CN108676918A - 一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒，包括引物AF‑F1、引物AF‑R1、引物BB‑F1、引物BB‑R1、探针AF‑P1、探针BB‑P1，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控。本发明的试剂盒，可采用多个不同的荧光对多个不同的探针进行标记，能够同时对HPV6和HPV11型进行检测；能够用于宫颈脱落细胞的HPV检测；经过核酸提取和纯化后的检测过程不超过2小时。

Description

一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒。

背景技术

人类***瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，HPV的宿主为人类。HPV是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，DNA限制性内切酶图谱各异，核壳体蛋白质的抗原性不同，通过对人***瘤病毒克隆基因的DNA杂交试验及酶谱分析，至今已鉴定出100多种类型人***瘤病毒，每一型别都与体内特定感染部位和病变有关。所有HPV病毒的基因组结构相似，迄今已发现多种HPV类型，随着研究的深入，将会鉴定出更多HPV新的类型。人***瘤病毒(大约35种型别)可通过多种感染途径感染妇女生殖道，从而导致***，约20种与肿瘤相关。至少有10个类型与***有关(如6，11，16，18及33型，最常见6、11型)，而第11，16，18型，则是国外目前研究***、外阴癌甚至***癌的最热门的病毒因子，其长期感染与女性***的发生有关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与***及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。从高危亚型人***瘤病毒的持续感染到一般的***前病变并最终发展为***大约需要5-10年。因此，有针对地进行HR-HPV的检测对***的早期诊断具有重要意义。

目前，HPV分型方法有很多，常见的有细胞生物学检测方法和分子生物学技术方法，如杂交捕获实验(HC)、原位杂交技术(ISH)和PCR方法等。其中，PCR方法较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。由于单重PCR通量不高的局限性，一般在进行PCR反应后还需要做进一步实验才能鉴别HPV不同的亚型；而且，如样本中存在不同的的型HPV的混合感染，不同的HPV型有不同的扩增反应效率，导致某些型相对于其它型有不均衡的扩增，不均衡的扩增使反应平衡趋向于样品中的高拷贝型，消耗了PCR反应的组分，使拷贝数少的型不易被检测出。因此，本试剂盒主要在荧光定量PCR的平台上结合了一种多重荧光PCR技术，特异性的FAM标记的TaqMan探针对待检测样本进行HPV 6和11亚型的检测。PCR多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。其中，最常见的类型是两重反应。与单重PCR技术相比，多重PCR技术具有更高的通量、更低的样本用量和试剂用量以及检测更加快捷等明显的优点。

另外，荧光PCR技术的荧光探针现已发展成多种类型，如TaqMan MGB探针、Beacon探针等。Taq-Man探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。其中，TaqMan MGB探针的原理一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子MGB修饰基团，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记，可大大降低本底信号的强度，同时MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计的更短，既降低了合成成本，大大增加了探针的稳定性，也使得探针设计的成功率大为提高。该方法具有如下优点：(1)容易设计；(2)探针短；(3)提高配对与非配对模板间的Tm值差异；(4)高特异性和高准确性；(5)稳定性好；(6)结果重复性好等。但是目前荧光PCR技术在人类***瘤病毒的检测上还不够成熟，不能够实现高通量的测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种高通量的一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒，包括引物AF-F1、引物AF-R1、引物BB-F1、引物BB-R1、探针AF-P1、探针BB-P1，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，其中

引物AF-F1的序列5'-3'具体为：CAG GAT TCAGAG GAC GAG GAA GA；

引物AF-R1的序列5'-3'具体为：TGC AGT ACA TGT TTG TTT AGG TCA G；

引物BB-F1的序列5'-3'具体为：ACG CGC CAG ACC GTT ATT G；

引物BB-R1的序列5'-3'具体为：TTG GAG TCA AAG TCT CCA CG；

探针AF-P1的序列5'-3'具体为：FAM-TGC CAG GAA CAG TTG T-MGB；

探针BB-P1的序列5'-3'具体为：VIC TGG GCA TAT GAT AAT GAT-MGB。

试剂盒中还包括扩增预混液(AP mix)、探针引物预混液(PP mix)和阴、阳性质控。其中，扩增预混液(AP mix)包括PCR缓冲液、MgCl₂、甜菜碱、dNTPs、Taq酶等，探针引物预混液(PP mix)包括引物组合、探针组合等，阴性质控为TE缓冲液，阳性质控为HPV6和HPV11质粒。

HPV6质粒序列

AAATCCATTCCCTTTTGACAGAAATGGGAATGCAGTGTATGAACTGTCAAATGCAAACTGGAAATGTTTTTTTGAAAGACTGTCGTCAAGCCTAGACATTCAGGATTCAGAGGACGAGGAAGATGGAAGCAATAGCCAAGCGTTTAGATGCGTGCCAGGAACAGTTGTTAGAACTTTATGAAGAAAACAGTACTGACCTAAACAAACATGTACTGCATTGGAAATGCATAAGACATGAAAGTGTATTATTATATAAAGCAAAACAAATGGGCCTAAGCCACATAGGAATGCAAGTAGTGCCACCATTAAAGGTGTCC

HPV11质粒序列

GCCTCCTAAAATACAAAGTGGCGTAGCAGCCCTGTATTGGTTTAGGACAGGCATTTCAAATGCAAGTACAGTTATAGGGGAGGCGCCGGAATGGATAACGCGCCAGACCGTTATTGAACATAGTTTGGCTGACAGTCAATTTAAATTAACTGAAATGGTGCAGTGGGCATATGATAATGATATTTGTGAAGAAAGTGAGATAGCATTTGAATATGCACAGCGTGGAGACTTTGACTCCAATGCAAGGGCCTTTTTAAATAGTAATATGCAGGCTAAATATGTAAAAGATTGTGCAATTATGTGCAGACATTATAAACATGCAGAAATGAAAAAGATGTCTATTAAAC

本发明所达到的有益效果是：本发明的试剂盒，可采用多个不同的荧光对多个不同的探针进行标记，能够同时对HPV6和HPV11型进行检测；能够用于宫颈脱落细胞的HPV检测；经过核酸提取和纯化后的检测过程仅为70分钟。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明试剂盒检测时HPV6阳性样本的扩增曲线；

图2是本发明试剂盒检测时HPV11阳性样本的扩增曲线；

图3是本发明试剂盒检测时HPV6检测灵敏度(FAM通道)；

图4是本发明试剂盒检测时HPV11检测灵敏度(VIC通道)；

图5是是本发明试剂盒检测时阳性质控(PC)的扩增曲线。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒，包括引物AF-F1、引物AF-R1、引物BB-F1、引物BB-R1、探针AF-P1、探针BB-P1，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，1)、引物序列设计如表1所示：

表1.引物序列设计

引物名称	序列编号	序列5’-3’	Tm(℃)	反应管
					引物AF-F1	SEQ ID NO.1	cag gat tca gag gac gag gaa ga	57℃	B-PPmix
引物AF-R1	SEQ ID NO.2	tgc agt aca tgt ttg ttt agg tca g	54℃	B-PPmix
					引物BB-F1	SEQ ID NO.3	acg cgc cag acc gtt att g	53℃	B-PPmix
引物BB-R1	SEQ ID NO.4	ttg gag tca aag tct cca cg	52℃	B-PPmix
					探针AF-P1	SEQ ID NO.5	FAM-tgc cag gaa cag ttg t-MGB	61℃	B-PPmix
探针BB-P1	SEQ ID NO.6	VIC-tgg gca tat gat aat gat-MGB	56℃	B-PPmix

2)、样本制备：

适用样本为宫颈刷取样的宫颈脱落细胞，用适当的方法提取宫颈脱落细胞DNA，可选用含有非离子型去垢剂的细胞裂解液，或柱纯化试剂盒，具体提取方式请参照提取试剂盒说明书，提取的DNA体积应在50ul左右，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度建议在2.5ug/ml-250ug/ml。若浓度低于2.5ug/ml，建议用酒精沉淀浓缩提取的DNA，使之浓度符合要求。若浓度高于250ug/ml，应用TE予以适当稀释至规定的浓度范围。

3)、仪器

ABI7500、nanodrop2000、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱。

4)、PCR扩增体系组分

PCR扩增体系组分，见表2所示。

表2：PCR扩增体系组分

5)、检测过程

将2ul提取的样本DNA小心加入至对应的PCR反应孔中，封上荧光定量PCR级别的封闭膜或盖上管盖，以2000转/分，离心30秒，以确保反应混合液全部离入管底。为了检验实验操作是否成功以及结果判断，在每次实验时，需设置PC和NC对照。

将PCR管或PCR 96孔板按顺序放入PCR仪，根据PCR仪设定表3中的反应程序：

表3PCR扩增程序

表3PCR扩增程序

注：阶段3的退火、延伸及荧光检测程序设置中：荧光检测通道：FAM和VIC。

运行PCR反应程序，保存文件。

6)、结果判定

(1)质控标准

①阳性对照的测定结果为阳性，且Ct≤39.00。

②阴性对照的测定结果为阴性，Ct无数值或Ct≥42.00。

③扩增曲线应有明显的指数期；基线和指数期应有明显清晰的拐点。

④应同时满足上述3项条件，否则试验无效。

(2)结果判断

①Ct无数值或Ct≥42.00的标本为阴性。

②Ct＜42.00，但扩增曲线无明显的指数期或基线和指数期无明显清晰拐点的标本为阴性。

③Ct≤39.00，且扩增曲线有明显的指数期，基线和指数期有明显清晰拐点的标本为阳性。

④39.00＜Ct＜42.00的标本建议复测，复测结果Ct＜39.00为阳性，否则均为阴性。

试剂盒主要在荧光定量PCR的平台上结合了多重荧光PCR技术、特异性的FAM、VIC标记的TaqMan MGB探针可同时对待检测样本进行HPV6型和HPV11型的检测。

图1是本发明试剂盒检测时HPV6阳性样本的扩增曲线；

从图1可以看出，本发明试剂盒检测HPV6阳性样本时，在FAM通道有典型的扩增曲线，Ct值＜31，无非特异性扩增，且准确度达到0.5％；

图2是本发明试剂盒检测时HPV11阳性样本的扩增曲线；

从图2可以看出，本发明试剂盒检测HPV11阳性样本时，在VIC通道有典型的扩增曲线，Ct值＜31，无非特异性扩增，且准确度达到0.5％；

图3是本发明试剂盒检测时HPV6检测灵敏度(FAM通道)；

从图3可以看出，将HPV6型突变质粒稀释为1000拷贝/ul、250拷贝/ul、125拷贝/ul，加样2ul，梯度检测，FAM通道有典型的扩增曲线，Ct值均＜34，无非特异性扩增。

图4是本发明试剂盒检测时HPV11检测灵敏度(VIC通道)；

从图4可以看出，将HPV11型突变质粒稀释为1000拷贝/ul、250拷贝/ul、125拷贝/ul，加样2ul，梯度检测，VIC通道有典型的扩增曲线，Ct值均＜34，无非特异性扩增。

图5是是本发明试剂盒检测时阳性质控(PC)的扩增曲线。

阳性质控(PC)在ABI7500的FAM、VIC通道下应均有典型的扩增曲线，且FAM、VIC通道的Ct值均＜32，无非特异性扩增。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 无锡正则精准医学检验有限公司

<120> 一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒

<141> 2018-06-06

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

<210> 7

<211> 317

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

<210> 8

<211> 347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Claims (3)

1.一种人***瘤病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括引物AF-F1、引物AF-R1、引物BB-F1、引物BB-R1、探针AF-P1、探针BB-P1，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，其中

引物AF-F1的序列5'-3'具体如SEQ ID No.1所示，

引物AF-R1的序列5'-3'具体如SEQ ID No.2所示，

引物BB-F1的序列5'-3'具体如SEQ ID No.3所示，

引物BB-R1的序列5'-3'具体如SEQ ID No.4所示，

探针AF-P1的序列5'-3'具体如SEQ ID No.5所示，

探针BB-P1的序列5'-3'具体如SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控为HPV6质粒和HPV11质粒，其中，HPV6质粒的序列如SEQ ID No.7所示，HPV11质粒的序列如SEQ ID No.8所示。

3.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，提取的样本DNA荧光定量反应的条件为95℃预变性处理2min；95℃变性10s，62℃退火40s，45个循环。