CN108676863B - 高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法 - Google Patents

高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法 Download PDF

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Abstract

本发明高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法属于小麦作为食品引起乳糜泻过敏的致敏蛋白的DNA鉴定技术。用导致乳糜泻的小麦谷蛋白和醇溶蛋白DNA序列设计出第三组引物，将待测小麦面粉提取基因组DNA，并用这三组引物进行PCR扩增小麦致敏原扩增DNA产物；把扩增DNA产物用高通量测序仪进行测序，获得谷蛋白醇和溶蛋白基因DNA片段序列；用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将该两种致敏蛋白的DNA片段序列分别与已知的多种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段比较，得到敏原的DNA片段的个数和位置。优点：能一次性在小麦样品中，定量检测出多种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片的数量和位置，所以本方法能作为小麦导致乳糜泻强弱的评价方法的检测技术手段。

Description

高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法
技术领域
本发明属于DNA鉴定技术，特别是小麦作为食品引起乳糜泻过敏的致敏蛋白的DNA鉴定技术。
背景技术
乳糜泻(Celiac disease，CD)又称小麦麸质过敏，目前认为是由于患者对小麦麸质中 的谷醇溶蛋白不能耐受所导致的小肠吸收不良综合症。症状为腹泻、胃食管反流、恶心、 呕吐、贫血等，是一类由小麦引起的较严重的过敏疾病，由人的自身抗体IgG和IgA介导自身免疫病，人类白细胞抗原(Human leucocyte antigen，HLA)为DQ2或者DQ8基因 型的为易感人群，在北美、北欧、澳大利亚发病率较高，目前国内普遍漏诊。乳糜泻主要 是由小麦、大麦等麦类作物的储藏蛋白诱发。在这些蛋白质中的一些多肽片段称为表位 (Epitope)或者抗原决定簇或小麦致敏原蛋白肽的DNA短片。这些表位常常出现在小麦 的醇溶蛋白和谷蛋白亚基中，同时，这些表位常常位于脯氨酸和谷氨酰胺富集的区域，这 样的区域难以被消化。大量研究已证实谷醇溶蛋白(prolamin；prolamine)可能是乳糜泻的 致病因素，进食麦类(小麦、大麦、黑麦)食物症状加重(活动期)，忌麦类食物症状缓 解，目前最有效的治疗是严格的无谷醇溶蛋白饮食。
目前大量研究已证实，乳糜泻的产生与小麦蛋白中的谷醇溶蛋白有关。谷醇溶蛋白包 括谷蛋白和醇溶蛋白。并且已证实乳糜泻的产生与高分子量谷蛋白、低分子量谷蛋白、醇 溶蛋白这三类蛋白直接相关。在麦类产品中检测这三类蛋白就是判定该麦类产品是否有致 乳糜泻致敏原的依据。
目前，国内对食品是否含小麦致敏原的检测是检测是否有小麦成分来代替对小麦致敏 原的检测，这种检测的结果是使对小麦致敏原的人不能到吃小麦，这使大量的无致敏原小 麦失去了价值，所以为了使小麦致敏人群吃到无致敏原小麦，检测小麦致敏原，把无小麦 致敏原的小麦提供给小麦致敏人群是非常重要的。
目前检测小麦致敏原，国外对小麦致敏原蛋白肽的DNA短片检测研究较国内深入，但也只能在一次试验中，单一检测某一种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片的有无；
即现有技术不能检测这种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片在小麦面粉致敏原蛋白长链 中的位置和数量；
即现有技术更不能在一次试验中，检测多出多种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片在小 麦面粉致敏原蛋白长链中的位置和数量。
现有技术己知小麦面粉致敏原有17种蛋白肽，也称作17种蛋白短肽乳糜泻致敏原； 现有技术要检测小麦面粉致敏原，是对被检测小麦进行17次检测实验，其17次检测实验 的结论只能获得：被检测小麦是否含有这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原来评价该小麦的致 敏性。
由于现有技术只能获得被检测小麦是否含有这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原，则不知 到一种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片在小麦致敏原蛋白的DNA长链中有多少，所以现 有技术对小麦致敏性评价标准中，没有用同一种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片数量的多 少来评价小麦致敏性强弱的评价方法。
发明内容
本发明的目的是为增加一种小麦导致乳糜泻致敏性强弱的评价方法，即用小麦致敏原 蛋白肽的DNA短片数量的多少来评价乳糜泻的小麦致敏性强弱的评价方法，提供一种一 次性在小麦样品中，定量检测出小麦多种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段在样品小麦致敏原蛋白的DNA长链中数量的方法。
本发明所述的乳糜泻致敏原为小麦谷醇溶蛋白，小麦谷醇溶蛋白中主要致敏物是谷蛋 白和醇溶蛋白。
本发明利用NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)谷蛋白和醇溶蛋白编码基因 序列，进行序列多重比对，依据小麦谷蛋白和醇溶蛋白保守区段序列特征，设计谷蛋白和 醇溶蛋白检测引物，送至能进行DNA合成的公司，合成下面三组用于谷蛋白和醇溶蛋白 DNA扩增用的引物，以便用这三组引物对小麦面粉材料中谷蛋白和醇溶蛋白编码基因进 行扩增，使其有足够数量的谷蛋白和醇溶蛋白编码基因用于高通量测序仪进行谷蛋白和醇 溶蛋白编码基因测序。
高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法，用谷蛋白基因DNA测序设计 出第一组引物和第二组引物，用醇溶蛋白DNA测序设计出第三组引物；并合成第一组引物、第二组引物和第三组引物；
将待测小麦面粉提取基因组DNA，用上述的三组引物和小麦面粉提取的基因组DNA在同一个反应体系中进行PCR扩增DNA，获得含有小麦致敏原谷蛋白基因DNA片段和 醇溶蛋白DNA片段的小麦致敏原扩增DNA产物；
把上述获的小麦致敏原扩增DNA产物用高通量测序仪进行测序，测出这引物所扩增 的谷蛋白基因DNA片段序列，和测出这引物所扩增的醇溶蛋白DNA片段序列；
由于现有技术己知小麦面粉中的乳糜泻致敏原主要是由已确定的17种蛋白短肽导致 的，这17种蛋白短氨基酸编码序例是公知的；则检测这17种蛋白肽，可以转换为检测这 17种蛋白肽氨基酸对应的DNA片段的个数和位置，即可以转换为检测这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置。
用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的 DNA片段序列分别与上述测序得到的谷蛋白基因DNA片段序列进行多次比对，找出谷蛋白基因DNA片段序列中这多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位 置：
用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的 DNA片段序列分别与上述测序得到的醇溶蛋白DNA片段序列进行多次比对，找出醇溶蛋白DNA片段序列中这多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置；
上述方法中使用的三种引物是：
第一组引物：
PF2：5′-TACACCCACAACACCGAGCA-3′；
PF1：5′-GTAGCTAAGCGGYTRGTCTTTG-3′；
PR1：5′-CTATCACTGGCTRGCCGACAATGCG-3′；
第二组引物：
LMWi-F：5′-CGCTTTCTTGTTTACGGCTG-3′；
LMWi-R：5′-GATCATTGACATCCACACAAT-3′；
LMWs-F：5′-CCAACTAGTTAACACTARTCCACC-3′；
LMWs-R：5′-TTTCAACTAGTTTGGGCGGGTC-3′：
LMWm-F：5′-TGAAAGACCTTCCTCGTCTTTGC-3；
LMWm-R：5′-ACTGTAGGCACCAACTCCGGTGC-3′；
第三组引物：
QP-alphaF：5′-CTGCAATACAAATCCAYCATG-3′；
QP-alphaR：5′-ATTCCTTCTCAGTTRGTACCR-3′；
Omega-F2：5′-AAGATGACCTTCCTCATCTTTG-3′；
Omega-R2：5′-ACATTGGCCACCGATGCTTGT-3′；
gamma-F1：5′-AATTTAGTTAACGCAAATCCACYATG-3′；
gamma-R1：5′-GTGAAATCAGCTAAGCAACGATG-3′；
gamma-F2：5′-TTCCACACAACTAGAGCACAAG-3′；
gamma-R2：5′-AGTCTACATCTATTGGTGCATCAG-3′；
所述三组引物中的字母Y为碱基C或T，字母R为碱基A或G。
本发明中涉及的几个具体操作方法如下：
1、小麦面粉基因组DNA提取：采用SDS法提取小面粉的基因组DNA。
2、用PCR的DNA扩增方法，将含小麦致敏原片段的小麦谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA片段扩增。
3、将扩增小麦谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA片段回收与纯化：
4、对扩增片段的高通量测序：使用Illumina高通量测序平台的DNA测序的通用平台，对 已扩增的小麦谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA序列进行测序，得到小麦谷蛋白和醇溶蛋白编 码基因序列的DNA序列信息。
5、用计算机进行数据对比的处理方法，将这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段与 小麦谷蛋白和醇溶蛋白编码基因的DNA序列对比，计算机进行数据对比，获得这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段在小麦谷蛋白和醇溶蛋白编码基因的DNA序列中的 位置和数量。17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段与小麦谷蛋白和醇溶蛋白编码基因 的DNA序列对比后，这些片段在测序DNA序列中出现的次数和具***置就可以准确确 定。这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段在样品小麦致敏原蛋白的DNA长链中的 数量多少就是样品小麦致敏性强弱的评价值，即数量越多致敏性越强，数量越少致敏性越 弱。
本发明的优点：由于本发明能提供一次性在小麦样品中，定量检测出多种小麦致敏原 蛋白肽的DNA短片在样品小麦致敏原蛋白的DNA长链中数量的方法，所以本方法能作为小麦导致乳糜泻强弱的评价方法的检测技术手段，即能实现简单、快速的检测过程，进行用小麦致敏原蛋白肽的DNA短片数量的多少来评价乳糜泻的小麦致敏性强弱的评价。
本发明能对于一个小麦样品，只需要作一次DNA提取，把三个引物合在一起对小麦样品中的乳糜泻致敏原DNA作一次PCR的DNA扩增，一次把小麦致敏原扩增DNA产 物用高通量测序仪进行测序，就能同时测出这引物所扩增的谷蛋白基因DNA片段序列， 和测出这引物所扩增的醇溶蛋白DNA片段序列；用两种DNA序列中有相同区段的比对 算法，将17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的谷蛋白和 醇溶蛋白基因DNA片段序列进行17次比对，找出谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA片段序列 中这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置。即实现了提供在一次性定 量检测17种蛋白短肽乳糜泻致敏原DNA在小麦样品中数量的方法。
具体实施方式
实施例1、高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法
高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法，用谷蛋白基因DNA序列设计 出第一组引物和第二组引物，用醇溶蛋白DNA序列设计出第三组引物；并合成第一组引物、第二组引物和第三组引物；
将待测小麦面粉提取基因组DNA，用上述的三组引物和小麦面粉提取的基因组DNA在同一个反应体系中进行PCR扩增DNA，获得含有小麦致敏原谷蛋白基因DNA片段和 醇溶蛋白DNA片段的小麦致敏原扩增DNA产物；
把上述获的小麦致敏原扩增DNA产物用高通量测序仪进行测序，测出用引物所扩增 的谷蛋白基因DNA片段序列，和测出这引物所扩增的醇溶蛋白DNA片段序列；
用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将17种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的谷蛋白基因DNA片段序列进行17次比对，找出 谷蛋白基因DNA片段序列中这17种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和 位置；
用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将17种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的醇溶蛋白DNA片段序列进行17次比对，找出醇 溶蛋白DNA片段序列中这17种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位 置：
上述方法中使用的三种引物是：
第一组引物：
PF2：5′-TACACCCACAACACCGAGCA-3′；
PF1：5′-GTAGCTAAGCGGYTRGTCTTTG-3′；
PR1：5′-CTATCACTGGCTRGCCGACAATGCG-3′；
第二组引物：
LMWi-F：5′-CGCTTTCTTGTTTACGGCTG-3′；
LMWi-R：5′-GATCATTGACATCCACACAAT-3′；
LMWs-F：5′-CCAACTAGTTAACACTARTCCACC-3′；
LMWs-R：5′-TTTCAACTAGTTTGGGCGGGTC-3′；
LMWm-F：5′-TGAAAGACCTTCCTCGTCTTTGC-3；
LMWm-R：5′-ACTGTAGGCACCAACTCCGGTGC-3′；
第三组引物：
QP-alphaF：5′-CTGCAATACAAATCCAYCATG-3′；
QP-alphaR：5′-ATTCCTTCTCAGTTRGTACCR-3′；
Omega-F2：5′-AAGATGACCTTCCTCATCTTTG-3′；
Omega-R2：5′-ACATTGGCCACCGATGCTTGT-3′；
gamma-F1：5′-AATTTAGTTAACGCAAATCCACYATG-3′；
gamma-R1：5′-GTGAAATCAGCTAAGCAACGATG-3′；
gamma-F2：5′-TTCCACACAACTAGAGCACAAG-3′；
gamma-R2：5′-AGTCTACATCTATTGGTGCATCAG-3′；
所述三组引物中的字母Y为碱基C或T，字母R为碱基A或G；
本发明中涉及的几个具体操作方法如下：
1、小麦面粉基因组DNA提取：采用SDS法提取小面粉的基因组DNA。
2、用PCR的DNA扩增方法，将含小麦致敏原片段的小麦谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA片段扩增。
PCR引物扩增：选用常规PCR仪如eppendorf或者ABI；
PCR产物检测：琼脂糖凝胶电泳仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、荧光定量PCR。
3、将扩增小麦谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA片段回收与纯化：
(1)电泳结束后在紫外线下快速将目的条带用锋利的小刀小心切下，尽量切除不含DNA 的胶块。
(2)将切下的目的DNA条带放入干净的离心管中，称取重量。
(3)用omega胶回收试剂盒对该目的DNA进行回收。
(4)回收完成后，收集DNA。-20℃保存。
4、对扩增片段的高通量测序：使用Illumina高通量测序平台的DNA测序的通用平台，对 已扩增的小麦谷蛋白和醇溶蛋白基因DNA序列进行测序，得到小麦谷蛋白和醇溶蛋白编 码基因序列的DNA序列信息。
使用Illumina高通量测序平台的DNA测序的通用平台，对已扩增的小麦谷蛋白和醇 溶蛋白基因DNA序列进行测序的具体步骤如下：
(1)文库构建：采用Illumina平台指定的官方试剂盒进行文库的构建，以确保高质量数 据的产出。
(2)文库检测：文库质量检测包括文库浓度检测、***片段大小检测、文库摩尔浓度精 确检测。文库检测主要包括3种方法：
(2-1)Qubit 2.0对文库浓度进行初步定量；
(2-2)Agilent 2100检测文库DNA片段的完整性及***片段大小；
(2-3)Q-PCR方法对文库有效浓度进行精确定量；
(3)上机测序：文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库 pooling至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina高通量测序平台(HiSeq/MiSeq)进行测序。
5、用计算机进行数据对比的处理方法，将这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段与 小麦谷蛋白和醇溶蛋白编码基因的DNA序列对比，计算机进行数据对比，获得这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段在小麦谷蛋白和醇溶蛋白编码基因的DNA序列中的 位置和数量。17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段与小麦谷蛋白和醇溶蛋白编码基因 的DNA序列对比后，这些片段在测序DNA序列中出现的次数和具***置就可以准确确 定。
这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段对应的氨基酸序列是：
(1)第1种致敏原的氨基酸序列是：FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ
(2)第2种致敏原的氨基酸序列是：FSQPQQQFPQPQ
(3)第3种致敏原的氨基酸序列是：LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF
(4)第4种致敏原的氨基酸序列是：LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ
(5)第5种致敏原的氨基酸序列是：PQPELPYPQPELPY
(6)第6种致敏原的氨基酸序列是：PQPQLPYPQPQLP
(7)第7种致敏原的氨基酸序列是：QLQPFPQPELPYPQPQS
(8)第8种致敏原的氨基酸序列是：QQFHQQQ
(9)第9种致敏原的氨基酸序列是：QQFPQQQ
(10)第10种致敏原的氨基酸序列是：QQIPQQQ
(11)第11种致敏原的氨基酸序列是：QQLPQQQ
(12)第12种致敏原的氨基酸序列是：QQSGQGQ
(13)第13种致敏原的氨基酸序列是：QQSPEQQ
(14)第14种致敏原的氨基酸序列是：QQSPQQQ
(15)第15种致敏原的氨基酸序列是：QQYPQQQ
(16)第16种致敏原的氨基酸序列是：QSPEQQQ
(17)第17种致敏原的氨基酸序列是：YQQYPQQ。
由于这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段对应的17种致敏原氨基酸序列是之间是唯一对应的，即一个致敏原氨基酸序列对应只有一种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA 片段，并且这17种致敏原氨基酸序列更易在科技文献中查找，所以本发明仅公开这17种 致敏原氨基酸序列，也就等于公开了这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段。
6、举例一组实际测实小麦谷醇溶蛋白乳糜泻抗原中的17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA 片段，如下表：下表是通过上述第5步骤，一项实验一次性具体测实了15种小麦面粉中谷 蛋白和醇溶蛋白中，共有的17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段个数数量。
Figure BSA0000164254080000081
Figure BSA0000164254080000091
上面表中“合计”的数字就是这17种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段在样品小麦致敏原蛋白的DNA长链中的数量，这个“合计”的数字就是样品小麦致敏性强弱的评 价值，即“合计”的数字越大致敏性越强，“合计”的数字越小致敏性越弱。

Claims (1)

1.高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法，用谷蛋白基因DNA序列设计出第一组引物和第二组引物，用醇溶蛋白DNA序列设计出第三组引物；并合成第一组引物、第二组引物和第三组引物；
提取待测小麦面粉的基因组DNA，用上述的三组引物和小麦面粉提取的基因组DNA在同一个反应体系中进行PCR扩增DNA，获得含有小麦致敏原谷蛋白基因DNA片段和醇溶蛋白DNA片段的小麦致敏原扩增DNA产物；
把上述获得的小麦致敏原扩增DNA产物用高通量测序仪进行测序，测出用引物所扩增的谷蛋白基因DNA片段序列，和测出引物所扩增的醇溶蛋白DNA片段序列；
用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的谷蛋白基因DNA片段序列进行多次比对，找出谷蛋白基因DNA片段序列中这多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置；
用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的醇溶蛋白DNA片段序列进行多次比对，找出醇溶蛋白DNA片段序列中这多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置；
上述方法中使用的三组引物是：
第一组引物：
PF2：5′-TACACCCACAACACCGAGCA-3′；
PF1：5′-GTAGCTAAGCGGYTRGTCTTTG-3′；
PR1：5′-CTATCACTGGCTRGCCGACAATGCG-3′；
第二组引物：
LMWi-F：5′-CGCTTTCTTGTTTACGGCTG-3′；
LMWi-R：5′-GATCATTGACATCCACACAAT-3′；
LMWs-F：5′-CCAACTAGTTAACACTARTCCACC-3′；
LMWs-R：5′-TTTCAACTAGTTTGGGCGGGTC-3′；
LMWm-F：5′-TGAAAGACCTTCCTCGTCTTTGC-3；
LMWm-R：5′-ACTGTAGGCACCAACTCCGGTGC-3′；
第三组引物：
QP-alphaF：5′-CTGCAATACAAATCCAYCATG-3′；
QP-alphaR：5′-ATTCCTTCTCAGTTRGTACCR-3′；
Omega-F2：5′-AAGATGACCTTCCTCATCTTTG-3′；
Omega-R2：5′-ACATTGGCCACCGATGCTTGT-3′；
gamma-F1：5′-AATTTAGTTAACGCAAATCCACYATG-3′；
gamma-R1：5′-GTGAAATCAGCTAAGCAACGATG-3′；
gamma-F2：5′-TTCCACACAACTAGAGCACAAG-3′；
gamma-R2：5′-AGTCTACATCTATTGGTGCATCAG-3′；
所述三组引物中的字母Y为碱基C或T，字母R为碱基A或G；
所述多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段对应的氨基酸序列如下：
(1)FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ；
(2)FSQPQQQFPQPQ；
(3)LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF；
(4)LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ；
(5)PQPELPYPQPELPY；
(6)PQPQLPYPQPQLP；
(7)QLQPFPQPELPYPQPQS；
(8)QQFHQQQ；
(9)QQFPQQQ；
(10)QQIPQQQ；
(11)QQLPQQQ；
(12)QQSGQGQ；
(13)QQSPEQQ；
(14)QQSPQQQ；
(15)QQYPQQQ；
(16)QSPEQQQ；
(17)YQQYPQQ。
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