
X6选自K和Q；
X7选自L和I；
X8选自I和T；
X9选自Y和H；并且
X10选自V和T；
或者包含选自以下的氨基酸序列、基本上由选自以下的氨基酸序列组成或由选自以下的氨基酸序列组成
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)，和
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFNNYWINWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYIVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40).
本发明提供积极影响其中AβN3pE可能参与的淀粉样变性的疾病和疾病状况的人源化抗体或其片段。
在另一实施方案中，本发明提供人源化抗体或其片段，其结合循环和组织，特别是脑中的AβN3pE肽。本发明的人源化抗体能够结合游离AβN3pE肽分子或甚至AβN3pE肽的结合形式。
因此，本发明进一步提供改变中枢神经***如脑中以及循环中如血浆中AβN3pE肽可溶和结合形式的清除的人源化抗体。
在进一步的实施方案中，本发明提供人源化抗体及其片段，其中所述人源化抗体特异性地结合携带焦谷氨酸的AβN3pE的N-末端。
在进一步的实施方案中，本发明还涉及用表达所述人源化抗体或其片段的载体转化或者并入表达所述人源化抗体或其片段的多核苷酸的宿主细胞。
此外，本发明提供包含本发明的人源化抗体及其片段的药物组合物。
本发明进一步涉及所述人源化抗体及其片段的用途，其可用于结合并清除或去除人中的AβN3pE，从而用于诊断、预防和治疗特征在于淀粉样变性或AβN3pE毒性的疾病和疾病状况。
在一具体实施方案中，能够结合并清除或去除生物流体和组织中的AβN3pE肽的本发明的人源化抗体可用于预防和/或治疗与包含AβN3pE的斑块如脑中的弥漫性、神经炎和脑血管斑块形成相关的疾病状况。
施用本发明的人源化抗体，包括其免疫反应性片段，可以导致从上述斑块或其他生物复合物清除或去除AβN3pE。因此，本发明的人源化抗体会容易地在循环、其他体液中转运病到达形成上述斑块和/或其他生物复合物的位点或者AβN3pE表现出损伤作用的其他地方。
此外，通过本发明的人源化抗体从斑块或其他生物复合物去除AβN3pE可以导致不溶形式的斑块的溶解，因此导致从受影响的组成如脑组织去除整个斑块。这转过来可以导致诊断患有神经变性疾病的患者中认知的改善，如轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或者家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)等，唐氏综合征中的神经变性，路易体痴呆，具有淀粉样变性的遗传学脑出血(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征。
本发明的人源化抗体结合循环中或其他体液中的AβN3pE可以进一步导致去除循环的或可溶形式的AβN3pE。如上文讨论的，AβN3pE表现出高疏水性，并且对其他例如非焦谷氨酸化Aβ肽具有高亲和性，这导致形成寡聚或超分子结构，如淀粉样斑块。已显示特别是这些寡聚结构是高度神经毒性的。寡聚结构的形成导致神经元细胞的细胞损伤和死亡。因此，去除循环的或可溶形式的AβN3pE或者甚至去除包含AβN3pE的寡聚体导致防止细胞损伤和/或神经毒性。因此，本发明还提供预防神经变性疾病的方法，如轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或者家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)等，唐氏综合征中的神经变性，路易体痴呆，具有淀粉样变性的遗传学脑出血(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征。
本发明进一步提供预防和/或治疗其他疾病的方法，所述疾病基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关，所述淀粉样蛋白特别是AβN3pE，所述疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化；Creutzfeldt-Jacob病，帕金森病，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，与成人发病型糖尿病相关的痴呆；老年性心脏淀粉样变性等，包括黄斑变性。
本发明进一步提供一种高度灵敏同时稳健的检测技术，其允许定量确定生物样品如液体或血清样品(优选血清样品)或者组织样品中的Aβ变体，特别是AβN3pE。考虑到这些AβN3pE肽在血液中的低丰度，这是巨大的挑战。但是，有这样的检测技术可用是药物筛选和药物开发项目中研究小分子抑制剂效力的先决条件。
通过本发明的教导得到的抗体特别可用于淀粉样变性的诊断，与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和病症，包括继发性淀粉样变性和年龄相关的淀粉样变性，包括但不限于神经***病症如阿尔茨海默病(AD)、路易体痴呆、唐氏综合征、具有淀粉样变性的遗传学脑出血(荷兰型)、关岛帕金森-痴呆综合征，以及基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关的其他疾病如进行性核上性麻痹、多发性硬化；Creutzfeldt-Jacob病、具有淀粉样变性的遗传学脑出血荷兰型、帕金森病、HIV相关痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化症)、与成人发病型糖尿病相关的痴呆、老年性心脏淀粉样变性等，包括黄斑变性，仅举几例。
附图说明
图1示出小鼠抗体克隆#6的CDR定义
示出轻链(LC)和重链(HC)的可变结构域的氨基酸序列。LC和HC的3个CDR通过Sircar等人，2009(Sircar A.et al.:RosettaAntibody:antibody variable regionhomology modeling server.Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,pp.W474-W479)根据Kabat和Wu，1971(Kabat E.A.and WU,T.T.:An Attempt to Locate the Non-helical andPermissively Helical Sequences of Proteins:Application to the VariableRegions of Immunoglobulin Light and Heavy Chains.Proc.Nat.Acad.Sci.USA；Vol.68,No.7,pp.1501-1506,1971)以及Kabat等人1991(Kabat E.A.and WU,T.T.:IDENTICAL V REGION AMINO ACID SEQUENCES AND SEGMENTS OF SEQUENCES INANTIBODIES OF DIFFERENT SPECIFICITIES:Relative Contributions of VH and VLGenes,Minigenes,and Complementarity-Determining Regions to Binding ofAntibody-Combining Sites.The Journal of Immunology,Vol.147；pp.1709-1719,1991)框定；除了HC的CDR1，其根据Clothia等人，1989(Clothia C.et al.:Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions.Nature,Vol.342,pp.877-883,1989)定义。
图2示出通过蛋白G色谱纯化人源化抗体克隆#6。通过蛋白G色谱纯化重组产生的人源化抗体克隆#6。在非还原条件下将24μl的输入级分(泳道1)、流过级分(泳道22)和洗脱级分(泳道3)加样至10％SDS PAGE上。在10％考马斯染色的SDS凝胶中将2μg的人源化(泳道4)抗体与小鼠抗体(泳道5)进行比较。
图3示出人源化抗体克隆#6HC T97变体和LC L41变体的KD的计算。利用1-100nM(HC T97变体)和10-1000nM(LC L41变体)的肽浓度通过SPR测量人源化抗体克隆#6的HCT97和LC L41变体对Aβ(pE3-18)的结合亲和力。KD计算为5.3nM。如上文所述通过RUequ值对肽浓度作图并通过稳态模型拟合确定LC L41变体的KD值为162.7nM。
图4示出表达人源化抗体克隆#6变体HC T97的稳定细胞系的产生。A)稳定表达人源化抗体克隆#6变体HC T97的CHO DG44细胞的MTX处理。与0.1μM和没有MTX(泳道1和4)相比，0.5μM MTX(泳道2)导致表达增加。此外，与利用1μM MTX(泳道4)处理相比，少量细胞死亡。在非还原条件下将24μl上清液加样至10％SDS PAGE上。B)通过有限稀释和蛋白印迹分析进行克隆选择之后产生18个克隆。在非还原条件下将24μl上清液加样至12％SDS PAGE上。C)将这18个克隆中的5个扩大并培养7天，所以可以通过SPR分析上清液中的表达水平。
图5示出用AβpE3-18肽ITC测量人源化抗体克隆#6。将纯化的人源化抗体克隆#6HCT97变体用于ITC测量。顶部：ITC测量的原始数据。底部：整合原始数据以表示添加的肽浓度作为函数摩尔比肽/抗体。左边示出热力学参数的值。
图6示出两种抗体对Fcγ受体CD16A的结合，所述抗体包含SEQ ID NO:73(WT)的人IgG1 Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)。
图7示出两种抗体对Fcγ受体CD32A的结合，所述抗体包含SEQ ID NO:73(WT)的人IgG1 Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)。
图8示出两种抗体对Fcγ受体CD32B的结合，所述抗体包含SEQ ID NO:73(WT)的人IgG1 Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)。
图9示出两种抗体对Fcγ受体CD64的结合，所述抗体包含SEQ ID NO:73(WT)的人IgG1 Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)。
图10示出两种抗体对C1q的结合分析，所述抗体包含SEQ ID NO:73(WT)的人IgG1Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)。
发明详述
定义
术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、形成自至少两个完整抗体的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段(只要它们表现出期望的生物学活性)。抗体可以是例如IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。但是，优选所述抗体不是IgM抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，通常是所述完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段：双抗体；单链抗体分子；以及形成自抗体片段的多特异性抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获得自基本上均质的抗体群体的抗体，即该群体包含的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的“多克隆抗体”制品相反，每种单克隆抗体只针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体通常的有利之处是它们通过杂交瘤培养合成，未被其它免疫球蛋白污染。“单克隆”表示抗体的特征，其获得自基本上均质的抗体群体，并且不应理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以通过由
Figure GDA0003445579340000101
et al.,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过一般公知的重组DNA方法制备。“单克隆抗体”还可以分离自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术。
本文中的单克隆抗体具体包括嵌合抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性。
非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合子序列)，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由具有期望的特异性、亲和力和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，其在受体抗体或者引入的CDR或构架序列中均未发现。
进行这些修饰以进一步精制和优化抗体的性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区域，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些区域。人源化抗体最优选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones et al.,Nature,321:522-525(1986),Reichmann et al,Nature.332:323-329(1988):和Presta,Curr.Op.Struct.Biel.,2:593-596(1992)。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常地，Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使得sFv能够形成抗原结合所期望的结构。sFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在相同多肽链中与轻链可变结构域(VD)连接的重链可变结构域(VH)(VH–VD)。通过使用过短而不允许相同链上两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sol.USA,90:6444-6448(1993)。
“分离的”抗体是已经鉴定并从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化为：(1)如通过劳里(Lowry)方法所测定的，大于95重量％的抗体，并且最优选大于99重量％；(2)通过使用旋杯测序仪足以获得N-末端的至少15个残基或内部氨基酸序列的程度；或者(3)通过还原或非还原条件SDS-PAGE使用考马斯蓝或优选银染的均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不存在抗体天然环境的至少一种组分。但是，通常分离的抗体通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这些名称均包括后代。因此，词语“转化子”和“转化的细胞”包括初始的对象细胞以及由其衍生的培养物而不论转移的数目。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可以不完全相同。本发明包括经筛选与原始转化的细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代。在使用不同名称的情况下，从上下文可明了。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，并且定义为表示由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
如果本文中提到肽或氨基酸，每个氨基酸残基通过一字母或三字母命名表示，对应于氨基酸的俗名，按照以下常规表：
Figure GDA0003445579340000121
如本文所用，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”定义为表示“一个或多个”，并且包括复数形式，除非在上下文中是不适合的。
语言“由淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白引起或者与淀粉样物质或淀粉样蛋白相关的疾病或病症”包括但不限于由单体、纤维或聚合状态或者这三者的任何组合的淀粉样蛋白的存在或活性引起的疾病或病症。这类疾病或病症包括但不限于淀粉样变性、内分泌肿瘤和黄斑变性。
术语“淀粉样变性”是指与淀粉样斑块形成相关的一组疾病和病症，包括但不限于继发性淀粉样变性和年龄相关的淀粉样变性，如这样的疾病，包括但不限于神经***病症如阿尔茨海默病(AD)，包括特征在于丧失认知记忆能力的疾病或疾病状况，例如，轻度认知障碍(MCI)，散发性阿尔茨海默病，路易体痴呆，唐氏综合征，具有淀粉样变性的遗传学脑出血(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆综合征，阿尔茨海默病的家族型如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)；以及基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关的其他疾病如进行性核上性麻痹，多发性硬化；Creutzfeld Jacob病，帕金森病，HIV相关痴呆，ALS(肌萎缩性侧索硬化症)，包涵体肌炎(IBM)，成人发病型糖尿病和老年性心脏淀粉样变性；以及各种眼疾，包括黄斑变性、玻璃疣相关的视神经病和由于β-淀粉样蛋白沉积的白内障。
“淀粉样蛋白β、Aβ或/β-淀粉样蛋白”是本领域公认的术语，并且是指淀粉样蛋白β蛋白和肽、淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)以及其修饰、片段和任何功能等同物。特别地，如本文所用，淀粉样蛋白β表示通过蛋白酶切割APP所产生的任何片段，但特别是涉及或与淀粉样蛋白病理学相关的那些片段，包括但不限于Aβ1-38、Aβ1-40、Aβ1-42。这些Aβ肽的氨基酸序列如下：
Aβ1-42(SEQ ID NO.1):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ1-40(SEQ ID NO.2):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ1-38(SEQ ID NO.3):
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
“pGlu-Aβ”或“AβN3pE”是指Aβ的N-末端截短形式，其在Aβ的氨基酸序列中位置3的谷氨酸残基开始，并且其中所述谷氨酸残基环化形成焦谷氨酸残基。特别地，如本文所用，pGlu-Aβ或AβN3pE表示涉及或与淀粉样蛋白病理学相关的那些片段，包括但不限于pGlu-Aβ3-38、pGlu-Aβ3-40、p-Glu-Aβ3-42。
Aβ、Aβ3-38、Aβ3-40、Aβ3-42的N-末端截短形式的序列如下：
Aβ3-42(SEQ ID NO.4):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala
Aβ3-40(SEQ ID NO.5):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
Aβ3-38(SEQ ID NO.6):
Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
本发明涉及人Aβ肽特异性的人源化抗体，所述Aβ肽是通过切除或释放N-末端的1和2号氨基酸而N-末端截短的，并且其中这样暴露的N-末端3号氨基酸通过焦谷氨酸形成进行修饰，因此其在N-末端的位置3包含焦谷氨酸残基(进一步称作AβN3pE肽或N3pE-Aβ肽或焦谷氨酸化Aβ肽)。
在第一方面，本发明涉及人源化抗体，其中所述抗体轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLX1SDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLX2YLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:7),
其中
X1选自Y和H；并且
X2选自A、I和T。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的抗体轻链可变部分的抗体，在轻链中包含以下CDR区：
VL CDR1:KSSQSLLX1SDGKTYLN(SEQ ID NO:8),
其中X1选自Y和H；
VL CDR2:LVSKLDS(SEQ ID NO:9)；以及
VL CDR3:VQGTHFP(SEQ ID NO:10)。
更优选地，在本发明的抗体轻链的可变部分中，X1为Y且X2为I，并且轻链的可变部分因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:11)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的抗体轻链可变部分的抗体，在轻链中包含以下CDR区：
VL CDR1:KSSQSLLYSDGKTYLN(SEQ ID NO:12),
VL CDR2:LVSKLDS(SEQ ID NO:9)；以及
VL CDR3:VQGTHFP(SEQ ID NO:10).
甚至优选地，在本发明的抗体轻链的可变部分中，X1为Y且X2为A，并且轻链的可变部分因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:13)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的抗体轻链可变部分的抗体，包含CDR区SEQ ID NO:12的VL CDR1、SEQ ID NO:9的VL CDR2和SEQ ID NO:10的VL CDR3。
最优选地，在本发明的抗体轻链的可变部分中，X1为Y且X2为T，并且轻链的可变部分因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:14)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的抗体轻链可变部分的抗体，包含CDR区SEQ ID NO:12的VL CDR1、SEQ ID NO:9的VL CDR2和SEQ ID NO:10的VL CDR3。
甚至最优选地，在本发明的抗体轻链的可变部分中，X1为H且X2为T，并且轻链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:15)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成抗体轻链可变部分的抗体，在轻链中包含以下CDR区：
VL CDR1:KSSQSLLHSDGKTYLN(SEQ ID NO:16)，
VL CDR2:LVSKLDS(SEQ ID NO:9)；以及
VL CDR3:VQGTHFP(SEQ ID NO:10)。
进一步按照第一方面，本发明涉及人源化抗体，其中所述抗体重链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGX3TMNWVRQAPGQGLEWMGLINPX4NX5VTRYNQKFX6GRVTX7X8RDTSTTTVX9MELTSLTSEDTAX10YYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)；
其中
X3选自Y和H；
X4选自Y和S；
X5选自G、T、A和E；
X6选自K和Q；
X7选自L和I；
X8选自I和T；
X9选自Y和H；并且
X10选自V和T；
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGX3TMN(SEQ ID NO:18)，
其中X3选自Y和H；
VH CDR2:LINPX4NX5VTRYNQKFX6G(SEQ ID NO:19)；
其中X4选自Y和S，X5选自G、T、A和E，并且X6选自K和Q；以及
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
优选地，在本发明的抗体重链的可变部分中，X3为Y，X4为Y，X5为G，X6为K，X7为T，X8为I，X9为Y且X10为V，并且重链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNGVTRYNQKFKGRVTLIRDTSTTTVYMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:21)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGYTMN(SEQ ID NO:22)，
VH CDR2:LINPYNGVTRYNQKFKG(SEQ ID NO:23)，
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
更优选地，在本发明的抗体重链的可变部分中，X3为H，X4为S，X5为G，X6为Q，X7为I，X8为T，X9为H且X10为V，并且重链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:24)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:25),
VH CDR2:LINPSNGVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:26)；
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
甚至更优选地，在本发明的抗体重链的可变部分中，X3为H，X4为S，X5为G，X6为Q，X7为I，X8为T，X9为H且X10为T，并且重链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:25),
VH CDR2:LINPSNGVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:26)；
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
最优选地，在本发明的抗体重链的可变部分中，X3为H，X4为S，X5为T，X6为Q，X7为I，X8为T，X9为H且X10为T，并且重链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNTVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:66)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:25),
VH CDR2:LINPSNTVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:67)；
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
甚至最优选地，在本发明的抗体重链的可变部分中，X3为H，X4为S，X5为A，X6为Q，X7为I，X8为T，X9为H且X10为T，并且重链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNAVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:68)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:68的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:68的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:25),
VH CDR2:LINPSNAVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:69)；
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
甚至最优选地，在本发明的抗体重链的可变部分中，X3为H，X4为S，X5为E，X6为Q，X7为I，X8为T，X9为H且X10为T，并且重链因此包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNEVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:70)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成的抗体重链可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:25),
VH CDR2:LINPSNEVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:71)；
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
进一步根据本发明的第一方面，优选包含轻链和重链可变部分的以下组合、基本上由轻链和重链可变部分的以下组合组成或者由轻链和重链可变部分的以下组合组成的人源化抗体：
Figure GDA0003445579340000181
Figure GDA0003445579340000191
更优选地，本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。
甚至更优选地，本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
甚至更优选地，本发明的人源化抗体重链的可变部分包含选自SEQ ID NO:66、72和74的氨基酸序列、基本上由选自SEQ ID NO:66、72和74的氨基酸序列组成或者由选自SEQID NO:66、72和74的氨基酸序列组成。
最优选地，本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成。
最优选地，本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，并且本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQ IDNO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
甚至最优选地，
-本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且
-本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成；并且
-所述抗体的轻链的可变部分，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:12的VL CDR1、SEQ ID NO:9的VL CDR2和SEQ ID NO:10的VL CDR3；并且
-所述抗体的重链的可变部分的抗体，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQID NO:25的VH CDR1、SEQ ID NO:26的VH CDR2和SEQ ID NO:20的VH CDR3。
甚至最优选地，本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，并且本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQ IDNO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成。
甚至最优选地，
-本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且
-本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成；并且
-所述抗体的轻链的可变部分，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:12的VL CDR1、VL CDR2 SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的VL CDR3；并且
-所述抗体的重链的可变部分，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:25的VH CDR1、SEQ ID NO:71的VH CDR2和SEQ ID NO:20的VH CDR3。
在第二方面，本发明涉及人源化抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSDGNTYLHWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSTHVPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:28)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成的抗体轻链的可变部分的抗体，在轻链中包含以下CDR区：
VL CDR1:RSSQSLVHSDGNTYLH(SEQ ID NO:29),
VL CDR2:KVSNRFS(SEQ ID NO:30)；以及
VL CDR3:SQSTHVPPT(SEQ ID NO:31)。
进一步按照第二方面，本发明涉及人源化抗体，其中所述抗体重链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLAYSIYYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYDYDNILDYVMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成的抗体重链的可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GFTFSDYGMA(SEQ ID NO:33),
VH CDR2:FISNLAYSIYYADTVTG(SEQ ID NO:34)；
VH CDR3:YDYDNILDYVMDY(SEQ ID NO:35)。
在第三方面，本发明涉及人源化抗体，其中所述抗体轻链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYVVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:36).
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的抗体轻链的可变部分的抗体，在轻链中包含以下CDR区：
VL CDR1:KSSQSLLYSNGKTYLN(SEQ ID NO:37),
VL CDR2:VVSKLDS(SEQ ID NO:38)；以及
VL CDR3:VQGTHFPFT(SEQ ID NO:39)。
进一步按照第三方面，本发明涉及人源化抗体，其中所述抗体重链的可变部分包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFNNYWINWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGDTNYNGKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYIVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)。
在本发明的一优选实施方案中，具有所述包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成的抗体重链的可变部分的抗体，在重链中包含以下CDR区：
VH CDR1:GYIFNNY(SEQ ID NO:41),
VH CDR2:QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:42)；
VH CDR3:EGYIVY(SEQ ID NO:43)。
在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及人N3pE-Aβ肽特异性的人源化抗体，其在轻链中包含选自以下的CDR区：
Figure GDA0003445579340000211
Figure GDA0003445579340000221
此外，本发明涉及人N3pE-Aβ肽特异性的人抗体，其在重链中包含选自以下的CDR区：
Figure GDA0003445579340000222
根据本发明优选的人源化抗体是通过选自以下的杂交瘤细胞系产生的单克隆小鼠抗体的人源化形式：
Figure GDA0003445579340000223
其描述于WO 2010/009987中。
本发明的人源化抗体的轻链和重链序列可以变化。免疫球蛋白可以具有两对轻链/重链复合物，至少一条链包含功能连接至人框架区片段的一个或多个小鼠互补性决定区(CDR)。
在另一实施方案中，本发明涉及编码包含如本文所示的重链和轻链CDR的本发明的人源化抗体的重组多核苷酸。
本发明的抗体的人框架区是通过比较提供CDR的非人免疫球蛋白的框架或可变区氨基酸序列与包含人免疫球蛋白可变区的序列集合中的相应序列来确定的。选择具有高百分比的相同氨基酸的序列。
本发明的优选多核苷酸编码抗体，在轻链中包含选自由SEQ ID NO:9、10、16、29-31和37-39的氨基酸序列组成的那些CDR以及在重链中包含选自由SEQ ID NO:20、22、23、25、26、33-35、41-43、67、69和71的氨基酸序列组成的那些CDR。
进一步优选多核苷酸，其编码抗体，其中轻链的可变部分包含选自SEQ ID NO:7、11、13、14和28的氨基酸序列，基本上由选自SEQ ID NO:7、11、13、14和28的氨基酸序列组成或者由选自SEQ ID NO:7、11、13、14和28的氨基酸序列组成。
甚至优选多核苷酸，其编码抗体，其中重链的可变部分包含选自SEQ ID NO:17、21、24、27、32、36、40、66、68和70的氨基酸序列，基本上由选自SEQ ID NO:17、21、24、27、32、36、40、66、68和70的氨基酸序列组成或者由选自SEQ ID NO:17、21、24、27、32、36、40、66、68和70的氨基酸序列组成。
在进一步的实施方案中，本发明的人源化抗体具有人IgG1 Fc区，其包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成。
C1q以及两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物C1，补体依赖性细胞毒性(CDC)途径的第一组分。C1q为六价分子，具有大约460,000的分子量和类似于郁金香花束的结构，其中6个胶原“茎”连接至6个球状头区(Burton and Woof,Advances in Immunol 51:1-84；1992)。IgG1分子结合至C1q启动补体激活，随后导致补体介导的细胞裂解。本发明的人源化抗体应当用于治疗炎性疾病和疾病状况，即本发明的人源化抗体应当具有抗炎特性。
本发明的人源化抗体的效应子功能还可以通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用介导，所述Fc受体(FcR)是造血细胞上特化的细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已显示介导通过免疫复合物的吞噬作用去除抗体包被的病原体，以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解相应抗体包被的红细胞和各种其他细胞靶标(例如肿瘤细胞)(Van de Winkel and Anderson,J.Leuk.Bioi.49:511-24；1991)。
因此，本发明进一步提供仍结合Fc受体以满足它们的效应子功能的人源化抗体。但是，优选本发明的人源化抗体不表现出补体依赖性细胞毒性。更优选地，本发明的人源化抗体不激活补体细胞，而是抑制补体介导的细胞裂解。
因此，在一优选实施方案中，本发明的人源化抗体具有人IgG Fc区，其包含一个或多个氨基酸取代，优选3或2个氨基酸取代，最优选1个氨基酸取代。氨基酸取代可以通过常规方法实现，如本发明的抗体的人IgG1 Fc区的定点诱变。
在一更优选的实施方案中，本发明的人源化抗体具有人IgG Fc区，其在位置322处包含氨基酸取代。所述氨基酸取代优选K322A。
在一最优选的实施方案中，本发明的人源化抗体具有人IgG Fc区，其包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成。
进一步最优选地，本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成；并且人IgG Fc区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成。
甚至最优选地，
-本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且
-本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成；并且
-人IgG Fc区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成；
-所述抗体的轻链的可变部分，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:12的VL CDR1、SEQ ID NO:9的VL CDR2和SEQ ID NO:10的VL CDR3；并且
-所述抗体的重链的可变部分，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:27的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:25的VH CDR1、SEQ ID NO:26的VH CDR2和SEQ ID NO:20的VH CDR3。
甚至最优选地，本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQ IDNO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成；并且人IgG Fc区包含SEQID NO:74的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成。
甚至最优选地，
-本发明的人源化抗体轻链的可变部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且
-本发明的人源化抗体重链的可变部分包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成；并且
-人IgG Fc区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成；
-所述抗体的轻链的可变部分，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:14的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:12的VL CDR1、SEQ ID NO:9的VL CDR2和SEQ ID NO:10的VL CDR3；并且
-所述抗体的重链的可变部分，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、基本上由SEQID NO:70的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成，包含CDR区SEQ ID NO:25的VH CDR1、SEQ ID NO:71的VH CDR2和SEQ ID NO:20的VH CDR3。
本发明的优选多核苷酸编码抗体，在轻链中包含选自由SEQ ID NO:9、10、16、29-31和37-39的氨基酸序列组成的那些CDR以及在重链中包含选自由SEQ ID NO:20、22、23、25、26、33-35、41-43、67、69和71的氨基酸序列组成的那些CDR；并且包含选自SEQ ID NO:73和74的人IgG Fc区。
进一步优选多核苷酸，其编码抗体，其中轻链的可变部分包含选自SEQ ID NO:7、11、13、14和28的氨基酸序列，基本上由选自SEQ ID NO:7、11、13、14和28的氨基酸序列组成或者由选自SEQ ID NO:7、11、13、14和28的氨基酸序列组成；并且其中人IgG Fc区包含选自SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列、基本上由选自SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列组成或者由选自SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列组成。
甚至优选多核苷酸，其编码抗体，其中重链的可变部分包含选自SEQ ID NO:17、21、24、27、32、36、40、66、68和70的氨基酸序列，基本上由选自SEQ ID NO:17、21、24、27、32、36、40、66、68和70的氨基酸序列组成或者由选自SEQ ID NO:17、21、24、27、32、36、40、66、68和70的氨基酸序列组成；并且其中人IgG Fc区包含选自SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列、基本上由选自SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列组成或者由选自SEQ ID NO:73或74的氨基酸序列组成。
可以将上述多核苷酸整合入本领域公知的表达载体。在适当宿主中转染这些表达载体，选择宿主以及表达收集和纯化轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式是本领域公知的过程。
本领域技术人员可以基于期望特性选择载体，例如，用于在特定细胞如哺乳动物细胞或细菌细胞中产生载体。
各种诱导型启动子或增强子中的任何一种可以包括在载体中用于表达本发明的抗体或可以调节的核酸。这类可诱导***包括例如四环素可诱导***(Gossen&Bizard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)；Gossen et al.,Science,268:17664769(1995)；Clontech,Palo Alto,Calif.)；重金属诱导的金属硫蛋白启动子；对蜕皮素或相关类固醇如muristerone应答的昆虫类固醇激素(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)；Yao et al.,Nature,366:476-479(1993)；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)；类固醇如糖皮质激素和***诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)(Lee et al.,Nature,294:228-232(1981)；以及可通过温度变化诱导的热休克启动子；大鼠神经元特异性烯醇化酶基因启动子(Forss-Petter,et al.,Neuron 5；197-197(1990))；人β-肌动蛋白基因启动子(Ray,et al.,Genes and Development(1991)5:2265-2273)；人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因启动子(Sasahara,et al.,Cell(1991)64:217-227)；大鼠钠通道基因启动子(Maue,et al.,Neuron(1990)4:223-231)；人铜-锌超氧化物歧化酶基因启动子(Ceballos-Picot,et al.,Brain Res.(1991)552:198-214)；以及哺乳动物POU-结构域调节基因家族成员的启动子(Xi et al.,(1989)Nature 340:35-42)。
包括启动子或增强子在内的调节元件可以是组成型或可以被调节，取决于调节的性质。将调节序列或调节元件可操作地连接至本发明的多核苷酸序列之一，从而多核苷酸序列和调节序列之间的物理和功能关系允许多核苷酸序列的转录。可用于在真核细胞中表达的载体可以包括例如调节元件，所述调节元件包括CAG启动子、SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)类固醇-诱导型启动子、Pgtf、Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)启动子、thy-1启动子等。
如果期望，载体可以包含选择标记。如本文所用，“选择标记”是指向其中已引入所述选择标记的细胞提供可选择表型的遗传元件。选择标记一般是其基因产物提供对抑制细胞生长或杀死细胞的物质的抗性的基因。多种选择标记可以用于本发明的DNA构建体，包括例如Neo、Hyg、hisD、Gpt和Ble基因，例如Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 47),John Wiley&Sons,New York(1999))和美国专利第5,981,830号所述。可用于针对选择标记存在进行选择的药物包括例如用于Neo的G418、用于Hyg的潮霉素、用于hisD的组氨醇、用于Gpt的黄嘌呤和用于Ble的博来霉素(参见Ausubel等人，上文，(1999)；美国专利第5,981,830号)。本发明的DNA构建体可以并入正选择标记、负选择标记或两者(参见，例如，美国专利第5,981,830号)。
多种哺乳动物细胞培养***也可以用来表达重组蛋白。哺乳动物表达***的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，由Gluzman,Cell,23:175(1981)描述。能够表达相容载体的其他细胞系包括例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体一般会包含复制起点，合适的启动子和增强子，还有任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受***点，转录终止序列以及5'侧翼非转录序列。衍生自SV40剪接的DNA序列和多腺苷酸化位点可以用来提供需要的非转录遗传元件。
多肽可以通过各种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱以及凝集素色谱。如果多肽在细胞表面表达可以促进回收，但这不是先决条件。表达较长形式的多肽之后切割的切割产物的回收也是可取的。必要时可以使用本领域已知的蛋白重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型。高效液相色谱(HPLC)可以用于最终的纯化步骤。
可以按照公知的方法从各种人细胞分离人恒定区DNA序列。
本发明特别涉及人源化抗体，所述人源化抗体的特征在于它们以高亲和力结合AβN3pE肽。本发明还涉及抗体，所述抗体的特征在于它们以高亲和力结合AβN3pE肽或其免疫活性片段。所述高亲和力在本发明的上下文中表示10-5M、10-6M或10-7M或更好的KD值的亲和力，优选10-8M或更好KD值，甚至更优选10-9M–10-12M的KD值。因此，本发明的抗体以比以前已知抗体高的亲和力结合单体AβN3pE。
优选地，本发明的人源化抗体在AβN3pE中结合的结合表位是这样的表位，其在N-末端携带焦谷氨酸。更优选地，本发明的人源化抗体的结合表位选自
pEFRHDSGYEVHHQKLV(SEQ ID NO:50)，
pEFRHDSGYEVHHQKL(SEQ ID NO:54)，
pEFRHDSGYEVHHQK(SEQ ID NO:55)，
pEFRHDSGYEVHHQ(SEQ ID NO:56)，
pEFRHDSGYEVHH(SEQ ID NO:57)，
pEFRHDSGYEVH(SEQ ID NO:58)，
pEFRHDSGYEV(SEQ ID NO:59)，
pEFRHDSGYE(SEQ ID NO:60)，
pEFRHDSGY(SEQ ID NO:61)，
pEFRHDSG(SEQ ID NO:62)，
pEFRHDS(SEQ ID NO:63)，
pEFRHD(SEQ ID NO:72)，
pEFRH(SEQ ID NO:64)，和
pEFR(SEQ ID NO:65)。
最优选地，本发明的人源化抗体不结合在N-末端不携带焦谷氨酸的表位。
甚至最优选地，当结合上文和随后提到的结合表位时，本发明的人源化抗体通常结合在N-末端包含焦谷氨酸的序列或序列的部分。本发明的人源化抗体不结合在N-末端不含焦谷氨酸的序列或序列的部分。
此外，本发明的人源化抗体还可以结合AβN3pE变体。
在本发明的上下文中，AβN3pE变体特别是
pE-Aβ3-38，
pE-Aβ3-40，
pE-Aβ3-42
AβN3pE肽的其他变体是已显示作为阿尔茨海默病的后果或在阿尔茨海默病之前在脑中积累的所有AβN3pE变体。这些是pE-Aβ3-X肽，其中x定义为19-42的整数，例如在上述pE-Aβ3-42中，“42”是整数“x”。
在本发明的上下文中，本发明的人源化抗体的“功能变体”是保留对pE-Aβ3-x肽的结合能力的抗体，特别是高亲和力的结合能力。这类功能变体的提供是本领域已知的，并且涵盖在抗体及其片段的定义下表示的上述可能性。
在进一步的实施方案中，人源化抗体是抗体片段，如上文定义的。
在进一步优选的实施方案中，本发明的人源化抗体是具有上文定义的抗体的互补决定区(CDR)的人源化抗体。优选地，可以将抗体标记；可能的标记特别是如上文提到的那些标记以及抗体的诊断用途领域中的技术人员已知的那些标记。
在另一实施方案中，可以将人源化抗体固定在固相上。
在另一实施方案中，根据本发明和如上文所述的人源化抗体或其片段表现出比对AβN3pE单体的结合亲和力高至少2倍、特别是至少4倍、特别是至少10倍、特别是至少15倍、更特别是至少20倍、但是尤其是至少25倍的对AβN3pE寡聚体、纤维、原纤维或长丝的结合亲和力。
在另一实施方案中，如上文所述提供人源化抗体或其片段，其实质上结合哺乳动物中，特别是人脑中聚集的Aβ，包括Aβ斑块(其包含AβN3pE)，但是优选不与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)表现出任何显著的交叉反应性。
在本发明的另一方面，如上文所述提供人源化抗体或其片段，所述抗体实质上结合寡聚或多聚淀粉样蛋白(其包含AβN3pE)，特别是哺乳动物中，特别是人脑中的淀粉样蛋白β(Aβ)，但是优选不与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)表现出任何显著的交叉反应性。
本发明还涉及包含所述人源化抗体的组合物以及所述组合物在治疗淀粉样变性中的用途，特别是用于治疗哺乳动物(特别是人)中的神经变性疾病。所述神经变性疾病特别选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性。优选地，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。
因此，在一优选实施方案中，本发明涉及一种治疗和/或预防疾病状况的方法，所述疾病状况的特征在于哺乳动物(优选人)中包含AβN3pE的斑块形成，所述方法包括向需要这样的治疗的人优选外周施用治疗或预防有效量的本发明的人源化单克隆抗体或其免疫反应性片段，所述抗体特异性地结合在N-末端携带焦谷氨酸的AβN3pE肽的表位。
在另一实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物(优选人)中抑制淀粉样斑块形成以及清除或去除淀粉样斑块的方法，所述方法包括向需要这样的抑制的人施用有效量的人源化抗体，所述人源化抗体结合循环中、体液或组织中，特别是脑中的AβN3pE，并且进一步优选地，导致清除血浆和脑中的AβN3pE。
因此，本发明还提供在对象中逆转认知下降、改善认知、治疗认知下降和防止认知下降的方法，所述对象诊断患有轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性以及临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病，所述方法包括向对象施用有效量的本发明的人源化抗体。
本发明还提供本发明的人源化抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防或逆转轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性以及临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病；或者在对象中逆转认知下降、改善认知、治疗认知下降和防止认知下降，所述对象被诊断患有轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性以及临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病。
本发明进一步提供本文公开的人源化抗体，其用于治疗、预防或逆转轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性以及临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病；用于在对象中治疗、预防或逆转认知下降，改善认知，治疗认知下降以及防止认知下降，所述对象被诊断患有轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性以及临床或临床前大脑淀粉样血管病，优选阿尔茨海默病；或者抑制哺乳动物(优选人)中的淀粉样斑块形成或AβN3pE的效应。
在一具体实施方案中，本发明提供一种通过向动物，特别是哺乳动物或人施用人源化抗体或者包含根据本发明和如上文所述的人源化抗体的药物组合物保留或增加认知记忆能力的方法，特别地，用于恢复记忆受损的哺乳动物(特别是人)的认知记忆能力。
本发明进一步提供评价人对象对用结合AβN3pE或其变体的人源化抗体治疗的反应的方法，所述方法包括：
a)向对象施用本发明的人源化抗体或其片段；以及
b)测量采自对象的生物样品中的AβN3pE浓度。
本发明还提供一种用结合AβN3pE或其变体的抗体治疗人对象的方法，所述方法包括：
a)向对象施用第一量的抗体或其片段；
b)在施用第一剂量之后3小时至2周内，测量采自对象的生物样品中的AβN3pE浓度；
c)如果必要，基于步骤b)的结果计算第二量的抗体或其片段，所述第二量与第一量相同或不同；以及
d)施用第二量的抗体或片段。
本发明还包括一种在哺乳动物(优选人对象)中评价结合AβN3pE的抗体或其片段的效力的方法，所述效力包括抑制或防止AβN3pE相关的淀粉样斑块形成，减少包含AβN3pE的斑块的负荷，减少毒性AβN3pE及其变体的效应，或者治疗与包含AβN3pE的斑块相关的疾病状况或疾病，所述方法包括：
a)从对象获得第一生物样品；
b)测量第一样品中的AβN3pE的基线浓度；
c)向对象施用本发明的人源化抗体或其片段；
d)在施用抗体或其片段之后3小时至2周内，从对象获得第二生物样品；以及
e)测量第二生物样品中的AβN3pE浓度；其中，效力涉及血液中结合至抗体的AβN3pE的量和AβN3pE的浓度，特别是在第二生物样品中与第一生物样品相比其浓度的减少。
生物样品可以是任何样品，例如来自人。在一具体实例中，样品是组织样品、体液样品或细胞样品。在一实施方案中，生物样品选自血液、血清、尿、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、泪液、胆汁和胰分泌物。在另一实施方案中，生物样品是血浆。在一优选实施方案中，生物样品是CSF。
生物样品可以以本领域技术人员公知的方式获得自对象。特别地，血液样品可以获得自对象，并且所述血液样品可以通过常规方法分离为血清和血浆。获得生物样品的对象优选是怀疑患有淀粉样变性的疾病或疾病状况的对象，优选阿尔茨海默病，有发展阿尔茨海默病的风险和/或有风险或患有任何其他种类的痴呆。特别地，样品获得自怀疑患有轻度认知障碍(MCI)和/或处于阿尔茨海默病早期的对象。
可以在阿尔茨海默病的现有动物模型中测试本发明的人源化抗体在诊断、预防和/或治疗淀粉样变性(如轻度认知障碍、阿尔茨海默病、家族性英国型痴呆或家族性丹麦型痴呆以及例如唐氏综合征中的神经变性)中的效力。
阿尔茨海默病的合适动物模型在McGowan et al.TRENDS in Genetics,Vol.22,No.May 2006,pp 281-289中综述，并且选自如下文所述的PDAPP、Tg2576、APP23、TgCRND8、PSEN1M146V或PSEN1M146L、PSAPP、APPDutch、BRI-Aβ40和BRI-Aβ42、JNPL3、TauP301S、TauV337M、TauR406W、rTg4510、Htau、TAPP、3x TgAD。
PDAPP:具有结实的斑块病理的第一个突变APP转基因模型。小鼠表达具有印第安纳突变的人APP cDNA(APPV717F)。在半合子PDAPP小鼠中在6-9个月之间斑块病理开始。有突触丢失，但是未观察到明显的细胞丢失和NFT病理。这种模型已广泛用于免疫治疗策略。
Tg2576:小鼠在仓鼠朊病毒启动子的控制下表达突变的APPSWE。从9月龄观察到斑块病理。这些小鼠具有认知缺陷，但是没有细胞丢失或NFT病理。这个模型是在阿尔茨海默病领域中最广泛使用的转基因模型之一。
APP23:小鼠在Thy1启动子的控制下表达突变的APPSWE。从6月龄观察到显著的脑血管淀粉样蛋白、淀粉样蛋白沉积，并且一些海马神经元丢失与淀粉样斑块形成相关。
TgCRND8:小鼠表达多个APP突变(瑞典加印第安纳)。在～3月龄认知缺陷与快速的胞外斑块发展一致。认知缺陷可以通过Aβ免疫治疗逆转。
PSEN1M146V或PSEN1M146L(分别为系6.2和8.9):这些模型是突变的PSEN1选择性地提高Aβ42的第一体内证明。未观察到明显的斑块病理。
PSAPP(Tg2576 x PSEN1M146L,PSEN1-A246E+APPSWE):Bigenic转基因小鼠，添加与单转基因突变APP小鼠相比显著加速淀粉样蛋白病理的突变PSEN1转基因，证实PSEN1驱动的Aβ42升高增强斑块病理。
APPDutch:小鼠表达具有荷兰突变的APP，其在人中引起具有淀粉样变性的遗传学脑出血-荷兰型。APPDutch小鼠发展严重的嗜刚果红淀粉样血管病。添加突变的PSEN1转基因重新分布淀粉样蛋白病理至实质，表明Aβ40和Aβ42在血管和实质淀粉样蛋白病理中的不同作用。
BRI-Aβ40和BRI-Aβ42:小鼠表达单独的Aβ同种型，没有APP过量表达。仅表达Aβ42的小鼠发展老年斑和CAA，而BRI-Aβ40小鼠不发展斑块，表明Aβ42对于斑块形成至关重要。
JNPL3:小鼠表达具有P301L突变的4R0N MAPT。这是第一个转基因模型，具有显著的缠结病理和细胞丢失，证实MAPT单独可以引起细胞损伤和丢失。JNPL3小鼠由于脊髓中的严重病理和运动神经元丢失随着年龄发展运动障碍。
TauP301S:表达具有P301S突变的4R MAPT的最短同种型的转基因小鼠。纯和小鼠在5-6月龄发展严重的下肢轻瘫，在大脑和脊髓中具有广泛的神经元纤维病理以及脊髓中的神经元丢失。
TauV337M:血小板衍生生长因子(PDGF)启动子驱动的具有V337M突变的4R MAPT的低水平合成(1/10内源MAPT)。这些小鼠中神经元纤维病理的发展表明MAPT的性质而不是绝对MAPT细胞内浓度驱动病理。
TauR406W:在CAMKII启动子的控制下表达具有R406W突变的4R人MAPT的小鼠。小鼠从18月龄在前脑中发展MAPT包涵体，并且具有受损的联想记忆。
rTg4510:利用TET-关***可诱导的MAPT转基因小鼠。异常的MAPT病理从1月龄发生。小鼠具有发展的NFT病理和严重的细胞丢失。认知缺陷从2.5月龄显而易见。关闭转基因提高认知表现但NT病理恶化。
Htau:仅表达人基因组MAPT的转基因小鼠(小鼠MAPT敲除)。Htau小鼠从6个月积累高度磷酸化的MAPT，并且在它们15月龄时发展Thio-S阳性NFT。
TAPP(Tg2576 x JNPL3):在TAPP小鼠中与JNPL3相比增加的MAPT前脑病理表明突变的APP和/或Aβ可以影响下游MAPT病理。
3xTgAD:在PSEN1M146V“敲入”背景(PSNE1-KI)上表达突变的APPSWE、MAPTP301L的三转基因模型。小鼠从6个月发展斑块并且从它们12月龄时发展MAPT病理，加强APP或Aβ可以直接影响神经元纤维病理的假说。
此外，WO 2009/034158公开了非人转基因动物模型，其中转基因编码选自AβN3E-42、AβN3Q-42、AβN3E-40和AβN3Q-40的至少一种淀粉样蛋白β(Aβ)肽。这些Aβ肽是QC和QPCTL的底物，导致N-末端谷氨酰胺(Q)或谷氨酸环化为焦谷氨酸(pGlu)。因此，这些转基因动物模型为研究pGlu-Aβ肽对神经变性发展过程的影响提供模型***。
抗AβpN3pE抗体还可以用于AβpN3pE的诊断测定，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的存在。因此，本发明的人源化抗体特别可用于诊断方法以检测淀粉样变性，特别是神经变性疾病，其选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。
为了诊断应用，所述抗体通常用可检测的部分标记。许多标记可用，其一般可以分为以下类别：
(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131I。所述抗体可以利用如CurrentProtocols in Immunology,Volumes 1and 2,Gütigen et al.,Ed.,Wiley-Interscience.New York,New York.Pubs.,(1991)所述的技术用放射性同位素标记，并且放射性可以利用闪烁计数来测量。
(b)可以利用荧光标记，如稀土金属螯合物(铕螯合物)或者荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺(Lissamine)、藻红素和德克萨斯红(Texas Red)。可以利用例如上文的Current Protocols in Immunology中公开的技术将荧光标记缀合至抗体。荧光可以使用荧光计定量。
(c)各种酶-底物标记可用。酶一般催化生色底物的化学改变，这可以利用各种技术测量。例如，酶可以催化底物的颜色改变，这可以通过分光光度计测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。定量荧光变化的技术如上文所述。化学发光底物通过化学反应变成电子激发的，然后可以发出可测量的光(例如利用化学发光计测量)或者将能量供给荧光接受体。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利第4,737,456号)、萤光素、2,3-二氢2,3-二氮杂萘二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、0-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶缀合至抗体的技术描述于O'Sullivan et al.,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym(edLangone&H.Van Vunakis),Academic Press,New York,73:147-166(1981)。
酶-底物组合的实例包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基盐酸联苯胺(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的磷酸对硝基苯酯；以及
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶(4-methylumbellifery1-β-D-galactosidase)。
许多其它酶-底物组合对于本领域技术人员是可用的。
有时，将标记与抗体间接缀合。技术人员会知道实现这个目的的各种技术。例如，可以将抗体与生物素缀合，并且可以将任何上述三大类的标记与抗生物素蛋白缀合，或者反之亦然。生物素选择性地结合至抗生物素蛋白，因此可以将该标记以这种间接方式与抗体缀合。或者，为了实现标记与抗体的间接缀合，将抗体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，并且将上述不同类型标记中的一种与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。因此，可以实现标记与抗体的间接缀合。
本发明的人源化抗体可以用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies A Manual ofTechniques,pp.147-158(CRC Press.Inc.,1987)
竞争性结合测定依赖于标记的标准品与测试样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的AβN3pE的量与结合至抗体的标准品的量成反比。为了便于测定结合的标准品的量，抗体在竞争之前或之后一般是不溶的，从而结合至抗体的标准品和分析物可以方便地与保持未结合的标准品和分析物分离。
夹心测定包括使用两种抗体，每种能够结合至待检测的蛋白的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，通过固定在固体支持物上的第一抗体结合测试样品分析物，然后第二抗体结合至分析物，因此形成不溶的由三部分组成的复合物。所述第二抗体本身可以用可检测的部分标记(直接夹心测定)，或者可以利用可检测的部分标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心测定)。例如，夹心测定的一种优选类型是ELISA测定，在这种情况下可检测的部分是酶。
为了免疫组织化学，组织样品可以是新鲜或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并用诸如***的防腐剂固定。
本发明还涉及包含如上文定义的人源化抗体的组合物，其中所述组合物是用于诊断用途的组合物，特别是用于神经变性疾病，所述神经变性疾病选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病；特别是通过检测生物样品中的AβN3pE或其变体。
诊断试剂盒
便利地，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，所述试剂盒即预定量的试剂与进行诊断测定的说明书的包装组合。当抗体用酶标记时，试剂盒包括酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其它添加剂如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛变化以提供充分优化测定灵敏度的试剂溶液浓度。特别地，试剂可以以干粉，通常是冻干粉末的形式提供，其包括在溶解时提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
本发明的诊断试剂盒可以包含如下文所述的其他生物活性物质。特别优选用于诊断试剂盒的所述其他生物活性物质是谷氨酰胺酰基环化酶。
本发明的诊断试剂盒特别可用于淀粉样蛋白相关疾病和疾病状况的检测和诊断，特别是神经变性疾病，其选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。
本发明还涉及如上文定义的本发明的人源化抗体或包含人源化抗体的组合物，其用于体外诊断方法。特别地，这种诊断方法涉及诊断神经变性疾病，其选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病；特别是通过检测生物样品中的AβN3pE或其变体。
在一特别优选的实施方案中，本发明涉及以下方法：
诊断淀粉样蛋白相关疾病或疾病状况，优选阿尔茨海默病的体外或原位诊断方法包括以下步骤：
使本发明的人源化抗体与样品接触，所述样品优选选自血清、液体或CSF样品，最优选血样品；或者与怀疑患有所述疾病状况或疾病的对象的特定身体部分或身体区域接触，以及
检测抗体结合至来自样品的AβN3pE。
更特别地，本发明涉及一种诊断淀粉样蛋白相关疾病或疾病状况的方法，优选阿尔茨海默病，所述方法包括在样品中或原位检测本发明的人源化抗体或其免疫活性片段免疫特异性结合至AβN3pE，其包括以下步骤
(a)使怀疑包含淀粉样蛋白的样品或者特定身体部分或身体区域与本发明的人源化抗体或其片段接触；
(b)允许抗体和/或其功能部分结合至AβN3pE以形成免疫复合物；
(c)检测免疫复合物的形成；以及
(d)使免疫复合物的存在或不存在与样品或者特定身体部分或区域中AβN3pE的存在或不存在关联。
还包含一种确定组织和/或体液中的淀粉样病变斑块负荷程度的方法，所述方法包括
(a)获得研究的组织和/或体液的代表性样品；
(b)用本发明的人源化抗体或者嵌合抗体或其片段测试所述样品中淀粉样蛋白的存在；
(c)确定结合至蛋白的人源化抗体的量；以及
(d)计算组织和/或体液中的斑块负荷。
特别地，本发明涉及一种确定组织和/或体液中的淀粉样病变斑块负荷程度的方法，其中确定步骤c)中免疫复合物的形成从而免疫复合物的存在或不存在与淀粉样蛋白，特别是AβN3pE的存在或不存在相关。
在另一实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含本发明的人源化抗体，或者嵌合抗体或其片段，并且如上文所述包括任何功能等价抗体或者其任何衍生物或功能部分，特别是任选进一步包含药学可接受的载体的药物组合物。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的人源化抗体。
本发明进一步包含一种混合物，其包含治疗有效量的本发明的人源化抗体，或者嵌合抗体或其片段，并且如上文所述包括任何功能等价抗体或者其任何衍生物或功能部分，以及任选存在的其他生物活性物质和/或药学可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
特别地，本发明涉及一种混合物，其中所述其他生物活性物质是这样的化合物，其用于以下的医疗：淀粉样变性，一组与参与神经变性疾病的淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白如AβN3pE相关的疾病和病症，其选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，例如散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)如家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)，唐氏综合征中的神经变性；优选阿尔茨海默病。
在本发明的另一实施方案中，其他生物活性物质或化合物还可以是可以用于治疗AβN3pE引起的淀粉样变性或者可以用于其他神经***病症医疗的治疗剂。
其他生物活性物质或化学物可以通过与本发明的抗体相同或相似的机制或者通过无关的作用机制或者通过多种相关和/或无关的作用机制发挥其生物效应。
一般来说，其他生物活性化合物可以包括神经元传递增强剂，精神病治疗药物，乙酰胆碱酯酶抑制剂，钙通道阻断剂，生物胺，苯二氮
Figure GDA0003445579340000351
镇静剂，乙酰胆碱合成、储存或释放促进剂，乙酰胆碱突出后受体激动剂，单胺氧化酶-A或-B抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂，非甾体抗炎药，抗氧化剂以及血清素能受体(serotonergic receptor)拮抗剂。
更特别地，本发明涉及一种混合物，其包含选自以下的至少一种化合物：有效抗氧化应激的化合物，抗凋亡化合物，金属螯合物，DNA修复抑制剂如哌仑西平(pirenzepin)和代谢物，3-氨基-1-丙磺酸(3APS)，1,3-丙烷基二磺酸酯(1,3PDS)，α-分泌酶激活剂，β-和γ-分泌酶抑制剂，tau蛋白，神经递质，β-折叠破坏剂，淀粉样蛋白β清除/消耗细胞组分的引诱剂，包括焦谷氨酸化淀粉样蛋白β3-42在内的N-末端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂，如谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂，抗炎分子，或者胆碱酯酶抑制剂(ChEI)如他克林、利凡斯的明、多奈哌齐和/或加兰他敏，Ml激动剂和其他药物，包括任何淀粉样蛋白或tau修饰药物以及营养补充剂，连同本发明的抗体以及任选存在的药学可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
本发明进一步涉及一种混合物，其中所述化合物是胆碱酯酶抑制剂(ChEI)，特别是一种混合物，其中所述化合物是选自他克林、利凡斯的明、多奈哌齐、加兰他敏、烟酸和美金刚的一种。
在进一步的实施方案中，本发明的混合物可以包含烟酸或美金刚连同本发明的抗体以及任选存在的药学可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
在进一步的实施方案中，本发明的混合物可以包含谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂连同本发明的抗体以及任选存在的药学可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
谷氨酰胺酰基环化酶的优选抑制剂如WO 2005/075436、WO 2008/055945、WO2008/055947、WO 2008/055950、WO 2008/065141、WO 2008/110523、WO 2008/128981、WO2008/128982、WO 2008/128983、WO 2008/128984、WO 2008/128985、WO 2008/128986、WO2008/128987、WO 2010/026212、WO 2011/131748、WO 2011/029920、WO 2011/107530、WO2011/110613、WO 2012/123563和WO 2014/140279所述，其公开援引加入本文。
在本发明的另一实施方案中，提供混合物，其包含“非典型抗精神病药”如氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平用于治疗阳性和阴性精神病症状，包括幻觉、妄想、思维障碍(表现为明显的语无伦次、出轨、言不及义)、和奇怪或紊乱的行为，以及情感缺乏、扁平化影响、冷漠和社会退缩，连同抗体，特别是本发明的单克隆抗体，特别是嵌合抗体或其片段，或者根据本发明和如本文所述的人源化抗体或其片段，以及任选存在的药学可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
在本发明的一具体实施方案中，根据本发明和如上文所述的组合物和混合物包含分别为治疗有效量的本发明的人源化抗体和生物活性物质。
可以合适地与本发明的人源化抗体组合用于混合物的其他化合物如WO2008/065141所述(特别参见37/38页)，包括PEP-抑制剂(pp.43/44)，LiCl，二肽基氨肽酶的抑制剂，优选DP IV或DP IV样酶的抑制剂(参见pp.48/49)；乙酰胆碱酯酶(ACE)抑制剂(参见p.47)，PIMT促进剂，β分泌酶的抑制剂(参见p.41)，γ分泌酶的抑制剂(参见pp.41/42)，中性内肽酶的抑制剂，磷酸二酯酶-4(PDE-4)的抑制剂(参见pp.42/43)，TNFα抑制剂，毒蕈碱M1受体拮抗剂(参见p.46)，NMDA受体拮抗剂(参见pp.47/48)，σ-1受体抑制剂，组胺H3拮抗剂(参见p.43)，免疫调节剂，免疫抑制剂或选自以下的药剂：antegren(那他珠单抗)、Neurelan(氨吡啶-SR)、campath(阿伦珠单抗)、IR 208、NBI 5788/MSP 771(替利莫肽)、紫杉醇、Anergix.MS(AG 284)、SH636、达芙文(CD 271,阿达帕林)、BAY 361677(白介素-4)、基质-金属蛋白酶-抑制剂(例如BB 76163)、干扰素-tau(滋养层素)和SAIK-MS；β-淀粉样蛋白抗体(参见p.44)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂(参见p.44)；MCP-1拮抗剂(参见pp.44/45)，淀粉样蛋白沉积抑制剂(参见42)和β淀粉样蛋白合成抑制剂(参见p.42)，所述文件援引加入本文。
在另一实施方案中，本发明涉及一种混合物，其包含本发明的人源化抗体，或者嵌合抗体或其片段，如上文所述，和/或治疗有效量的生物活性物质。
药物组合物可以按照常规技术如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21th Edition,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,2005中公开的那些技术用药学可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂配制。
药学可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂应当适合所选的本发明的人源化抗体和所选的施用模式。基于在抗原结合上对所选的本发明的人源化抗体或药物组合物的期望生物特性没有显著的负面影响(例如，少于实质性影响(10％或更少的相对抑制，5％或更少的相对抑制等))确定药物组合物的载体和其他组分的适合性。
本发明的药物组合物还可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如，非离子去污剂，如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，糖或不含蛋白的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合包括在药物组合物中的其他物质。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现特定患者的期望治疗应答的活性成分的量、组合物和施用模式。所选剂量水平取决于各种药物动力学因素，包括本发明采用的特定组合物的活性，或其酰胺，施用途径，施用时间，采用的特定人源化抗体的***速率，治疗持续时间，与采用的特定组合物联用的其他药物、化合物和/或物质，治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和既往病史，以及医学领域公知的类似因素。
药物组合物可以通过任何合适的途径和模式施用。体内和体外施用本发明的人源化抗体的合适途径是本领域公知的，并且可以由本领域技术人员选择。
在一实施方案中，本发明的药物组合物肠胃外施用。
如本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”表示除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一实施方案中，药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。
药学可接受的载体包括与本发明的人源化抗体在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
可以用于本发明的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，如橄榄油、玉米油、花生油、棉子油和芝麻油，羧甲基纤维素胶体溶液，黄芪胶和可注射的有机酯，如油酸乙酯，和/或各种缓冲液。其他载体是药学领域公知的。
药学可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于无菌可注射的溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。这类介质和物质用于药学活性物质的使用是本领域已知的。除了与活性人源化抗体不相容的任何常规介质或物质，考虑其在本发明的药物组合物中使用。
例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可以包含药学可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂，如糖，多元醇，如甘露醇、山梨醇、甘油或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以包含一种或多种适合所选施用途径的佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可以增加药物组合物的保质期或有效性。本发明的人源化抗体可以与保护人源化抗体免于快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送***。这类载体可以包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，生物可降解、生物相容性聚合物如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸单独或与蜡，或者本领域公知的其他物质。用于制备这类制剂的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
在一实施方案中，可以配制本发明的抗体以确保在体内适当分布。用于肠胃外施用的药学可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于无菌可注射的溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。这类介质和物质用于药学活性物质的使用是本领域已知的。除了与人源化抗体不相容的任何常规介质或物质，考虑其在本发明的药物组合物中使用。
用于注射的药物组合物通常在制备和储存条件下必须是无菌的和稳定的。组合物可以配制为溶液剂、微乳剂、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，会优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘油、甘露醇、山梨醇，或者氯化钠。可注射组合物延长的吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质来实现，例如单硬脂酸盐和明胶。无菌的可注射溶液可以这样制备，将需要量的人源化抗体与需要的例如上文所列的一种成分或多种成分的组合加入适当的溶剂，然后除菌微滤。通常，通过将人源化抗体并入包含基本的分散介质和所需的例如来自上文所列的那些的其他成分的无菌媒介物来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)以获得来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分加上任何额外的期望成分的粉末。
无菌的可注射溶液可以这样制备，将需要量的人源化抗体与需要的上文所列的一种成分或多种成分的组合加入适当的溶剂，然后除菌微滤。通常，通过将人源化抗体并入包含基本的分散介质和所需的来自上文所列的那些的其他成分的无菌媒介物来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)以获得来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分加上任何额外的期望成分的粉末。
调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单一团注，可以随时间施用几个分剂量，或者剂量可以如治疗情况的迫切需要所示成比例减少或增加。肠胃外组合物可以配制为剂量单位形式便于施用和剂量的均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗的对象的物理上分离的单位；每个单位包含计算产生期望疗效的预定量的人源化抗体联合所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规格受限于并直接取决于(a)人源化抗体的独特特征和待实现的特定疗效，以及(b)复合这样的人源化抗体用于对象中的治疗敏感性的领域中固有的限制。
本发明的人源化抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或疾病状况，并且可以由本领域技术人员确定。本发明的抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是约0.1-10mg/kg/体重，例如约0.1-5mg/kg/体重，例如约0.1-2mg/kg/体重，例如约0.1-1mg/kg/体重，例如约0.15、约0.2、约0.5、约1、约1.5或约2mg/kg/体重。
具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定并开出所需的有效量的药物组合物。例如，医生或兽医可以以低于需要的水平开始药物组合物中采用的
Figure GDA0003445579340000391
抗体的剂量以获得期望的疗效并逐步增加剂量直至获得期望的效果。一般来说，本发明的组合物的合适的每日剂量是有效产生疗效的最低剂量的人源化抗体的量。这样的有效剂量一般取决于上述因素。施用可以是例如静脉内的、肌肉内的、腹腔内的或皮下的，以及例如在靶位点近端施用。如果期望，有效每日剂量的药物组合物可以任选地以单位剂型作为一整天以适当间隔分别施用的2、3、4、5、6或更多亚剂量施用。虽然本发明的人源化抗体可以单独施用，但是优选作为如上文所述的药物组合物施用人源化抗体。
实施例
1.产生N3pE-Aβ特异性人源化抗体的人源化方法
N3pE-Aβ特异性小鼠单克隆抗体克隆#6、#17和#24获得自杂交瘤细胞系6-1-6、17-4-3和24-2-3，其已按照布达佩斯条约保藏，并且在德国不伦瑞克的Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)可获得，保藏日期为2008年6月17日，并且具有各自的保藏号
(克隆6-1-6):DSM ACC2924
(克隆17-4-3):DSM ACC2925
(克隆24-2-3):DSM ACC2926。
抗体克隆#6、#17和#24的人源化过程中的第一步是轻链和重链可变结构域中CDR的定义。通过罗塞塔抗体建模服务器(http://antibody.graylab.jhu.edu)预测CDR。图1示出对克隆#6预测的CDR的实例。
为了选择适当的框架用于CDR-移植，需要鉴定与非人抗体具有最高相似性的人序列。通过Blast分析，用公开的人序列池分别拟合轻链(Lv)和重链(Hv)的可变结构域。对于轻链，找到了具有82％相同性的人抗体序列，其属于κLC类别。重链的最高同源性具有62％相同性的人氨基酸序列。
为了将所选人抗体框架分组至种系基因序列，在种系文库IMGT中进行Blast搜索。对于轻链克隆#6和克隆#24，找到了具有序列编码IGKV2-30*01的序列。克隆#17的轻链可变区与IGKV2-30*02最相似。重链可变区编码可以用分别对应于克隆#6、克隆#17和克隆#24的IGHV1-3*01、IGHV1-69*13和IGHV3-48*01鉴定。表1示出人源化抗体可变区的框架参数。
表1：人源化抗体可变区的框架参数
Figure GDA0003445579340000401
aa＝氨基酸序列，acc nr.＝登录号，家族＝基因家族
通过CDR移植，将小鼠抗体克隆#6、#17和#24的CDR与各自的人抗体框架组合以产生人源化抗体。人IgG1的重链恒定区用于重组整个抗体。将轻链可变结构域融合至人κ链恒定区。
2.RNA分离和cDNA合成
作为恒定序列的来源，通过在室温下用5ml 1x FACS裂解溶液(BectonDickinson)裂解500μl全血10分钟分离人B细胞的RNA。将裂解物以300g离心5分钟；将沉淀用PBS洗涤2次，然后分解于Nucleo
Figure GDA0003445579340000403
RNAII(Macherey-Nagel)的350μl RA1缓冲液中并添加3.5μl 0,5M TCEP(SIGMA)。通过制造商的说明书分离RNA。将10μl的RNA首先用1μl 0.5μg/μl OligodT引物(Invitrogen)和1μl 10mM dNTP在65℃下温育5min。然后将4μl的5x第一链缓冲液(Invitrogen)、2μl的100mM DTT和0.5μl SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)添加至20μl，并且将混合物在25℃下温育5分钟，在50℃下温育50min以及在70℃下温育15min。通过用表2中示出的引物对PCR，可以扩增轻链和重链恒定区的合成cDNA。
表2：恒定区克隆的引物
Figure GDA0003445579340000402
对于人源化轻链克隆#6的PCR产物的扩增，使用以下正向和反向引物：
RT_chim_humKl6f:CAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTG(SEQ ID NO:48)；
RT_chim_humKl6r:GTACCTTGCACGCAGTAATAAAC(SEQ ID NO:49).
对于参考基因的扩增，使用小鼠HPRT引物。
为了进行扩增，在循环仪中使用7.5μl Sybergreen(Firma)、1μl引物正向(25pmol/μl)、1μl引物反向(25pmol/μl)、5.5μl ddH2O和1μl cDNA。
3.通过将LC和HC分别克隆入两个不同表达载体在CHO细胞中表达重组抗体
将人源化抗体轻链和重链的序列分别克隆入两个不同的哺乳动物表达载体pCDNA3.1和HC-pOptiVEC。为了鉴定载体在CHO细胞培养中表达重组抗体的最佳组合，将不同质粒组合用来在粘附CHO细胞中进行瞬时表达。在第二步中，研究LC和HC质粒之间不同的DNA比例是否影响表达水平。对3μg LC-pCDNA3.1和1μg HC-pOptiVEC的转染发现表达水平升高。
对于人源化抗体的进一步粘附CHO细胞表达，使用LC-pCDNA3.1和1μg HC-pOptiVEC的质粒组合以及LC 3:1HC的质粒DNA比例。
将FreestyleTM CHO悬浮细胞用于以下转染以培养较高量的瞬时表达细胞产生重组抗体。首先测试过量的LC质粒是否可以像在粘附细胞的情况下提高抗体的表达。像在粘附CHO细胞中，使用1:1和3.1的LC比HC质粒DNA比例。蛋白印迹分析显示如在粘附CHO细胞的情况下，过量的LC质粒增加人源化抗体的表达。通过测量细胞生存力其变得明显，6天后细胞生存力减少至约50％的转染细胞。第6天后，不可检测到上清液中抗体水平的进一步升高。结果，在以下转染的情况下，在第6天收获培养上清液。
为了研究产生的抗体是否高效转运至细胞上清液中，将细胞裂解物样品用来SDSPAGE，通过蛋白印迹进行分析。将看家胞质蛋白GAPDH用于参考，将可比量的细胞裂解物上样至SDS凝胶。在表达人源化抗体的CHO细胞的细胞裂解物中，120kDa的强带出现，如细胞上清液中检测的以相同大小迁移。
4.通过蛋白G色谱纯化重组抗体
纯化人源化抗体克隆#6以研究蛋白的抗原结合特性与原始小鼠抗体进行比较。因此制备具有表达的嵌合和人源化抗体的300ml上清液并通过蛋白G色谱纯化(图2)。因为表达抗体的量非常低，收率少于0.1μg/ml，总计25μg纯化的蛋白。将洗脱的抗体浓缩至约200μg/ml，并且将2μg蛋白用来SDS-PAGE然后考马斯染色(图2)。
5.表面等离子共振测量以比较小鼠和人源化抗体的抗原结合
表面等离子共振测量用来研究人源化抗体对AβpE3-18的结合效力(图3)。为了防止测量期间的质量转移和亲和性影响，使用以下方法。
首先将多克隆α-人抗体偶联至SPR-芯片，随后装载人源化抗体直至响应单位超过1000。
在不同浓度(5-1000nM)的AβpE3-18–肽下进行动力学测量。测量系列的图示出为具有传感图的覆盖图，通过测量运行缓冲液的传感图矫正，在注射的时间对齐并在注射之前将基线调整至零。根据简单的1:1相互所有模型(Langmuir拟合)评价结果，其促进koff和kon速率常数。在图3中示出SPR-结合曲线，与结合和解离曲线一致。
根据1:1Langmuir拟合的表观动力学常数在表3中列出。由于人源化抗体非共价结合至芯片表面，少量抗体分子在测量期间被洗掉了。因此对每个单一的传感图局部拟合Rmax值。
表3：人源化抗体克隆#6的动力学中的Langmuir拟合的统计
Figure GDA0003445579340000421
肽结合期间的曲线图(图3A，上插图)拟合地非常好，而肽解离曲线的图(图3A，下插图)不准确定位于实验曲线上。用拟合计算了22.2 10-3 1/s的动力学参数koff(表2)。这个参数描述去除一半结合的肽所需的时间。这表示在1/0,0222s＝45s期间，去除一半注射的肽(见图3A，下面的插图)。因为Langmuir拟合在解离相中匹配地不是非常好，通过利用以下等式：Requ＝Rmax·KA·c/(1+KA·c)对肽浓度拟合Requ值(图3B)进行KD确定，在所述Requ与相应浓度c平衡的信号是变量，并且Rmax和KA是拟合的常数。KD可以通过1/KA计算。
通过小鼠Fab片段抗体克隆#6的结构分析，得出结论HC中的Thr97可以对AβpE3的结合亲和力具有重要影响。在人源化抗体克隆#6中通过Thr97置换Ala97之后，产生提高的结合亲和力，具有与小鼠抗体克隆#6相比几乎相同的KD值。需要较高量的表达抗体以通过额外的ITC测量证实这些发现。因此通过用小鼠序列置换人源化抗体T97变体的LC和HC信号序列提高表达水平。在第二步中，进行稳定细胞系生成以增加抗体产生。
表4示出人源化抗体克隆#6的进一步序列变体的根据1:1Langmuir拟合的表观动力学常数：
Figure GDA0003445579340000431
6.人源化抗体变体HC T97的稳定细胞系产生
对于稳定细胞系开发，首先通过用不同浓度的甲氨蝶呤(MTX)处理产生稳定CHO-DG44细胞系的池。在0.5μM MTX的浓度下检测到最佳表达，伴有少量的死亡细胞(图4A，泳道2)。因此，将0.5μM MTX预处理的细胞用于通过有限稀释的克隆选择。
克隆选择之后发现了100个潜在的抗体表达克隆。将这些克隆的上清液在HBS-EP缓冲液中1:20稀释并利用AβpE3-18偶联芯片通过SPR进行分析。校准曲线用来确定上清液中的抗体浓度。分离了18个克隆，它们在3天表达之后表现出超过0.15μg/ml的起始抗体浓度。将这些克隆以24孔形式扩大，收集上清液并通过蛋白印迹进行分析(图4B)。这些克隆中的5个显示良好的表达并进一步放大直至30ml振荡培养。7天表达时间之后，通过SPR测量表达水平(图4C)。克隆9A在7天培养之后显示最高的抗体浓度。因此将这个克隆用于表达较高量的上清液。没有进一步的选择压力进行培养以获得较高的细胞生存力。收集3升包含抗体的上清液。
7.通过蛋白G色谱纯化人源化抗体克隆#6
将1升的上清液用1升40mM Na2HPO4 pH 7稀释并在4℃下应用至5ml蛋白G柱过夜。之后将柱用结合缓冲液(20mM Na2HPO4，pH 7，级分A1-A3)洗涤，然后用高盐缓冲液(2MNaCl，40mM Na2HPO4 pH 7，级分A4-A7)洗涤以去除非特异性结合的蛋白。将抗体用0.1MGlycin-HCl,pH 2.7从柱洗脱并立即通过1M Tris pH 9中和。收集级分并分别将24μl上样至12％SDS PAGE。将级分A12+B1汇集并用于通过ITC的KD确定。总的来说，从1升培养上清液纯化了2.5mg抗体。
8.用AβpE3-18的人源化抗体克隆#6的ITC测量
为了确定KD-值，将人源化抗体克隆#6稀释至1μM的浓度。在293.15K滴定浓度为20μM的配体AβpE3-18。整合ITC-测量的原始数据(图5，底部)之后，计算了1.5的化学计量。计算的KD-值为2.7nM，与计算自SPR数据的5.3nM的值非常一致，表征在溶剂中人源化克隆#6HC T97配体结合为高亲和相互作用。相互作用主要通过焓的贡献(ΔH＝-23.45kcal/mol)驱动并通过熵的惩罚(TΔS＝-11.96kcal/mol)反对，其对于结合位点的结构重排是典型的，通过氢键的形成产生自由度的显著损失。
9.两个进一步的AβpE3特异性抗体克隆#17和克隆#24的人源化、表达和纯化
利用与用于克隆#6相同的方案、材料和方法以及实验条件进行两个进一步的AβpE3特异性抗体克隆#17和克隆#24的人源化、表达和纯化。
10.人源化抗体克隆#24和克隆#17的SPR测量
利用pE3-Aβ18配体的SPR测量显示两种人源化抗体均能结合pE3-Aβ肽。速率常数和KD值可以通过Langmuir 1:1模型拟合非常好地计算。小鼠抗体对pE3-Aβ的原始KD值在表5中示出。显然人源化抗体#24的koff值比小鼠抗体克隆#24的koff值高20倍。这表示人源化之后，pE3-Aβ肽从抗体的抗原结合口袋解离更快。
表5：确定不同Aβ肽的kon、koff和KD
Figure GDA0003445579340000441
Figure GDA0003445579340000451
11.结合Fcγ受体
比较包含SEQ ID NO:73的人IgG1 Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)的两种抗体结合至不同Fcγ受体(CD16A、CD32A、CD32B和CD64)。
通过位点定向诱变产生K322A突变体。在基于FACS的生物测定中对稳定表达全长人CD16A、CD32A、CD32B或CD64的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞测量结合。将两种抗体用7个不同浓度的每种细胞系温育1小时，然后洗涤。用荧光染料缀合的抗Fab’检测受体结合的H6或H67。通过FACS测量结合能力，并且通过非线性回归计算Kd和Bmax。
结果：两种抗体均显示可比地结合所有受体。见图6、7、8和9。
12.结合C1q
比较包含SEQ ID NO:73的人IgG1 Fc野生型区或其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)的两种抗体对C1q的结合以更好地表征抗体的效应子功能。
测试抗体结合至C1q的许多测定形式，包括
a)两种抗体直接结合至板，然后结合至溶液中的C1q；以及
b)首先用生物素化的pE-Aβ肽温育的链霉抗生物素蛋白包被的板，结合至抗体然后C1q。
总的来说，形式a)产生最佳结果。方法总结如下：
将ELISA板用10、8、6、4、3、2、1和0μg/ml的抗体一式三份包被并在4℃下温育过夜，所述抗体包含SEQ ID NO:73的人IgG1 Fc野生型区、其K322A突变变体(SEQ ID NO:74)以及不结合C1q的K322A对照(hu14.18K322A)。第二天，将板用1x PBS洗涤3次，然后用1x PBS中的1％BSA以50μl/孔封闭。将C1q(Sigma,Cat.#C1740)在封闭缓冲液中以2μg/ml添加至每个孔，并且在室温下温育1小时。然后将板用200μl的1x PBS洗涤3次。将抗C1q-HRP(Thermo,Cat.#PA1-84324)以封闭缓冲液中1:250稀释添加至板(50μl/孔)1小时以检测结合。将板用200μl的1x PBS再洗涤3次。将50μl的TMB(Invitrogen,Cat.#002023)添加至每个孔2min以使相互作用可见(Invitrogen,Cat.#002023)。向每个孔添加50μl的终止溶液(1M硫酸)，然后在450nm下读取吸光度。
结果：包含SEQ ID NO:73的人IgG1 Fc野生型区的抗体的确结合C1q。其K322A突变变体(包含SEQ ID NO:74的IgG1 Fc区)不结合C1q。含参见图10。
13.免疫组织化学
用IHC可以将抗原AβN3pE定位在脑组织切片中。因此本发明的人源化抗体用于AβN3pE的检测。
对于IHC，可以使用来自AD患者的海马和额叶皮层的人脑组织切片以及来自阿尔茨海默病的现有动物模型的海马的脑组织切片。这些小鼠模型显示升高的脑Aβ水平，然后发展神经炎性斑块。将组织切片石蜡包埋并连续切割。将切片用苏木精染色以着色细胞核，然后用本发明的抗AβN3pE抗体免疫染色。按照标准方法进行组织切片制备和染色。
14.阿尔茨海默小鼠的体内治疗
在这个研究中利用总计62只雄性小鼠。在免疫开始之前，将阿尔茨海默病的现有小鼠模型的4只小鼠(avg.5.6mo±0.45)处死作为基线对照以评价治疗开始时的大脑Aβ斑块负荷。将剩余小鼠分为4组并接受以下治疗：250μl无菌PBS(n＝12；avg.5.89mo±0.13)，200μg本发明的人源化抗体。将一组年龄和性别匹配的Wt同窝仔畜用250μl PBS注射(n＝12；avg.5.80mo±0.12)并用作行为对照。将小鼠通过腹腔内注射用250μl(抗体或PBS)的总体积治疗28周。
安乐死和组织制备
在6月龄(基线)或13月龄将小鼠安乐死、灌注并收获血浆。提取脑并矢状分割。从一个半球解剖海马、皮层和小脑并快速冷冻用于生物化学分析。将另一半球在4℃下于4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中下降固定24h，在4℃下于梯度蔗糖溶液中冷冻保护并包埋在OCT化合物(Tissue Tek)中。
序列表
<110> 前体生物药物股份公司
<120> 人源化抗体
<130> PBD128WO
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> Human
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> Human
<400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly
35
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> Human
<400> 4
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
20 25 30
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
20 25 30
Met Val Gly Gly Val Val
35
<210> 6
<211> 36
<212> PRT
<213> Human
<400> 6
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
20 25 30
Met Val Gly Gly
35
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> variable part of light chain
<220>
<221> VARIANT
<222> (31)..(31)
<223> X is His or Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(53)
<223> Xaa is Ala, Ile or Thr
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Xaa Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> Variant
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is His or Tyr
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Val Gln Gly Thr His Phe Pro
1 5
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 11
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 13
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ala Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 14
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Thr Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 15
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Thr Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 16
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> Variant
<222> (32)..(32)
<223> Xaa is His or Tyr
<220>
<221> Variant
<222> (54)..(54)
<223> Xaa is Ser or Tyr
<220>
<221> Variant
<222> (56)..(56)
<223> Xaa is Gly, Thr, Ala or Glu
<220>
<221> Variant
<222> (65)..(65)
<223> Xaa is Lys or Gln
<220>
<221> Variant
<222> (70)..(70)
<223> Xaa is Leu or Ile
<220>
<221> Variant
<222> (71)..(71)
<223> Xaa is Ile or Thr
<220>
<221> Variant
<222> (80)..(80)
<223> Xaa is Tyr or His
<220>
<221> Variant
<222> (93)..(93)
<223> Xaa is Val or Thr
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Xaa
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Xaa Asn Xaa Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Xaa Gly Arg Val Thr Xaa Xaa Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val Xaa
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> Variant
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Tyr or His
<400> 18
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Xaa Thr Met Asn
1 5 10
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> Variant
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is Tyr or Ser
<220>
<221> Variant
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Gly, Thr, Ala or Glu
<220>
<221> Variant
<222> (16)..(16)
<223> Xaa is Lys and Gln
<400> 19
Leu Ile Asn Pro Xaa Asn Xaa Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 20
Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Ile Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 22
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 23
Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 25
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His Thr Met Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 26
Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 29
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 30
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 31
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 34
Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 35
Tyr Asp Tyr Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 36
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 37
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 38
Val Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 39
Val Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 40
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 41
Gly Tyr Ile Phe Asn Asn Tyr
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 42
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 43
Glu Gly Tyr Ile Val Tyr
1 5
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 44
actgtggctg caccatctgt cttc 24
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 45
ctaacactct cccctgttga agctc 25
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 46
agggaaccct ggtcaccgtc tcc 23
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 47
tcatttaccc ggagacaggg agagg 25
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 48
caagtcagag cctcttatat agtg 24
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 49
gtaccttgca cgcagtaata aac 23
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 50
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 51
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 52
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
1 5 10 15
Val
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 53
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 54
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
1 5 10 15
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 55
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 56
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 57
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
1 5 10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 58
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 59
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val
1 5 10
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 60
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 61
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 62
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 63
Glu Phe Arg His Asp Ser
1 5
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 64
Glu Phe Arg His
1
<210> 65
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 65
Glu Phe Arg
1
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Thr Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 67
Leu Ile Asn Pro Ser Asn Thr Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 69
Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 71
Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID
<400> 72
Glu Phe Arg His Asp
1 5
<210> 73
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 74
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Glu Val Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Thr Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ala Lys Arg Glu Trp Asp Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys

Claims (31)

1.一种人源化抗体或其功能变体，其特异性地结合AβN3pE表位的携带焦谷氨酸的N-末端，其中所述抗体的轻链的可变部分由选自以下的氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:13)，以及
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；
其中SEQ ID NO:13和14的轻链的可变部分包含CDR区：
VL CDR1:KSSQSLLYSDGKTYLN(SEQ ID NO:12)，
VL CDR2:LVSKLDS(SEQ ID NO:9)，以及
VL CDR3:VQGTHFP(SEQ ID NO:10)；
其中所述人源化抗体或其功能变体的重链的可变部分包含CDR区：
VH CDR1:GYSFTGHTMN(SEQ ID NO:25)，
VH CDR2:LINPSNGVTRYNQKFQG(SEQ ID NO:26)，和
VH CDR3:EAKREWDETY(SEQ ID NO:20)。
2.权利要求1的人源化抗体，其中轻链的可变部分由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLAYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:13)。
3.权利要求1的人源化抗体，其中轻链的可变部分由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:14)。
4.权利要求1的人源化抗体，其中重链的可变部分由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTAVYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:24)。
5.权利要求1的人源化抗体，其中重链的可变部分由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
6.权利要求1的人源化抗体，其中轻链的可变部分由以下氨基酸序列组成：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLTYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHFPFTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；且
其中重链的可变部分由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYSFTGHTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPSNGVTRYNQKFQGRVTITRDTSTTTVHMELTSLTSEDTATYYCTREAKREWDETYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
7.权利要求1的人源化抗体，其具有人IgG1 Fc区。
8.权利要求7的人源化抗体，其中所述人IgG1 Fc区由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成。
9.权利要求7的人源化抗体，其中轻链的可变部分由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；并且重链的可变部分由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成；并且人IgG1 Fc区由SEQ ID NO:74的氨基酸序列组成。
10.权利要求1-9中任一项的人源化抗体，其中所述人源化抗体特异性地结合以下表位
pEFRHDSGYEVHHQKLV(SEQ ID NO:50)。
11.权利要求1-9中任一项的人源化抗体，其中所述人源化抗体不结合在N-末端不携带焦谷氨酸的表位。
12.一种包含权利要求1-11中任一项的人源化抗体的药物组合物。
13.权利要求12的药物组合物，其进一步包含另外的生物活性物质和/或药学可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述另外的生物活性物质选自神经元传递增强剂，乙酰胆碱酯酶抑制剂，钙通道阻断剂，生物胺，苯二氮
Figure FDA0003532469710000021
镇静剂，乙酰胆碱合成、储存或释放促进剂，单胺氧化酶-A或-B抑制剂，N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂，非甾体抗炎药，抗氧化剂以及血清素受体拮抗剂。
15.权利要求13的药物组合物，其中所述另外的生物活性物质选自金属螯合物，DNA修复抑制剂，3-氨基-1-丙磺酸，1,3-丙烷基二磺酸酯，α-分泌酶激活剂，β-和γ-分泌酶抑制剂，β-折叠破坏剂，淀粉样蛋白β清除/消耗细胞组分的引诱剂，N-末端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂，或者胆碱酯酶抑制剂。
16.权利要求13的药物组合物，其中所述另外的生物活性物质选自哌仑西平、谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂、他克林、利凡斯的明、多奈哌齐和/或加兰他敏。
17.权利要求13的药物组合物，其中所述另外的生物活性物质选自胆碱酯酶抑制剂，美金刚或谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂。
18.权利要求1-11中任一项的人源化抗体或权利要求12-17中任一项的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于诊断或治疗淀粉样变性。
19.权利要求18的用途，所述药物用于治疗神经变性疾病，其选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，唐氏综合征中的神经变性。
20.权利要求19的用途，所述阿尔茨海默病(AD)是散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)。
21.权利要求20的用途，所述家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)是家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)。
22.权利要求1-11中任一项的人源化抗体或权利要求12-17中任一项的药物组合物在制备诊断性试剂盒中的用途，所述诊断性试剂盒用于淀粉样变性的诊断。
23.权利要求22的用途，所述诊断性试剂盒用于诊断神经变性疾病，其选自轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)和唐氏综合征中的神经变性。
24.权利要求23的用途，所述阿尔茨海默病(AD)是散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)。
25.权利要求24的用途，所述家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)是家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)。
26.权利要求18-25中任一项的用途，其中施用权利要求1-11中任一项的人源化抗体或权利要求12-17中任一项的药物组合物导致在对象中认知下降的逆转、认知改善或预防认知下降，所述对象被诊断患有轻度认知障碍(MCI)，阿尔茨海默病(AD)，唐氏综合征中的神经变性。
27.权利要求26的用途，其中所述阿尔茨海默病(AD)是散发性阿尔茨海默病(SAD)或家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)。
28.权利要求27的用途，其中所述家族性阿尔茨海默型痴呆(FAD)是家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)。
29.权利要求18-25中任一项的用途，其中施用权利要求1-11中任一项的人源化抗体或权利要求12-17中任一项的药物组合物导致从斑块或其他生物复合物清除或去除AβN3pE。
30.权利要求18-25中任一项的用途，其中施用权利要求1-11中任一项的人源化抗体或权利要求12-17中任一项的药物组合物导致斑块负荷减少和/或从受影响的组织去除全部斑块。
31.权利要求30的用途，其中所述受影响的组织是脑组织。
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