CN108676090A - 一种纤溶酶抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纤溶酶抑制剂在预防或治疗纤溶亢进、出血等相关疾病中的应用，属于生物医药领域。该纤溶酶抑制剂的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。本发明中的纤溶酶抑制剂具有强纤溶酶抑制活性且有较好的抑制特异性，能显著抑制纤溶酶的溶解纤维蛋白作用，减少手术中失血，可作为预防或治疗纤溶亢进、出血的药物，具有临床应用价值。

Description

一种纤溶酶抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说本发明涉及一种纤溶酶抑制剂在预防或治疗纤溶亢进、出血等相关疾病中的应用。
背景技术
纤溶酶(plasmin)是人体纤溶***重要组成部分，主要是降解纤维蛋白以及纤维蛋白原。抗纤溶药物在预防或治疗纤溶亢进、外科手术失血以减少输血需求等方面有广泛的应用。应用抗纤溶药物是复杂的心脏手术和涉及心肺通过体外循环(CBP，Cardiopulmonary bypass)手术的标准操作；在围术期应用抗纤溶药物可减少失血和减少输血需求，在创伤、产后出血以及各外科(肝胆、骨科、神经科、产科/妇科、泌尿科、血管、儿科等)中均有应用(参见如下文献，文献1：“Antifibrinolytic Agents in Cardiac andNoncardiac Surgery:A Comprehensive Overview and Update”(中文译文：抗纤溶药物在心脏和非心脏手术中的应用：全面概述和最新进展)，Gerstein NS等，《J CardiothoracVasc Anesth》，2017年第31卷第6期第2183～2205页；文献2：“Antifibrinolytic Therapyand Perioperative Considerations”(中文译文：抗纤溶治疗和围术期注意事项)，LevyJH等，《Anesthesiology》，2018年第128卷3期657-670页)。目前的抗纤溶药物主要有：氨甲环酸、氨基己酸、氨甲苯酸和抑肽酶(aprotinin)。其中，氨甲环酸、氨基己酸和氨甲苯酸是通过结合纤溶酶原上的赖氨酸结合位点，从而抑制纤溶酶原转变为纤溶酶，但它们对已经生成的纤溶酶的活性无抑制作用。抑肽酶则是通过直接抑制纤溶酶的活性而具有抗纤溶作用，能抑制已经生成的纤溶酶。
氨甲环酸、氨基己酸、氨甲苯酸和抑肽酶在临床应用中各有利弊。其中，抑肽酶应用在体外循环(CBP)术中能显著减少失血和减少输血需要，但抑肽酶是一种广谱的丝氨酸蛋白酶，不但对纤溶酶活性具有强抑制活性，而且对胰蛋白酶(trypsin)、激肽释放酶(kallikrein)和糜蛋白酶(chymotrypsin)等多种蛋白酶具有较强或一定的抑制作用。抑肽酶由于被认为可能引起心肌缺血、肾功能障碍等副作用而在2007年被暂停临床使用，但随着替代的氨甲环酸等抗纤溶药物的临床应用增多发现：氨甲环酸等赖氨酸类似物能透过血脑屏障，影响中枢神经***，可能出现痉挛等副作用，而且抑肽酶在手术中的减少失血和减少输血作用明显优于氨甲环酸等药物，同时，抑肽酶退市后心脏手术的死亡率和肾功能损害的发生率并没有改善，而异体血制品(输血)的使用却显著增加(参见如下文献，文献3：“后抑肽酶时代抗纤溶的困惑与展望”，招伟贤，《广东医学》，2013年第34卷19期2909～2913页；文献4：“心脏手术中抗纤溶药物的临床应用进展”，杜英杰等，《中国分子心脏病学杂志》，2014年第4期1018-1021页；文献5：“氨甲环酸相关型癫痫的研究进展”，郝茂林等，《医学综述》，2017年第23卷2期332-335页；文献6：“Increased perioperative mortalityfollowing aprotinin withdrawal：a real-world analysis of blood managementstrategies in adult cardiac surgery”(中文译文：抑肽酶停用后围手术期死亡率增加：成人心脏手术血液管理策略的现实分析)，Walkden GJ等，《Intensive Care Med》，2013年第39卷10期1808-1817页)。
也鉴于抑肽酶在临床应用中还具有收益大于风险的优势，加拿大和欧洲已分别于2011年、2012年允许恢复临床使用抑肽酶。目前正在研究的但尚未上市的纤溶酶抑制剂textilinin-1可能是一种比抑肽酶安全的抗纤溶药，与抑肽酶具有广谱丝氨酸蛋白酶抑制活性的特点相比较，textilinin-1对纤溶酶、弹性蛋白酶(elastase)及胰蛋白酶均有强抑制作用，但对激肽释放酶(kallikrein)、凝血酶(thrombin)的抑制作用比抑肽酶弱，即textilinin-1具有一定的抑制特异性(参见如下文献，文献7：“Textilinin-1,analternative anti-bleeding agent to aprotinin:Importance of plasmin inhibitionin controlling blood loss”(中文译文：Textilinin-1，一种替代抑肽酶的止血药物：抑制纤溶酶在控制失血中的重要性)，Flight SM,等,《Br J Haematol》，2009年第145卷2期207–211页；文献8：“纤溶酶抑制剂textilinin-1在毕氏酵母的表达及应用”，王宏英等，《蛇志》，2014年第26卷3期273-277页)。
总的看来，目前临床应用的抗纤溶药物虽然有效，但均还具明显副作用或不足，因此研发更有效、更安全的抗纤溶新药具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种对纤溶酶具有强抑制活性且抑制特异性好的纤溶酶抑制剂，以用于预防或治疗纤溶亢进、出血相关疾病。
为预防或治疗纤溶亢进、手术中出血以减少失血或减少输血需求，本发明提供了一种多肽-NKI10，或其突变体在预防或治疗纤溶亢进、出血相关疾病中的应用。NKI10的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1，突变体是对SEQ ID NO.1序列中的部分氨基酸残基进行截断、替换或缺失后形成的具有与SEQ ID NO.1氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽，如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10。
本发明中的多肽是一种对纤溶酶抑制活性很强且具有较好抑制特异性的纤溶酶抑制剂。等摩尔浓度的NKI10能抑制大于90％人纤溶酶活性，2倍摩尔比浓度的NKI10能完全抑制人纤溶酶活性，但等摩尔及2倍摩尔比浓度的NKI10仅能分别抑制约22％、10％的人胰蛋白酶活性，加大到5倍摩尔比浓度的NKI10对糜蛋白酶、胰弹性蛋白酶、凝血酶及血浆激肽释放酶均无明显抑制作用。
本发明中的SEQ ID NO.1突变体，如具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的多肽均对纤溶酶具有强抑制活性，且有较好抑制特异性，是抑制活性强且抑制特异性较好的纤溶酶抑制剂。
本发明中的多肽能抑制纤溶酶对纤维蛋白的溶解作用，具有显著抗纤溶作用，因此，本发明的多肽可作为药物应用于预防或治疗纤溶亢进相关性疾病。另外，本发明中的多肽具有明显减少小鼠断尾失血作用，因此，本发明的多肽可作为药物应用于出血相关疾病中以减少输血需求，尤其可应用于减少外科手术失血。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。
图1所示的是NKI10的抗纤维酶溶解纤维蛋白平板作用。在纤维蛋白平板中，A1、A2及A3对应孔为每孔加入纤溶酶(2 000nmol/L)及生理盐水(对照)各5μL；B1、B2及B3对应孔为每孔加入纤溶酶(2 000nmol/L)及NKI10(500nmol/L)各5μL；C1、C2及C3对应孔为每孔加入纤溶酶(2 000nmol/L)及NKI10(1 000nmol/L)各5μL；D1、D2及D3对应孔为每孔加入纤溶酶(2000nmol/L)及NKI10(2 000nmol/L)各5μL。图中，每孔周围透明圈为纤溶酶溶解纤维蛋白形成的纤溶圈，随着加入NKI10的浓度增加，纤溶圈愈小，表明对纤溶酶的抑制作用愈强。
图2所示的是NKI10的完整编码框核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。小写字母为核苷酸序列，大写字母为编码对应的氨基酸序列，*为对应的终止密码子。
图3所示NKI10、proNKI10(NKI10的前肽)与抑肽酶(aprotinin)、textilinin-1及预测的序列GenBank No.XP_013306948的氨基酸序列的Clustal V比对结果。NKI10与GenBank No.XP_013306948具有92.1％的氨基酸序列相似性，与抑肽酶(aprotinin)、textilinin-1分别具有39.6％、38.6％的氨基酸序列相似性。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。以下具体实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1本发明中纤溶酶抑制剂的基因序列
(1)编码SEQ ID NO.1的cDNA序列及其分析
根据美洲板口线虫(Necator americanus)基因组的预测组装mRNA序列GenBankNo.XM_013451494(预测编码多肽GenBank No.XP_013306948)，设计扩增引物NI10-2:5’-TCAATCCACTTTGCAACGTTTCTT-3’，利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，以美洲板口线虫cDNA为模板，与SMART-RACE(Clontech产品)通用引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’)配对进行扩增，获得了一个与GenBank No.XM_013451494所示核苷酸序列不同，且编码不同氨基酸序列的完整编码框的cDNA。该cDNA及预测编码氨基酸序列见图2，通过在线网站预测信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，预测成熟肽为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，该序列与GenBank中已知多肽/蛋白的序列有较大差异，且未有功能研究报道，因此命名为NKI10。
本实施例中美洲板口线虫(Necator americanus)cDNA模板的制备方法及利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得NKI10的cDNA的方法，可以参考如下文献，文献9：“美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究”，隋细香等，中国寄生虫学与寄生虫病杂志2017年6月第35卷第3期；文献10：“美洲钩虫广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂NaKuI 3的鉴定及特性研究”，钟芳芳等，中国病原生物学杂志2017年6月第12卷第6期。
经BlastP搜索GenBank中的氨基酸序列相似性的蛋白/多肽，结果表明：与SEQ IDNO.1所示氨基酸序列具有最大相似性的序列为GenBank No.XP_013306948的预测序列。用DNAstar软件对NKI10、proNKI10(NKI10的前肽)氨基酸序列与抑肽酶(aprotinin)、textilinin-1及他人在GenBank中登记的预测序列GenBank No.XP_013306948进行ClustalV比对，结果见图3。结果表明NKI10与GenBank No.XP_013306948具有92.1％的氨基酸序列相似性，与抑肽酶(aprotinin)、textilinin-1分别具有39.6％、38.6％的氨基酸序列相似性。
从美洲板口线虫(Necator americanus)中获得的编码SEQ ID NO.1的cDNA序列(参考图2)如下：
ATGGGAATGAAGGGAAGTGGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGCTAAAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGCAAAGTGGAT。
(2)编码SEQ ID NO.2的基因序列扩增
设计上游引物Nm1-1：5’-GGTCATCTATGCAATGGGGA-3’，及下游引物Nm1-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTG-3’，以美洲板口线虫cDNA为模板，PCR扩增获得编码氨基酸序列SEQ ID NO.2的cDNA序列，序列如下：
GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGCTAAAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGCAAAGTGGAT。
(3)编码SEQ ID NO.3的基因序列扩增
设计上游引物Nm2-1：5’-TGCAATGGGGATTTACTACC-3’，及下游引物Nm2-2：5’-GCAACGTTTCTTGCATTTC-3’，以美洲板口线虫cDNA为模板，PCR扩增获得编码氨基酸序列SEQID NO.3的cDNA序列，序列如下：
TGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGCTAAAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGC。
(4)编码SEQ ID NO.4的基因序列扩增
用重叠引物延伸PCR法获得编码SEQ ID NO.4的基因序列。其中第一轮扩增上游引物用Nm4-3：5’-ATTTACTACCAGGACCTTGCAAAGCTAAAATGGAAAGATGGG-3’，与下游引物Nm4-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，以前述从美洲板口线虫中获得的编码SEQ IDNO.2的cDNA序列为模板，进行PCR扩增获得第一轮产物，以该第一轮PCR产物为模板，用设计的上游引物Nm4：5’-GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTG-3’，与下游引物Nm4-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，进行第二轮扩增，扩增获得编码SEQ ID NO.4的基因序列，序列如下：
GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAAAGCTAAAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGCAAAGTGGAT。
(5)编码SEQ ID NO.5的基因序列扩增
用重叠引物延伸PCR法获得编码SEQ ID NO.5的核苷酸序列。其中，下游引物均用Nm4-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTGCATTTC-3’，第一轮扩增上游引物用Nm5-3：5’-TTGCAAAGCTAGAATGGAAAGATGGGGATTG-3’，第二轮扩增上游引物用Nm5-1：5’-ATTTACTACCAGGACCTTGCAAAGCTAGAATGGAAAGATGGG-3’，第三轮扩增上游引物用Nm4：5’-GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTG-3’。第一轮扩增模板用前述从美洲板口线虫中获得的编码SEQ ID NO.2的cDNA序列，第二轮扩增模板用第一轮PCR产物，第三轮扩增模板用第二轮PCR产物，结果获得编码SEQ ID NO.5的基因序列，序列如下：
GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAAAGCTAGAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGCAAAGTGGAT。
(6)编码SEQ ID NO.6的基因序列扩增
用重叠引物延伸PCR法获得编码SEQ ID NO.6的核苷酸序列。其中，下游引物均用Nm4-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTGCATTTC-3’，第一轮扩增上游引物用Nm6-3：5’-TTGCAGAGCTAGAATGGAAAGATGGGGATTG-3’，第二轮扩增上游引物用Nm6-1：5’-ATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGCTAGAATGGAAAGATGGG-3’，第三轮扩增上游引物用Nm4：5’-GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTG-3’。第一轮扩增模板用前述从美洲板口线虫中获得的编码SEQ ID NO.2的cDNA序列，第二轮扩增模板用第一轮PCR产物，第三轮扩增模板用第二轮PCR产物，结果获得编码SEQ ID NO.6的基因序列，序列如下：
GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGCTAGAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGCAAAGTGGAT。
(7)编码SEQ ID NO.7的基因序列扩增
以前述获得编码SEQ ID NO.4的基因序列为模板，用上游引物Nm2-1：5’-TGCAATGGGGATTTACTACC-3’，及下游引物Nm2-2：5’-GCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，PCR扩增获得编码氨基酸序列SEQ ID NO.7的基因序列，序列如下：
TGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAAAGCTAAAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGC。
(8)编码SEQ ID NO.8的基因序列扩增
以前述获得编码SEQ ID NO.5的核苷酸序列为模板，用上游引物Nm2-1：5’-TGCAATGGGGATTTACTACC-3’，及下游引物Nm2-2：5’-GCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，PCR扩增获得编码氨基酸序列SEQ ID NO.8的基因序列，序列如下：
TGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAAAGCTAGAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGC。
(9)编码SEQ ID NO.9的基因序列扩增
以前述获得编码SEQ ID NO.6的核苷酸序列为模板，用上游引物Nm2-1：5’-TGCAATGGGGATTTACTACC-3’，及下游引物Nm2-2：5’-GCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，PCR扩增获得编码氨基酸序列SEQ ID NO.9的基因序列，序列如下：
TGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGCTAGAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGC。
(10)编码SEQ ID NO.10的基因序列扩增
用重叠引物延伸PCR法获得编码SEQ ID NO.10的基因序列。其中第一轮扩增上游引物用Nm10-3：5’-ATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGTTAAAATGGAAAGATGGGG-3’，与下游引物Nm4-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，以前述从美洲板口线虫中获得的编码SEQID NO.2的cDNA序列为模板，进行PCR扩增获得第一轮产物，以该第一轮PCR产物为模板，用设计的上游引物Nm4：5’-GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTG-3’，与下游引物Nm4-2：5’-ATCCACTTTGCAACGTTTCTTGCATTTC-3’配对，进行第二轮扩增，扩增获得编码SEQ IDNO.10的基因序列，序列如下：
GGTCATCTATGCAATGGGGATTTACTACCAGGACCTTGCAGAGTTAAAATGGAAAGATGGGGATTGGATAAGGAATCAGGAAAGTGCAAAAAATTCATCTACGGTGGTTGCGGTGGAAACAGAAACAATTTTGAAAGTGAAGAGAAATGCAAGAAACGTTGCAAAGTGGAT
实施例2本发明中纤溶酶抑制剂的蛋白酶抑制活性
获得本发明的重组NKI10的方法，可以参考如下文献，文献9：“美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究”，隋细香等，中国寄生虫学与寄生虫病杂志2017年6月第35卷第3期；文献10：“美洲钩虫广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂NaKuI3的鉴定及特性研究”，钟芳芳等，中国病原生物学杂志2017年6月第12卷第6期。简而言之，设计表达编码NKI10(SEQ ID NO.1)基因的上游引物NI10-1e：5’-CAGGATCCATGGGAATGAAGGGAAGTGGT-3’(下划线为BamH I酶切位点)，下游引物NI10-2e：5’-GCAAGCTTCAATCCACTTTGCAACGTTTCTT-3’(下划线为Hind III酶切位点)，以本发明实施例1已获得的编码SEQ ID NO.1的cDNA序列为模板，扩增得到编码NKI10(SEQ ID NO.1)的基因序列，将获得的基因序列连接入原核表达载体pET32a-sumo，构建正确的重组质粒转入大肠埃希菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达，宿主菌体经分离、超声破碎后，表达产物经镍亲和层析纯化获得融合蛋白，经SUMO蛋白酶切割融合伴侣，并经进一步通过亲和层析除去融合伴侣，获得重组NKI10。
用发色底物法观察重组NKI10对有关丝氨酸蛋白酶的抑制作用。所用蛋白酶/底物(括号内为浓度)分别为：纤溶酶(5nmol/L)/S2288(400μmol/L)、胰蛋白酶(1nmol/L)S2302(200μmol/L)、胰糜蛋白酶(1nmol/L)/S7388(200μmol/L)、弹性蛋白酶(5nmol/L)/S4760(200μmol/L)、凝血酶(1nmol/L)/S2288(400μmol/L)、血浆缓激肽释放酶(1nmol/L)/S2302(200μmol/L)。上述蛋白酶除猪弹性蛋白酶外，其他蛋白酶均为人蛋白酶，其中纤溶酶(plasmin)、凝血酶(thrombin)为美国Haematologic Technologies Inc产品，胰糜蛋白酶、胰蛋白酶为德国CalbioChem产品，血浆激肽释放酶为美国Enzyme ResearchLaboratories产品，底物S2302和S2288为意大利Chromogenix产品，S4760、S7388及猪弹性蛋白酶为美国sigma公司产品。检测方法是在96孔板(100μl反应体系)中加入10μl相应浓度的重组NKI10(空白对照用PBS)和50μl蛋白酶，温箱25℃孵育15min后，加入40μl预温的相应底物，用酶标仪(Elx808IU)A405扫描检测酶反应动力学，每15秒读板1次，连续读5min，记录酶反应速度，每组均重复3次。抑制率＝(V0-V)/V0，其中，V0为对照组反应速度，V为加入纤溶酶抑制剂后反应速度。
实验结果显示：两倍摩尔比浓度的NKI10(SEQ ID NO.1)能完全抑制人纤溶酶(plasmin)活性；等摩尔浓度的NKI10(SEQ ID NO.1)能抑制超过90％的人纤溶酶活性。NKI10对人胰蛋白酶(trypsin)具有一定抑制作用，2倍及等摩尔比浓度的NKI10分别能抑制约22％及10％的人胰蛋白酶活性。1、2和5倍摩尔比浓度的NKI10对胰糜蛋白酶(chymotrypsin)、胰弹性蛋白酶(elastase)、凝血酶(thrombin)及血浆缓激肽释放酶(plasma kallikrein)均无明显抑制作用。结果表明NKI10是一种具有很强的纤溶酶抑制活性且有较好抑制特异性好的纤溶酶抑制剂。
参照上述实施方法，结果显示NKI10的突变体NKI10-1(SEQ ID NO.2)、NKI10-2(SEQ ID NO.3)、NKI10-3(SEQ ID NO.4)、NKI10-4(SEQ ID NO.5)、NKI10-5(SEQ ID NO.6)、NKI10-6(SEQ ID NO.7)、NKI10-7(SEQ ID NO.8、NKI10-8(SEQ ID NO.9)及NKI10-9(SEQ IDNO.10)均对纤溶酶有强抑制活性，且具有较好的抑制特异性。
实施例3本发明中纤溶酶抑制剂的抗纤溶作用
本实施例中纤溶酶抑制剂制备方法同实施例2，利用纤维蛋白平板溶解实验观察纤溶酶抑制剂的抗纤溶作用。实验方法为：以1×HBSAC缓冲液(25mM HEPES，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH 7.4)配制1.2％的琼脂糖溶液15mL，加热溶解，待冷却至50～60℃，加入1mL已于37℃保温的牛纤维蛋白原溶液10mg/mL，再立即加入100μL凝血酶(200U/mL)混匀后倒入培养皿制成平板。平板打孔，在孔中分别加入相应浓度的重组NKI10及其突变体[浓度分别为0nmol/L(等体积生理盐水)、500nmol/L、1 000nmol/L、2 000nmol/L]和纤溶酶(2000nmol/L)各5μL，每个浓度3孔，于37℃温育3h。通过观察平板中孔周纤溶圈大小确定NKI10及其突变体对纤溶酶溶解纤维蛋白的抑制作用，纤溶圈愈小，表明对纤溶酶溶解纤维蛋白的抑制作用愈强。
如图1，在相同的纤溶酶浓度下，随着每孔中加入NKI10浓度的增加，孔周纤溶圈缩小，加入等摩尔浓度的NKI10和纤溶酶的孔周围已无明显的纤溶圈(图1，D1、D2及D3孔)，表明NKI10具有非常显著的抗纤溶作用，且其抗纤溶作用具有浓度依赖关系。对NKI10的突变体NKI10-1(SEQ ID NO.2)、NKI10-2(SEQ ID NO.3)、NKI10-3(SEQ ID NO.4)、NKI10-4(SEQ IDNO.5)、NKI10-5(SEQ ID NO.6)、NKI10-6(SEQ ID NO.7)、NKI10-7(SEQ ID NO.8、NKI10-8(SEQ ID NO.9)及NKI10-9(SEQ ID NO.10)的抗纤溶实验均表明它们具有非常强的抗纤溶作用。因此，本实施例的结果表明本发明的纤溶酶抑制剂可作为药物应用于预防或治疗纤溶亢进相关性疾病。
实施例4纤溶酶抑制剂对小鼠尾出血时间的影响
本实施例中的纤溶酶抑制剂制备方法同实施例2。取Balb/c小鼠40只(实验动物证：SCXK(粤)2013-0008；SYXK(粤)2015-0147)，雌雄各半，体重18～22g，随机分为8组，每组5只，分别为：生理盐水对照组、重组NKI10(SEQ ID NO.1)组，重组NKI10-1(SEQ ID NO.2)组、重组NKI10-2(SEQ ID NO.3)组、重组NKI10-3(SEQ ID NO.4)组、重组NKI10-4(SEQ IDNO.5)组、重组NKI10-5(SEQ ID NO.6)组及重组NKI10-6(SEQ ID NO.7)组。腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉Balb/c小鼠，各鼠尾静脉注射50μg人组织纤溶酶原激活剂(tPA)(法国HBM)10min后，分别尾静脉注射给予本发明中的纤溶酶抑制剂1.0mg·kg-1或等体积生理盐水。给药2min后，将距小鼠尾尖约0.5cm处剪断并置于37℃生理盐水中，记录小鼠从剪断到出血停止的时间即为出血时间，即是尾出血时间，以均数±标准差表示。
结果见表1，与生理盐水对照组比较，重组NKI10及其突变体各组的尾出血时间显著减少(P<0.05)。结果表明本发明中纤溶酶抑制剂可作为减少出血的药物应用于出血相关疾病，尤其可用于手术中减少失血以减少输血需求。
表1本发明中纤溶酶抑制剂对纤溶小鼠尾出血时间的影响(n＝5)
*与对照组比较，P<0.05
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 一种纤溶酶抑制剂及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Met Lys Gly Ser Gly His Leu Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Pro Cys Arg Ala Lys Met Glu Arg Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser
20 25 30
Gly Lys Cys Lys Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn
35 40 45
Asn Phe Glu Ser Glu Glu Lys Cys Lys Lys Arg Cys Lys Val Asp
50 55 60
<210> 2
<211> 57
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 2
Gly His Leu Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Arg Ala Lys
1 5 10 15
Met Glu Arg Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe
20 25 30
Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu
35 40 45
Lys Cys Lys Lys Arg Cys Lys Val Asp
50 55
<210> 3
<211> 51
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Arg Ala Lys Met Glu Arg
1 5 10 15
Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe Ile Tyr Gly
20 25 30
Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu Lys Cys Lys
35 40 45
Lys Arg Cys
50
<210> 4
<211> 57
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 4
Gly His Leu Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Lys Ala Lys
1 5 10 15
Met Glu Arg Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe
20 25 30
Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu
35 40 45
Lys Cys Lys Lys Arg Cys Lys Val Asp
50 55
<210> 5
<211> 57
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 5
Gly His Leu Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg
1 5 10 15
Met Glu Arg Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe
20 25 30
Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu
35 40 45
Lys Cys Lys Lys Arg Cys Lys Val Asp
50 55
<210> 6
<211> 57
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 6
Gly His Leu Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Arg Ala Arg
1 5 10 15
Met Glu Arg Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe
20 25 30
Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu
35 40 45
Lys Cys Lys Lys Arg Cys Lys Val Asp
50 55
<210> 7
<211> 51
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Lys Ala Lys Met Glu Arg
1 5 10 15
Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe Ile Tyr Gly
20 25 30
Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu Lys Cys Lys
35 40 45
Lys Arg Cys
50
<210> 8
<211> 51
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 8
Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg Met Glu Arg
1 5 10 15
Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe Ile Tyr Gly
20 25 30
Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu Lys Cys Lys
35 40 45
Lys Arg Cys
50
<210> 9
<211> 51
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Arg Ala Arg Met Glu Arg
1 5 10 15
Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe Ile Tyr Gly
20 25 30
Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu Lys Cys Lys
35 40 45
Lys Arg Cys
50
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> 美洲板口线虫或人工序列(Necator americanus or Artificial Sequence)
<400> 10
Gly His Leu Cys Asn Gly Asp Leu Leu Pro Gly Pro Cys Arg Val Lys
1 5 10 15
Met Glu Arg Trp Gly Leu Asp Lys Glu Ser Gly Lys Cys Lys Lys Phe
20 25 30
Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu
35 40 45
Lys Cys Lys Lys Arg Cys Lys Val Asp
50 55

Claims (5)

1.一种纤溶酶抑制剂及其应用，该抑制剂氨基酸序列为：SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于应用于预防或治疗纤溶亢进相关疾病。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于应用于预防或治疗出血相关疾病。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述纤溶酶抑制剂作为组分应用于止血制剂或止血材料。
5.如权利要求3所述的出血相关疾病为外科手术中失血。
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