CN108651276A - 蓝莓组织袋内快速生根培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蓝莓组织袋内生根培养方法。本发明公开的蓝莓组织生根培养方法，包括：1)将半固体培养基或固体培养基装至塑料袋中，得到装有培养基的塑料袋；塑料袋由有机高分子材料制成；2)将蓝莓组织置于装有培养基的塑料袋中进行培养，完成蓝莓的组织培养；固体培养基或半固体培养基为向液体培养基中添加不同浓度的卡拉胶代替传统的琼脂得到的培养基；有机高分子材料为聚丙烯。实验证明，利用本发明的蓝莓组织生根培养方法培养蓝莓组织13天即开始生根，不仅大大缩短生根时间，还可以提高蓝莓组织的生根率，减少占用空间，节约生产成本，加速苗木繁育。

Description

蓝莓组织袋内快速生根培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，蓝莓组织袋内生根培养方法。
背景技术
蓝莓具有极高的经济价值和保健价值，在全世界范围内广泛种植。近几年，我国引种规模不断扩大，优良种苗需求量越来越大，种苗生产供不应求。组织培养凭借其无性繁殖的独特优势，可在较小空间和较短时间内快速获得大量性状一致的无性系组织培养苗，成为生产上获得脱毒、优良蓝莓种苗的主要方法。
目前，玻璃瓶在组培工厂中广泛使用，但玻璃制品易破碎而且不便于运输，且蓝莓组培苗瓶内生根缓慢，时间长，效率低。目前生产上主要采取瓶外生根模式，生根时间相对较短，但占地面积较大，费工费力。在蓝莓组培苗瓶内生根过程中，蓝莓苗生根缓慢，自接种50-60天后才开始生根，且生根率低，所需培养基多，存在效率低下、投入高且费时的问题。
有机高分子聚丙烯透明塑料袋，具有耐高温高压灭菌、热封强度较高的特点。
由于良好的凝固性和不参与代谢等优点，琼脂一直被广泛应用在植物组织培养中。但市场所售琼脂质量参差不齐，往往对培养物产生不利影响。卡拉胶，为红藻类植物的提取物，具有凝胶清澈、结构均一、有弹性的特点，且市场价格低于琼脂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行蓝莓组织培养，并提高其生根率。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蓝莓组织培养袋内快速生根方法。
本发明所提供的蓝莓组织培养袋内生根方法，包括：
1)将半固体培养基或固体培养基装至塑料袋中，得到装有培养基的塑料袋；
2)将蓝莓组织置于所述装有培养基的塑料袋中进行培养，完成蓝莓的组织培养。
所述蓝莓组织于所述装有培养基的塑料袋中进行的培养为无菌培养。
所述固体培养基或半固体培养基可用于蓝莓组织培养。
所述蓝莓组织培养方法的目的是使所述蓝莓组织生根和/或长为幼苗。
上述方法中，所述固体培养基或半固体培养基可为向液体培养基中添加卡拉胶得到的培养基。
所述固体培养基、所述半固体培养基与所述液体培养基的区别仅在于：所述固体培养基和所述半固体培养基均含有卡拉胶，所述液体培养基不含有卡拉胶。
所述固体培养基、所述半固体培养基与所述液体培养基均可为无菌培养基。
上述方法中，所述塑料袋可由有机高分子材料制成。
上述方法中，所述装有培养基的塑料袋可处于密封状态。
上述方法中，所述半固体培养基或所述固体培养基中卡拉胶的浓度可为4.0-8.0g/L，如8g/L或6.5g/L。
上述方法中，所述有机高分子材料可为聚丙烯。所述塑料袋的厚度为0.05mm。所述塑料袋的透光率大于等于90％。
上述方法中，所述液体培养基可为生根培养基。
所述生根培养基可含有IBA。IBA在所述生根培养基中的浓度可为0.1-2.0mg/L。IBA在所述生根培养基中的浓度具体可为0.1-1.0mg/L，进一步可为0.1-0.5mg/L或0.5-1mg/L。
所述生根培养基可为现有的任何适合于蓝莓的培养基，如本发明使用的是添加激素的1/2WPM培养基。具体的本发明所使用的所述生根培养基可由溶质和溶剂组成；所述溶剂可为1/2WPM培养基，所述溶质及其浓度分别为30g/L蔗糖和0.1-2.0mg/L IBA。所述1/2WPM培养基可为将WPM培养基中的各溶质浓度减半得到的培养基。所述生根培养基的pH可为5.2-5.3。
上述方法中，所述蓝莓可为奥扎克蓝(Ozark blue)品种，IBA在所述生根培养基中的浓度可为0.1mg/L。
所述蓝莓可为喜来(Sierra)品种，IBA在所述生根培养基中的浓度可为0.5mg/L。
所述蓝莓可为‘WeiwaKuahuat’品种，IBA在所述生根培养基中的浓度可为1.0mg/L。
上述方法中，所述将蓝莓组织置于所述装有培养基的塑料袋中进行培养的条件可为：温度25℃，和/或，光照强度为2500lx，和/或，光照时间为16小时/天。
上述方法中，所述蓝莓组织可为蓝莓茎段。所述蓝莓组织具体可为多次继代的蓝莓组培苗的茎段。所述蓝莓茎段的长度可为2-6cm，如3cm。
上述方法中，所述将蓝莓组织置于所述装有培养基的塑料袋中进行培养可包括在将所述蓝莓组织置于所述装有培养基的塑料袋中后将所述装有培养基的塑料袋封口后进行培养。
上述方法中，所述装有培养基的塑料袋中所述半固体培养基或所述固体培养基占所述塑料袋容积的1/3-1/6，如1/5。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于蓝莓组织培养的物质。
本发明所提供的用于蓝莓组织培养的物质，为下述1)或2)：
1)由所述半固体培养基或所述固体培养基装与所述塑料袋组成的物质；
2)由所述液体培养基、所述塑料袋与卡拉胶组成的物质。
本发明中，所述蓝莓组织培养可为蓝莓组织生根培养。
实验证明，利用本发明的蓝莓组织培养袋内快速生根方法培养蓝莓组织时，在培养第13天即开始生根，在培养第60天时生根率最高可达100％；而利用琼脂作为培养基的凝固剂在瓶内进行蓝莓组织培养时，在培养第50天开始生根，且其最高生根率小于利用本发明的蓝莓组织培养袋内快速生根方法培养蓝莓组织的生根率；在瓶外进行蓝莓组织培养时，在培养60天的最高生根率为65％，显著低于利用本发明的蓝莓组织培养袋内快速生根方法培养蓝莓组织的生根率。表明，利用本发明的蓝莓组织培养袋内快速生根方法培养蓝莓组织不仅可以提高蓝莓组织的生根率，还可以大大缩短生根时间。
本发明采用透气但不透水的聚丙烯塑料袋代替玻璃容器进行蓝莓生根阶段培养,并用卡拉胶代替琼脂作为培养基的固定物，对蓝莓进行组织培养，大大提高生产效率，降低生产成本，缩短育苗周期。用聚丙烯塑料制作的生根袋代替玻璃容器，可充分发挥其生根时间短、生根率高、培养基用量少、占用空间少、灭菌能耗低、便于运输等诸多优点,从而提高育苗效率,降低生产成本。
附图说明
图1为由聚丙烯制成的耐高温高压塑料袋及卷折临时封口示意图。左图为未卷折的塑料袋，右图为卷折的塑料袋。
图2为在聚丙烯塑料袋中进行蓝莓组织培养。
图3为各蓝莓的生根照片。其中，A为喜来(Sierra)，B为奥扎克蓝(Ozark blue)，C为‘WeiwaKuahuat’。
图4为生根袋、瓶内生根、瓶外生根空间利用对比图。左图为塑料袋中生根，中图为在三角瓶中生根，右图为在土壤中生根。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明所提供的蓝莓组织培养方法，包括：
1)将半固体培养基或固体培养基装至塑料袋中，得到装有培养基的塑料袋(生根袋)；塑料袋由有机高分子材料制成；
2)将蓝莓组织置于装有培养基的塑料袋中进行培养，完成蓝莓的组织培养。
下面以蓝莓品种——奥扎克蓝(Ozark blue)、喜来(Sierra)和‘WeiwaKuahuat’为例来具体阐述蓝莓组织培养方法。其中奥扎克蓝(Ozark blue)、喜来(Sierra)和‘WeiwaKuahuat’均为秦皇岛天硕农业科技开发有限公司产品。
下述实施例中的培养基1为向液体培养基1中添加卡拉胶得到的卡拉胶浓度为6.5g/L的半固体培养基，其中，液体培养基1为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为0.1mg/L的培养基。
下述实施例中的培养基2为向液体培养基2中添加卡拉胶得到的卡拉胶浓度为6.5g/L的半固体培养基，其中，液体培养基2为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为0.5mg/L的培养基。
下述实施例中的培养基3为向液体培养基3中添加卡拉胶得到的卡拉胶浓度为6.5g/L的半固体培养基，其中，液体培养基3为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为1.0mg/L的培养基。
下述实施例中的培养基4为向液体培养基4中添加卡拉胶得到的卡拉胶浓度为6.5g/L的半固体培养基，其中，液体培养基4为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为2.0mg/L的培养基。
其中，1/2WPM培养基为将WPM减半得到的培养基。WPM和IBA均为Sigma公司产品，蔗糖为AMRESCO公司产品。
下述实施例中的封口机为温州市兴业机械设备有限公司产品，卡拉胶为阿拉丁公司产品。
实施例1、蓝莓的组织培养
选用奥扎克蓝(Ozark blue)、喜来(Sierra)和‘WeiwaKuahuat’蓝莓品种，选用培养基1、培养基2、培养基3和培养基4分别进行蓝莓组织培养，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
1、制作生根袋
将培养基装至由聚丙烯制成的耐高温高压塑料袋中，25-30mL/袋，倒入袋子底部，将袋口卷折两次，用胶带临时封口，得到装有培养基的塑料袋(生根袋)，生根袋中培养基与空气的体积之比约为1:4，培养基占生根袋容积的1/5。塑料袋的厚度为0.05mm，透光率为90％以上，宽×高为12cm×13cm。
2、培养基灭菌
将步骤1的生根袋置入高压灭菌锅中,在压力为1.1kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20～25min。灭菌完成后，从灭菌锅中取出生根袋，放入无菌温室，整理袋子褶皱部分，静置凝固，得到无菌生根袋。
3、接种及密封
将蓝莓的3cm左右茎段在无菌条件下接种至步骤2的无菌生根袋中，每袋接种6根茎段，用无菌封口机封口，得到接有蓝莓组织的生根袋。
4、培养
将接有蓝莓组织的生根袋放入温度为25℃、光照强度为2500lx、光照时间为16小时/天的无菌温室中培养。
每个蓝莓品种均采用培养基1-4进行培养，每个蓝莓品种在每种培养基中的组织数为50，在培养60天时，观察蓝莓组织的生根情况(图3)，统计生根率，生根率(％)＝生根组织数/总组织数×100％。结果如表1所示。
表1、蓝莓组织培养
结果显示，各蓝莓品种在培养基1-4中进行培养时，最早在培养第13天开始生根。奥扎克蓝在培养基1中的生根率最高，在培养第60天生根率达到了97.7％，组织的平均生根数达到了6.5±0.39条；WeiwaKuahuat在培养基2中的生根率最高，在培养第60天生根率达到了84.0％，组织的平均生根数达到了3.0±0.43条；喜来在培养基3中的生根率最高，在培养第60天生根率达到了100.0％，组织的平均生根数达到了5.9±0.91条。表明，不同蓝莓品种在培养基的凝固剂为为卡拉胶时所需要的激素的浓度不同，在凝固剂为卡拉胶时，蓝莓在生根组织培养时所需的IBA的浓度为0.1-2.0mg/L培养基，其中，奥扎克蓝的最适IBA浓度为0.1mg/L培养基，WeiwaKuahuat的最适IBA浓度为0.5mg/L培养基，喜来的最适IBA浓度为1.0mg/L培养基。
对比例1、蓝莓瓶内生根
选用奥扎克蓝(Ozark blue)、喜来(Sierra)和‘WeiwaKuahuat’蓝莓品种，选用培养基5-8利用三角瓶进行蓝莓组织培养，三角瓶的规格为100ml，实验重复三次。
其中，培养基5为向液体培养基5中添加琼脂得到的琼脂浓度为6.4g/L的培养基，其中，液体培养基5为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为0.1mg/L的培养基；培养基6为向液体培养基6中添加琼脂得到的琼脂浓度为6.4g/L的培养基，其中，液体培养基6为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为0.5mg/L的培养基；培养基7为向液体培养基7中添加琼脂得到的琼脂浓度为6.4g/L的培养基，其中，液体培养基7为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为1.0mg/L的培养基；培养基8为向液体培养基8中添加琼脂得到的琼脂浓度为6.4g/L的培养基，其中，液体培养基8为向1/2WPM培养基中添加蔗糖和IBA得到的蔗糖浓度为30g/L、IBA浓度为2.0mg/L的培养基。
1、培养基的准备
将培养基装至三角瓶中，50Ml/瓶，用封口膜封口，得到装有培养基的三角瓶。
2、培养基灭菌
将步骤1的装有培养基的三角瓶置入高压灭菌锅中,在压力为1.1kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20～25min，得到装有培养基的无菌三角瓶。
3、接种及密封
将蓝莓的3cm左右茎段在无菌条件下接种至步骤2的装有培养基的无菌三角瓶中，每瓶接种3根茎段，用无菌封口膜封口，得到接有蓝莓组织的三角瓶。
4、培养
将接有蓝莓组织的三角瓶放入温度为25℃、光照强度为2500lx、光照时间为16小时/天的无菌温室中培养。
每个蓝莓品种均采用培养基5-8进行培养，在培养85天时，观察蓝莓组织的生根情况，统计生根率。结果如表2所示。
表2、蓝莓组织三角瓶内培养生根率(％)
结果显示，瓶内生根处理的蓝莓的这三个品种在培养第50天开始生根，在培养第85天时奥扎克蓝的最高生根率为47.2％，喜来的最高生根率为97.2％，WeiwaKuahuat的最高生根率为44.4％。表明，在利用琼脂作为培养基的凝固剂时，在瓶内进行蓝莓组织生根时的生根率显著低于利用卡拉胶作为培养基的凝固剂在生根袋中的生根率，并且生根时间显著长于利用卡拉胶作为培养基的凝固剂在生根袋中的生根率。
对比例2、蓝莓瓶外生根
1、激素和基质的准备
选用海藻与营养土蛭石(营养土蛭石中营养土与蛭石的比例为1：1)2种类型的栽培基质。将2种处理的栽培基质均装入塑料穴盘(每个穴盘60个穴)。所配制的生根粉和海藻素的浓度均为2.0mg/L。
2、接种
扦插前取出芽苗放入清水中。将其上粘带的培养基清洗干净，待用。扦插时，将芽苗***端剪断。选取健壮的继代芽苗，将剪口端浸入配制好的生根粉溶液或海藻素溶液10s，后分别扦***步骤1的4种处理的栽培基质中，稍压紧实。每种处理扦插20株。
3、培养
生根实验过程中，加强温度、湿度、光照、水分、通风等条件的控制，保持各种条件均为适于蓝莓生根的条件。芽苗扦插60天后统计生根率(具有成活能力的生根苗数量/扦插总量×100％)。结果如表3所示。×
表3、蓝莓组织培养生根率(％)
蓝莓品种 营养土蛭石+海藻素 营养土蛭石+生根粉 海藻+海藻素 海藻+生根粉
奥扎克蓝 45 20 20 35
喜来 35 40 45 50
WeiwaKuahuat 35 65 20 15
结果显示，瓶外生根处理奥扎克蓝的最高生根率为45％，喜来的最高生根率为50％，WeiwaKuahuat的最高生根率为65％，在相同的培养时间时各品种的生根率均显著低于利用卡拉胶作为培养基的凝固剂在生根袋中的生根率。
统计蓝莓幼苗在不同环境中所用空间，结果(图4)显示，在利用卡拉胶作为培养基的凝固剂的生根袋中，蓝莓幼苗所占空间为1600棵/m2；瓶内生根时蓝莓幼苗所占空间为270棵/m2；瓶外生根时蓝莓幼苗所占空间为420棵/m2。在利用卡拉胶作为培养基的凝固剂在生根袋进行生根所占空间最小。

Claims (10)

1.蓝莓组织培养方法，包括：
1)将半固体培养基或固体培养基装至塑料袋中，得到装有培养基的塑料袋；
2)将蓝莓组织置于所述装有培养基的塑料袋中进行培养，完成蓝莓的组织培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固体培养基或半固体培养基为向液体培养基中添加卡拉胶得到的培养基；
和/或，所述塑料袋由有机高分子材料制成；
和/或，所述装有培养基的塑料袋处于密封状态。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述半固体培养基或所述固体培养基中卡拉胶的浓度为4.0-8.0g/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述有机高分子材料为聚丙烯；
和/或，所述塑料袋的厚度为0.05mm；
和/或，所述塑料袋的透光率大于等于90％。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述液体培养基为生根培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述生根培养基含有IBA；IBA在所述生根培养基中的浓度为0.1-2.0mg/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蓝莓为奥扎克蓝，IBA在所述生根培养基中的浓度为0.1mg/L；
和/或，所述蓝莓为喜来，IBA在所述生根培养基中的浓度为0.5mg/L；
和/或，所述蓝莓为‘WeiwaKuahuat’，IBA在所述生根培养基中的浓度为1.0mg/L。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述将蓝莓组织置于所述装有培养基的塑料袋中进行培养的条件为：温度25℃，和/或，光照强度为2500lx，和/或，光照时间为16小时/天。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述蓝莓组织为蓝莓茎段。
10.用于蓝莓组织培养的物质，为下述1)或2)：
1)由权利要求1-7中任一所述半固体培养基或所述固体培养基装与所述塑料袋组成的物质；
2)由权利要求1-7中任一所述液体培养基装、所述塑料袋与卡拉胶组成的物质。
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