CN108659128B

CN108659128B - 抗cd19蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Info

Publication number: CN108659128B
Application number: CN201810540600.5A
Authority: CN
Inventors: 王丹; 杨清海; 陈惠玲; 蒋宁城; 王小亚
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108659128A

Abstract

本发明涉及一种可以识别人白细胞分化抗原CD19的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。其中，选取CD19蛋白C末端的第527位至551位氨基酸序列为抗原肽，抗原肽与KLH载体蛋白偶联后得到所述免疫原。免疫原免疫小鼠，最终获得的抗体26D3为IgG1κ亚型，经基因克隆的方式获得其编码重链和轻链可变区的序列。该抗体可用于CD19蛋白的免疫检测，可以通过ELISA以及免疫组化的方法鉴别肿瘤的发生和增生，属于生物检测领域。

Description

抗CD19蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗CD19蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

CD19(白细胞分化抗原19，Cluster of Differentiation 19)为免疫球蛋白超家族成员之一，是一种长度为556个氨基酸，分子量为95kDa的糖蛋白。它有两个免疫球蛋白样区域，常与CD21、CD81一起形成B细胞共受体，在活化状态下，其胞质中的C端发生磷酸化，引起Src-家族激酶的结合并募集磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)参与细胞增殖、分化和凋亡过程。其他与CD19互作的分子还包括CD82、补体受体2及VAV2，以更好完成其磷酸化等过程。

从最早期的、可识别性B淋巴细胞阶段到分化、发育的B淋巴细胞以及滤泡树突状细胞都有CD19表达，但是在成熟期B淋巴细胞和骨髓中的浆细胞中CD19无表达或微弱表达，T细胞和巨噬细胞中也不表达。对肿瘤细胞，CD19表达于大多数B细胞淋巴瘤/白血病(B淋巴母细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病)的B细胞表面，在浆细胞肿瘤和T细胞淋巴瘤中则不表达，这也可与CD56阳性一并作为浆细胞肿瘤增生的标志。靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤患者已经取得了明显的效果。此外，CD19还参与自身免疫病的发病过程，因此也是潜在的治疗靶点，FDA已授予阿斯利康(Astra Zeneca)及MedImmune将抗CD19单克隆抗体MEDI-551最为治疗视神经脊髓炎(NMO)和视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSDs)的孤儿药地位。

针对CD19的抗体其抗体产品用于IHC检测的主要有目前属安捷伦的DAKOM7296(MRQ-36)和Thermo Fisher的MA1-81724，但其细胞株均为LE-CD19，该抗体识别的表位位于CD19的C末端胞质区。Cell Marque公司的产品119M-16为膜区染色。

陈森等利用PCR的方法从分泌抗CD19抗体的鼠杂交瘤细胞中克隆了该抗体的重链和轻链可变区序列，并通过一个柔性的连接肽将其构建为重组的单链抗体，此抗体具有一定的免疫印迹结合能力，在流式细胞检测中也表现出阳性结果(陈森，抗人CD19单链抗体-CD80融合蛋白的构建与表达，中国协和医科大学2005年博士论文；陈森，绕青，王建祥，王敏.抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定.生物工程学报，2005,21(5)：681-691.)，单链抗体作为常见的工程化抗体方式，与全长抗体比较存在易于表达和纯化的特点，也存在亲和力较单抗低下，表达可溶性不好导致效价下降的问题，同时尚无明确证据表明其在免疫组化检测中的应用能力。与之相似，发明专利“抗CD19单克隆抗体及其制备方法”(申请号：201510016959.9)也公开了一种可用于免疫印迹的CD19单抗和制备方法，可用于免疫印迹。CD19与其他分子联用也可产生有益的结果，发明专利“抗CD19的抗体和抗CD5的抗体的新用途”(申请号：201010164473.7)即通过CD19和CD5联合使用，开发了其在制备检测糖皮质激素和抗病毒药物疗效评价试剂中的应用途径。

在肿瘤治疗领域，集中了更多的研究和成果，其核心在于获得人源化程度高甚至全人的抗体序列以降低治疗中的免疫原性，因此识别天然构象、降低免疫原性和良好的半衰期都是此类抗体的技术目标，即便是这样的治疗抗体也并非确定可以用于免疫组化的诊断，这类抗体的发明集中在人源化抗体构建(“人源化抗CD19的抗原结合片段”(申请号：201710766521.1)，“人源化抗CD19抗体制剂”(申请号：201080019731.0)，“具有降低的免疫原性的抗CD19抗体”(申请号：200680049811.4)，“靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体”(申请号：201710301492.1)，“改良的抗CD19抗体”(申请号：200980144442.0))、全人抗体的获得(“抗CD19全人抗体以及靶向CD19的免疫效应细胞”(申请号：201510599065.7)，“结合CD19的人类抗体及其用途”(申请号：200780050552.1)，“CD19抗体及其用途”(申请号：200680028184.6)，“CD19结合剂及其应用”(申请号200880122233.1)，“抗CD19抗体及其在肿瘤学中的应用”(申请号：201610091069.9))、通过与CD3、CD28等其他免疫调节分子结合构建双特异抗体甚至三特异抗体领域(“双特异性CD3和CD19抗原结合构建体”(201580009124.9)，“一种结合CD19、CD3和CD28的三功能分子及其应用”(申请号：201611258643.1)，“双特异性CD3和CD19抗原结合构建体”(申请号：201480044366.7)，“一种抗CD3/抗CD19双特异性抗体及其应用”(申请号：201410180172.1)，“抗PD1和CD19双特异性抗体及其应用”(申请号：201710189120.4))。同样地，此类抗体不适于免疫检测。

发明内容

发明人提供了一种抗CD19单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15488的杂交瘤细胞株产生。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CD19蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CD19蛋白中的SEQID1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID6所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG1κ亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗CD19单克隆抗体免疫原的制备方法：选取CD19蛋白C末端的第527位至551位氨基酸序列为抗原肽，抗原肽与KLH载体蛋白偶联得到所述免疫原；所述抗原肽的氨基酸序列为SEQID2所示的氨基酸序列。

发明人还提供了一株分泌抗CD19蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株26D3，所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 15488，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在CD19蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：

(1)本发明获得的单克隆抗体由杂交瘤26D3分泌产生，能特异性识别重组表达的人CD19蛋白和人细胞中的CD19蛋白，可以特异性检测能够检测高表达CD19蛋白的肺细胞、肾细胞、T淋巴细胞等正常组织和非小细胞肺癌的肿瘤组织。

(2)本发明获得的杂交瘤26D3为一种IgG1κ亚型抗体，与天然CD19蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

(3)因本发明获得的单克隆抗体杂交瘤26D3由特殊选择的多肽作为免疫原，因此具有限定的识别表位，更利于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blotting)中的蛋白检测。

附图说明

图1为CD19的26D3杂交瘤细胞提取的总RNA电泳结果；

图2为26D3杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果，其中Marker为蛋白分子量标记，1为BSA-CD19-PEP偶联产物，2为未经多肽偶联的BSA载体蛋白；

图3为不同的引物组合扩增的26D3杂交瘤抗体重链和轻链可变区；其中M：分子量标记DL2000(TaKaRa)，1-3分别为上游引物Bi6、Bi7、Bi8与下游引物组合扩增轻链可变区的结果，4-7分别为上游引物Bi3、Bi3b、Bi3c、Bi3d分别于下游引物Bi4组合扩增重链可变区的结果；

图4为B细胞淋巴瘤样本的染色结果对比图；其中LE-CD19染色结果为+，73478-26D3染色结果为++；

图5为扁桃体B淋巴细胞的染色结果对比图；其中LE-CD19染色结果为+++，73478-26D3染色结果为+++；

图6为***组织IHC染色结果对比图，其中LE-CD19染色结果为-，73478-26D3染色结果为-。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1多肽合成及与载体蛋白的化学偶联

从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号为P15391的CD19蛋白序列作为标准序列，其序列如序列表SEQID1所示，通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具比较其与其他同家族蛋白的序列差异，并以DNASTAR8.0软件(www.dnastar.com)的Protean模块进行二级结构、抗原性和表面可及性分析。选定CD19蛋白C末端的第527位至551位氨基酸作为抗原肽，并在该序列的C末端添加一个半胱氨酸用于和载体蛋白的偶联，该抗原肽命名为CD19-PEP，其序列如序列表中SEQID2所示。免疫原由抗原肽、KLH载体蛋白及将二者的二硫键组成，制备流程如下所述：

(1)将20mg SMCC((N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯,4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylicacid N-hydroxysuccinimide ester)溶于2mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺,Dimethylformamide)。

(2)将0.8ml KLH(钥孔血蓝蛋白，keyhole limpet hemocyanin)加入到25ml三角瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使载体蛋白终浓度为15mg/ml。

(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH中，室温搅拌反应1h。

(4)用1L 1×PBS(pH 7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。

(5)将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。

(6)将3.0mg多肽用0.6ml 1×PBS(pH 7.2)溶液溶解。

(7)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂(上海索宝生物科技有限公司)储备液，再加入10μl多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15继续实验；0.05<OD值<0.15，需要补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。

(8)将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。

(9)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl交联后的多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上，可以进行免疫实验；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。

按上述方法制备的免疫原与牛血清白蛋白(BSA)进行交联，所得的交联产物命名为BSA-CD19-PEP，用于对抗体的筛选，亲和力测定和免疫印迹分析。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中得到的免疫原用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠或者ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和BSA-CD19-PEP合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1κ亚型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的BSA-CD19-PEP偶联产物，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为1.28×10⁹。

三.单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的BSA-CD19-PEP偶联产物，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：与BSA偶联的多肽及作为对照的BSA蛋白各上样约50ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质分子量标记购自北京华大蛋白质研发中心有限公司。按常规方法在Bio-Rad电转移***中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由26D3杂交瘤分泌的抗体的单克隆抗体(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像***(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。结果可见图2：26D3杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果，该株抗体可与偶联至BSA载体蛋白的抗原特异结合，与载体蛋白无结合，其条带位置在70kDa附近。

实施例5抗体的可变区序列测定

培养新鲜的26D3杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，提取的总RNA电泳结果见附图1。取9μl总RNA，加入2.5μLoligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μldNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μl的5×逆转录酶缓冲液，2.5μlDTT(0.1M)及1μl逆转录酶(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μl反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增使用的引物参照文献(DübelS,Breitling F,Fuchs P,Zewe M,Gotter S,Welschof M,Moldenhauer G,LittleM.Isolation of IgG antibody Fv-DNA from various mouse and rat hybridoma celllines using the polymerase chain reaction with a simple set of primers.JImmunol Methods.1994,75(1):89-95.)设计和合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)。用于扩增重链可变区的引物如下，其中Bi3、Bi3b、Bi3c、Bi3d为重链可变区上游引物，可分别与重链下游引物Bi4组合扩增重链的可变区基因。

Bi3：5’-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTAGCCTGGTG-3’

Bi3b:5’-AGGTSMAACTGCAGSAGTCWGG-3’

Bi3c:5’-AGGTSMAGCTGCAGSAGTCWGG-3’

Bi3d:5’-AGGTSCAGCTGCAGSAGTCWGG-3’

Bi4:5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中Bi6、Bi7、Bi8为kappa上游引物，可分别与轻链下游引物Bi5组合扩增Kappa轻链的可变区基因。

Bi6:5’-GGTGATATCGTGATRACMCARGATGAACTCTC-3’

Bi7:5’-GGTGATATCWTGMTGACCCAAWCTCCACTCTC-3’

Bi8:5’-GGTGATATCGTKCTCACYCARTCTCCAGCAAT-3’

Bi5:5’-GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC-3’

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μl和1U热启动Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μl PCR产物进行电泳分析，在1.0％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，重链和轻链可变区基因在不同引物组合下的扩增结果见附图3，选条带清晰的位置，切胶回收，克隆至T载体测序。

实施例6.免疫组化组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体(26D3)和市售抗体(LE-CD19)在不同人体肿瘤组织芯片(包括B细胞淋巴瘤123例、T细胞淋巴瘤71例)上的进行同步检测并比较检测结果。

CD19的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表

由上表可见，在21例样本中，本抗体的染色强度高于市售抗体的染色强度，说明本抗体在肿瘤组织的特异性同市售抗体相当，敏感度和亲和力高于市售抗体。

图5为扁桃体B淋巴细胞的染色结果对比图；其中LE-CD19染色结果为+++，73478-26D3染色结果为+++。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、***、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本抗体(26D3)和市售抗体(LE-CD19)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

本发明对B细胞表面的白细胞分化抗原CD19蛋白，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为免疫用肽段。将选择的肽段与KLH载体蛋白进行化学交联以提高其免疫原性，得到免疫原，同时将免疫原与牛血清白蛋白(BSA)化学偶联，用于抗体的交叉筛选，减少识别KLH抗体的干扰。

筛选获得的抗体上清利用包含多种病理组织的组织芯片进行筛查，获得基本的染色特异性、敏感度和特异性评价数据，对于初选合格的杂交瘤细胞株用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1κ亚型单克隆抗体，并通过对杂交瘤细胞的mRNA逆转录后扩增出编码其重链和轻链可变区的基因序列。对于最终获得的单克隆抗体以多种组织样本和多种抗体进行IHC方法检测，确定用途。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗CD19蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 3

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 556

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly

485 490 495

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln

500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala

515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp

530 535 540

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Asp Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro

1 5 10 15

Ala Trp Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Cys

20 25

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ttaggtcaac tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcacga cttctggata cacatgcact gaatacacca tgcactgggt gaaacagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attactccta gcagtgctga tgctgcctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240

atggaactcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagtct attactgttc cctcttcggc 300

ctgtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gatatcgtga tgacccagga tgaactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgtc cacactaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag cgcctgatct acaagctggt ttccaaccga 180

ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag 240

atcatcagag tggaggctga ggatctggga gtttatttct gctctcgaat ttcacatctt 300

ctattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 5

Leu Gly Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Thr Thr Ser Gly Tyr Thr Cys Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Thr Pro Ser Ser Ala Asp Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Leu Phe Gly Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Thr

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Lys Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Arg

85 90 95

Ile Ser His Leu Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

Claims

1.一种抗CD19单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15488的杂交瘤细胞株产生。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CD19蛋白。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CD19蛋白中的SEQ ID NO.1所示的蛋白片段。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5 所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG1κ亚型单克隆抗体。

7.一株分泌抗CD19蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株26D3，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO15488 。