CN108660234A

CN108660234A - 与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362

Info

Publication number: CN108660234A
Application number: CN201711295539.4A
Authority: CN
Inventors: 邹洪锋; 蔡伟; 崔巨多; 肖建军; 杨祖荣
Original assignee: Zhongyuan Huada Agricultural Technology Co Ltd; Shenzhen Huada Millet Industry Ltd By Share Ltd
Current assignee: Zhongyuan Huada Agricultural Technology Co Ltd; Shenzhen Huada Millet Industry Ltd By Share Ltd
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2018-10-16

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，该分子标记含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在谷子叶片颜色基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子叶片颜色基因定位方法、以及一种谷子育种方法。本发明发现了与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362，该分子标记与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为1.7cM，将谷子基因组DNA序列与谷子叶片颜色基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于谷子辅助育种，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

Description

与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记，具体地，涉及一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在谷子叶片颜色基因定位或谷子遗传育种中的用途、一种谷子叶片颜色基因定位方法、以及一种谷子育种方法。

背景技术

谷子是起源于我国的重要粮食作物，也是特色抗旱作物，种子萌发只需要占其重量26％的水分，而高粱、小麦和玉米的种子萌发分别需要其重量的40％、45％和48％的水分，同时谷子对低土壤肥力的忍耐力较高。谷子是环境友好型作物，也是二倍体自花授粉作物，基因组约470M，非常适合作为基因组研究对象。

植物叶色是叶绿体中各种色素的综合表现，正常叶片中叶绿素占优势，通常表现为绿色。叶色变异是高等植物中突变频率较高且易于鉴定的突变性状。迄今为止，在水稻、小麦、大麦、玉米、大豆、棉花、烟草、玉米、向日葵、番茄、黄瓜、马铃薯、桑树等几乎所有高等植物中都发现了叶色突变体。其突变基因直接或间接影响光和色素，特别是叶绿素的合成和降解，导致各种色素的含量和比例改变，从而引起植物叶色变异。

华大基因研究院早在2009年已共同启动对谷子基因组学研究项目，并于2011年完成了阶段性研究，其成果于2012年5月在国际著名杂志《自然-生物技术》(NatureBiotechnology)上在线发表。目前，遗传连锁图谱的构建已成为基因定位、图位克隆以及基因组结构与功能研究的重要基础，而分子标记又是构建遗传连锁图谱的基础。叶片颜色直接关系到作物光合作用效率，是高产和稳产的重要农艺性状。因此，迫切需要发现与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。

发明内容

本发明人根据谷子全基因组序列，根据大量的数据分析和实验，提供了一种与谷子(Setaria italica L.Beauv.)叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362，并由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362，所述分子标记为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。其中加下划线部分为引物设计区段：

CAGGTCTACTATTCAAGTCCAATCTCTTTTGACGTACAATCCAACTATAACCTAAGGACATTGCGTTTGTAATGTGTTTGGTACTACGATTCGCACCCATCCGGGTGCCGGAAAACAAGACATGTCACGCTTGAATTTACCAAGACATACTTTTTTTTGTAGACGAAAGCATCAAAACAAACTGGTCCGACAATCCCTGCACTTTCCCATTCTTTGCTTATTTCTCCCATCACCAAGTTGTCTGCACACAGAAAGAGGGAGGAAAGCACAAGACCCAGTCTCCCCAATGCCCCCCATAGACCAAGTTT GGTTAGACAAGCAAGG(SEQ ID NO:1)

在本发明中，术语“与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记”是指这样的分子标记，在遗传连锁图谱中，该分子标记与谷子叶片颜色基因的遗传连锁距离小于2cM或者小于3cM；或者在谷子的大于400个样本中，叶片绿色型的样本中含有该分子标记。叶片绿色型的确定参见后文中的描述。

本发明的还一方面涉及扩增本发明的分子标记SIsv0362的引物对，所述引物对的引物1为含有SEQ ID NO:2所示序列，引物2为含有SEQ ID NO:3所示序列；优选地，引物1为SEQ ID NO:2所示序列，引物2为SEQ ID NO:3所示序列；

SIsv0362F：5’-CCTTGCTTGTCTAACCAAAC-3’(SEQ ID NO:2)

SIsv0362R：5’-CAGGTCTACTATTCAAGTCC-3’(SEQ ID NO:3)

本发明的分子标记也可以为含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA片段，该DNA片段的长度为适当长度，但并不特别限定，例如，小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000、或者小于800bp。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段)为谷子基因组中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因组中的序列，优选地，为谷子基因组中SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测谷子基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有SEQ ID NO：1所示的序列。SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的SEQ ID NO：1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于SEQ ID NO：1的一个位置上，以致该控制序列指导SEQ ID NO：1编码的多肽的产生。

本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的分子标记。所述重组载体可以是***有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。本发明的还一方面涉及一种重组细胞，其含有该重组载体。

本发明的还一方面涉及一种制备本发明的分子标记的方法，包括下述步骤：使用叶片绿色型的谷子基因组DNA作为模板，以上述引物对进行PCR扩增，得到的扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增的产物进行纯化的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述叶片绿色型谷子为张谷1号、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的F₂代中的叶片绿色型。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。

本发明的还一方面涉及一种检测所述分子标记的方法，包括下述步骤：

(1)根据本发明的分子标记的核苷酸序列设计引物；

(2)以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；

(3)判断扩增产物中是否存在该分子标记。

优选地，所述引物为上述分别含有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的引物对。

例如，可以以被检测谷子的基因组DNA为模板，以上述引物(SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3)进行PCR扩增，得到扩增产物，可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记或该分子标记的引物在谷子叶片颜色基因定位或检测中的用途。

本发明的还一方面涉及本发明的分子标记或该分子标记的引物在谷子辅助育种中的用途。

本发明的还一方面涉及一种谷子叶片颜色基因定位的方法，包括使用本发明的分子标记或该分子标记的引物的步骤。

本发明的还一方面涉及一种谷子辅助育种方法，包括检测本发明的分子标记或用该分子标记的引物进行检测的步骤。

本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选谷子叶片颜色是否为绿色(例如，可以参考，DNA分子标记在小麦抗病育种中的用途，陇东学院学报(自然科学版)，2006年4月第16卷第1期，P65-69)。检测出具有本发明的分子标记的谷子叶片颜色为绿色，不具有该分子标记的谷子叶片颜色为黄色。所述检测可以是PCR检测方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记引物。所述检测还可以通过测序的方法进行。该谷子辅助育种方法具有快速、简便、高通量的优点。

在本发明中，具体地，所述谷子可以为张谷1号、谷子A2不育系、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的F₂代。其中，谷子A2不育系、张杂谷3号自交产生的部分F₂代为叶片黄色型；张谷1号、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的部分F₂代为叶片绿色型。

发明的有益效果

本发明提供了与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，并将谷子基因组DNA与谷子叶片颜色基因联系起来，更有利于谷子分子标记辅助育种体系的建立；所述的分子标记与叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为1.7cM。本发明的分子标记、扩增引物可以对谷子叶片颜色基因进行良好分型，为实现谷子叶片颜色的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持，可以简便、快速、高通量地应用于谷子辅助育种，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

附图说明

图1：分子标记引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对F₂代480个单株扩增的部分结果。其中：

泳道2、8、10、11、12、14、15、17、19、20、21、23、24为F₂代中13株叶片绿色型的单株PCR扩增产物。泳道1、3～7、9、13、16、18、22为F₂代中11株叶片黄色型的单株PCR扩增产物。泳道M为marker，其为D2000；其分子量包括2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。结果显示：叶片绿色型的植株中条带大小为324bp，叶片黄色型的植株中条带大小为742bp。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方案进行详细说明，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径或者市购获得的常规产品。

实施例1：谷子遗传群体的构建

父本为张谷1号：高株型，叶片绿色，抗拿捕净(一种除草剂)，旗叶长而窄，刚毛红色，颖壳红色，可育。

母本为A2不育系：矮株型，叶片黄色，不抗拿捕净，旗叶短而宽，刚毛绿色，颖壳绿色，部分不育。

父本和母本杂交得到F₁(叶片绿色型)，F₁自交共得到480个F₂代单株。对480个F₂单株进行叶片颜色性状分析，发现叶片绿色型360株，叶片黄色型120株。

实施例2：父母本以及F₁代、F₂代个体基因组DNA的提取

用CTAB法分别提取父母本、F₁代和实施例1中获得的480个谷子F₂单株的基因组DNA，具体方法如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL1.5×CTAB冲洗，再转入离心管中，混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：15g的CTAB、75mL的1mol/L Tris.HCl(pH为8.0)、30mL的0.5mol/L EDTA、61.4g的NaCl，加去离子水定容至1L，使用前加入2ml的巯基乙醇，使巯基乙醇的终浓度为0.2ml/100ml。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。

(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。

(6)将得到的父母本、F₁代和480个谷子F₂单株的基因组DNA存于-20℃备用。

实施例3：分子标记的制备

以实施例2中提取的父本、F₁代、或F₂代中的叶片绿色型的基因组DNA为模板，以分子标记引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)进行PCR扩增。

a.PCR反应体系：25μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL模板DNA、0.5μL引物F、0.5μL引物R、0.15μL dNTPs(10mM)、0.15μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2.5μL 10×PCRBuffer、ddH₂O补齐25μL，混匀，离心。

b.扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟，PCR扩增产物可以在4℃保存。

c.将扩增产物纯化，得到分子标记。纯化后进行测序，结果如SEQ ID NO:1所示。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子标记。

实施例4：分子标记扩增引物的初步筛选

对父本进行de novo测序(60X contig N50:22K，scaffold N50:320K；Totalsize:400Mb)，母本进行重测序(10X)。

根据父母本测序数据，利用SOAP软件(例如SOAP2.20，可以从http://soap.genomics.org.cn/下载，也可以使用其它的序列比对软件)比较父母本之间的序列差异，然后基于差异的序列，在父本5’端和3’端外侧约50bp位置，随机选取20bp左右长度的序列，用primer premier软件随机设计引物，一共1105对引物，下面的表1中列出了其中的部分引物的序列(SEQ ID NO:2-41)。

表1:1105对随机引物中的部分引物

分别以实施例2中提取的父母本及F₁代的基因组DNA为模板，以设计的1105对引物进行PCR扩增，PCR反应体系其它条件和程序与实施例3中类似。

将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，以检测引物的有效性和多态性。在此有效性是指是否具有扩增产物；多态性是指父母本间扩增产物的片段大小有差异。

按照如下的筛选标准进行引物的筛选：父母本及F₁均有扩增产物，并且父母本扩增产物均只有一条明晰的带型且大小有差异，F₁表现有父母本带型的杂合带型，即有父本和母本带型的两条带。

筛选结果：从随机设计的1105对引物中筛选出616对引物。

实施例5：谷子F₂代遗传连锁图谱的构建及基因定位

(1)遗传图谱构建

利用实施例4中筛选出的616对分子标记引物对F₂群体的480个个体分别进行PCR检测，所用模板为实施例2中制得的F₂群体的480个个体的基因组DNA，PCR体系的其它成分及PCR程序与实施例4相同。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中分子标记引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)对480个个体扩增的部分结果如图1所示。

将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将F₂群体单株扩增条带为父本型的记为a，扩增条带为母本型的记为b，扩增条带同时含有父本型和母本型的记为h，都没有的记为-，最终得到F₂群体480个个体的616对引物扩增的基因型数据。比如，用第一对引物得到的480个个体的数据是a，b，h，-，b，……共480个数据，用第二对引物得到的数据为b，a，h，a，-，……共480个数据，共616对引物分别统计，所得即为该F₂群体的基因型数据。

用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，SLincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。遗传连锁图上标明了616对引物的位置及与叶片颜色基因的遗传距离。

(2)基因定位

根据480个个体的叶片颜色表型，与父本型性状相似的记为a(叶片颜色绿色型)，与母本型性状相似的记为b(叶片颜色黄色型)，性状居于父本和母本之间的记为h，得到480个个体的表型数据，将480个个体的表型数据与之前得到的480个个体的基因型数据进行比较，相似高则代表该标记与叶片颜色性状紧密连锁。

根据上述结果将叶片颜色基因定位在遗传连锁图谱上。

实施例6：与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记的验证

1.在实施例5制得的遗传连锁图谱的基础上，根据与谷子叶片颜色基因的遗传连锁距离，在与谷子叶片颜色基因的遗传紧密连锁距离为1.7cM的位置确定了分子标记引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)，并找到对应的父本序列位置，上下游引物之间的序列即为分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.在实施例5中的对F₂代的480个个体的PCR扩增产物电泳中，分子标记引物(SEQID NO:2和SEQ ID NO:3)的扩增结果是：453个叶片绿色型的扩增产物均有324bp大小的条带，而27个叶片黄色型的PCR扩增产物均有742bp的条带，并且经测序证明该324bp的核苷酸序列与SEQ ID NO:1相同。

可见，本发明的分子标记(SEQ ID NO:1)为与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对这些实施例进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 深圳华大小米产业股份有限公司

中原华大农业科技有限公司

<120> 与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0362

<130> P2017-1-0173.CN

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> Setaria italica

<400> 1

caggtctact attcaagtcc aatctctttt gacgtacaat ccaactataa cctaaggaca 60

ttgcgtttgt aatgtgtttg gtactacgat tcgcacccat ccgggtgccg gaaaacaaga 120

catgtcacgc ttgaatttac caagacatac ttttttttgt agacgaaagc atcaaaacaa 180

actggtccga caatccctgc actttcccat tctttgctta tttctcccat caccaagttg 240

tctgcacaca gaaagaggga ggaaagcaca agacccagtc tccccaatgc cccccataga 300

ccaagtttgg ttagacaagc aagg 324

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttgcttgt ctaaccaaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtctact attcaagtcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

gccatgccat ctgcgttctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

actctgatcg caacaaggac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

cttcacactt cccacttcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 7

aagtttgcga gcaagcacaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 8

cctttgcagc atctgtacgt 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtgtcacgc tcgatcgac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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ctccattgtg gtttgtccac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcttgctat tgcgcatcct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 12

agccagctgg agaagagaat 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 13

cccaagtcca actgaaggc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 14

ctggaatagc cgtagctaat 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 15

ccaacttgca acacgcaaat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 16

ggactgggtc atgaatactg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 17

atggactatt ggactgtatg t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 18

tcgtctccaa gccgtccagt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 19

ccaatgtatt ggccctaagc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 20

gctaaggttc cgatctgtct 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 21

cggatacgag tcgtgtttgt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 22

ccttcaacct gactttgcac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 23

catgacaagg atcgtcacag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 24

ccaagtgtgt atgcgacaag 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 25

ccagcttgct taaggtatca 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 26

gcagtgtgtt tctttcatgg 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 27

gcaatggttg atagatacga t 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 28

ttcgttggct gtagcgttga 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 29

gaagaaatca ccaacataac c 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 30

caggacatcg ccatggtact 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 31

atgaagcgag caagtgaact 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 32

tggattatgt ggagccatgt 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 33

gcattggtct tcttccaagg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 34

gtttctgcgc taatctgatc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 35

ccgaaatggt ggcaattgct 20

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 36

gagtatgtcg accgtagtac t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 37

gtgatggatt tgcttgtcac t 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 38

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<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 39

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<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 40

cctacacacc gctataaacc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 41

atcgtgtacc cagctccgtt 20

Claims

1.一种与谷子叶片颜色基因紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记含有SEQID NO:1所示核苷酸序列；优选地，所述分子标记为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述的分子标记。

3.一种重组细胞，其特征在于：含有权利要求2所述的重组载体。

4.一种扩增权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的引物1为含有SEQ ID NO:2所示序列，引物2为含有SEQ ID NO:3所示序列；优选地，引物1为SEQ IDNO:2所示序列，引物2为SEQ ID NO:3所示序列。

5.一种制备权利要求1所述的分子标记的方法，包括下述步骤：使用叶片绿色型谷子的基因组DNA作为模板，以权利要求4所述的引物对进行PCR扩增；优选地，还包括将PCR扩增的产物进行纯化的步骤；具体地，所述叶片绿色型谷子为张谷1号、张杂谷3号、或张杂谷3号自交产生的F₂代中的叶片绿色型。

6.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，包括下述步骤：根据权利要求1所述的分子标记的核苷酸序列设计引物；以被检测谷子的基因组DNA作为模板进行扩增；判断扩增产物中是否存在该分子标记；优选地，所述引物为权利要求4所述的引物对。

7.权利要求1所述的分子标记或权利要求4所述的分子标记的引物对在谷子叶片颜色基因定位或检测中的用途。

8.权利要求1所述的分子标记或权利要求4所述的分子标记的引物对在谷子辅助育种中的用途。

9.一种谷子叶片颜色基因定位的方法，其特征在于：所述方法包括使用权利要求1所述的分子标记或权利要求4所述的分子标记的引物对的步骤。

10.一种谷子辅助育种方法，其特征在于：所述方法包括检测权利要求1所述的分子标记或用权利要求4所述的分子标记的引物对进行检测的步骤。