CN108676715B - 一种半封闭的纳米催化反应器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半封闭的纳米催化反应器及其制备方法与应用。通过将脚手架DNA单链、未修饰生物素的订书钉DNA链和生物素修饰的订书钉DNA链混合后经过退火,得到三维DNA纳米管;然后根据生物素和亲和素的特异性结合作用,得到内部结合亲和素的三维DNA纳米管;然后在三维DNA纳米管内结合过氧化物酶,再通过DNA标记的贵金属纳米粒子与DNA纳米管末端碱基互补配对,将DNA纳米管末端封闭,从而得到一种半封闭的纳米催化反应器。该方法不仅可以在纳米尺度精确控制酶位置,有助于对酶反应动力学的机理的研究,还可以特异性地催化反应底物产生气体,成为一种自带动力源的纳米机器。
Description
技术领域
本发明属于DNA纳米技术领域,具体涉及一种半封闭的纳米催化反应器及其构建方法与应用。
背景技术
2006年,Rothemund发明了DNA折纸术(DNA origami),这是一项全新的DNA自组装技术;在这一技术中,Rothemund将噬菌体单链DNA(7249 bases)作为纳米结构的支架(scaffold DNA),用数百条寡核苷酸序列(staple DNA)在特定的地方将M13mp18单链DNA固定住,根据固定位点的不同,可以折叠出不同形状的DNA纳米结构。
与传统的DNA tile自组装相比,DNA折纸术有着无与伦比的优势。(1) DNA折纸术无须纯化,DNA tile中的所有DNA序列都需要进行纯化,并且需要严格按照设计的比例进行混合反应,而DNA折纸术不需要对DNA 序列进行纯化,且只要有大致的浓度比混匀即可。(2)DNA折纸术制作便捷,DNA tile需要进行多次长时间的退火进行反应,DNA折纸术只需进行一步退火反应即可,且反应时间较短。(3)DNA折纸术设计方便。由于大部分DNA折纸术结构都是基于M13mp18构建的,所以一旦折叠路径确定好后,staple DNA也就确定了。此外,目前已有针对DNA折纸术设计的软件caDNAno,可以对DNA折纸术结构进行程序化设计。(4)DNA折纸术结构设计精密,图形分辨率远高于tile自组装,origami的图形像素精度比 tile自组装高10倍以上。(5)DNA折纸术产率高,origami的产率通常可达 90%。
DNA折纸术技术发展至今,各种二维、三维的DNA折纸结构层出不穷,为DNA纳米技术带来了突飞猛进的进步。
基于DNA折纸术的可寻址性,可以实现在DNA折纸结构上对小分子、生物大分子的精确定位,从而构建精密的DNA纳米反应器,但是这些DNA 纳米反应器大部分都是基于二维DNA折纸结构构建,无法提供一个相对封闭和稳定的环境,导致其反应存在不确定性且易受环境因素影响。
发明内容
本发明解决了现有技术基于DNA折纸术的反应器无法为反应提供相对封闭和稳定的反应环境的问题,提供了一种半封闭的纳米催化反应器及其构建方法与应用。
根据本发明的第一方面,提供了一种半封闭的纳米催化反应器的制备方法,包含以下步骤:
(1)将脚手架DNA链、未修饰生物素的订书钉DNA链和生物素修饰的订书钉DNA链溶解在缓冲液中,得到溶液A;所述溶液A中脚手架DNA 链的浓度与未修饰生物素的订书钉DNA链的浓度之比为1:(5-20);生物素修饰的订书钉DNA链的浓度大于或等于未修饰生物素的订书钉DNA链的浓度;
(2)将步骤(1)得到的溶液A加热至95℃-80℃,然后按照1℃/ (2min -10min)的降温速度,将溶液A的温度降至70℃-60℃;再按照1℃/ (80min-160min)的降温速度,继续将溶液A的温度降至25℃-4℃;通过所述脚手架DNA链与所述未修饰生物素的订书钉DNA链和生物素修饰的订书钉DNA链碱基互补配对,得到三维DNA纳米管溶液;
(3)向步骤(2)得到的三维DNA纳米管溶液中加入亲和素,在200 rpm-800rpm条件下,震荡反应1h-3h,使得所述亲和素与生物素修饰的订书钉DNA链上的生物素特异性结合,得到内部结合亲和素的三维DNA纳米管溶液;
(4)向步骤(3)得到的内部结合亲和素的三维DNA纳米管溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的酶、D-生物素甲酯修饰的酶或D-生物素酰肼修饰的酶,在200rpm-800rpm条件下,震荡反应2h-8h,使得所述 N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的酶、D-生物素甲酯修饰的酶或D-生物素酰肼修饰的酶与亲和素特异性结合,得到内部结合酶的三维DNA纳米管溶液;
(5)向步骤(4)得到的内部结合酶的三维DNA纳米管溶液中加入 DNA修饰的贵金属纳米粒子,在200rpm-800rpm条件下,避光震荡反应 2h-8h;所述DNA修饰的贵金属纳米粒子与所述三维DNA纳米管其中一个末端的DNA互补配对,使得所述三维DNA纳米管的该末端封闭,即得到半封闭的纳米催化反应器。
优选地,步骤(1)所述脚手架DNA链为M13mp18单链DNA。
优选地,步骤(1)所述生物素修饰的订书钉DNA链为3’端修饰生物素的订书钉DNA链。
优选地,步骤(4)所述的酶为过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶。
优选地,步骤(2)所述三维DNA纳米管为双层空心六棱柱DNA纳米管。
优选地,步骤(3)所述亲和素为链霉亲和素或卵白亲和素;步骤(5) 所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
优选地,步骤(3)所述三维DNA纳米管与所述亲和素的物质的量之比为1:(3-10)。
优选地,步骤(4)所述内部结合亲和素的三维DNA纳米管与所述N- 羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的酶、D-生物素甲酯修饰的酶或D-生物素酰肼修饰的酶物质的量之比为1:(10-50)。
按照本发明的另一方面,提供了所述方法制备得到的半封闭的纳米催化反应器。
按照本发明的另一方面,提供了所述的半封闭的纳米催化反应器在纳米材料、生物医疗以及分析检测方面的应用。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,主要具备以下的技术优点:
(1)本发明通过DNA折纸术构建的三维DNA纳米管结构,同时利用生物素与链霉亲和素的特异性结合,将生物素修饰的过氧化氢酶结合在 DNA纳米管结构内部,再通过碱基互补配对,用DNA标记的贵金属纳米粒子封闭DNA纳米管的一端端口,从而构建出半封闭的纳米反应器。本发明不仅可以在纳米尺度精确控制酶的位置,有助于对酶反应动力学的机理的研究,还可以特异性地催化反应底物如H2O2产生气体,为纳米反应器提供动力,使其成为自带动力源的纳米反应器。
(2)本发明中制备的空心六棱柱结构DNA纳米管的一端端口处伸出的DNA序列作为贵金属纳米粒子颗粒的捕获位点,可以与贵金属纳米粒子的巯基DNA杂交,从而利用贵金属纳米粒子将纳米管的一端端口封闭,完成纳米催化反应器的构建。
(3)本发明采用DNA折纸术构造了空心六棱柱结构,该六棱柱为双层结构,使得结构更加稳固;在六棱柱纳米管内部,生物素修饰的订书钉单链DNA作为酶在纳米管内部的固定点,能够特异性地与链霉亲和素结合,再通过链霉亲和素结合N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的过氧化氢酶,从而将过氧化氢酶固定在纳米管内部。另外,在纳米管一端端口处伸出的DNA 序列作为贵金属纳米粒子的捕获位点,可以与贵金属纳米粒子的巯基DNA 杂交,完成纳米催化反应器的构建。
附图说明
图1为三维DNA纳米管放大50000倍的透射电子显微成像图;其中图 1(a)为DNA纳米管的截面结构透射电子显微成像图,图1(b)为DNA 纳米管的侧面结构透射电子显微成像图。
图2为三维DNA纳米管放大50000倍的透射电子显微成像图。
图3为三维DNA纳米管以及M13mp18单链DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为DNA标记的纳米金的透射电子显微成像图。
图5为半封闭的纳米催化反应器的透射电子显微成像图;其中图5(a) 是纳米金结合了一个六棱柱的DNA纳米管的电子显微成像图,图5(b) 是纳米金结合了两个六棱柱的DNA纳米管的电子显微成像图,图5(c)是纳米金结合了三个六棱柱的DNA纳米管的电子显微成像图,图5(d)是纳米金结合了四个六棱柱的DNA纳米管的电子显微成像图,图5(e)是纳米金结合了一个六棱柱的DNA纳米管的示意图,图5(f)是纳米金结合了两个六棱柱的DNA纳米管的示意图,图5(g)是纳米金结合了三个六棱柱的DNA纳米管的示意图,图5(h)是纳米金结合了四个六棱柱的DNA 纳米管的示意图。
图6为半封闭的纳米催化反应器的催化活性检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例中的M13mp18单链DNA(N4040S)购于NEB公司;未修饰生物素的订书钉单链DNA和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA购于武汉金开瑞生物工程有限公司。
(1)制备空心六棱柱的DNA纳米管
S1、用1×TAE缓冲液(Tris,40mM;醋酸,20mM;EDTA,2mM;醋酸镁,12.5mM;pH8.0)将未修饰生物素的订书钉单链DNA、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA稀释到100μM备用;用1×TAE缓冲液将 M13mp18单链DNA稀释到20nM备用。所述生物素为Biotin、Biotin-TEG 或Desthio Biotin-TEG。
S2、将未修饰生物素的订书钉单链DNA(100μM)、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA(100μM)等体积混合,再将混合溶液稀释到单链浓度为 200nM备用。
S3、在0.2mL PCR管中按照下列体系混合溶液:取50μL未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA链的混合溶液 (200nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S4、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从80℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至60℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从60℃降温至24℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
(2)DNA纳米管的聚乙二醇沉淀法纯化
S1、向步骤(1)中的DNA纳米管中加入等体积的PEG8000溶液(Tris, 5mM;EDTA,1mM;NaCl,505mM;PEG8000,15%),混匀;
S2、将混合液进行离心纯化(12000rpm,30min,23℃);
S3、用微量移液器小心吸去上清液,再用原样品体积的1×TAE缓冲液回溶沉淀;回溶的样品溶液即为纯化后的DNA纳米管。
(3)透射电子显微镜成像
S1、对透射电子显微镜的载网表面碳膜进行亲水化处理;
S2、吸去5μL DNA纳米管样品滴加在载网上,吸附5分钟后用滤纸吸去溶液;
S3、对步骤S2中吸附有样品的载网用5μL 2%乙酸双氧铀染色液染色 45秒,然后用滤纸吸去染色液;
S4、将步骤S3中染色后的载网进行透射电子显微镜成像。成像结果如图1和图2所示,由图1和图2可以得出,DNA纳米管是一个内部中空的六棱柱型纳米结构,并且从图像中可以明显地看出DNA纳米管是一个双层纳米结构。图3为DNA纳米管以及M13mp18单链DNA的琼脂糖凝胶电泳图,由图3可以看出,DNA纳米管的条带在M13mp18单链DNA上面,由此得知DNA纳米管的迁移速率比M13mp18单链DNA慢,表明DNA纳米管的分子量明显大于M13mp18单链DNA。
(4)链霉亲和素与DNA纳米管结合
S1、用1×TAE缓冲液将步骤(2)中得到的DNA纳米管稀释到5nM 备用,用PBS缓冲液(NaCl,136.89mM;KCl,2.67mM;NaHPO4,8.24mM; KH2PO4,1.76mM;pH7.4)将链霉亲和素稀释到50nM备用;
S2、在0.2mL离心管中按照下列体系混合溶液:取50μL DNA折纸产物(5nM)和50μL链霉亲和素(15nM),共100μL,进行充分混合。
S3、在恒温混匀仪中振荡反应(37℃,300rpm)2小时;
S4、将步骤(3)中的产物纯化后即得内部结合链霉亲和素的DNA纳米管。
(5)N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的合成
S1、在圆底烧瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺(20mL)、生物素(0.5g, 2.046mmol),N-羟基琥珀酰亚胺(0.3765g,3.271mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.51g,2.66mmol),室温下搅拌24小时,圆底烧瓶中的液体由浑浊逐渐变澄清;
S2、向步骤S1中的产物中加入等质量的由超纯水制成的碎冰,产物由澄清变为浑浊;
S3、将步骤S2中的产物转移到50mL离心管中,10000rpm,25℃离心 30分钟,吸去上清液,得到白色沉淀;
S4、用超纯水对步骤S3中的沉淀进行清洗,清洗后冷冻干燥,所得白色产物即为N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯。
(6)N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰过氧化氢酶
S1、用PBS缓冲液将过氧化氢酶稀释到20nM备用;用DMF将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯稀释到10mM备用;
S2、在超滤离心管(1.5mL,100KD)中按照下列体系混合溶液:取500μL 过氧化氢酶(20nM)和10μL N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(10nM),共计 510μL,进行充分混合。
S3、在恒温混匀仪中振荡避光反应(37℃,300rpm)30分钟;
S4、对步骤S3的产物进行离心(6000rpm,25℃,30min),吸去滤液,并在超滤离心管中加入200μL PBS缓冲液,将滤芯倒转,再次离心(6000rpm, 25℃,30min),所得产物即为N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰过氧化氢酶。
(7)N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的过氧化氢酶与DNA纳米管结合
S1、用1×TAE缓冲液将内部结合链霉亲和素的DNA纳米管稀释到2nM 备用;用PBS缓冲液将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的过氧化氢酶稀释到6nM备用;
S2、在0.2mL离心管中按照下列体系混合溶液:取25μL内部结合链霉亲和素的DNA纳米管(2nM)和25μL N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的过氧化氢酶(6nM),共计50μL,进行充分混合。
S3、在恒温混匀仪中振荡反应(37℃,300rpm)4小时;
S4、将步骤S3中的产物纯化后即得内部结合过氧化氢酶的DNA纳米管。
(8)纳米金溶液的制备
S1、HAuCl4·4H2O配置成0.01%水溶液,将Na3C6H5O7·2H2O配置成1%水溶液;
S2、在圆底烧瓶中加入100mL步骤(1)中的HAuCl4溶液,加热至沸腾后加入2mL步骤(1)中的Na3C6H5O7溶液,持续搅拌加热15分钟,得到红色透明的纳米金溶液;
(9)DNA修饰纳米金
S1、用1×TAE缓冲液将SH-DNA稀释到100μM备用;用超纯水将三 (2-羧乙基)膦(TCEP)稀释到1mM备用。
S2、在0.2mL离心管中按照下列体系混合溶液:取10μL SH-DNA(100μM) 和1.2μL醋酸-醋酸钠缓冲液(500mM;pH5.2),共计12.2μL,混匀后避光反应1小时;
S3、向步骤S2中的产物中加入1mL纳米金(1nM),混匀后避光反应 16小时;
S4、向步骤S3中的产物中缓慢加入10μL Tris-醋酸缓冲液(500mM, pH8.2)和100μL氯化钠溶液(1M),再避光反应24小时;
S5、将步骤S4中的产物离心(16000rpm,25℃,30min),移去上清液,并用Tris-NaCl缓冲液B(300mM NaCl,25mM Tris acetate,pH 8.2)回溶沉淀,回溶得到的溶液即是DNA修饰的纳米金。图4为DNA标记的纳米金的透射电子显微成像图,从图4可以得出,DNA修饰的纳米金分布均匀,且纳米金颗粒的粒径也符合预期。
(10)纳米金与DNA纳米管结合
S1、用1×TAE缓冲液将DNA修饰的纳米金稀释到2nM备用;用1×TAE 缓冲液将结合过氧化氢酶的DNA纳米管稀释到5nM备用;
S2、在0.2mL离心管中按照下列体系混合溶液:取10μL DNA修饰的纳米金(2nM)和10μL结合过氧化氢酶的DNA纳米管(5nM),共计20μL,进行充分混合;
S3、将S2中的混合溶液在恒温混匀仪中振荡避光反应(37℃,300rpm) 2小时;所得的产物即为基于DNA折纸术的纳米催化反应器。图5为基于 DNA折纸术的纳米催化反应器的透射电子显微成像图,其中图5(a)-(d) 分别是纳米金结合了一个、两个、三个和四个六棱柱的DNA纳米管的电子显微成像图,图5(e)-(h)是纳米金结合了一个、两个、三个和四六棱柱的DNA纳米管的示意图。由图5可以得知,DNA修饰的纳米金可以与不同数目的DNA纳米管结合形成不同构型的纳米催化反应器。
实施例2
本实施例为不同PCR退火条件制备空心六棱柱的DNA纳米管。
(1)PCR仪退火条件1
S1、在0.2mL PCR管中按照下列体系混合溶液:取50μL未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA链混合溶液 (200nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S2、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从95℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至70℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从70℃降温至24℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
(2)PCR仪退火条件2
S1、在0.2mL PCR管中按照下列体系混合溶液:取50μL未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA链混合溶液 (200nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S2、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从80℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至70℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从70℃降温至4℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
(3)PCR仪退火条件3
S1、在0.2mL PCR管中按照下列体系混合溶液:取50μL未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA链混合溶液 (200nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S2、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从95℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至60℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从60℃降温至4℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
实施例3
本实施例为不同脚手架DNA链与未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链浓度比制备空心六棱柱的DNA纳米管。
(1)脚手架DNA链浓度:未修饰生物素的订书钉DNA链浓度:3’端修饰生物素的订书钉单链DNA=1:20:20。
用1×TAE缓冲液将M13mp18单链DNA稀释到20nM备用。所述生物素为Biotin、Biotin-TEG或Desthio Biotin-TEG。
S2、将所有未修饰生物素的订书钉单链DNA(100μM)、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA(100μM)等体积混合,再将混合溶液稀释到单链浓度为400nM备用。
S3、在0.2mL PCR管中按照下列体积混合溶液:取50μL未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA链混合溶液 (400nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S4、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从80℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至60℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从60℃降温至24℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
(2)脚手架DNA链浓度:未修饰生物素的订书钉DNA链浓度:3’端修饰生物素的订书钉单链DNA=1:5:5。
用1×TAE缓冲液将M13mp18单链DNA稀释到20nM备用。所述生物素为Biotin、Biotin-TEG或Desthio Biotin-TEG。
S2、将所有未修饰生物素的的订书钉单链DNA(100μM)、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA(100μM)等体积混合,再将混合溶液稀释到单链浓度为100nM备用。
S3、在0.2mL PCR管中按照下列体系混合溶液:取50μL未修饰生物素的订书钉DNA链和3’端修饰生物素的订书钉单链DNA链混合溶液 (100nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S4、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从80℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至60℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从60℃降温至24℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
(3)脚手架DNA链浓度:未修饰生物素的订书钉DNA链浓度:3’端修饰生物素的订书钉单链DNA=1:10:20。
用1×TAE缓冲液将M13mp18单链DNA稀释到20nM备用。所述生物素为Biotin、Biotin-TEG或Desthio Biotin-TEG。用1×TAE缓冲液将将未修饰生物素的的订书钉单链DNA稀释到50μM备用,用1×TAE缓冲液将将3’端修饰生物素的订书钉单链DNA稀释到100μM备用。
S2、将未修饰生物素的的订书钉单链DNA(50μM)、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA(100μM)等体积混合,再将混合溶液稀释到溶液中未修饰生物素的的订书钉单链DNA浓度为200nM、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA浓度为400nM备用。
S3、在0.2mL PCR管中按照下列体系混合溶液:取50μL订书钉链混合溶液(未修饰生物素的的订书钉单链DNA浓度为200nM、3’端修饰生物素的订书钉单链DNA浓度为400nM)和50μL M13mp18单链DNA(20nM),共100μL,进行充分混合。
S4、在PCR仪上按照下列程序进行退火:首先从80℃开始,按照1℃ /4min的降温速度开始降温,直至降温至60℃;然后按照1℃/120min的降温速度,从60℃降温至24℃。完成降温程序后,制备好的DNA折纸产物保存在4℃中。
实施例4
Amplex Red(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)是一种灵敏度高,稳定性好的过氧化氢荧光探针,当反应体系中存在辣根过氧化物酶时,Amplex Red 与H2O2以1:1的比例反应,并产生高荧光强度的荧光产物。由于过氧化氢酶可以催化分解H2O2,我们可以根据荧光强度间接检测过氧化氢酶的活性,当过氧化氢酶浓度高时,相同时间内可以分解更多的H2O2,所以反应体系中的H2O2的浓度降低,荧光强度也会降低;反之,当过氧化氢酶浓度低时,体系中的H2O2浓度较高,荧光也较强。
本实施例中用10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪检测构建的实施例1制备的半封闭纳米催化反应器的催化活性。按照以下步骤进行:
S1、用DMSO将10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪稀释到10mM备用;用PBS 缓冲液将辣根过氧化物酶稀释到100units/mL备用;用PBS缓冲液将H2O2稀释到10μM备用;
S2、在0.2mL离心管中按照下列体系混合溶液:取50μL实施例1制备的半封闭纳米催化反应器和50μL H2O2(10μM),共计100μL,进行充分混合;
S3、将S2中的混合溶液在恒温混匀仪中(37℃,300rpm)反应1小时;
S4、在0.2mL离心管中按照下列体系混合溶液:取10μL10-乙酰基-3,7- 二羟基吩嗪(10mM)、4μL辣根过氧化物酶(100units/mL)以及986μL PBS 缓冲液,共计1000μL,进行充分混合;
S5、将步骤S3的产物50μL和步骤S4的产物50μL混匀,在恒温振荡培养箱中避光反应30min(37℃,280rpm);
S6、测定步骤(S5)的产物的荧光,并于空白样品进行对比。结果如图6所示,从图6中可以得知,在DNA纳米催化反应器的作用下,反应体系中的H2O2被催化为H2O和O2,与空白样品对比,与荧光结合后的荧光值发生了明显的变化,表明该DNA纳米催化反应器能够有效地催化H2O2分解。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种半封闭的纳米催化反应器的制备方法,包含以下步骤:
(1)将脚手架DNA链、未修饰生物素的订书钉DNA链和生物素修饰的订书钉DNA链溶解在缓冲液中,得到溶液A;所述溶液A中脚手架DNA链的浓度与未修饰生物素的订书钉DNA链的浓度之比为1:(5-20);生物素修饰的订书钉DNA链的浓度大于或等于未修饰生物素的订书钉DNA链的浓度;
(2)将步骤(1)得到的溶液A加热至95℃-80℃,然后按照1℃/(2min -10min)的降温速度,将溶液A的温度降至70℃-60℃;再按照1℃/(80min-160min)的降温速度,继续将溶液A的温度降至25℃-4℃;通过所述脚手架DNA链与所述未修饰生物素的订书钉DNA链和生物素修饰的订书钉DNA链碱基互补配对,得到三维DNA纳米管溶液;
(3)向步骤(2)得到的三维DNA纳米管溶液中加入亲和素,在200rpm-800rpm条件下,震荡反应1h-3h,使得所述亲和素与生物素修饰的订书钉DNA链上的生物素特异性结合,得到内部结合亲和素的三维DNA纳米管溶液;
(4)向步骤(3)得到的内部结合亲和素的三维DNA纳米管溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的酶、D-生物素甲酯修饰的酶或D-生物素酰肼修饰的酶,在200rpm-800rpm条件下,震荡反应2h-8h,使得所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的酶、D-生物素甲酯修饰的酶或D-生物素酰肼修饰的酶与亲和素特异性结合,得到内部结合酶的三维DNA纳米管溶液;
(5)向步骤(4)得到的内部结合酶的三维DNA纳米管溶液中加入DNA修饰的贵金属纳米粒子,在200rpm-800rpm条件下,避光震荡反应2h-8h;所述DNA修饰的贵金属纳米粒子与所述三维DNA纳米管其中一个末端的DNA互补配对,使得所述三维DNA纳米管的该末端封闭,即得到半封闭的纳米催化反应器。
2.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述脚手架DNA链为M13mp18单链DNA。
3.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述生物素修饰的订书钉DNA链为3’端修饰生物素的订书钉DNA链。
4.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述的酶为过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶。
5.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述三维DNA纳米管为双层空心六棱柱DNA纳米管。
6.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述亲和素为链霉亲和素或卵白亲和素;步骤(5)所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
7.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述三维DNA纳米管与所述亲和素的物质的量之比为1:(3-10)。
8.如权利要求1所述的半封闭的纳米催化反应器的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述内部结合亲和素的三维DNA纳米管与所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯修饰的酶、D-生物素甲酯修饰的酶或D-生物素酰肼修饰的酶物质的量之比为1:(10-50)。
9.由权利要求1-8任一所述方法制备得到的半封闭的纳米催化反应器。
10.如权利要求9所述的半封闭的纳米催化反应器在催化过氧化氢分解中的应用。
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DNA折纸术纳米反应器;贾思思等;《化学进展》;20141231;第695-705页 * |
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