CN108676847A - 大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒 - Google Patents

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CN108676847A CN201810403576.0A CN201810403576A CN108676847A CN 108676847 A CN108676847 A CN 108676847A CN 201810403576 A CN201810403576 A CN 201810403576A CN 108676847 A CN108676847 A CN 108676847A
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杨骁�
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Shenzhen Human Body Code Gene Technology Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明提供了一种大片段区域基因组的捕获探针的制备方法，其包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将混合物破碎成规定片段；在规定片段的两端接上含有RNA聚合酶识别序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。在本发明中，采用将待捕获区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现了更高的灵敏度。

Description

大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物样品的制备和处理，更具体而言，涉及一种大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒。
背景技术
高通量测序技术自2005年诞生以来，展示了广阔的应用前景。通过测序科学家可以看到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。而在很多研究中，并不需要对全基因组进行测序，全基因组测序数据要求大，并非适合所有应用领域。因此在生化方法领域，产生了很多靶区域测序的捕获方法，这其中主要以探针捕获和多重PCR两种方法为主。探针捕获适合制作长而大的基因组区域，而多重PCR适合制作小区域。
在探针捕获领域，已经开发了有很多制备探针的方法。典型地，以罗氏公司的芯片捕获DNA探针合成以及安捷伦公司的RNA探针合成为主。DNA探针的刚性强，探针对应区域如果有大片段的***或缺失则较难捕获下来。虽然短片段DNA探针的化学合成成本很低，但随着片段长度的增加，化学合成方法的成本会显著增加。安捷伦开创的RNA杂交捕获探针是长度统一的120mer的单一靶标特异性RNA探针，但定制性捕获价格较高。
专利文献1(公开号为105506035A)公开了一种RNA探针制备的方法。具体而言，在专利文献1中，该方法以所述多重DNA片段为模板，加入RNA聚合酶和带有生物素或荧光标记的biotin-dUTP进行反应，将UTP参入产物，纯化后得到RNA探针。最终得到的RNA探针是100-500mer长度的RNA探针。然而，这些RNA探针中部分探针长度过长，在过量的环境下容易自我退火形成二级结构，使得探针在使用时结合效率降低。然而，在上述专利文献中，需要扩增产物构建载体，然后再用构建的克隆载体为对象，进行基因探针制备，不适合大量区域的捕获。
此外，也有一些文献公开了其他基因探针制备的方法，包括如下几种：(1)在PCR后直接加接头，也是小区域片段，且并没有将转录后残留的DNA去除；(2)需要合成DNA探针，因此合成成本会较高，而且制备单链时需要单向扩增，这种扩增方法属于线性扩增，效率通常较差；(3)制备单链需要经过多次试验后外切酶水解，步骤较多，会产生一定的偏差，同时酶效率也会影响探针的制备质量。
发明内容
本发明是鉴于上述现有的状况而完成的，其目的在于提供一种能够在使用探针时改善结合效率的大片段区域基因组捕获探针的制备方法。
为此，本发明的一方面提供了一种大片段区域基因组捕获探针的制备方法，其包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将所述混合物破碎成规定片段；在所述规定片段的两端接上含有RNA聚合酶识别序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的所述文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将所述RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。
在本发明的一方面中，采用将待捕获大片段区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现了更高的灵敏度。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，所述RNA聚合酶可识别启动子序列包括T7启动子序列。在这种情况下，T7RNA启动子能够高效率的促使RNA聚合酶转录RNA。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，所述待捕获基因组的长度为200bp-10kb。通过将待捕获基因组的长度控制在适当的长度范围，由此能够更加容易地得到期望长度的基因探针。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，所述混合物由PCR产物按照等分子量混合而成。在这种情况下，能够更加容易地调配混合物的成分比例。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，所述规定片段为150bp-300bp的基因片段。在这种情况下，能够控制后续所形成的基因探针的长度，例如为150-300mer。这个上述长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高，由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现更高的灵敏度。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库的步骤包括：使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对所述规定片段进行加A处理，形成中间片段；使用DNA连接酶将所述中间片段接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，形成接头片段；并且根据接头序列设计接头引物对所述接头片段进行PCR扩增以构建文库，在所述PCR扩增中使用的dNTP包含biotin-dUTP，且biotin-dUTP与dTTP比率(biotin-dUTP:dTTP)为1:1～5:1。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库的步骤包括：使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对所述规定片段进行加A处理，形成中间片段；用DNA连接酶将所述中间片段接上含有T7RNA聚合酶识别序列的接头；并且使用试剂盒进行文库构建。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，所述DNA消化酶为USER酶。
另外，在本发明的一方面所涉及的制备方法中，所述DNA消化酶为脱氧核糖核酸酶(DNaseI)。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，其包括根据权利要求1至9中的任一项所述的制备方法所制备的基因探针。该试剂盒可以用于大片段基因组的捕获。
根据本发明，能够提供一种能够在使用探针时改善结合效率的大片段区域基因组捕获探针的制备方法及试剂盒。
附图说明
图1是示出了本发明的实施方式所涉及的大片段基因组捕获探针的制备方法的流程图。
图2是示出了以大片段基因组为模板的RNA探针的制备过程的流程图。
具体实施方式
以下，参考附图，详细地说明本发明的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
图1是示出了本发明的实施方式所涉及的大片段基因组捕获探针的制备方法的流程图。图2是示出了以大片段基因组为模板的RNA探针的制备过程的流程图。
本实施方式所涉及的大片段区域基因组捕获探针的制备方法，包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增(步骤S10)；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将混合物破碎成规定片段(步骤S20)；在规定片段的两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库(步骤S30)；使用RNA聚合酶将所得到的文库中的片段逆转录成RNA产物(步骤S40)；加入DNA消化酶，将RNA产物中的DNA链消化(步骤S50)；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针(步骤S60)。
在本实施方式所涉及的制备方法中，采用将待捕获大片段区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使得使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，既可以捕获单碱基突变，又可以捕获***或缺失突变，更少地丢失目标序列，实现了更高的灵敏度。
在步骤S10中，设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增。在本实施方式中，PCR引物没有特别限制，可以采用常规PCR引物。
另外，在步骤S10中，待捕获基因组的长度可以为200bp-10kb。在这种情况下，通过将待捕获基因组的长度控制在适当的长度范围，由此能够更加容易地得到期望长度的基因探针。
另外，在本实施方式中，PCR反应扩增可以采用常规的PCR反应，PCR反应通常包括变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。具体而言，首先，进行模板DNA的变性，模板DNA经加热至例如93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；接着，模板DNA与引物的退火(复性)，模板DNA经加热变性成单链后，温度降至例如55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；然后，进行引物的延伸，也即DNA模板引物结合物在DNA聚合酶的作用下，例如以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
接着，在步骤S20中，将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将混合物破碎成规定片段。这里，由PCR产物混合而成的混合物可以由PCR产物按照等分子量混合而成。在这种情况下，能够更加容易地调配混合物的成分比例。
在一些示例中，该规定片段可以为150bp-300bp的基因片段。在这种情况下，能够控制后续所形成的基因探针的长度，例如为150-300mer。这个上述长度范围的RNA不易自我退火，使用探针时结合效率较高，由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现更高的灵敏度。
在步骤S30中，在规定片段的两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库。具体而言，步骤S30可以包括：使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对规定片段进行加A处理，形成中间片段(步骤S31)；使用DNA连接酶将中间片段接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，形成接头片段(步骤S32)；并且根据接头序列设计接头引物对接头片段进行PCR扩增以构建文库，在PCR扩增中使用的dNTP包含biotin-dUTP，且biotin-dUTP与dTTP比率(biotin-dUTP:dTTP)为1:1～5:1(步骤S33)。这里，DNA消化酶可以为商用市售的USER酶，也可以由实验室制成，例如通过提纯方法制成。由于USER酶是比较容易获取的酶，因此，能够便于DNA消化酶的供应。
在一些示例中，在接头片段中，正向接头序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，反向接头序列为5'-CCCTATAGTGAGCATGTCAG-3'。
另外，作为另一种示例，在步骤S30中，步骤S33也可以使用以下步骤来替代，也即：使用试剂盒进行文库构建(步骤S33A)。在这种情况下，同样能够完成文库构建。这里，试剂盒可以使用商用的试剂盒例如市售的诺维赞DNA文库构建试剂盒(ND604)。DNA消化酶可以为脱氧核糖核酸酶(DNaseI)。
然后，在步骤S40中，使用RNA聚合酶将所得到的文库中的片段转录成RNA产物。在步骤S40中，RNA聚合酶可识别启动子序列可以包括T7启动子序列。众所周知，由于T7启动子序列能够专门催化5'至3'方向的RNA形成过程，具有高度启动子专一性，因此能够更加有效地促进文库中的片段逆转录成所需的RNA产物。
在步骤S50中，加入DNA消化酶，将RNA产物中的DNA链消化(步骤S50)。最后，在步骤S60中，消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。在步骤S60中，纯化处理可以采用乙醇沉淀的方式。
如上所述，在本实施方式中，在大片段基因组捕获探针的制备方法的中，采用将待捕获大片段区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，既可以捕获单碱基突变，又可以捕获***或缺失突变，更少地丢失目标序列，既可以捕获单碱基突变，又可以捕获***或缺失突变，更少地丢失目标序列，实现了更高的灵敏度。
此外，本实施方式所涉及的种试剂盒可以包括根据上述各个步骤所制备的基因探针。该试剂盒可以用于大片段基因组的捕获。
以下，结合具体的实施例对本发明的实施方式进一步详细说明。
实施例1
本实施例采用自配试剂进行文库构建的方式进行，且后酶切处理方式为USER酶切。
<探针制备>
1.PCR扩增出靶区域片段
PCR引物委托商业公司合成，以能够扩增出基因组上200bp-20kb长度片段为限。对每对PCR引物，采用0.2ml PCR管进行PCR反应，反应体系如表1所示。
表1
体积
Phusion High-Fidelity PCR mix 15μl
PCR正向引物F(SEQ ID NO.1，20uM) 1μl
PCR反向引物R(SEQ ID NO.2，20uM) 1μl
基因组DNA 10-200ng
补H2O至 30μl
在PCR仪中执行以下反应程序(见表2)。
表2
步骤 温度 时间
激活 1 95℃ 3min
变性 2 95℃ 15s
退火 3 60℃ 20s
延伸 4 72℃ 4min
2-4步骤循环30次 5
延伸 6 72℃ 4min
保持 7 10℃ 保存
PCR结束后，所有产物进行DNA纯化，纯化步骤可按照生工生物PCR纯化试剂盒(货号：B518141)操作步骤进行，也可采用其他公司功能类似的纯化试剂盒。
2.将上述PCR产物等分子量混合；混合后取500ng按照CovarisS220操作标准，将PCR产物打断至150-300bp左右。或采用其他方式如酶切等将DNA片段处理至150-300bp。
3.文库构建，本实施例采用以下自配试剂进行文库构建。
1)末端修复：按照下表(见表3)的配比准备反应混合物：
表3
体积(ul)
第2.步打断后的PCR产物 50
5X T4DNA Polymerase buffer 20
dNTPs mix 4
T4DNA pol. 3
Klenow DNA pol. 3
T4PNK 5
补RNase-freeH2O至 100
将thermomixer调至20℃，反应30min，然后用QIAquick PCR Purification Kit进行纯化，最后将样品溶于30ul EB solution。
2)DNA片断3’末端加‘A’：按照表的配比准备反应混合物。
表4
体积(ul)
第1)步纯化后的DNA 30
Klenow buffer 5
dATP(1mM) 10
Klenow exo-(3'to 5'exo minus) 3
补RNase-free H2O至 50
将thermomixer调至37℃，反应30min，然后用PCR Purification Kit进行纯化，最后将样品溶于20ul EB solution；Klenow exo-(3'to 5'exo minus)可以换成任何不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶。
3)将Adapter连接在DNA片断末端：按照下表的配比准备反应混合物。
表5
SEQ ID NO.1：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
SEQ ID NO.2：5'-CCCTATAGTGAGCATGTCAG-3'
将thermomixer调至22℃，反应60min，然后用PCR Purification Kit进行纯化，最后将样品溶于30ul TE；
4)文库PCR反应：本PCR需要加入biotin-dUTP；反应体系如下表6所示。
表6
体积(ul)
第3)步加接头后的DNA 15
2X Kapa 2G Rubost mix 25
biotin-dUTP(10mM) 1
PCR正向引物F(SEQ ID NO.1，20uM) 1
PCR反向引物R(SEQ ID NO.2，20uM) 1
补RNase-free H2O至 50
PCR反应条件如下表7：
表7
步骤 温度 时间
激活 1 98℃ 30s
变性 2 98℃ 10s
退火 3 65℃ 15s
延伸 4 72℃ 15s
2-4步骤循环8次 5
延伸 6 72℃ 5min
保持 7 10℃ 保存
PCR产物进行DNA纯化，纯化步骤可按照生工生物PCR纯化试剂盒(货号：B518141)操作步骤进行，也可采用其他公司功能类似的纯化试剂盒。
4.PCR产物转录为单链RNA探针
按照下表(见表8)配制转录反应体系：
表8
体积(μl)
10×Reaction Buffer 2
ATP Solution 2
GTP Solution 2
CTP Solution 2
UTP Solution 1.5
Biotin-UTP(10mM) 5
DNA模板 x
T7RNA Polymerase Mix 2
补RNase-free H2O至 20
将上述反应混合物置于37℃反应2小时。
5.USER酶切消化捕获探针中的DNA片段(见表9)。
表9
体积(μl)
第4.步的反应混合物 20
USER酶(NEB) 1
USER酶Buffer 3
补RNase-free H2O至 30
将上述反应混合物置于37℃反应15分钟。
然后将反应体积采取乙醇沉淀方式纯化。该产物便为所制备的基因捕获RNA探针。
<探针的捕获效果>
采用上述制备得到的探针，进行特定区段捕获，起始量200ng，文库构建PCR的循环数不超过9，浓度大于25ng/ul，***片段200bp左右。具体捕获流程如下。
1.杂交
1)配制MIX1
在1.5mlEP管中加入以下体系(见表10)：
表10
盖上管盖后，用注射器针头(5ml注射器)在管盖上扎3-5个孔，55℃离心真空干燥至看不见明显液滴，离心条件：12000rpm，2min。小心开盖，底部加入8ul水，盖上盖，用封口膜将盖子上的孔封住，涡旋，12000rpm，2min，并转移到PCR管，标记LM。
2)取一支新的PCR管，加入以下体系(见表11)，并标记MIX2：
表11
体积(μl)
Hyb#1 20
Hyb#2 0.8
Hyb#3 8
Hyb#4 8
合计 36.8
3)取一支新的PCR管，加入以下体系(见表12)，并标记MIX3。
表12
体积(μl)
实施例1制备的探针 2(100ng)
RNase抑制剂 0.5
无核酸水 3.5
合计 6
4)PCR仪设定程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞。
5)将LM放进PCR仪中，开始程序第一步：95℃5min。
6)到程序第二步65℃3min时，立即将MIX1放入。
7)到程序第三步65℃2min时，立即将MIX2放入。
8)到程序第四步后，在PCR仪上，移7ul MIX1与13ul MIX2至MIX3，上下吹吸10次，盖好管盖，此步骤需要快，防止液体蒸发。
9)65℃杂交18个小时。
2.捕获
1)wash buffer1提前半小时放置到室温，wash buffer2 65℃预热1h。
2)50ul DynalM270磁珠至新的1.5ml EP管，磁力架上3min，移去上清。
3)加入200ul binding buffer，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，磁力架上3min，去上清。
4)重复3)两次，总共洗3次。
5)加入200ul binding buffer，移液器上下吹吸10次。
6)移液器调到26ul，吸取杂交体系，观察体积损失情况，迅速加入到重悬好的Myone C1磁珠中，立刻颠倒混匀3-5下，rotator室温30min。
注：杂交体系加入到磁珠前需一致在PCR仪上，若体积损失超过3ul，表明杂交失败，停止实验。
7)磁力架上3min，去上清。
8)加入500ul wash buffer 1，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，室温15min，磁力架上3min，去上清。
9)加入500ul wash buffer 2，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，65℃10min，磁力架上3min，去上清。重复2次，一共洗三遍。
注：从65℃取出前，先颠倒混匀下，将管盖的液体带下来，再放到水浴锅30s后，取出，立即置于磁力架上。
10)为确保液体去净：可用小离心机离心，放磁力架上，用10ul移液器将残留液体洗净。
11)加入20ul的水将磁珠重悬。
4.PCR体系
表13
体积
捕获产物(含磁珠) 10
2Xkapa hifi mix 25
引物F/R 2
水 13
PCR反应条件(见表14)：
表14
步骤 温度 时间
激活 1 98℃ 45s
变性 2 98℃ 20s
退火 3 65℃ 30s
延伸 4 72℃ 60s
2-4步骤循环18次 5
延伸 6 72℃ 4min
保持 7 10℃ 保存
将PCR管置于磁力架上，将上清移到新管，加入90ul Ampurebeads进行纯化，25ulElution buffer洗脱。
该产物可进行测序，并计算捕获效果。
5.捕获效果
设计区域160K；捕获效果如下表，主要看靶区域捕获序列比率、Mapping比率以及>20*平均深度比率。
表15
样本名 B1-1 B2-2 B2-3
测序序列数目 48920 46276 51881
靶区域捕获序列比率 72.23％ 73.27％ 74.30％
Mapping比率 99.23％ 98.71％ 98.85％
平均深度 61.36 58.88 66.94
>5％*平均深度 99.57 99.51 99.66
>＝10％*平均深度 99.04 98.99 99.25
>＝20％*平均深度 98.25 97.87 98.27
>＝50％*平均深度 85.36 84.16 85.62
实施例2
本实施例采用商业试剂盒进行文库构建的方式进行，且后酶切处理方式为DnaseI酶切。
<探针制备>
1.PCR扩增出靶区域片段
PCR产物委托商业公司合成，以能够扩增出基因组上200bp-20kb长度片段为限。
采用0.2ml PCR管，对每对PCR，进行如下PCR反应。
表16
体积
Phusion High-Fidelity PCR mix 15μl
PCR正向引物F(SEQ ID NO.1，20uM) 1μl
PCR反向引物R(SEQ ID NO.2，20uM) 1μl
基因组DNA 10-200ng
补H2O至 30μl
PCR反应条件：
表17
步骤 温度 时间
激活 1 95℃ 3min
变性 2 95℃ 15s
退火 3 60℃ 20s
延伸 4 72℃ 4min
2-4步骤循环8次 5
延伸 6 72℃ 4min
保持 7 10℃ 保存
PCR结束后，所有产物进行DNA纯化，纯化步骤可按照生工生物PCR纯化试剂盒(货号：B518141)操作步骤进行，也可采用其他公司功能类似的纯化试剂盒。
2.将上述PCR产物等分子量混合；混合后取500ng按照CovarisS220操作标准，将PCR产物打断至150-300bp左右。或采用其他方式如酶切等将DNA片段处理至150-300bp.
3.文库构建
本实施例采用商业试剂盒进行文库构建。可用诺维赞DNA文库构建试剂盒(ND604)。
按照试剂盒操作流程进行文库构建，其中接头还是采用如下引物序列；
Adapter oligo引物F：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
Adapter oligo引物R：5'-CCCTATAGTGAGCATGTCAG-3'
4.PCR产物转录为单链RNA探针
按照下表配制转录反应体系：
表18
体积(μl)
10×Reaction Buffer 2
ATP Solution 2
GTP Solution 2
CTP Solution 2
UTP Solution 1.5
Biotin-UTP(10mM) 5
DNA模板 x
T7RNA Polymerase Mix 2
补RNase-free H2O至 20
将上述反应混合物置于37℃反应2小时。
5.DNaseI酶切处理捕获探针中的DNA序列。
表19
体积(μl)
第4.步反应混合物 20
DNaseI(neb) 1
补RNase-free H2O至 30
将上述反应混合物置于37℃反应15分钟。
然后将反应体积采取乙醇沉淀方式纯化。该产物便为所制备的基因捕获RNA探针。
<探针的捕获效果>
与实施例1同样，设计区域也是160K；捕获效果如下表，主要看靶区域捕获序列比率、Mapping比率以及>20*平均深度比率。
表20
样本名 B1-1 B2-2 B2-3
测序序列数目 48920 46276 51881
靶区域捕获序列比率 72.23％ 73.27％ 74.30％
Mapping比率 99.23％ 98.71％ 98.85％
平均深度 61.36 58.88 66.94
>5％*平均深度 99.57 99.51 99.66
>＝10％*平均深度 99.04 98.99 99.25
>＝20％*平均深度 98.25 97.87 98.27
>＝50％*平均深度 84.18 85.28 83.33
如上所示，通过本发明的方法制备的探针能够用于改善结合效率的大量区域的捕获。
虽然以上结合附图和实施例对本发明进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本发明。本领域技术人员在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本发明进行变形和变化，这些变形和变化均落入本发明的范围内。
序列表
<110> 深圳人体密码基因科技有限公司；上海何因生物科技有限公司
<120> 大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒
<130> SE170100-01CN
<150> 2017114904433
<151> 2017-12-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(ordo artificialis)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(ordo artificialis)
<400> 2

Claims (10)

1.一种大片段基因组的捕获探针的制备方法，其特征在于，
包括：
设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；
将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将所述混合物破碎成规定片段；
在所述规定片段的两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库；
使用RNA聚合酶将所得到的所述文库中的片段转录成RNA产物；
加入DNA消化酶，将所述RNA产物中的DNA链消化；并且
消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述RNA聚合酶可识别启动子序列包括T7启动子序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述待捕获基因组的长度为200bp-10kb。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述混合物由PCR产物按照等分子量混合而成。
5.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，
所述规定片段为150bp-300bp的基因片段。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库的步骤包括：
使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对所述规定片段进行加A处理，形成中间片段；
使用DNA连接酶将所述中间片段接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，形成接头片段；
根据接头序列设计接头引物对所述接头片段进行PCR扩增以构建文库，在所述PCR扩增中使用的dNTP包含biotin-dUTP，且biotin-dUTP与dTTP比率(biotin-dUTP:dTTP)为1:1～5:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
在所述规定片段两端接上含有RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，构建成文库的步骤包括：
使用不具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶对所述规定片段进行加A处理，形成中间片段；
用DNA连接酶将所述中间片段接上含有T7RNA聚合酶可识别启动子序列的接头，并且
使用试剂盒进行文库构建。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
所述DNA消化酶为USER酶。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
所述DNA消化酶为脱氧核糖核酸酶(DNaseI)。
10.一种试剂盒，其特征在于，
包括根据权利要求1至9中的任一项所述的制备方法所制备的基因探针。
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