CN108693147A - 一种微型荧光成像仪及荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

一种微型荧光成像仪及荧光检测方法，以手机等智能硬件的图像传感器为探测器，可以用于荧光成像，通过使用荧光比色卡作为荧光强度参考标准，与待测样本的荧光强度对比，可实现对待测样品的荧光分析。结合荧光探针技术，将样本与荧光探针反应，再与荧光比色卡共同拍照即可判断样本中靶标含量。通过图像分析软件，可以对样本进行较精确的荧光定量分析。该方法具有较广泛的适用性，可以兼容可见光区的许多荧光探针、荧光量子点.该方法省略了光谱分析，不需要逐个测量标准样本以获得工作曲线，操作简便、迅速，适用于即时检测，并且检测结果不受光强，手机型号的影响。

Description

一种微型荧光成像仪及荧光检测方法

技术领域

本发明利用分子的光致发光实现成像和检测，涉及荧光成像仪器的制造和使用方法，属于荧光分析、检测领域。

背景技术

荧光分析在分析化学、生物医学检测、环境检测等方面应用广泛。然而传统的荧光检测依赖于大型的光谱仪、成像***，不便于户外检测和即时检测。为此，人们发展了微型光谱仪、手持式荧光检测设备。然而，现有的很多微型光谱仪价格昂贵，难以普及到民用，其次，这些便携的检测设备在对样本进行定量分析的时候，需要先测定工作曲线，增加了操作误差，不够便捷。

随着技术发展，手机已经不仅仅是通讯设备，现在的智能手机已配备图像传感器，不仅用于拍照成像，还可以结合光学元件，用于光谱检测（专利CN 201410248090.6 ，Biosensors and Bioelectronics 87 (2017) 686–692）。结合一些应用软件，手机可以分析图像的亮度、色度等。结合一些荧光分析方法，手机也用于一些物质的检测（专利CN201620622263.0，CN201510140830.9，CN201510253603.7），也有一些专用的便携式荧光检测仪（CN201610302041.5）。

然而上述的荧光检测方法还难以适用于各种手机，手机上图像传感器的灵敏度、应用软件的设定都可能影响检测的结果。即还没有一种通用的方法，其检测结果不受手机型号、激发光强的影响。此外，现有的手机的自带摄像头的透镜孔径较小，光透过量小，不利于荧光、化学发光等弱光信号的成像应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种通用的方法，将微型成像仪用于荧光定量分析，该方法简单实用，不受光强，手机型号的影响。

本发明设计的微型成像仪是基于手机相机等具有图像传感器的智能硬件。

该成像仪以手机或其它智能硬件的图像传感器为探测器，还包括暗室、光源，其中，从光源发出的光激发暗室中样品荧光，样品的荧光图像通过智能硬件的透镜聚焦于图像传感器上。

优选的，该成像仪还包括一个大孔径的透镜，位于智能硬件传感器和样品之间，相对于直接使用智能硬件自带的透镜，该透镜可以缩短成像的工作距离，并具有更大的数值孔径，可增大光透过量，并提高荧光探测的灵敏度。

优选的，该成像仪还包括滤光片，滤光片位于光源和样品之间或样品和传感器之间，滤光片数量不限，使光源的光先经过滤光片再激发样品，或者使样品发光经过滤光片再进入探测器，可以降低散射光干扰。

优选的，该成像仪还包括二向色镜，二向色镜用于反射光源的光，透射样品的发光，或者透射光源的光，反射样品的发光。

优选的，光源为LED光源，其体积小，寿命长，便携。

优选的，光源周围有反光灯罩，将光源发散的光反射到样品上，用于增加激发光强。

优选的，光源出射方向有聚光透镜，将光源发散的光会聚到样品上。

优选的，该成像仪还包括一个夹具，用于将成像仪固定于智能硬件上。

优选的，还可以在暗室中添加其它光源，可作为其它波长的激发光源，也可以作为明场成像光源。

优选的，还可以在光路上添加光学元件，这些元件选自狭缝、光阑、光栅、透镜、滤光片、棱镜、反光镜。

上述成像仪可以用于荧光成像，然而，该仪器搭配不同的智能硬件，成像亮度不同，还不能直接用于定量分析。

为此，基于上述仪器，本发明还发展了一种荧光分析方法，包括成像、比色的过程。具体方法如下：

对待测样本和荧光比色卡进行荧光成像，通过比较样本与荧光色块在照片中的亮度就可以判定待测样本中荧光物质的含量或浓度；

其中，荧光比色卡由基底和荧光色块组成，荧光色块含有荧光物质，含量已知，可以作为荧光强度参考标准，一张荧光比色卡上荧光色块的形状和数量不限。

荧光物质可附着在基底上，或者与基底共价连接。荧光物质种类不限，可选自有机荧光或磷光化合物、无机荧光磷光材料、荧光磷光组合物。其中有机荧光或磷光化合物的代表物质有：荧光磷光小分子、荧光磷光高分子、绿色荧光蛋白、荧光磷光金属配合物等；无机荧光或磷光材料的代表物质有：量子点、辉光粉（夜光粉）等；荧光磷光组合物的代表物质有：荧光磷光超分子、荧光磷光超分子凝胶、激基复合物、荧光溶液、荧光塑料、荧光油墨等。

一张荧光比色卡上荧光色块的形状和数量不限，不同色块含有荧光物质的量不同，或者荧光物质浓度不同，这样成像时，各个色块的荧光亮度不同。

一种优选的方案中，荧光比色卡上的荧光物质与待测荧光物质相同，由于荧光色块中荧光物质的浓度是已知的，因而与样本的亮度最接近的荧光色块代表样本中荧光物质的含量。

在另外一种方案中，使用等效荧光物质制备荧光比色卡，也可以获得定量分析的效果。其中，等效荧光物质与待测物所含荧光物质不相同，但是二者荧光光谱相同或相似，因而，可以作为荧光强度及待测物荧光物质含量的参考标准。

由于现有智能硬件的图像传感器大多为CMOS或CCD传感器，像素点累积的电荷与光强和积分时间大致成正比，因而在排除了背景散射的荧光成像中，像素点亮度可以反应该点荧光物质的浓度。

如果图像清晰，可以通过肉眼判断。

如果要精确判断，可以通过图像软件分析图像，以色块亮度值对荧光物质含量进行线性拟合，可以得到工作曲线，并以此计算出照片中其它区域所代表的荧光物质含量。

根据这种原理，在一种简单的荧光比色卡中，只需要两个不同亮度的荧光色块，就可以扣除背景散射光和传感器的暗电流信号，实现对其它区域的荧光含量分析。然而实际应用中，CMOS或CCD传感器对光强并不是完美线性响应，可能会导致实际荧光强度偏离工作曲线。为此，可增加比色卡上的荧光色块数量，并对各色块亮度进行非线性拟合，从而增加荧光分析的准确度。优选的，荧光色块按荧光强度次序排列。

结合荧光探针技术，上述方法可以用于荧光探针靶标的检测。在荧光探针的应用中，探针没有荧光或者荧光很弱，当探针与靶标分子反应或结合后生成荧光化合物，或者荧光组合物。因而，将样本与荧光探针反应，再与荧光比色卡共同拍照即可判断样本中荧光物质的含量，其中，荧光比色卡所含的荧光物质与荧光探针生成的荧光化合物或组合物相同，或者是其等效荧光物质。

为了便于实际检测，可以使用这样一种检测卡，一个检测卡含有一块基底，基底上有检测区域，检测区域含有荧光探针，其中，该探针与靶标物质反应后生成的荧光物质与荧光比色卡上荧光色块所含有的荧光物质相同或等效。

这样，在检测卡的检测区域加入待测样本，使样本与其中的荧光探针反应生成荧光物质，再将该检测卡和荧光比色卡置于本发明的荧光成像仪下拍照，比较待测区域和荧光色块的亮度，就可以判断靶标物质的含量。其中检测卡和荧光比色卡可以同时或着先后置于本发明的荧光成像仪下拍照。

一种优选的方案中，所使用的检测卡包含检测区域和荧光比色卡，这样的一个检测卡含有一块基底，基底上有荧光色块和检测区域。其中，荧光色块与前面所述的荧光比色卡一致，检测区域与前面所述的检测区域一致。其中所含的荧光探针与靶标物质反应后生成的荧光物质与荧光色块所含有的荧光物质相同或等效。这样，在检测区域加入待测样本充分反应后，再置于成像仪中拍照，就可以判断靶标物质的含量。检测原理与前一种方案一致。

在实际应用中，可能会产生视野区域误差，主要由以下两个因素造成：首先，由光源发出的光不能均匀照射在检测卡上，造成区域的激发光能量不同，因而区域的荧光强度不同；其次，透镜对来自视野中心与视野边缘的发光的聚焦能力不同，会造成视野中心的样品亮于视野边缘。这两个因素导致视野中不同区域的荧光信号与荧光物质的含量不成正比。

为了克服这种误差， 一种改进的方案为：使用校准卡对视野区域误差进行校准，即在前面方案的基础上，增加一个校准卡，校准卡由基底和荧光色块组成，其中荧光色块中荧光物质的相对含量和浓度已知，并且荧光色块分布在视野的不同区域。

通过对这个校准卡进行成像拍照、分析，就可以获知视野中不同区域的荧光亮度与实际荧光物质含量的差异。然后，在分析检测卡和比色卡时，扣除上述差异即可降低视野区域的误差。

在最简单的校准方案中，校准卡只有一个荧光色块，其中荧光物质均匀分布在整个基底上，这样视野中每个点的荧光物质含量相同，因而成像拍照的亮度差异就反应了视野区域差异。

在实际测量中，增加一个校准卡会多一次拍照，两次拍照中可能会因为设置不同而导致校准不准确，为此可采用校准物质对视野区域误差进行校准，方法如下：

在荧光色块和检测区域中增加另外一种荧光物质，作为校准物质，校准物质在不同区域的相对浓度已知，因而校准物质的亮度可以反应视野区域误差。

作为校准物质的要求为：（1）不受检测条件影响，即不参与荧光检测反应；（2）其荧光光谱与待测荧光物质的荧光光谱范围分别位于红绿蓝中任意两个区域。

例如，如果待测物质荧光为红色，则校准物质应选择蓝色或绿色的荧光物质。

此外，为了避免校准物质荧光信号干扰，其浓度不宜过大。

这样的检测卡使用一次拍照即可以对视野区域误差进行校准。原理如下：

现有手机的图像传感器大多为彩色传感器，传感器前面具有红绿蓝滤光片阵列，用于分别收集各种颜色的光子信号；由于校准物质和待测物质的荧光信号分别由不同的感光点收集，因而在一次成像中就可以分别采集到待测物质和校准物质光强的信息，由于校准物质和待测荧光物质同时分布在荧光色块和检测区域中，因而校准物质荧光的亮度代表视野区域误差。

如果待测物质为红色荧光，则只有红色滤光片后的感光点可以探测到光信号，而蓝绿滤光片后的感光点不能探测待测信号。如果校准物质为绿色荧光，则可以被绿色滤光片后的感光点探测，该绿色荧光信号的分布代表了视野区域差异。如果各区域中校准物质的含量相同，则红色荧光信号与绿色荧光信号强度的比值就是消除了视野区域误差的荧光物质含量的相对值。

上述的校准过程操作简便，其优势在于：不需要构建准直光源，不需要入射光的能量均匀分布，降低了光源的要求，也就降低了成本。

通过以上的校准、比色、检测的过程，本发明的微型成像仪可以运用于荧光物质的检测和荧光分析，由于比色卡与检测样本同时成像，因而避免了不同探测器、不同光源的检测差异，并且，该方法省略了光谱分析，不需要逐个测量标准样本以获得工作曲线，操作简便、迅速。

相对于传统的荧光分析，利用了手机等智能硬件自带的探测器和图像处理功能，因而不需要大型的光谱仪、荧光光度计，也不需要其它额外的大型附件，便于即时检测，并且成本低。相对于许多便携式荧光检测方法，该方法具有较广泛的适用性，可以兼容可见光区的许多荧光探针、荧光量子点。此外，不同的检测卡可以检测不同的靶标，可以开发针对某个靶标或者适用于某类样本的检测卡；并且检测卡可以作为一次性使用，降低仪器污染。

除了荧光检测，本发明的仪器还可以用于化学发光的检测，在化学发光的检测中，不需要光源，因而相关的装置可以省略光源。

附图说明

图1为一种荧光成像仪结构示意图，101为暗室，102为光源，103为反光灯罩，104为滤光片，105为透镜，106为检测卡，107为样本，108为手机，109为摄像头。

图2为一种荧光成像仪结构示意图，201为暗室，202为光源，203为反光灯罩，204为滤光片，205为二向色镜，206为滤光片，207为透镜，208为暗室的门，209为检测卡。

图3为一种荧光成像仪结构示意图，301为暗室，302为底座，303为光源，304为透镜，305为滤光片，306为二向色镜，307为检测卡。

图4为罗丹明6G的荧光比色卡成像图。

图5为一种荧光检测卡示意图。

图6为一种荧光检测卡示意图。

图7为一种校准卡示意图。

图8为一种校准卡示意图。

图9为一种检测卡示意图，901为荧光色块，902为荧光色块，903为检测区域。

图10为双氧水检测的成像结果。

图11为一种检测卡示意图。

具体实施方式

为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。 在实际应用中，可以根据具体情况实施最合适的方案。

实施实例1，适用于手机的荧光成像仪

一种成像仪的结构如附图1所示，该成像仪包括有一个暗室101、光源102、反光灯罩103、滤光片104和透镜105。其中从光源发出的光照射在检测卡106上，样本107受激发后发出的荧光经过透镜105会聚到手机108的摄像头109中。该成像仪结构简单，光源发出的光斜射到检测卡上，虽然一部激发光被反射到透镜的另外一侧，但是一部分光会散射到传感器中，增加检测背景。

相比之下，附图2所示的成像仪具有较低的背景干扰。该成像仪包括有一个暗室201、光源202、反光灯罩203、滤光片204、二向色镜205、滤光片206、透镜207。其中从光源202发出的光经过滤光片204后，被二向色镜205反射到检测卡209上，检测卡上的荧光经过二向色镜205和透镜206后会聚到智能硬件的传感器中。

该成像方式中，二向色镜205反射截止波长以下的光，透过截止波长以上的光，因而可显著降低散射光干扰，增加信噪比，增强了定量分析的可靠性。滤光片206用于选择性透过荧光波长范围的信号，进一步降低散射干扰。

如果光源202的单色性和二向色镜205的分光性能能够达到检测要求，可以省略滤光片206。

该成像仪的暗室包括一个门208，当门208打开时，可以放入检测卡或比色卡，并让外界的自然光透过，用于明场图像的拍摄。当门208合上时，用于荧光成像。

在待测荧光足够强的情况下，可以省略摄像头前面的透镜。一种方案如附图3所示，暗室301含有可以拆卸的底座302，光源303发出的光经过透镜304、滤光片305后，经过二向色镜306反射照射检测卡307，检测卡上的荧光经过二向色镜306后进入智能硬件的传感器中。底座302便于拆下，放置样本。

本实例的光源优选为LED光源，其体积小，寿命长。由于大多数荧光物质可以被紫外光激发，因而选用紫外LED，如波长为365、375、395nm的单色LED为首先光源。

本实例中，可以用夹具将成像仪与手机等智能硬件固定，以降低成像过程的振动干扰。其中夹具可固定在成像仪上，也可以不固定。

此外，可以根据具体需要，在光路上添加挡板、狭缝、光阑、透镜、滤光片、棱镜、反光镜等光学元件。

实施实例2，荧光比色卡

在玻璃片上涂覆聚甲基丙烯酸甲酯的氯仿溶液，待溶剂挥发后，在涂覆层上点样制备荧光色块。点样方法如下：配置不同浓度的荧光物质的溶液，取1微升溶液滴在涂覆层上，每间隔一定的距离点样，形成阵列。待其自然干燥后，置于实例1中的仪器中进行成像拍照。所采用的成像仪结构如附图2所示，其中光源为365nm的紫外led光源，二向色镜为450nm以上透过的二向色镜。

一荧光比色卡的成像如附图4所示，选用的荧光物质的溶液为罗丹明6G的乙醇溶液。第一行有三个荧光圆斑，从左到右，所用荧光染料浓度依次为500、100、50 nM，第二行有四个荧光圆斑，从左到右，所用浓度依次为1000、500、100、50 nM。从图中可以判断，随着荧光物质浓度增加，荧光色块越来越亮。

在不借助图像分析软件的条件下，100 nM以上的荧光色块比较显著，50 nM的荧光色块隐约可见，即对罗丹明6G溶液浓度的检测限达到50 nM，物质量的检测限达到50 fmol。远低于一般荧光探针的工作浓度（微摩尔每升），说明这种方法可以用于荧光探针的靶标检测。该方法所用的样本量也很少，不超过1微升，适用于微量样本的即时检测。

以上方法具有改进的空间，通过选用低荧光背景的基底、更好的点样方式，并结合图像分析软件，可以进一步提升灵敏度。

荧光比色卡和检测卡不限于附图4中的样式，附图5至6中给出其它一些阵列样式。附图5为4×4的点阵，中心4个圆斑可作为检测区，***一圈作为荧光比色卡，不同亮度代表不同的荧光物质浓度，比较检测区和比色卡的荧光强度可以判断检测区的荧光物质浓度。类似的，附图6的点阵中，中心3个圆斑可作为检测区，***一圈作为荧光比色卡，判定方同前。

为了消除视野区域误差，可使用校准卡拍照进行校准，校准卡如附图7和8所示，分别对应附图5和6中的检测卡。该校准卡中的荧光色块所含的荧光物质浓度一致，若在成像照片中亮度不一致，则可能是激发光分布不均匀，或透镜聚光差异导致，通过对校准卡成像可以获知上述因素导致的差异量，将这个差异考虑到检测卡的成像照片中，就可以使荧光分析更加准确。

实施实例3，荧光探针靶标物的检测

反应型荧光探针自身荧光很弱，与靶标物质反应后生成的产物具有很强的荧光，因而可以用于靶标物质的检测。本实例以一种荧光探针为例，说明本发明的荧光成像仪联合荧光探针可用于过氧化氢的检测，不作为本发明的限定。

选用的荧光探针为二氢罗丹明123，该探针可以被过氧化氢氧化脱氢生成具有荧光的产物罗丹明123，反应式如下图所示：

荧光检测卡示意图如附图9所示，其中901和902为荧光色块，由充满罗丹明123水溶液的毛细管构成，浓度分别为1和10 μM；中间903为检测区域，由内壁含有荧光探针二氢罗丹明123的固体的毛细管构成。

作为检测区域的毛细管的制备方法为：吸取荧光探针10 μM的溶液，待其溶剂自然挥发后，荧光探针便留在毛细管内壁上。

将市售30%的双氧水用蒸馏水稀释成约5 μM的溶液，作为待测样本溶液。

检测方法为：使用检测卡上中间的毛细管自动吸取上述待测样本溶液，静置反应10分钟后，于荧光成像仪下拍照。所采用的成像仪结构如附图3所示，其中光源为365nm的紫外led光源，二向色镜为450nm以上透过的二向色镜。

使用三星SM-J3109手机对检测卡拍照，结果的灰度图如附图10所示，通过使用photoshop软件分别选取图像中的荧光色块和检测区，比较各区域直方图的灰度平均值，按线性拟合，可计算出中间毛细管所含荧光物质（罗丹明123）的约为4.4 μM。使用小米4手机和红米3S手机拍照，按同样方法计算罗丹明123浓度约为4.5和4.2 μM。由于一分子双氧水可以氧化一分子荧光探针生成一分子的罗丹明123，因而上述浓度可代表双氧水浓度，不同手机测量的结果偏差仅为3.5%，说明了这种检测方法的可靠性。

根据同样的原理，本方法不限于二氢罗丹明123的检测，其它的过氧化氢探针也可以代替二氢罗丹明123用于双氧水的检测。

过氧化氢的产生在酶联检测、化学发光检测中具有重要作用。因而该方法也可以用于相关的检测中，例如，本方法可以用于一些氧化酶或氧化酶底物的检测。

当检测区域含有氧化酶时，如果待测溶液中含有其底物，则酶催化底物氧化产生过氧化氢，从而氧化过氧化氢探针显现荧光。或者当检测区域含有氧化酶底物时，如果待测溶液含有其氧化酶，则也会发生酶反应并氧化过氧化氢探针显现荧光。例如，葡萄糖氧化酶可以氧化葡萄糖产生过氧化氢，从而可以结合上述方法实现葡萄糖的检测或葡萄糖氧化酶的检测。

根据同样的原理，本方法不限于过氧化氢的检测，各种反应型荧光探针也可结合这种方法用于相关物质的检测。

对于非反应型的荧光探针，可以将荧光探针与不同浓度的靶标物质混合作为比色卡，也可以用于其靶标物质的检测。

此外，本实例中的检测卡不限于附图中的样式，毛细管的形状不限于直线型，一种优选的检测卡样式如附图11所示，检测区域为连续的环形毛细管，可以通过毛细现象自动吸取样本液体，其***分布荧光色块，各荧光色块含有不同浓度的荧光物质，因而亮度依次增强，便于于检测区比较。在实际检测中，与检测区域亮度最接近的荧光色块就代表其中荧光物质的浓度。附图11中，检测区荧光物质浓度如箭头所示。

对于成像照片的分析不限于用photoshop软件，其它具有类似功能的软件均可以使用；也可以使用智能硬件自带的图像分析软件处理数据；或者将图像上传至互联网，使用其它计算机的软件处理获得结果。

Claims (10)

1.一种微型荧光成像仪，其特征在于，以智能硬件的图像传感器为探测器，还包括暗室、光源；其中，从光源发出的光激发暗室中样品荧光，样品的荧光通过智能硬件的透镜聚焦于图像传感器上。

2.如权利要求1所述的成像仪，其特征在于，该成像仪还包括一个大孔径的透镜，位于智能硬件传感器和样品之间。

3.如权利要求2所述的成像仪，其特征在于，该成像仪还包括二向色镜，其中，二向色镜用于反射光源的光，透射样品的发光，或者透射光源的光，反射样品的发光。

4.如权利要求2所述的成像仪，其特征在于，该成像仪还包括滤光片，滤光片位于光源和样品之间或样品和传感器之间，使光源的光先经过滤光片再激发样品，或者使样品发光经过滤光片再进入探测器，可以降低散射光干扰。

5.如权利要求2所述的成像仪，其特征在于，光路上还包括其它附加的零件，这些零件选自：夹具、反光灯罩、光源、狭缝、光阑、光栅、透镜、滤光片、棱镜、反光镜。

6.一种荧光分析方法，包括成像、比色的过程，其特征在于：

使用如权利要求1-5中任意一项所述的成像仪，

对待测样本和荧光比色卡进行荧光成像，通过比较样本与荧光色块在照片中的亮度就可以判定待测样本中荧光物质的含量或浓度；

其中，荧光比色卡由基底和荧光色块组成，荧光色块含有荧光物质，含量已知，可以作为荧光强度参考标准，一张荧光比色卡上荧光色块的形状和数量不限。

7.如权利要求6所述的荧光分析方法，用于荧光探针靶标的检测，

其特征在于，使用一种检测卡，该检测卡含有一块基底，基底上有检测区域，检测区域含有荧光探针，

其中，该探针与靶标物质反应后生成的荧光物质与荧光比色卡上荧光色块所含有的荧光物质相同或等效；

其中，等效荧光物质与待测物所含荧光物质不相同，但是二者荧光光谱相同或相似，因而，可以作为荧光强度及待测物荧光物质含量的参考标准；

检测过程为，在检测卡的检测区域加入待测样本，使样本与其中的荧光探针反应生成荧光物质，再将该检测卡和荧光比色卡置于荧光成像仪下拍照，比较待测区域和荧光色块的亮度，就可以判断靶标物质的含量。

8.如权利要求6所述的荧光检测方法，其特征在于，所使用的检测卡包含检测区域和荧光比色卡，这样的一个检测卡含有一块基底，基底上有荧光色块和检测区域。

9.如权利要求6所述的荧光分析方法，其特征在于，使用校准卡对视野区域误差进行校准，

其中，校准卡由基底和荧光色块组成，其中荧光色块中荧光物质的相对含量和浓度已知，并且荧光色块分布在视野的不同区域；

通过对这个校准卡进行成像拍照、分析，就可以获知视野中不同区域的荧光亮度与实际荧光物质含量的差异。

10.如权利要求6所述的荧光分析方法，其特征在于，采用校准物质对视野区域误差进行校准，其中校准物质分布在在荧光色块和检测区域中，校准物质在不同区域的相对浓度已知，因而校准物质的亮度可以反应视野区域误差；

作为校准物质的要求为：（1）不受检测条件影响，即不参与荧光检测反应，（2）其荧光光谱与待测荧光物质的荧光光谱范围分别位于红绿蓝中任意两个区域；

该方法所达到的效果为：在一次成像中就可以分别采集到待测物质和校准物质光强的信息，其中校准物质荧光的亮度代表视野区域误差。