CN108680757A - 一种检测蛋白质和dna相互作用的试剂盒与方法及应用 - Google Patents

一种检测蛋白质和dna相互作用的试剂盒与方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测蛋白质和DNA相互作用的试剂盒，其至少包括外源组蛋白抗原。还公开了上述试剂盒在检测少量蛋白质和DNA相互作用中的应用，所需样品量可低至1000个细胞。本发明还公开了一种检测蛋白质和DNA相互作用的方法及其应用。本发明提供的技术方案通过在少量起始样品中补加所要研究的与DNA相互作用的组蛋白相应的抗原以减少样品损失并提高免疫沉淀反应的效率。具有以下优点：1、所需最低样品量为1000个细胞，更加适用于少量来源样品的蛋白质和DNA相互作用的检测分析；2、ChIP实验不需要特定的试剂盒和实验设备，成本较低，具有较高普遍适用性。

Description

一种检测蛋白质和DNA相互作用的试剂盒与方法及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测蛋白质和DNA相互作用的试剂盒与方法及应用。
背景技术
蛋白质与DNA的相互作用在基因表达调控以及染色体的构成等过程中起到至关重要的作用，转录因子和特定DNA序列的结合是特定基因表达调控的重要机制，组蛋白的甲基化等表观遗传修饰对基因表达也具有非常重要的作用，因此研究蛋白质与DNA的相互作用能够更好的帮助人们理解复杂的生物学过程。染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是一种常用的研究蛋白质和DNA相互作用的技术，它是基于对特定蛋白质结合的DNA富集的原理，在此基础上，分别有ChIP-qPCR、ChIP-chip、ChIP-seq等针对不同研究目的技术。
虽然ChIP是一项研究蛋白质和DNA相互作用的强有力的研究方法，但是这种方法也具有自身的局限性，比如抗体的特异性问题、以及在甲醛交联固定时染色体上抗体结合表位的屏蔽，最重要的是该方法需要大量的起始材料，因此限制了其在来源少的珍贵样品上的应用，为了解决这个问题，基于少量样品的ChIP方法研究势在必行。
目前常用研究技术是在ChIP之前通过加入RNA和组蛋白共同作为载体从而增强少量样品ChIP的富集效果，这种方法是在免疫沉淀前加入20ug/ml组蛋白(M2505S；NewEngland Biolabs)和1ug/ml的人mRNA(Invitrogen)作为ChIP载体，此过程所使用的离心管为低吸附的EP管(13-698-794；Fisher Scientific)，其中抗体的用量为5ug。但由于RNA的加入在后续除去时会影响得到的ChIP-DNA的回收率，从而在一定程度上降低了ChIP的富集效果。
现有技术的主要缺点有两个：1、所需的最低样品起始量仍然是相对较多的细胞，仍不适用于少量来源样品的ChIP分析；2、实验过程涉及商品化试剂盒和全自动样品处理***，成本较高，不具有普遍适用性或通用性。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明要解决的技术问题是：1、降低所需样品起始量，使ChIP更加适用于少量来源样品的蛋白质和DNA相互作用的检测分析；2、不需要特定的试剂盒和实验设备即可完成ChIP实验，具有通用性。
本发明的技术方案如下：
本发明在第一方面提供了一种检测蛋白质和DNA相互作用的试剂盒，其至少包括外源组蛋白抗原。
在一个较优实施例中，上述外源组蛋白抗原为H3K4me3抗原。
优选地，上述试剂盒还包括蛋白酶K。
本发明在第二方面提供了上述试剂盒在检测少量蛋白质和DNA相互作用中的应用，所需样品量可低至1000个细胞。
本发明在第三方面提供了一种检测蛋白质和DNA相互作用的方法，包括以下步骤：
步骤1、对样品进行细胞固定、片段化处理；
步骤2、将特异性抗体与蛋白A+G包被的磁珠结合；
步骤3、在经步骤1处理后的样品中加入与上述特异性抗体对应的外源组蛋白抗原，混合均匀，再加入步骤2中结合了上述特异性抗体的磁珠进行反应；
步骤4、将样品从磁珠上洗脱，并进行解交联处理；
步骤5、纯化提取DNA样品；
步骤6、对上述DNA样品进行定性和/或定量分析。
优选地，上述步骤1中，采用甲醛交联进行细胞固定，采用超声破碎进行片段化处理。
优选地，上述步骤2中，特异性抗体为H3K4me3抗体。
优选地，上述步骤3中，外源组蛋白抗原为H3K4me3抗原。
优选地，上述步骤4中，加入蛋白酶K进行解交联处理。
本发明在第四方面提供了上述方法在检测少量蛋白质和DNA相互作用中的应用，所需样品量可低至1000个细胞。
本发明提供的技术方案通过在少量起始样品中补加所要研究的与DNA相互作用的组蛋白相应的抗原以减少样品损失并提高免疫沉淀反应的效率。具有以下优点：1、所需最低样品量为1000个细胞，更加适用于少量来源样品的蛋白质和DNA相互作用的检测分析；2、ChIP实验不需要特定的试剂盒和实验设备，成本较低，具有较高普遍适用性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了本发明较优实施例的实验流程图；
图2示出了本发明较优实施例中K562细胞片段化处理后的琼脂糖凝胶电泳图；
图3示出了本发明较优实施例中1000个细胞H3K4me3ChIP-qPCR富集倍数图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
在本实施例中，检测蛋白质和DNA相互作用的方法具体包括以下步骤：
1、将10cm皿培养的K562细胞用2mL PBS洗两遍；
2、甲醛交联：加入37％甲醛至5ml培养基中，使培养基甲醛浓度最终为1％，100rpm室温摇10min；
3、终止固定：加入2M甘氨酸溶液到交联缓冲液中，使其终浓度为0.125M，混匀，100rpm，室温摇5min；
4、收细胞：800rpm，离心3min，弃上清，用1ml 10％FBS的PBS洗两遍(每次800rpm离心3min)，用1ml 10％FBS的PBS重悬合并，取10ul测细胞浓度，结果为106个/ml，1100rpm离心3min，弃上清；
5、超声破碎：加入500ul FA裂解缓冲液(FA Lysis Buffer)到细胞中混匀，再加蛋白酶抑制剂PI(25x)20ul，吹匀，冰水浴超声，先用40％超声强度超2.5min，再用35％超声强度超声13.5min，总时间16min，30s“开”，50s“关”，置冰上，避光。用13000rpm，4℃离心10min，除去不溶物杂质，取20ul解交联跑胶，破碎效果如附图2所示；
6、梯度稀释法取总量1/1000的产物(～1000个细胞)，其中1/10做Input样本，保存-20℃至解交联，其余上清加至结合抗体的磁珠(第7步)中；
7、抗体与磁珠结合：取20ul磁珠(Magna ChIPTM Protein A+G MagneticBeads，millipore，16-663)(使用前混匀)加入1mL FA裂解缓冲液，上下颠倒若干次，于磁力架上再上下倒置若干次，吸去FA裂解缓冲液，再加入1mL FA裂解缓冲液，重复洗1次。加入1mL FA裂解缓冲液重悬磁珠，加入3ug H3K4me3抗体(abcam，ab8580)，在旋转混合仪4℃，40rpm反应2小时，用1mL FA裂解缓冲液洗磁珠两次，弃去上清；
8、样品与抗体结合：将6中样品加入3ug H3K4me3抗原(HistoneH3K4me3Trimethyl Peptide，epigentek，R-1022-100)，混匀，加FA裂解缓冲液补至500ul，加20ul PI(25X)，涡旋混匀，加入洗好的结合了抗体的磁珠中，再加500ul FA裂解缓冲液，上下倒置混匀，于混旋仪4℃，40rpm过夜；
9、解交联：关闭旋转仪，取出EP管，置于磁力架上，倒置若干次，弃FA裂解缓冲液，再加1ml FA裂解缓冲液洗一次。再依次分别用1ml高盐缓冲液(FA裂解缓冲液(高盐))、氯化锂缓冲液(即：LiCl清洗缓冲液)、TE缓冲液各洗2次，加入270ul洗脱缓冲液，混匀，于68℃孵育1300rpm，30min，取出EP管，置于磁力架上，来回倒置若干次，至澄清。将含有DNA的洗脱缓冲液转移至另一EP管，加入230ul TE缓冲液和3ul RNase A(Thermo fisher,EN0531)；取出Input样品，加80ul FA裂解缓冲液和90ul TE缓冲液，200ul洗脱缓冲液和3ul RNase A，与ChIP样品一起37℃孵育30min，两者各再加入3ul蛋白酶K(Thermo fisher,AM2546)，混匀，于65℃解交联6小时；
10、酚抽：样品各加入等体积的苯酚-氯仿混匀，13000rpm离心5min。取上清，各加2.5倍无水乙醇，10％NaAc(3M，PH5.2)，1％糖原(Thermo,R0561)，混匀，放-80℃，30min；
11、配平，13000rpm，4℃离心30min，弃上清，加入1ml 75％乙醇，13000rpm，4℃离心30min洗一次，弃上清，将离心管置于空气中5min晾干，加10mMTris-HCl(PH8.0)溶解DNA；
12、取10ul 10mM Tris-HCl(PH8.0)加入ChIP-DNA管中，混匀溶解后转移至另一管。再用10ul加入先前的ChIP-DNA管，再洗一次后转移至同一管后总体积为20ul；取20ul10mM Tris-HCl(PH8.0)加入Input管，溶解；
13、通过qPCR对得到的DNA样品进行富集验证(每管成分配比：10ul qPCR预混液(Kappa,KK4602)、8ul DNA(Input/ChIP)、2ul引物，共计20ul)；
14、ChIP-qPCR结果如附图3所示。
引物序列如下：
CDK1F CTTTAGAGGGAGGCTATGGGA(SEQ No.1)
CDK1R ACAGCCGACCTCGACTCAT(SEQ No.2)
GAPDH F CCCCTAGTCCCCAGAAACAG(SEQ No.3)
GAPDH R GCGAAAGGAAAGAAAGCGTC(SEQ No.4)
TRMT F TGCCAGGACACTTACCGAGC(SEQ No.5)
TRMT R GTGGAAGGAAGCGTGAGCCG(SEQ No.6)
control(sox2)F TTTGTTACATCCAAGATGACGG(SEQ No.7)
control(sox2)R CCACAAGAACTGCGGGCTAC(SEQ No.8)
本实施例中所使用的试剂配方如下：
本发明公开的技术方案不仅可以应用于少量样品的ChIP-qPCR分析，还可以将其应用于少量样品的ChIP-chip、ChIP-seq(Chromatin immunoprecipitation-sequencing)分析，即在少量样品起始时加入相应外源抗原进行ChIP，需要建库时加入外源DNA，从而减少ChIP和建库过程中样品的损失。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种检测蛋白质和DNA相互作用的试剂盒与方法及应用
<130> 2018
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctttagaggg aggctatggg a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagccgacc tcgactcat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccctagtcc ccagaaacag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgaaaggaa agaaagcgtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccaggaca cttaccgagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggaaggaa gcgtgagccg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttgttacat ccaagatgac gg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccacaagaac tgcgggctac 20

Claims (10)

1.一种检测蛋白质和DNA相互作用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括外源组蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述外源组蛋白抗原为H3K4me3抗原。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白酶K。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒在检测少量蛋白质和DNA相互作用中的应用，其特征在于，所需样品量低至1000个细胞。
5.一种检测蛋白质和DNA相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、对样品进行细胞固定、片段化处理；
步骤2、将特异性抗体与蛋白A+G包被的磁珠结合；
步骤3、在经步骤1处理后的样品中加入与所述特异性抗体对应的外源组蛋白抗原，混合均匀，再加入步骤2中结合了所述特异性抗体的所述磁珠进行反应；
步骤4、将样品从所述磁珠上洗脱，并进行解交联处理；
步骤5、纯化提取DNA样品；
步骤6、对所述DNA样品进行定性和/或定量分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，采用甲醛交联进行细胞固定，采用超声破碎进行片段化处理。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，所述特异性抗体为H3K4me3抗体。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，所述外源组蛋白抗原为H3K4me3抗原。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，加入蛋白酶K进行解交联处理。
10.根据权利要求5-9中任何一项所述的方法在检测少量蛋白质和DNA相互作用中的应用，其特征在于，所需样品量低至1000个细胞。
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