CN108660155A

CN108660155A - 过表达靶蛋白的***和方法

Info

Publication number: CN108660155A
Application number: CN201710207100.5A
Authority: CN
Inventors: 胡育诚; 沈志哲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-10-16

Abstract

本发明提供一种过表达靶蛋白的***，所述***包含二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞、叶酸拮抗剂、靶蛋白表达载体和CRISPRi表达载体，其中靶蛋白表达载体包含靶蛋白表达盒和DHFR表达盒，CRISPRi表达载体包含gRNA盒和dCas9表达盒。所述过表达靶蛋白的***可以显著提高靶蛋白的产量，并缩短进行基因扩增的时间。

Description

过表达靶蛋白的***和方法

技术领域

本发明涉及一种DNA重组技术，特别是一种使用载体引入外来遗传材料的DNA重组技术。

背景技术

由于生物体内各种蛋白质控制了生理状态，因此许多疾病与缺乏某些蛋白质有关。蛋白质药物属于大分子药物，可定义为治疗人类疾病而由体外给予的配制蛋白质。蛋白质药物原料以天然的生物材料为主，包括人体、动物、植物和微生物等，因其低毒性以及与人体兼容的优点，为目前新药发展趋势和为我国生物制剂产业发展重要项目之一。

过去蛋白质药物主要来源为从人(血液或尿液)或动物器官(如胰脏)中萃取。这种方法产率和产量都很低，来源不易取得，因此成本非常高。同时由于各种传染病(如艾滋病与狂牛病)盛行，很难保证这些药物不被病原体污染。

以基因工程生产的药物，利用生物细胞为工厂制造，可在实验室中筛检确保不受病原体污染，同时在转染蛋白质基因时，可利用强启动子(strong promoter)使蛋白质表达量增强以提升产量。早期的宿主细胞常选用大肠杆菌或酵母菌，因为此类细胞较易培养，容易利用生化反应器放大生产规模，产量较大且培养基较便宜。但大肠杆菌或酵母菌为较简单的生物，有些蛋白质生产出来会无法适当地折叠成正确的三维形状，或因无法进行适当翻译后处理，而使蛋白质缺乏其应有功能或影响到蛋白质的形状、功能、稳定性和免疫性质等，因此以细菌生产出的蛋白质可能无法达到所要求的药效。

面对此种状况，可选用较高等的生物细胞如中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary,CHO)细胞、人类胚胎肾脏(Human embryonic kidney,HEK)细胞、非洲绿猴肾脏(Vero)细胞等哺乳动物细胞作为生产工具，用以表达需要较精密修饰的蛋白质分子。其中CHO细胞具有不死性，可以传代百代以上，且对于蛋白进行糖基化的糖型与人类基本一致，此外CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，为一种非分泌型细胞，且本身很少分泌CHO内源蛋白，对靶蛋白分离纯化工作十分有利，因此CHO细胞为表达复杂生物大分子的理想宿主。目前CHO细胞基因扩增表达***常用于生产靶蛋白，先前文献报导中指出，利用CHO细胞基因扩增表达***进行基因扩增时，若是逐步增加药物筛选的压力能促使目的基因扩增套数增加，但由于需要逐步增加药物浓度，非常耗时费力，往往需数个月以上才能筛选出高产量细胞株。因此如何有效提高靶蛋白产量并缩短筛选出高产量细胞株始终是相当重要的课题。

发明内容

本发明的一个方面是在提供一种过表达靶蛋白的***，其包含二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO细胞、叶酸拮抗剂、靶蛋白表达载体和CRISPRi表达载体。靶蛋白表达载体包含靶蛋白表达盒和DHFR表达盒，其中靶蛋白表达盒包含第一启动子和靶蛋白的基因，DHFR表达盒包含第二启动子和DHRF基因。CRISPRi表达载体包含gRNA盒和dCas9表达盒，其中gRNA盒包含第三启动子、gRNA序列和终止子，dCas9表达盒包含第四启动子、dCas9-KRAB基因以及抗生素耐受基因。

根据上述的过表达靶蛋白的***，其中所述二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞可为DUXB11细胞株或DG44细胞株。

根据上述的过表达靶蛋白的***，其中所述叶酸拮抗剂可为甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺酰亚胺(Methionine sulfoximine,MSX)。

根据上述的过表达靶蛋白的***，其中所述第一启动子可为CMV启动子或SV40启动子，所述第二启动子可为CMV启动子或SV40启动子，且第二启动子和第一启动子不相同。

根据上述的过表达靶蛋白的***，其中所述第三启动子可为U6启动子，第四启动子可为CMV启动子或SV40启动子。

根据上述的过表达靶蛋白的***，其中所述dCas9表达盒可进一步包含2A肽序列，所述2A肽序列连接KRAB区域和抗生素耐受基因。

根据上述的过表达靶蛋白的***，其中所述抗生素耐受基因可为博莱霉素(Zeocin resistance,Zeo^R)基因。

本发明的另一个方面是提供一种过表达靶蛋白的方法，包含下述步骤：构建靶蛋白表达载体、构建CRISPRi表达载体、建立第一稳定表达细胞株、建立第二稳定表达细胞株和进行基因扩增。所述靶蛋白表达载体包含靶蛋白表达盒和DHFR表达盒，其中靶蛋白表达盒包含第一启动子和靶蛋白的基因，DHFR表达盒包含第二启动子和DHRF基因。所述CRISPRi表达载体包含gRNA盒和dCas9表达盒，其中gRNA盒包含第三启动子、gRNA序列和终止子，dCas9表达盒包含第四启动子、dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因。而建立第一稳定表达细胞株时，是将所述靶蛋白表达载体转染至二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞中，并以筛选培养基进行筛选，以得到第一稳定表达细胞株。建立第二稳定表达细胞株时，是将CRISPRi表达载体转染至所述第一稳定表达细胞株中，并以抗生素进行筛选，以得到第二稳定表达细胞株。进行基因扩增时，是以含有叶酸拮抗剂的培养基培养所述第二稳定表达细胞株，以过表达靶蛋白。

根据上述的过表达靶蛋白的方法，其中所述二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞可为DUXB11细胞株或DG44细胞株。

根据上述的过表达靶蛋白的方法，其中所述筛选培养基可为缺乏核酸的α-MEM。

根据上述的过表达靶蛋白的方法，其中所述抗生素可为博莱霉素(Zeocin)。

根据上述的过表达靶蛋白的方法，其中所述叶酸拮抗剂可为甲氨蝶呤或甲硫胺酸磺酰亚胺。

因此，本发明的过表达靶蛋白的***和过表达靶蛋白的方法，能有效地抑制CHO细胞的DHFR基因表达，进而增加基因扩增后的靶蛋白产量。此外，本发明的过表达靶蛋白***和过表达靶蛋白方法不会影响CHO细胞的生长速度，且与传统方法相比，在进行基因扩增时仅需添加较低剂量的叶酸拮抗剂，而达到传统方法中以高剂量叶酸拮抗剂处理的基因扩增效果，因此可以显著提高靶蛋白的产量，并缩短进行基因扩增的时间。

上述发明内容旨在提供本公开内容的简要概括，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在于指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的说明如下：

图1A绘示pDHFR-2A-EGFP载体的构建示意图；

图1B绘示CRISPRi表达载体的构建示意图；

图2为CRISPRi表达载体以及绿荧光测试模型对CHO细胞的DHFR mRNA表达量影响的分析结果图；

图3A和图3B为CRISPRi表达载体以及绿荧光测试模型对CHO细胞的绿荧光表达的分析结果图；

图4绘示靶蛋白表达载体的构建示意图；

图5为第二稳定表达细胞株的dCas9 mRNA表达量的分析结果图；

图6A和图6B为第二稳定表达细胞株生长速度影响的分析结果图；

图7绘示本发明的过表达靶蛋白方法的步骤流程图；

图8A至图8D为本发明的过表达靶蛋白方法提高靶蛋白产量的分析结果图；

图9A至图9D为本发明的过表达靶蛋白方法提高靶蛋白基因表达量的分析结果图；以及

图10A至图10D为本发明的过表达靶蛋白方法提高靶蛋白的基因套数的分析结果图。

具体实施方式

本说明书中所述的“CRISPRi”是指CRISPR interference(CRISPRi)***，是将修改源自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的第二型CRISPR/Cas9***—改质Cas9蛋白使其失去核酸内切酶活性(RuvC1 and HNH)，被称为dCas9(Cas9 D10A and H841A)，其作用原理一样是通过gRNA或crRNA-trancrRNA复合物的诱导结合至指定基因序列，但却不会对靶基因造成切割，因此可用来阻挡RNA聚合酶进行基因转录，进而抑制基因表达。

现以下列具体实施例进一步示范说明本发明，用以使本领域技术人员可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些实施例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料和方法。

<实施例>

一、本发明的过表达靶蛋白的***

本发明的过表达靶蛋白的***包含二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO细胞、叶酸拮抗剂、靶蛋白表达载体以及CRISPRi表达载体。

二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞可为CHO DUXB11细胞株或CHO DG44细胞株。

叶酸拮抗剂可为甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺酰亚胺(Methioninesulfoximine,MSX)。

靶蛋白表达载体包含靶蛋白表达盒和DHFR表达盒，靶蛋白表达盒包含第一启动子和靶蛋白的基因，DHFR表达盒包含第二启动子和DHRF基因。其中第一启动子可为CMV启动子或SV40启动子，第二启动子可为CMV启动子或SV40启动子，但第一启动子和第二启动子不相同。

CRISPRi表达载体包含gRNA盒和dCas9表达盒，gRNA盒包含第三启动子、gRNA序列和终止子，dCas9表达盒包含第四启动子、dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因。dCas9表达盒还可包含2A肽序列，所述2A肽序列连接dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因。上述第三启动子可为U6启动子，第四启动子可为CMV启动子或SV40启动子，抗生素耐受基因可为博莱霉素(Zeocin resistance,Zeo^R)耐受基因。

1.1.建立CRISPRi表达载体以及绿荧光测试模型

目前在尚无文献报导指出CRISPRi在CHO细胞内对DHFR的抑制效率。因此于本实施例中先测试CRISPRi能否在CHO细胞内有效抑制DHFR基因的表达。为了实现此目标，本实施例首先以绿色荧光蛋白(egfp)基因作为报告基因，构建共同表达DHFR与绿色荧光蛋白的pDHFR-2A-EGFP载体，并构建本发明的过表达靶蛋白***中的CRISPRi表达载体，以建立CRISPRi表达载体以及绿荧光测试模型。

请参照图1A，绘示pDHFR-2A-EGFP载体的构建示意图，pDHFR-2A-EGFP载体中具有1个表达盒，其中包含CMV启动子、DHFR基因和绿色荧光蛋白基因，DHFR基因和绿色荧光蛋白基因以P2A肽连接，在mRNA翻译时核糖体会在DHFR蛋白与绿色荧光蛋白中切断，因此可利用绿色荧光蛋白表达量判断DHFR蛋白的表达量。CMV启动子的序列如序列编号1所示，DHFR基因的序列如序列编号2所示，绿色荧光蛋白基因的序列如序列编号3所示，P2A肽的序列如序列编号4所示。

请再参照图1B，绘示CRISPRi表达载体的构建示意图。于本实施例中所示的一个实施例中，CRISPRi表达载体系以pUseAmp(+)(由Merck Millipore购入)为骨架，***gRNA盒和表达盒而得。gRNA盒包含U6启动子、gRNA序列和终止子，gRNA盒由U6启动子负责转录gRNA，而U6启动子的序列如序列编号5所示，终止子的序列如序列编号6所示。dCas9表达盒包含CMV启动子、dCas9-KRAB基因、博莱霉素抗生素耐受基因以及BGH多聚腺苷酸。dCas9表达盒由CMV启动子转录dCas9-KRAB蛋白并以P2A肽连接博莱霉素抗生素。其中KRAB(Krüppelassociated box)能抑制基因转录，与dCas9连接能增加抑制效果。而CMV启动子的序列如序列编号1所示，dCas9-KRAB基因的序列如序列编号7所示，其中dCas9-KRAB基因的序列依序包含dCas9基因序列、SV40核定位序列(负责将在细胞质表达的dCas9蛋白带入细胞核内)、3倍HA flag序列(可用于后续测定的标签)和KRAB基因。博莱霉素抗生素耐受基因的序列如序列编号8所示，BGH多聚腺苷酸的序列如序列编号9所示。于本实施例中同时构建3组CRISPRi表达载体-pCRISPRi-、pCRISPRi-T和pCRISPRi-NT，分别为空集合组()、模板链组(template strand,T)和非模板链组(non-template strand,NT)，3组CRISPRi表达载体的差异在于gRNA的序列不同，其余部分相同。组的gRNA的序列如序列编号10所示，T组的gRNA的序列如序列编号11所示，NT组的gRNA的序列如序列编号12所示，其中T组与NT组的目标位置(Target site)设计在DHFR的基因内。

试验上将pDHFR-2A-eGFP载体与CRISPRi表达载体共转染进入CHO DUXB11细胞株(购自食品工业发展研究所)内，在转染后48小时后，分别以qRT-PCR分析细胞中DHFR mRNA表达量的改变程度，以及利用荧光显微镜和流式细胞仪分析绿色荧光蛋白的表达量，进而推算CRSIPRi抑制DHFR蛋白的效率。qRT-PCR所使用的正向引物(Q mDHFR F)和反向引物(QmDHFR R)的序列分别如序列编号13和序列编号14所示。

请参照图2至图3B，图2为CRISPRi表达载体以及绿荧光测试模型对CHO细胞的DHFRmRNA表达量影响的分析结果图，其是以组的DHFR mRNA表达量为基准计算T组和NT组的DHFR mRNA表达量。图3A和图3B为CRISPRi表达载体以及绿荧光测试模型对CHO细胞的绿荧光表达的分析结果图，其中图3A为荧光显微镜观察的结果，图3B为流式细胞仪分析荧光强度的结果，图3B的荧光强度是以组的荧光强度为基准计算T组和NT组的荧光强度。

图2的结果显示，T组和NT组的DHFR mRNA表达量与组相较，分别为34.6±4.3％和15.2±0.4％，其DHFR抑制率分别是66±4.3％和85±0.4％，具有显著差异(p<0.05)。图3A的结果显示，T组和NT组的绿色荧光蛋白表达量明显地低于组，而由图3B的结果显示，T组和NT组的绿色荧光蛋白的荧光强度与组相较，分别为50.0±1.6％和21.6±2.8％，显示其DHFR抑制率分别是50.0±1.6％和79±2.8％，并有显著差异(p<0.05)。

由本实施例证实本发明所建立的CRISPRi表达载体在CHO细胞能有效的抑制DHFR基因的表达，且基因转录抑制效率可达85±0.4％，蛋白表达抑制效率可达79％。传统方式以RNAi抑制DHFR表达的效率约为72％，相较之下，本发明的CRISPRi***的抑制效率较高。

1.2.建立过表达靶蛋白的***

由实施例1.1确认了本发明的CIRSPRi表达载体在CHO细胞内能有效抑制DHFR基因表达，预期在CRISPRi抑制DHFR基因表达之下，可以进而增加基因扩增的幅度。于本实施例中进一步构建本发明的靶蛋白表达载体，以建立能够通过基因扩增放大的过表达靶蛋白***。

请参照图4，绘示靶蛋白表达载体的构建示意图。于本实施例中所示的一个实施例中，靶蛋白表达载体为pCMV-EGFP-SD载体，是利用绿色荧光蛋白为靶蛋白来当作测试模型，然而需说明的是，绿色荧光蛋白仅为本发明的一个实施例，靶蛋白的基因可依据所要生产的靶蛋白而进行更改。pCMV-EGFP-SD载体系以pUseAmp(+)(由Merck Millipore购入)为骨架，并***靶蛋白表达盒和DHFR表达盒。其中靶蛋白表达盒包含CMV启动子、绿色荧光蛋白的基因和BGH多聚腺苷酸，DHFR表达盒包含SV40启动子、DHRF基因和BGH多聚腺苷酸。绿色荧光蛋白的基因与DHFR基因分别由CMV启动子与SV40启动子进行转录，而CMV启动子的序列如序列编号1所示，绿色荧光蛋白基因的序列如序列编号3所示，BGH多聚腺苷酸的序列如序列编号9所示，DHFR基因的序列如序列编号2所示，SV40启动子的序列如序列编号15所示。

试验上先将pCMV-eGFP-SD载体转染进入CHO DUXB11细胞株后，利用缺乏核酸的α-MEM培养筛选出稳定表达的细胞群，并以荧光显微镜挑选出表达绿荧光的第一稳定表达细胞株，再转染pCRSIRPi表达载体至第一稳定表达细胞株中，并且外加博莱霉素(Zeocin)进行筛选，筛选出同时稳定表达两种载体的第二稳定表达细胞株。试验分成三组，第一组为无转染CRISPRi表达载体的对照组，第二组为转染pCRISPRi-的组，第三组为转染pCRISPRi-NT的NT组。在此对照组代表传统方法，组为比较额外表达dCas9蛋白和gRNA是否会影响目标靶蛋白产量的组别，NT组则是测试CRISPRi专一抑制DHFR是否能增加靶蛋白产量的组别。筛选出对照组、组和NT组的第二稳定表达细胞株后，以qRT-PCR相对定量法分析细胞内是否表达dCas9，qRT-PCR所使用的正向引物(Q dCas9 F)和反向引物(Q dCas9 R)的序列分别如序列编号16和序列编号17所示。

请参照图5，为第二稳定表达细胞株的dCas9 mRNA表达量的分析结果图，其中以第二稳定表达细胞株2-1的dCas9 mRNA表达量为基准值，来计算其他第二稳定表达细胞株的dCas9 mRNA表达量。结果显示，有转染CRISPRi表达载体组别(组及NT组)的单株细胞均有稳定表达dCas9基因。

1.3.本发明的过表达靶蛋白的***对细胞生长速度的影响

为验证CRSIPRi是否会造成细胞生长速度的影响，本试验进一步将实施例1-2中的对照组、组和NT组分别以1x10⁵的细胞密度接种于6孔盘，每隔一日计算贴附在表面的细胞数量，并取其对数生长期(48-120小时)的细胞密度，计算细胞的倍增时间(Doublingtime)。

请参照图6A和图6B，为第二稳定表达细胞株生长速度影响的分析结果图，其中图6A为第二稳定表达细胞株的生长曲线图，图6B为第二稳定表达细胞株的倍增时间统计图。图6A的结果显示，三组第二稳定表达细胞株的生长速度并无显著差异。此外图6B的结果显示，对照组的第二稳定表达细胞株平均***时间约22.5±0.8小时，组的第二稳定表达细胞株平均***时间约26.7±1.9小时，NT组的第二稳定表达细胞株平均***时间约23.8±0.6小时，虽NT组的第二稳定表达细胞株平均***时间较对照组较久，但无统计意义(p>0.05)。由本实施例的结果显示，本发明的过表达靶蛋白***不会影响CHO细胞的生长速度。

二、本发明的过表达靶蛋白的方法

请参照图7，为本发明的过表达靶蛋白方法100的步骤流程图。图7中，过表达靶蛋白方法100包含步骤110、步骤120、步骤130、步骤140和步骤150。

步骤110为构建靶蛋白表达载体，靶蛋白表达载体包含靶蛋白表达盒和DHFR表达盒，其中靶蛋白表达盒包含第一启动子和靶蛋白的基因，DHFR表达盒包含第二启动子和DHRF基因。其中第一启动子可为CMV启动子或SV40启动子，第二启动子可为CMV启动子或SV40启动子，但第一启动子和第二启动子不相同。

步骤120为构建CRISPRi表达载体，所述CRISPRi表达载体包含gRNA盒和dCas9表达盒，其中gRNA盒包含第三启动子、gRNA序列和终止子，dCas9表达盒包含第四启动子、dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因。dCas9表达盒还可包含2A肽序列，所述2A肽序列连接dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因。上述第三启动子可为U6启动子，第四启动子可为CMV启动子或SV40启动子，抗生素耐受基因可为博莱霉素(Zeocin resistance,Zeo^R)耐受基因。

步骤130为建立第一稳定表达细胞株，是将所述靶蛋白表达载体转染至二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞中，并以筛选培养基进行筛选，以得到第一稳定表达细胞株。所述二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞可为CHO DUXB11细胞株或CHO DG44细胞株。而转染的方式可利用磷酸钙转染法、电穿孔转染法或脂质体转染法。所述筛选培养基可为缺乏核酸的α-MEM。

步骤140为建立第二稳定表达细胞株，是将CRISPRi表达载体转染至所述第一稳定表达细胞株中，并以抗生素进行筛选，以得到第二稳定表达细胞株。所述抗生素可为博莱霉素。

步骤150为进行基因扩增，进行基因扩增时，是以含有叶酸拮抗剂的培养基培养所述第二稳定表达细胞株，以过表达靶蛋白。所述叶酸拮抗剂可为甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺酰亚胺(Methionine sulfoximine,MSX)。

2.1.本发明的过表达靶蛋白的方法能提高靶蛋白产量

为测试本发明的过表达靶蛋白方法是否能提高靶蛋白产量，于本实施例中先将pCMV-eGFP-SD载体转染进入CHO DUXB11细胞株后，利用缺乏核酸的α-MEM培养筛选出稳定表达的第一稳定表达细胞株，再转染pCRSIRPi表达载体至第一稳定表达细胞株中，并且外加博莱霉素筛选，筛选出同时稳定表达两种载体的第二稳定表达细胞株。再利用添加MTX的培养基进行基因扩增。试验分成三组，第一组为无转染CRISPRi表达载体的对照组，第二组为转染pCRISPRi-的组，第三组为转染pCRISPRi-NT的NT组，每组各挑6个第二稳定表达细胞株进行基因扩增，利用逐步提升MTX药剂浓度达到基因扩增的效果。先以浓度为50nM的MTX筛选四周后，再将MTX浓度提高到250nM持续筛选四周。

在完成基因扩增后，每组挑选出4株第二稳定表达细胞株，分别以荧光显微镜和流式细胞仪进行分析绿色荧光蛋白是否成功扩增。其中对照组所挑选的第二稳定表达细胞株分别为1-1、1-2、1-4、1-5，组所挑选的第二稳定表达细胞株分别为2-1、2-2、2-4、2-5，NT组所挑选的第二稳定表达细胞株分别为3-1、3-3、3-4、3-6。

请参照图8A至图8D，为本发明的过表达靶蛋白方法提高靶蛋白产量的分析结果图，其中图8A为进行基因扩增前CHO细胞的绿色荧光蛋白表达的显微照片图，图8B为进行基因扩增后CHO细胞的绿色荧光蛋白表达的显微照片图，图8C为进行基因扩增前CHO细胞的绿色荧光蛋白表达强度统计图，图8D为进行基因扩增后CHO细胞的绿色荧光蛋白表达强度统计图。

图8A和图8B的结果显示，在尚未进行基因扩增前(0nMMTX)，对照组、组和NT组的绿色荧光蛋白表达量较低，在进行基因扩增后(250nM MTX)后，三组的绿色荧光蛋白表达量均有上升。且与对照组和组相比，NT组的4个第二稳定表达细胞株的绿色荧光蛋白表达量有明显提高。

而图8C和图8D的结果显示，在进行基因扩增前，对照组的荧光强度平均为85±9a.u.，组平均荧光强度为121±14a.u.，NT组平均荧光强度为161±23a.u.，三组之间无统计差异(p>0.05)。在进行基因扩增后，对照组荧光强度平均为712±86a.u.，组平均荧光强度为670±41a.u.，NT组平均荧光强度为2722±632a.u.，其中NT组荧光强度明显上升且具有统计意义(p<0.05)，而组与对照组之间并无显著差异(p>0.05)，代表额外表达dCas9蛋白和gRNA并不影响第二稳定表达细胞株对于靶蛋白的产量。

由本实施例的结果可知，利用本发明的过表达靶蛋白方法抑制DHFR基因，能够增加基因扩增后的靶蛋白产量，且与传统方式相比能够增加绿色荧光蛋白3.8倍表达量。

2.2.本发明的过表达靶蛋白的方法能提高靶蛋白基因表达量

为测试本发明的过表达靶蛋白方法是否能提高靶蛋白基因表达量，于本实施例中进一步利用qRT-PCR进行绿色荧光蛋白基因和DHFR基因的相对定量，并以未进行基因放大的组2-1单株细胞作为基准值进行比较。其中qRT-PCR所使用的引物为QEGFP F、Q EGFP R、Q mDHFR F和Q mDHFR R，Q EGFP F的序列如序列编号18所示，Q EGFP R的序列如序列编号19所示，Q mDHFR F的序列如序列编号13所示，Q mDHFR R的序列如序列编号14所示。

请参照图9A至图9D，为本发明的过表达靶蛋白方法提高靶蛋白基因表达量的分析结果图，其中图9A为进行基因扩增前CHO细胞的绿色荧光蛋白基因表达量的分析图，图9B为进行基因扩增后CHO细胞的绿色荧光蛋白基因表达量的分析图，图9C为进行基因扩增前CHO细胞的DHFR基因表达量的分析图，图9D为进行基因扩增后CHO细胞的DHFR基因表达量的分析图。

图9A和图9B为绿色荧光蛋白基因于基因扩增前后的改变程度，结果显示，在进行基因扩增前，对照组平均绿色荧光蛋白基因表达量为1.05±0.02倍，组平均绿色荧光蛋白基因表达量为1.06±0.03倍，NT组平均绿色荧光蛋白基因表达量为1.06±0.05倍，三组之间并无统计上的差异(p>0.05)。在进行基因扩增后，对照组平均绿色荧光蛋白基因表达量为4.6±0.2倍，组平均绿色荧光蛋白基因表达量为2.6±0.1倍，NT组平均绿色荧光蛋白基因表达量为8.8±0.3倍，其中NT组比对照组高1.94倍，且具有统计意义(p<0.05)。

图9C和图9D为DHFR基因于基因扩增前后的改变程度，结果显示，在进行基因扩增前，对照组平均DHFR基因表达量为4.07±1.3倍，组平均DHFR基因表达量为3.73±1.0倍，NT组平均DHFR基因表达量为1.58±0.3倍，三组之间并无统计上的差异(p>0.05)。在进行基因扩增后，对照组平均DHFR基因表达量为39.02±1.4倍，组平均DHFR基因表达量为33.51±4.2倍，NT组平均DHFR基因表达量为67.1±10.6倍，其中NT组比对照组高1.7倍，且具有统计意义(p<0.05)。

由本实施例的结果可知，利用本发明的过表达靶蛋白方法抑制DHFR基因，能增加筛选压力进而增加靶蛋白基因的表达量，且在有CRISPRi-NT的表达下，绿色荧光蛋白基因表达量增加1.94倍，DHFR基因表达量增加1.7倍。

2.3.本发明的过表达靶蛋白的方法能提高靶蛋白基因表达量

在上述实施例中证实了本发明的过表达靶蛋白方法能有效增加靶蛋白表达量以及靶蛋白的基因表达量，于本实施例中进一步利用绝对定量的方式测定绿色荧光蛋白基因套数以及DHFR基因套数的变化。

试验上先使用Genomic DNA mini试剂盒(Geneaid)自第二稳定表达细胞株中抽取总基因组DNA。再取6ng总基因组DNA，使用对DHFR基因或绿色荧光蛋白基因特异性的引物组(QmDHFR F、Q mDHFR R、Q EGFP F和Q EGFP R)进行Q-PCR。为了定量绝对基因套数，序列稀释p-CMV-EGFP-2A-DHFR载体(4、0.4、0.04、0.004和0.0004μg)，并利用Q-PCR定量以产生标准曲线。再假设6ng总基因组DNA为1820个基因组DNA分子，对每个细胞的DHFR基因和绿色荧光蛋白基因的基因套数进行绝对定量。

请参照图10A至图10D，为本发明的过表达靶蛋白方法提高靶蛋白的基因套数的分析结果图，其中图10A为进行基因扩增前CHO细胞的绿色荧光蛋白基因套数的分析图，图10B为进行基因扩增后CHO细胞的绿色荧光蛋白基因套数的分析图，图10C为进行基因扩增前CHO细胞的DHFR基因套数的分析图，图10D为进行基因扩增后CHO细胞的DHFR基因套数的分析图。

图10A和图10B为绿色荧光蛋白基因套数在基因扩增前后的改变，结果显示，在进行基因扩增前，对照组平均绿色荧光蛋白基因套数为每个细胞0.73±0.04套，组平均绿色荧光蛋白基因套数为每个细胞0.76±0.07套，NT组平均绿色荧光蛋白基因套数为每个细胞0.46±0.05套，三组之间并无统计上的差异(p>0.05)。在进行基因扩增后，对照组平均绿色荧光蛋白基因套数为每个细胞12.1±3.6套，组平均绿色荧光蛋白基因套数为每个细胞8.9±1.07套，NT组平均绿色荧光蛋白基因套数为每个细胞56.3±0.5套，NT组比对照组高3.5倍，且具有统计意义(p<0.05)。

图10C和图10D为DHFR基因套数在基因扩增前后的改变，结果显示，在进行基因扩增前，对照组平均DHFR基因套数为每个细胞2.0±0.3套，组平均基因套数为每个细胞1.9±0.3套，NT组平均基因套数为每个细胞1.6±0.2套，三组之间并无统计上的差异(p>0.05)。在进行基因扩增后，对照组平均基因套数为每个细胞21.3±3.0套，组平均基因套数为每个细胞11.3±1.5套，NT组平均基因套数为每个细胞65.2±10.2套，NT组比对照组高3倍，且具有统计意义(p<0.05)。

由本实施例的结果可知，本发明的过表达靶蛋白方法在基因扩增时，利用CRISPRi抑制DHFR基因能提高基因扩增的效率，且在有CRISPRi-NT的表达下，绿色荧光蛋白基因扩增量为对照组的3.5倍，DHFR基因扩增量为对照组的3倍。

因此，本发明的过表达靶蛋白***和过表达靶蛋白方法，能有效地抑制CHO细胞的DHFR基因表达，其抑制效率达85±0.4％。而后续进行基因扩增时因可有效抑制DHFR基因表达，以增加基因扩增时的筛选压力，进而大幅增加靶蛋白的产量。与传统方法相比，本发明的过表达靶蛋白***和过表达靶蛋白方法可增加绿色荧光蛋白3.8倍表达量，而绿色荧光蛋白的基因表达量也提升3.5倍，且绿色荧光蛋白的基因套数也扩增3.5倍。此外，本发明得过表达靶蛋白***和过表达靶蛋白方法不会影响CHO细胞的生长速度，且与传统方法相比，在进行基因扩增时仅需以250nM的MTX处理，就能达到传统方法利用1000nM的MTX处理下的基因扩增效果，大幅缩减进行基因扩增的时间，因此可以显著提高靶蛋白的产量，并缩短进行基因扩增的时间。

然而本发明虽然已经以实施方式公开如上，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种更改和润饰，因此本发明的保护范围应当以所附的权利要求所限定的范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 胡育诚

<120> 过表达靶蛋白的***和方法

<130> TWLB7370-17P1

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMV启动子

<400> 1

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)

<400> 2

atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac 60

ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 120

acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180

attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240

aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300

attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggtct ggatagtcgg aggcagttct 360

gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420

caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480

ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540

gaagtctacg agaagaaagg c 561

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 绿色荧光蛋白基因

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A肽

<400> 4

ggatctggcg ccaccaactt cagcctgctg aagcaggcag gcgacgtgga agagaaccct 60

ggccct 66

<210> 5

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6启动子

<400> 5

tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattgga 60

attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 120

tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc 180

gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acg 233

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止子

<400> 6

ttttttgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccg 48

<210> 7

<211> 4452

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dCas9-KRAB基因

<400> 7

atggacaaga agtactccat tgggctcgct atcggtacca acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggagcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagctggtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcac 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga ggagaacccg 600

atcaacgcat ccggcgttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc tgcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctga acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgctcg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagagac gccgatatac aggatggggg 1980

cggctgtcaa gaaaactgat caatggcatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aaccggttgt ccgactacga cgtggatgct 2520

atcgtgcccc aaagctttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc tggaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc gcaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatccagct tcgagaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgaag cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gctgcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgagttctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agacggcacc ggcgggccca agaagaagag gaaggtatac 4140

ccatacgatg ttcctgacta tgcgggctat ccctatgacg tcccggacta tgcaggatcg 4200

tatccttatg acgttccaga ttacgctatg gacgcgaaat cacttacggc atggtcgaga 4260

acactggtta cgttcaagga cgtgtttgtg gactttacac gtgaggagtg gaaattgctg 4320

gatactgcgc aacaaattgt gtatcgaaat gtcatgcttg agaattacaa gaacctcgtc 4380

agtctcggat accagttgac gaaaccggat gtgatcctta ggctcgaaaa gggggaagaa 4440

ccttggctgg ta 4452

<210> 8

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 博莱霉素抗生素耐受基因

<400> 8

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg ac 372

<210> 9

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BGH多聚腺苷酸

<400> 9

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCRISPRi-Ø的gRNA

<400> 10

cgggtcttcg agaagacctg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCRISPRi-T的gRNA

<400> 11

gcaagaacgg agacctaccc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCRISPRi-NT的gRNA

<400> 12

acggcgacga tgcagttcaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q mDHFR F

<400> 13

gaatcaacca ggccacctca 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q mDHFR R

<400> 14

acttgatgcc tttttcctcc tg 22

<210> 15

<211> 358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40启动子

<400> 15

ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg 60

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg 120

aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 180

aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 240

ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 300

ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaa 358

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q dCas9 F

<400> 16

aatggcatcc gagacaagca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q dCas9 R

<400> 17

tgtgctcgtg aagactgtcc 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q EGFP F

<400> 18

tgaacttcaa gatccgccac a 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q EGFP R

<400> 19

ttctcgttgg ggtctttgct 20

Claims

1.一种过表达靶蛋白的***，其特征在于，包含：

二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)缺陷型CHO细胞；

叶酸拮抗剂；

靶蛋白表达载体，所述靶蛋白表达载体包含：

靶蛋白表达盒，所述靶蛋白表达盒包含第一启动子和靶蛋白的基因；和

DHFR表达盒，所述DHFR表达盒包含第二启动子和DHRF基因；以及

CRISPRi表达载体，所述CRISPRi表达载体包含：

gRNA盒，所述gRNA盒包含第三启动子、gRNA序列和终止子；和

dCas9表达盒，所述dCas9表达盒包含第四启动子、dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因。

2.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞为DUXB11细胞株或DG44细胞株。

3.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述叶酸拮抗剂为甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺酰亚胺(Methionine sulfoximine,MSX)。

4.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述第一启动子为CMV启动子或SV40启动子。

5.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述第二启动子为CMV启动子或SV40启动子，且所述第二启动子和所述第一启动子不相同。

6.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述第三启动子为U6启动子。

7.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述第四启动子为CMV启动子或SV40启动子。

8.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述dCas9表达盒还包含2A肽序列，所述2A肽序列连接所述dCas9-KRAB基因和所述抗生素耐受基因。

9.如权利要求1所述的过表达靶蛋白的***，其中所述抗生素耐受基因为博莱霉素(Zeocin resistance,Zeo^R)耐受基因。

10.一种过表达靶蛋白的方法，其特征在于，包含：

构建靶蛋白表达载体，所述靶蛋白表达载体包含：

DHFR表达盒，所述DHFR表达盒包含第二启动子和DHRF基因；

构建CRISPRi表达载体，所述CRISPRi表达载体包含：

gRNA盒，所述gRNA盒包含第三启动子、gRNA序列和终止子；和

dCas9表达盒，所述dCas9表达盒包含第四启动子、dCas9-KRAB基因和抗生素耐受基因；

建立第一稳定表达细胞株：将所述靶蛋白表达载体转染至二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞中，并以筛选培养基进行筛选，以得到所述第一稳定表达细胞株；

建立第二稳定表达细胞株：将所述CRISPRi表达载体转染至所述第一稳定表达细胞株中，并以抗生素进行筛选，以得到所述第二稳定表达细胞株；以及

进行基因扩增：以含有叶酸拮抗剂的培养基培养所述第二稳定表达细胞株，以过表达该靶蛋白。

11.如权利要求10所述的过表达靶蛋白的方法，其中所述二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞为DUXB11细胞株或DG44细胞株。

12.如权利要求10所述的过表达靶蛋白的方法，其中所述筛选培养基为缺乏核酸的α-MEM。

13.如权利要求10所述的过表达靶蛋白的方法，其中所述抗生素为博莱霉素(Zeocin)。

14.如权利要求10所述的过表达靶蛋白的方法，其中所述叶酸拮抗剂为甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)或甲硫胺酸磺酰亚胺(Methionine sulfoximine,MSX)。