CN108646034B - 细胞群中的稀有细胞判读方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物统计分析领域，具体而言，涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法，所述方法通过检测细胞系某靶点的不同表达水平，计算细胞比值R(R为细胞的阳性信号值F/细胞的阴性信号值F')，用ROC曲线分析阳性细胞组比值和阴性组细胞比值，得到比值阈值Rt。同时计算荧光阈值
Figure DDA0001718034600000011
(细胞群的F的平均值)+ns(s为细胞群的F的标准偏差)，得到荧光阈值Ft，根据比值R与Rt的关系及F与Ft的关系即可判读细胞的阴阳性。与现有技术相比，该方法简单、快捷、准确性高、一致性好。

Description

细胞群中的稀有细胞判读方法
技术领域
本发明涉及生物统计分析领域，具体而言，涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法。
背景技术
细胞群中的稀有细胞判读是生物学或医学领域常见目的；其中常见应用例如从血液细胞中寻找循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)。
循环肿瘤细胞是肿瘤原发灶组织部位脱落进入血液循环的肿瘤细胞，大量实验证实CTC的检测有助于肿瘤复发转移的监控、患者预后的判断及患者术后治疗的指导[1,2]。CTCs的检测分析方法较多，常见的技术包括流式细胞分析、基因芯片、反转录-聚合酶链反应、免疫荧光技术等[3]。目前，CTCs免疫荧光检测已上市产品主要有强生公司的Cellsearch检测***、武汉友芝友医疗科技股份有限公司的CTC-Biopsy检测***等。
Cellsearch检测***对于肿瘤细胞的判定标准一般为：1)具有典型细胞形态，2)具有细胞核形态，3)细胞形态有区别于白细胞形态，4)CK染色为阳性，5)CD45染色为阴性，6)形态比例大于4×4μm，7)CK染色较背景色至少3倍以上，8)细胞膜CK染色区域至少50％以上，9)细胞膜CK染色较均匀，而非点状染色[4]。该分析***虽然已经引入了计算机分析方法，经计算机辅助可以快速对肿瘤细胞进行判定，但仍然需要分析者对结果进行复核，而给出的判定指标并没有用数字进行量化，仍然很大程度上依赖分析者的主观印象，且基于简单的计算机辅助容易造成信息的丢失，导致结果误判。也有研究基于cellsearch检测***，制定HER2阳性细胞的判读方法，该判读方法用相对比值(细胞HER2染色荧光值/细胞面积)/(背景荧光强度值/细胞面积)[5]。该方法虽然用相对简单的数值直接对HER2阳性细胞进行了定义，但该方法容易受背景染色影响，且结果容易出现假阳性。
CTC-Biopsy检测***是基于细胞的病理状态来进行CTC的判定，该***虽然收集总结了目前大量细胞病理专家提出的CTC细胞形态标准，同时也与全国多家三甲医院的细胞病理专家一起进行了大量的免疫组化验证工作，但该***对于分析者的要求苛刻，要求分析者必须是经过严格训练且具有一定水平的病理知识才能完成结果的判读，在实际操作中，对于同一份结果往往需要参考至少两位分析者严格的分析结果，这对于临床检验是不小的挑战[6]。正如目前临床上作为金标准的免疫组化，其判读方法也是基于大量细胞病理知识建立，但在临床上，其对于判读者的要求极其苛刻，且不同分析者对于同一份结果的判读存在一定的差异。
因此，建立简单、快捷、准确的免疫荧光阳性细胞判读方法极为重要。
参考文献
[1]E Crowley,NF Di,F Loupakis,A Bardelli.(2013)Liquid biopsy:monitoring cancer-genetics in the blood.Nature Reviews Clinical Oncology 10(8):472.
[2]G Brock,E Castellanos-Rizaldos,L Hu,et al.(2015)Liquid biopsy forcancer screening,patient stratification and monitoring.Translational CancerResearch 4(3).
[3]Zhang Z,Ramnath N and Nagrath S.(2015)Current status of CTCs asliquid biopsy in lung cancer and future directions.Front Oncol.5:209.
[4]KC Andree,G Van Dalum,LWMM Terstappen.(2016)Challenges incirculating tumor cells detection by the cellsearch system.Molecular Oncology10(3):395-407.
[5]Ignatiadis M,Rothe′F,Chaboteaux C,Durbecq V,Rouas G,et al.(2011)HER2-Positive Circulating Tumor Cells in Breast Cancer.PLoS ONE 6(1):e15624.
[6]李庞。(2015)改良ISET(CTC-Biopsy)技术体系的优化及其检测肿瘤患者循环肿瘤细胞效果的验证。济南大学，硕士学位论文。
发明内容
本发明涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法，包括以下步骤：
将待检测的稀有细胞的标志物称之为X蛋白，细胞群的标志物称之为Y蛋白；使用第一信号强度指示剂标记抗X蛋白抗体，使用第二信号强度指示剂标记抗Y蛋白抗体；
将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到所述细胞群中，用所述抗X蛋白抗体和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，分别统计每张细胞图片的第一信号强度指示剂信号强度值F和第二信号强度指示剂信号强度值F'，并计算每张细胞图片的R＝F/F'；计算所有F的平均值
Figure BDA0001718034580000031
和标准偏差s，得到荧光阈值
Figure BDA0001718034580000032
当所述荧光阈值
Figure BDA0001718034580000033
取95％置信区间时，n＝2；取99％置信区间时，n＝3；取99.9％置信区间时，n＝4；取99.99％的置信区间时，n＝5；
用ROC曲线对各组R值进行分析，确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度比值阈值Rt；
对于所述细胞群的某细胞，若其F＞Ft，且R＞Rt，则其为具有X蛋白特征的稀有细胞。
与现有技术相比，该方法简单、快捷、准确性高、一致性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中HER2检测抗体和Herceptin抗体使用浓度确定；
图2为本发明实施例中HER2检测抗体和Herceptin抗体检测细胞系HER2表达水平；
Intensity指细胞FITC荧光值，代表HER2表达水平；
Ratio指细胞图片的FITC荧光值比细胞图片的CY5荧光值；
图3为本发明实施例中细胞染色与比值关系；
BT474、SKBR3细胞为HER2高表达细胞系，FITC检测阳性，CY5检测阴性；A431、MDA-MB-231、MCF7为HER2低表达细胞系，FITC检测阴性，CY5检测阴性；WBC为HER2低表达、CD45表达细胞，FITC检测阴性，CY5检测阳性。
图4为本发明实施例中不同细胞的比值分布；
A：不同细胞比值分布，比值在3.0～5.0，HER2阳性细胞组(SKBR3、BT474)和HER2阴性细胞组(MCF7、A431、MDA-MB-231、WBC)存在较明显差异；B：比值分析HER2阳性细胞组(SKBR3、BT474)和HER2阴性细胞组(MCF7、A431、MDA-MB-231、WBC)；
图5为本发明实施例不同比值阈值判读结果比较；
A：3.5分析健康人、良性病变、乳腺癌样本，B：比值4.0分析健康人、良性病变、乳腺癌样本，C：比值4.5分析健康人、良性病变、乳腺癌样本；
图6为本发明实施例不同判读方法对比；
A：比值判读方法分析健康人、良性病变、乳腺癌样本；B：统计学判读方法分析健康人、良性病变、乳腺癌样本。
具体实施方式
本发明涉及一种细胞群中的稀有细胞判读方法，包括以下步骤：
将待检测的稀有细胞的标志物称之为X蛋白，细胞群的标志物称之为Y蛋白；使用第一信号强度指示剂标记抗X蛋白抗体，使用第二信号强度指示剂标记抗Y蛋白抗体；
将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到所述细胞群中，用所述抗X蛋白抗体和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，分别统计每张细胞图片的第一信号强度指示剂信号强度值F和第二信号强度指示剂信号强度值F'，并计算每张细胞图片的R＝F/F'；计算所有F的平均值
Figure BDA0001718034580000051
和标准偏差s，得到荧光阈值
Figure BDA0001718034580000052
当所述荧光阈值
Figure BDA0001718034580000053
取95％置信区间时，n＝2；取99％置信区间时，n＝3；取99.9％置信区间时，n＝4；取99.99％的置信区间时，n＝5；
用ROC曲线对各组R值进行分析，确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度比值阈值Rt；
对于所述细胞群的某细胞，若其F＞Ft，且R＞Rt，则其为具有X蛋白特性的稀有细胞。
本发明采用抗Y蛋白抗体用以标记细胞群；可很好地模拟细胞群和稀有细胞所处的检测环境。
在一些实施方式中，所述抗X蛋白抗体为一种或多种；
当所述抗X蛋白抗体为多种时，再将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到细胞群中之前还包括：
用抗X蛋白抗体Ab1、抗X蛋白抗体Ab2、抗X蛋白抗体Ab3……抗X蛋白抗体Abn和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，并分别计算所述第一信号强度指示剂信号强度值与所述第二信号强度指示剂信号强度值的比值R1、R2、R3……Rn。
分析R1、R2、R3……Rn的数据一致性，若各种抗体一致性良好，则后续步骤选取其中一个抗体进行验证；若一致性较差，则按一致性相近的分组验证，或各个抗体分别验证。
数据一致性可通过本领域公知的统计分析方法进行验证，当抗体数量不多时(例如2或3种抗体)，则可由本领域技术人员通过比较各组R值与在白细胞验证后的R值来分析是否足以区分阴性细胞和阳性细胞，以确定是否划分统一的阈值标准。
不同抗体一般指识别X蛋白不同抗原表位的单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述第一信号强度指示剂和第二信号强度指示剂选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金或酶。
理论上来讲，第一信号强度指示剂和第二信号强度指示剂可以选自不同的可以量化的信号，只要二者能区分开来即可。例如第一信号强度指示剂选自Alexa 647，而第二信号强度指示剂选自放射性同位素。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、FITC(异硫氰酸荧光素)、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述X蛋白包括HER2、NapsinA、TTF-1、ERα、ERβ、PR、Bcl-2、EGFR、ERCC1、RRM1、CEA、AFP、ERα、CA242、CA199、CA724中的任一种。
在一些实施方式中，所述细胞群为白细胞，所述稀有细胞为循环肿瘤细胞、循环上皮细胞、循环内皮细胞、干细胞、残留病变细胞中的任一种；
或，所述细胞群为发育成熟的组织，所述稀有细胞为干细胞。
在一些实施方式中，当细胞群为白细胞时，所述Y蛋白包括CD45、CD3、CD50、CD66B、CD69、CD84中的一种或多种；
在一些实施方式中，在确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度阈值范围之后，所述方法还包括：
用含有所述阳性细胞或所述阴性细胞的血液样本对所述阈值范围进行验证。
在一些实施方式中，当所述稀有细胞为循环肿瘤细胞时，所述X蛋白包括HER2、ERα、ERβ、PR、Bcl-2、EGFR、ERCC1、RRM1、CEA、AFP、CA242、CA199、CA724、PDL1、PDL2中的一种或多种；
当稀有细胞为循环上皮细胞时，所述X蛋白包括Epcam、N-钙粘蛋白、FSP1、CK、hMAM、MUC1、PMSA中的一种或多种；
当稀有细胞为循环内皮细胞时，所述X蛋白包括CD34、P1H12、CD31、CD62、CD102中的一种或多种；
当稀有细胞为干细胞时，所述X蛋白包括CD44、CD133、CD90、ALDH1、ABCG2中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述X蛋白为HER2；
所述抗X蛋白抗体为Herceptin抗体和HER2检测抗体(珠海丽禾诊断产品技术有限公司，CBS006)；
在一些实施方式中，所述第一信号强度指示剂和第二信号强度指示剂均选自荧光物质，且为两种激发光和发射光均不同的荧光物质；
在一些实施方式中，所述第一信号强度指示剂为FITC，所述第二信号强度指示剂为CY5。
在一些实施方式中，HER2阳性细胞须满足：
阳性信号荧光强度>19，R值>3.5，且具有完整细胞核和细胞膜染色。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
本实施例以HER2的阳性细胞判定为例，用以说明本发明的技术方案。
1.HER2检测抗体最适反应浓度确定
将Herceptin抗体和HER2检测抗体用结合缓冲液稀释至16ug/ml，分别进行2倍梯度稀释，用SKBR3细胞进行检测。结果表明Herceptin抗体和HER2检测抗体使用浓度为2ug/ml～4ug/ml，细胞结合活性达到饱和，且使用浓度为4ug/ml时，荧光强度值更稳定。
2.免疫荧光检测乳腺癌细胞系HER2表达水平
根据已有的文献报道，SKBR3、BT474细胞系为HER2高表达乳腺癌细胞系，在免疫组化中定义为HER2 3+，FISH检测ErBb2基因扩增；MCF7、MDA-MB-231细胞系为HER2低表达乳腺癌细胞系，在免疫组化中定义为HER2 0～1+，FISH检测ErBb2基因不扩增；A431为HER2低表达皮肤癌细胞系；WBC为HER2低表达人体白细胞。用Herceptin抗体检测细胞系SKBR3、BT474、MCF7、MDA-MB-231、A431的HER2表达水平，结果表明SKBR3、BT474细胞为HER2高表达细胞，FITC荧光强度值19～254.98；A431、MCF7、MDA-MB-231、WBC为HER2低表达细胞，FITC荧光强度值5.29～25.22。同样地，用HER2检测抗体检测细胞系SKBR3、BT474、MCF7、MDA-MB-231、A431的HER2表达水平，结果表明SKBR3、BT474细胞的FITC荧光强度值22.29～254.8，MCF7、MDA-MB-231、A431的FITC荧光强度值4.38～29.63。因此，将SKBR3、BT474细胞归为HER2阳性细胞组，FITC荧光强度值19.00～254.98，阴性组荧光强度值4.86～29.63(表1，表2，图2)。
表1Herceptin抗体测试结果
Figure BDA0001718034580000101
表2HER2检测抗体测试结果
Figure BDA0001718034580000102
3.ROC分析HER2阳性与阴性细胞组比值
分别将100个SKBR3、BT474、MCF7、MDA-MB-231、A431细胞添加到1.25×107个白细胞中，分别用混合捕获抗体和磁珠进行细胞系捕获，用HER2检测抗体检测细胞系，用CD45-APC检测抗体检测白细胞。根据细胞CD45-APC染色荧光值确定白细胞群体(CY5荧光值>7.2)，根据细胞形态将细胞核大于白细胞细胞核的细胞归类为细胞系，并且按照FITC荧光值将细胞进行归类(HER2阳性组(SKBR3、BT474)FITC荧光值21.64～228.8，HER2阴性组(MDA-MB-231、MCF7、A431)的FITC染色荧光值5.5～19.3)。分别统计每张细胞图片的FITC荧光强度值和CY5荧光强度值，计算每张细胞图片的比值(FITC荧光强度值/CY5荧光强度值)(表3)。用Graphpad软件进行数据分析，比值在3.0～5.0范围内，HER2阳性组细胞与HER2阴性组细胞存在较大差异(图4)。用ROC曲线进行分析，比值3.5～4.0时，灵敏度为99.63～100％，特异性为99.00～99.88％，p<0.0001(表4，表5)。
表3细胞比值分布
Figure BDA0001718034580000111
表4ROC曲线分析比值阈值
Figure BDA0001718034580000112
表5不同比值阈值灵敏度和特异性分析
Figure BDA0001718034580000113
4.比值分析健康人、良性病变、乳腺癌HER2阳性细胞个数差异
分别用比值3.5、4.0、4.5作为阈值，分析72例健康人、35例良性病变、71例乳腺癌样本HER2阳性细胞个数，根据HER2阳性细胞个数统计样本阳性率。结果表明比值为4.0时，健康人、良性病变、乳腺癌样本存在较大差别(图5)。因此，选择比值4.0作为比值判读方法临界值，对于比值在3.5～4.0的细胞进行人工辅助判读，根据细胞核及细胞膜染色完整性进行判读。
5.比值判读方法建立
根据HER2阳性细胞组和HER2阴性细胞组的FITC荧光强度值，
Figure BDA0001718034580000114
Figure BDA0001718034580000115
因此，HER2阳性细胞须满足：FITC荧光强度>19，比值>3.5，且具有完整细胞核和细胞膜染色。
6.比值判读方法对比其他判读方法
随机选取10份免疫荧光检测样本，由两位分析者分别用比值判读方法、统计学判读方法进行分析，比较两种方法的耗时、准确率、一致性。结果表明用比值判读方法平均耗时10分钟/份样本，准确率达99％，两位分析者分析结果一致性达100％(表6)。同时，用该两种方法分别分析72例健康人、35例良性病变、71例乳腺癌样本，结果表明用比值方法判读时，健康人、良性病变、乳腺癌样本三者之间存在较大差异(图6)。
表6判读方法对比
Figure BDA0001718034580000121
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (11)

1.一种细胞群中的稀有细胞判读方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待检测的稀有细胞的标志物称之为X蛋白，细胞群的标志物称之为Y蛋白；使用第一信号强度指示剂标记抗X蛋白抗体，使用第二信号强度指示剂标记抗Y蛋白抗体；
将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到所述细胞群中，用所述抗X蛋白抗体和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，分别统计每张细胞图片的第一信号强度指示剂信号强度值F和第二信号强度指示剂信号强度值F'，并计算每张细胞图片的R=F / F'；计算所有F的平均值`x和标准偏差s，得到阈值Ft=`x +ns；
当所述阈值Ft=`x +ns取95%置信区间时，n=2；取99%置信区间时，n=3；取99.9%置信区间时，n=4；取99.99%的置信区间时，n=5；
用ROC曲线对各组R值进行分析，确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度比值阈值Rt；
对于所述细胞群的某细胞，若其F＞Ft，且R＞Rt，则其为具有X蛋白特征的稀有细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗X蛋白抗体为一种或多种；
当所述抗X蛋白抗体为多种时，再将X蛋白阳性细胞和阴性细胞分别添加到细胞群中之前还包括：
用抗X蛋白抗体Ab1、抗X蛋白抗体Ab2、抗X蛋白抗体Ab3……抗X蛋白抗体Abn和所述抗Y蛋白抗体分别检测X蛋白阳性细胞和阴性细胞，并分别计算所述第一信号强度指示剂信号强度值与所述第二信号强度指示剂信号强度值的比值R1、R2、R3……Rn。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一信号强度指示剂和第二信号强度指示剂选自荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金或酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6- 羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、FITC(异硫氰酸荧光素)、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb 和83Sr中的任一种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞群为白细胞，所述稀有细胞为循环肿瘤细胞、循环上皮细胞、循环内皮细胞、干细胞、残留病变细胞中的任一种；
或，所述细胞群为发育成熟的组织，所述稀有细胞为干细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当细胞群为白细胞时，所述Y蛋白包括CD45、CD3、CD50、CD66B、CD69、CD84中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在确定用于区分所述阳性细胞和所述阴性细胞的信号强度阈值范围之后，所述方法还包括：
用含有所述阳性细胞或所述阴性细胞的血液样本对所述阈值范围进行验证。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述稀有细胞为循环肿瘤细胞时，所述X蛋白包括HER2、ERα、ERβ、PR、Bcl-2、EGFR、ERCC1、RRM1、CEA、AFP、CA242、CA199、CA724、PDL1、PDL2中的一种或多种；
当稀有细胞为循环上皮细胞时，所述X蛋白包括Epcam、N-钙粘蛋白、FSP1、CK、hMAM、MUC1、PMSA中的一种或多种；
当稀有细胞为循环内皮细胞时，所述X蛋白包括CD34、P1H12、CD31、CD62、CD102中的一种或多种；
当稀有细胞为干细胞时，所述X蛋白包括CD44、CD133、CD90、ALDH1、ABCG2中的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述X蛋白为HER2；
所述抗X蛋白抗体为Herceptin抗体和HER2检测抗体；
所述第一信号强度指示剂和第二信号强度指示剂均选自荧光物质，且为两种激发光和发射光均不同的荧光物质。
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