CN108642136A

CN108642136A - 一种嗜热属真菌pcr模板的制备方法

Info

Publication number: CN108642136A
Application number: CN201810487854.5A
Authority: CN
Inventors: 牛雪梅; 黄为平; 张克勤
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2018-10-12

Abstract

本申请提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热至少10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。本申请获取嗜热属真菌基因组的方法可以用于嗜热属真菌遗传转化子的PCR鉴定，该方法使用的菌体量小、可缩短转化子的培养时间进而实现在培养早期就可以进行转化子的检测、操作简便快捷、省时省力、经济、且无毒环保，并且后续的PCR灵敏度高，特异性强，为大规模高通量筛选转化子成为可能，以此为基础的快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。

Description

一种嗜热属真菌PCR模板的制备方法

技术领域

本申请提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法。

背景技术

嗜热属真菌(Thermomyces)是一类适宜在45-50℃下生长的温特殊真菌类群，其分布广泛，从地球的热带、亚热带、温带、寒带以及湿润区和干旱区均发现有存在。嗜热属真菌因其细胞内具有一系列独特的酶和代谢产物，使得其在高温条件下具有独特的生存适应能力。又因为其中的许多酶和代谢产物，例如热稳定酶和生物活性小分子，在生产和生活中具有重要的经济价值，使得嗜热真菌成为当前研究热点。

遗传转化是研究生物分子生物学的重要手段。在遗传转化当中，最常规使用的方法主要是通过以转化子的基因组为模板，进行PCR筛选。传统获取真菌DNA基因组模板的方法大都基于CTAB和SDS法，这两种方法需要将大量的菌丝细胞用液氮研磨，不但菌体用量大(50mg以上)，而且操作繁琐且耗时长(1-2个小时)；另外，在提取的过程中用到的苯酚、氯仿等有机溶剂具有一定的毒性，这些因素严重影响了实验进度，不利于大规模高通量筛选转化子，对于嗜热属真菌来说也不例外。

如果能开发出一种使用菌体量小且操作快捷的获取嗜热属真菌基因组模板的方法，为大规模高通量筛选转化子成为可能，发掘快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。

发明内容

本申请之一提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：

1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；

2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热8分钟至10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，加热的温度为97至100℃。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，加热的时间为10分钟。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤2)之后的步骤3)，将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理5分钟以上，优选将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理8至15分钟后，恢复至室温得到冷冻处理的裂解的菌体悬浮液以用作PCR模板使用。例如冷冻处理的温度在-20℃以下。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤4)，将步骤2)中的所述裂解的菌体悬浮液或步骤3)中的冷冻处理的裂解的菌体悬浮液离心，得到上清液作为PCR模板。

在一个具体实施方式中，所述菌丝体与所述TE缓冲液的质量体积比为(0.1mg-10mg)：100μl。

在一个具体实施方式中，所述TE缓冲液包括8mM至12mM的Tris-HCl和0.05mM至0.5mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7至8。

在一个具体实施方式中，所述TE缓冲液包括10mM至12mM的Tris-HCl和0.1mM至0.2mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7.5至7.8。

在一个具体实施方式中，所述嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。

本申请之二提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌阳性遗传转化子的鉴定方法，其包括如下步骤：以如本申请之一中任意一项所述的方法获取所述嗜热属(Thermomyces)真菌的PCR模板，然后进行PCR筛选。

在一个具体实施方式中，还可以对PCR产物进行测序验证分析。

本申请的有益效果：

经过发明人的大量实验性的探索，发现本申请获取嗜热属真菌基因组的方法可以用于嗜热属真菌遗传转化子的PCR鉴定，该方法使用的菌体量小、可缩短嗜热真菌的培养时间至少2至3天，进而实现在培养早期就可以进行嗜热真菌野生型以及突变菌株的检测、操作简便快捷、省时省力、经济、且无毒环保，并且后续的PCR灵敏度高，特异性强，为大规模高通量筛选转化子成为可能，以此为基础的快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。

附图说明

图1为嗜热杜邦菌NRRL 2155的ER基因敲除示意图。

图2为敲除ER基因的嗜热杜邦菌NRRL 2155的突变菌株PCR检测图。其中，M为2000bp的Marker，从上到下依次为2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp；阴性对照为以采用CTAB法提取嗜热杜邦菌NRRL 2155野生菌株的基因组DNA作为模板进行PCR获得产物，标注为WT。

图3为实施例3-12的PCR检测图，所有PCR的模板均取自培养3d后的菌丝。其中Marker(即图中的M)的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图4为实施例13的PCR检测图，其中Marker(即图中的M)的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图5为对比例1和2的PCR检测图。泳道1为空白对照；泳道2-4依次为对比例1在以0.1mg、2mg、10mg的菌丝量提取的DNA作模板进行的PCR结果；泳道5-7依次为对比例2在培养5d、6d和7d后以10mg的菌丝量提取DNA作模板进行的PCR结果。其中Marker(即图中的M)的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图6为对比例3以本申请方法和CTAB处理酿酒酵母细胞作模板的进行ITS片段PCR检测图。泳道1为以本申请方法处理后的样品为模板进行的PCR结果，泳道2为CTAB法提取后的样品为模板进行的PCR结果，泳道3为以含有ITS片段的质粒为模板进行的PCR结果。其中Marker的条带大小从上至下依次为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请作进一步说明，但本申请实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本申请的限定。

本申请使用的试剂均可常规商业获得。

嗜热属真菌嗜热杜邦菌hermomyces dupontii NRRL 2155可购买获得，嗜热棉毛菌Thermomyces lanuginosus YM3-4可从云南生物资源保护与利用国家重点实验室获得，酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae AH109可购买获得。

P缓冲液：MgSO₄·7H₂O 39.435g，柠檬酸钠11.764g，加入150mL蒸馏水溶解后，调pH值＝5.5，定容至200mL。常规高压灭菌。

N缓冲液：山梨醇9.105g，柠檬酸钠0.735g，加入30mL蒸馏水，溶解后，调至pH值＝5.8，定容至50mL。常规高压灭菌。

STC溶液：山梨醇18.21g，CaCl₂·2H₂O 0.735g，加入60mL蒸馏水，溶解后加入1MTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)5mL，然后定容至100mL。常规高压灭菌。

60％PEG4000溶液：12g PEG4000于10mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入蒸馏水定容到20mL。常规高压灭菌。

KTC溶液：6.710g KCl溶解于30mL蒸馏水中，然后加入7.5mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH调至8.0)；1.104g CaCl₂·2H₂O溶解于4mL蒸馏水中，再将CaCl₂·2H₂O溶液倒入KCl+1MTris-HCl(pH调至8.0)溶液中，最后加入蒸馏水定容至50mL。常规高压灭菌。

PTC转化液：无菌的60％PEG4000溶液和无菌的KTC溶液以体积比2：1混匀。

酶解终止液可以为0.6M的KCl，即2.684g KCl溶解于40mL蒸馏水中，定容到60mL。常规高压灭菌。

PDA固体培养基：去皮马铃薯200g，切小块煮沸20min至30min，四层纱布过滤，葡萄糖20g，琼脂18-20g，定容至1L，自然pH。TB3液体培养基：蔗糖200g，酵母浸粉3g，水解酪蛋白3g，用蒸馏水定容至1L。固体培养基则需要再加入0.75％的琼脂粉。常规高压灭菌。

YPS液体培养基：酵母浸粉4g，可溶性淀粉1.5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，溶解后加蒸馏水定容到1L。常规高压灭菌。

TB3培养基：蔗糖200g，酵母浸粉3g，水解酪蛋白3g，用蒸馏水定容至1L。固体培养基则需要再加入0.75％的琼脂粉。常规高压灭菌。

TYGA固体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，糖蜜5g，葡萄糖10g，琼脂18-20g，加水定容至1L。常规高压灭菌。

实施例1

敲除质粒的构建

将嗜热杜邦菌NRRL 2155野生菌由斜面培养基接种到PDA培养基上，放置于45℃培养箱中培养7天，然后刮取约100mg菌丝，采用CTAB方法提取基因组PCR模板，步骤如下：

(1)将10mL CTAB分离缓冲液(CTAB 4g/L，NaCl 16.364g/L，1M Tris-HCl 20ml)加入50mL离心管中，置于60℃水浴中预热。

(2)称取100mg菌丝的菌丝，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将菌丝研碎。

(3)取研磨粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟。

(5)加等体积(10mL)的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。

(6)室温下4000rpm离心10分钟。

(7)用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。

(8)用下述方法收集DNA：

如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10-20mL洗涤缓冲液(75％酒精)中。如果DNA呈云雾状，可在2000rpm离心1-2分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加10-20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。

(9)用75％的乙醇洗涤至少两次。

(10)按照(8)法重新收集核酸，并按照(9)法二次洗涤。

(11)用玻璃棒搅出沉淀或2000rpm离心10分钟。小心倒去上清液，在室温下使DNA沉淀干燥。

(12)将DNA沉淀溶于1至1.5mL TE中，得到DNA溶液，分装后—20℃保存备用。

用PCR的方法获得ER基因(EM_EST:EB064217)的上下游同源臂片段，其中，以ER5F(SEQ ID No.1)/ER5R(SEQ ID No.2)为引物获得ER基因上游同源臂片段ER(up)，以ER3F(SEQ ID No.3)/ER3R(SEQ ID No.4)为引物获得ER基因下游同源臂片段ER(down)；以质粒pAg1-H3(获赠于美国德克萨斯医疗研究所An Zhiqiang教授)为模板，以引物HygB-F(SEQID No.5)和HygB-R(SEQ ID No.6)进行PCR获得潮霉素抗性表达片段(Hyg)。以pUC19质粒为骨架载体，将ER(up)、Hyg、ER(down)这三个片段用In-Fusion HD Cloning无缝链接技术按照从5’端到3’端的顺序连接到用Spe I和Hind III酶切后pUC19线性质粒片段上，然后将连接产物至转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取转化子，用ER5F(SEQ ID No.1)和ER3R(SEQ IDNo.4)为引物进行PCR验证并测序鉴定阳性转化子，即为获得pUC19--ER(up)-Hyg-ER(down)的敲除质粒。以该敲除质粒为模板，以ER5F(SEQ ID No.1)和ER3R(SEQ ID No.4)为引物进行PCR扩增获得敲除全长片段ER(up)-Hyg-ER(down)(SEQ ID No.7，6940bp)。

实施例2

嗜热杜邦菌NRRL 2155原生质体的制备、转化和验证

TE缓冲液的配制：10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH 7.5。

(1)取嗜热杜邦菌NRRL 2155的菌丝块接种于PDA培养基中心处，放置于45℃培养箱中培养7天。用1mL枪头及无菌水(加0.05％的吐温20)将培养物从上述平板上刮净，用四层擦镜纸过滤，将含有孢子的液体分装至1.5mL离心管中，10000rpm，室温5min离心富集孢子，弃上清，富集至1×10⁸个/mL后用无菌水清洗两次。

(2)吸取200μL孢子悬浮液转移至100mL YPS液体培养基中，45℃，180rpm震荡培养20h。

(3)将步骤(2)培养的菌丝倒入无菌漏斗(内含四层擦镜纸)中过滤收集菌丝体。

(4)用P缓冲液溶液洗涤菌丝体两次。

(5)挑取适量菌丝转移至100mL的无菌三角瓶内，加入20mL经过滤除菌的细胞壁裂解液(3mL含有0.3g/ml酵母破壁酶(Lysing酶)的N缓冲液+17mL P缓冲液)。

(6)28℃90rpm摇床中酶解5.5h，直到菌丝被全部裂解完全。

(7)用无菌漏斗(内含六层擦镜纸)过滤菌丝残片，收集酶解完全的原生质体，加入20mL 0.6M的KCl终止酶解反应，得到裂解物溶液。

(8)将裂解物溶液分装至1.5mL离心管中，5000rpm，4℃离心10min。

(9)缓缓倒掉上清液，将每6管至10管原生质体(裂解物)富集至一管，随后加入1mLSTC溶液，5000rpm，4℃离心10min。

(10)缓缓倒掉上清液，每管加入1mL STC溶液，5000rpm，4℃离心10min，加入STC溶液将原生质体调至1×10⁸个/mL的终浓度。

(11)将制备好的原生质体分装到2mL的无菌EP管中，每管200μL，置于冰上待用。

(12)将实施例1中纯化回收的敲除全长片段(SEQ ID No.7)10μg加入至上述获得的终浓度为1×10⁸个/mL的原生质体悬浮液中，轻柔混匀，迅速放置冰上40min。

(13)向冰浴后的溶液中加入1mL PTC液体，放置于45℃培养箱中静置30min，然后放置于冰上10min。

(14)吸取上述混匀液均匀涂布于TB3固体培养基表面，每皿涂布150μL，放置于45℃培养箱中培养16h。

(15)16h后，在上一步骤涂布有原生质体混合液的平板表面覆上一层含有200μg/mL潮霉素B的TB3培养基。

(16)待固体平板上长出转化子后，选取一定数量的转化子单个分别转接到含有200μg/mL潮霉素B的TYGA固体平板上；转化子在潮霉素B浓度为200μg/mL的TYGA固体平板上传代培养3天。

(17)PCR模板制备如下：在步骤(16)中培养平板上，刮取约1mg的菌丝体装入装有100μL TE缓冲液的1.5ml EP管中，盖紧盖子，涡旋振荡10s，使菌丝充分混匀在TE缓冲液中，得到菌体悬浮液，将装有菌体悬浮液的1.5ml EP管水浴处理，即置于水浴锅中沸水煮10min，然后冷却至室温，得到裂解的菌体悬浮液，即为PCR模板。

(18)PCR验证操作如下：

由上述(17)获得的裂解的菌体悬浮液(或称之为DNA溶液)1μl，TaqTM酶(TAKARA公司，货号：R001A)，上游引物ERF2(SEQ ID No.8)；下游引物ERR2(SEQ ID No.9)。PCR程序为：98℃2min，58℃30s，72℃3min，30个循环；72℃5min；12℃10s。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

结果见图2，在检测的7个转化子中(泳道1-7)均能有效扩增出目的条带，说明用于PCR的基因组模板合格。其中，根据扩增条带的结果，即扩增条带的大小以及扩增条带的条数可以判断泳道3至5对应的转化子为完全敲除的阳性转化子。

实施例3

将嗜热杜邦菌NRRL 2155野生菌由斜面培养基接种到PDA培养基上，放置于45℃培养箱中培养5天。

PCR模板制备同实施例2中的步骤(17)。不同之处在于选用的菌丝为本实施例培养得到的野生菌的菌丝；以及TE缓冲液的配方为：8mM Tris-HCl和0.05mM EDTA，pH 7。

PCR验证操作同实施例2中的步骤(18)。不同之处在于PCR使用的引物为ER5F(SEQID No.1)/ER5R(SEQ ID No.2)，PCR模板为本实施例制备得到的模板。

结果见图3中的泳道3，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例4

PCR模板制备同实施例3。不同之处仅在于TE缓冲液的配方，即：10mM Tris-HCl和0.2mM EDTA，pH 7.8。

PCR验证操作同实施例3。不同之处仅在于PCR使用的模板为本实施例制备得到的模板。

结果见图3中的泳道4，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例5

PCR模板制备同实施例3。不同之处仅在于TE缓冲液的配方，即：12mM Tris-HCl和0.5mM EDTA，pH 8.0。

结果见图3中的泳道5，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例6

PCR模板制备同实施例3。不同之处仅在于TE缓冲液的配方，即：15mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH 7.5。

结果见图3中的泳道6，从图中可以判断不能扩增出条带，说明Tris-HCl浓度过高不能有效获取该真菌的基因组PCR模板。

实施例7

PCR模板制备同实施例2中的步骤(17)。不同之处在于选用的菌丝为本实施例培养得到的野生菌的菌丝；以及菌体悬浮液的水浴处理的温度为90℃。

结果见图3中的泳道7，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例8

PCR模板制备同实施例7。不同之处在于菌体悬浮液的水浴处理的温度为97℃。

PCR验证操作同实施例7。不同之处在于PCR模板为本实施例制备得到的模板。

结果见图3中的泳道8，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例9

PCR模板制备同实施例2中的步骤(17)。不同之处在于选用的菌丝为本实施例培养得到的野生菌的菌丝；以及菌体悬浮液的水浴处理的时间为8min。

PCR验证步骤同实施例2中的步骤(18)。不同之处在于PCR使用的引物为ER5F(SEQID No.1)/ER5R(SEQ ID No.2)，PCR模板为本实施例制备得到的模板。

结果见图3中的泳道9，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例10

PCR模板制备同实施例9。不同之处在于菌体悬浮液的水浴处理的时间为15min。

PCR验证操作同实施例9。不同之处在于PCR模板为本实施例制备得到的模板。

结果见图3中的泳道10，从图中可以判断不能扩增出条带，说明由于水浴时间过长，在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液不再适合作为PCR的模板。

实施例11

PCR模板制备同实施例2中的步骤(17)。不同之处在于选用的菌丝为本实施例培养得到的野生菌的菌丝，并且菌丝的用量约0.1mg。

结果见图3中的泳道11，从图中可以判断能有效扩增出清晰的目的条带，但目的条带下方还含有模糊的非特异性条带。因此，虽然在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液质量不是最好的，但可以用作PCR的模板。

实施例12

PCR模板制备同实施例11。不同之处在于菌丝的用量约10mg。

PCR验证操作同实施例11。不同之处在于PCR模板为本实施例制备得到的模板。

结果见图3中的泳道12，从图中可以判断能有效扩增出目的条带，且无非特异性条带，并且与实施例2中的结果相比，PCR产物条带更为明亮，表明在该实施条件下获的裂解的菌体悬浮液(即PCR模板)更优。

实施例13

将嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)YM3-4的菌丝块接种于PDA平板，放置于45℃培养箱中培养5天。

刮取约10mg的菌丝体装入装有100μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl和0.1mM EDTA，pH7.5)的1.5ml EP管中，盖紧盖子，涡旋振荡10s，使菌丝充分混匀在TE缓冲液中，得到菌体悬浮液，将装有菌体悬浮液的1.5ml EP管水浴处理，即置于水浴锅中沸水煮10min，然后冷却至室温，得到裂解的菌体悬浮液。

用引物ITS1(SEQ ID No.10)和ITS4(SEQ ID No.11)以及裂解的菌体悬浮液对野生型嗜热棉毛菌进行ITS片段的PCR扩增。

结果见图4，从图中可以判断能够成功扩增出该真菌的ITS片段，说明在本实施例条件下获得的裂解的菌体悬浮液可以用作PCR的模板。

对比例1

将嗜热杜邦菌NRRL 2155野生菌由斜面培养基接种到PDA培养基上，放置于45℃培养箱中培养7天。

通过CTAB的方法提取基因组DNA。参见实施例1的步骤(1)至(12)。其中，分别取0.1mg、2mg、10mg、50mg和100mg的菌丝来提基因组。

以ER5F(SEQ ID No.1)/ER5R(SEQ ID No.2)为引物，以本实施例在5种不同菌丝量(0.1mg、2mg、10mg、50mg和100mg)下提取的基因组DNA为模板进行PCR验证。

结果见图3和图5，从图5中可以看出，在菌丝量为0.1mg、1mg和10mg时均不能对目标片段进行有效扩增，说明使用CTAB方法提取基因组DNA作为PCR模板时，菌丝量在0.1-10mg之间无法有效获得基因组扩增；而从图3可以看出，在菌丝量达到50mg及以上时，用CTAB方法提取基因组DNA作为PCR模板，可以实现对目标片段的有效扩增。说明在菌丝体用量在10mg及以下时，使用CTAB方法提取基因组DNA不能作为用于PCR扩增的模板。

对比例2

将嗜热杜邦菌NRRL 2155野生菌由斜面培养基接种到PDA培养基上，放置于45℃培养箱中培养。

分别在培养时间为5d、6d和7d时，取10mg菌丝进行基因组DNA的提取，其他提取操作同实施例1的步骤(1)至(12)。

以ER5F(SEQ ID No.1)/ER5R(SEQ ID No.2)为引物，以本实施例提取的基因组DNA为模板进行PCR验证。

结果见图5，从图中可以判断不能扩增到目的片段，说明提取基因组DNA不能作为用于PCR扩增的模板。

对比例3

野生型酵母AH109在2ml LB液体培养基中28℃、220rpm培养2d后，5000rpm离心获取菌体，用酵母菌体100mg来提取基因组DNA。

分别采用两种提取方法，一种为CTAB法，另外一种同实施例2中步骤(17)。

以ITS1(SEQ ID No.10)和ITS4(SEQ ID No.11)为引物，分别以两种方法各自获得的基因组DNA为模板扩增ITS片段进行PCR验证。

结果从图6可知，使用实施例2步骤(17)的方法获得的基因组DNA不能有效扩增酵母菌的靶标片段，而传统的CTAB方法则能有效扩增酵母菌的靶标片段。可见，本申请的方法不适合用于制备酵母等真菌的PCR模板。

虽然本申请已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本申请的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本申请的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本申请的权利要求的范围内。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种嗜热属真菌PCR模板的制备方法

<130> LHA1860307

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 1

cgccgcttgc ctgtatgacg tag 23

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 2

gggcccgggg tgcagccgga cagatc 26

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 3

actagtacgg cgattcgaga actggag 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 4

aagcttgccc gggtaatgcc ttggatc 27

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 5

tacgccggac gcatcacggc gattcgagaa ctgg 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

atcatcttct gtcgaggggt gcagccggac agatc 35

<210> 7

<211> 6940

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

cgccgcttgc ctgtatgacg tagtactctt gtttgatgcc tcattctcgt actgctggaa 60

gtacgcattt cacgacttca gacggtactt gtagagcaca tatgtaccta ggtgactaca 120

gtacctgcct gtaggtacct gtacccaggt agttgcgtag aagtacagtt atcctgatat 180

ttatctgtgg cctgccagaa tggtgtctga atgtacgggg tacaggcaaa gtagtaaaaa 240

tcctgttgac ttacggagta ctccgtatat gacgctgata ctacatcggc agtgccaaaa 300

tgtgtgcggt atgcagttac ctaatggtta cctgtccatc aaagttaacg agtttatcgt 360

agttacagag taactcaatt cagttacata cataggtagt taagttaaat agttaagcat 420

aaaactttac gtaaactgtg gcttgcagcg ttagtggcgg cgcctaaagg atctttccgt 480

tgatcagagg atcagaccct gcaggacctc gtataactta aactcaaccg tcaggttcca 540

tgtggaccgg gccgaaccgg agaccctctg ggtccggaaa tgtaactgcc gacagccgtt 600

gcacaccatt tccgtcagta gtacggagta ctccgtatac ctaggtaggt gctttctctg 660

caactcggcc ttgaggtgta ccagatgaga tttgcagtcg ttggtgattc cggaccagac 720

aaagtcaaac gtgcatactg cctctccatt tccattacaa gcacaatccc atcaccatga 780

tgacctggga gaaccgcgac gtgaaggaca accacctctt gaatttctcc ggtgatcaga 840

ccctgcagga tctcgtatgg catcgtcagg ttcgatctgg accgatccga gccggagacc 900

ctctggggcc ggaaatgtcg ttgctcacgc tctttgcacg agatttccga cggtggtagg 960

atacatgctg cacaattccc ccgtgggcca aatgttatat aggcagtcat tggtgggctt 1020

cggaccagac gaaatcagac cttgaactta cttctccatt tccctttaca agcacaagat 1080

caccatcatg acgacctggg agaaccgaga cgtgacgaac aaccacatcc taccctacgt 1140

ggactcgtcg acggcgccag acgatgtccg cgccgctctc aagacgcttc ccttcgagcg 1200

caacatcttc aaggtgtgat atggaaccca attcgcattc gacgcacgga ccagagagag 1260

ggagagcctc ctactgacca tgataacagc tcctggcgaa tgcgccgacc ttctttccca 1320

ccttcatgaa gctcttgacc tgtgcctggt ctcccaaccg cagtctccgc tcgaccgact 1380

ggcagctggt ggtcctgcgc acggcgtctc tactagacgc cccctacgag tgggatgtca 1440

acgagcccgt ggcccgcgtg tttggcttta ccgatgcgca cctggcatgt ctgcgctccg 1500

gagacctctc gagcaccgag ctgttcaccg atcgccagcg actgatcagt gccatcgtgg 1560

aggagctgtg tctgaagaac cgggttaaca ctgaactcgt tgagaaggcc aaggcggtcc 1620

tgggggtaga ggccctcatg gatttgttct atacccaagg catctacgcc ttcctggcgc 1680

gcaccatgaa cagctgcctg attgattttg acccgcccat cccgggtctg gaggagcagc 1740

tgcggaagta caatgctgcg attattgaga aggagagcca gtataccgat tgatgtgtat 1800

gtagaggatg taacgaatga ctatccttgg ccatgttccg gacgcttgag cgttgtatct 1860

gacagatgag gatgtatatc gtgcttcgga tatgttatag caagatatgg cacagtccct 1920

cagagtactc cgtgttgagt tttggcaggt tatgacacat ctggcgagta cctggggtga 1980

taagaccagt ggtcctgacc aacagactga tgtcagatgc ttgattccac tctatgtcac 2040

agagggtagg gaacgacccc tacttatgta catgggtagg tagatgaggc agaaaaaaca 2100

tggacaaatg aatgtcaggc agacacaaca aacacaagat aataatgaag gacacttgat 2160

taatgtacgc gattatcaga gcattcaaca ctctggacat tctcatatgg aacgcttcca 2220

acagaattct ccagaccgcc accctgtaca ccggaatata cataaacacc agaaagaatg 2280

atagactaca tgctatccaa tcccaagccc tgtgcatcag atctccttag cgactacatc 2340

ctagctactt catcagaatt gttgctacct caagactcaa attgaaagac gggcttgaga 2400

ttccccacca cccctgcaga actctccttg atctgagata gagcctcccg gactcgtttc 2460

tccagcgaac cgtctccttt ccatttaatg atcttcaccg gaggcgcaac cagctgtccc 2520

tgctcaaaga gctccccgaa ccaggtcagg agctggatct gcgcctcctc tgtgtaccgt 2580

gccagggcct gagacagccg gaagttgcga aaggtgattt gcttccagaa gagcagctct 2640

tgcgtcagaa tgatctgtcc ggctgcaccc ctcgacagaa gatgatattg aaggagcact 2700

ttttgggctt ggctggagct agtggaggtc aacaatgaat gcctattttg gtttagtcgt 2760

ccaggcggtg agcacaaaat ttgtgtcgtt tgacaagatg gttcatttag gcaactggtc 2820

agatcagccc cacttgtagc agtagcggcg gcgctcgaag tgtgactctt attagcagac 2880

aggaacgagg acattattat catctgctgc ttggtgcacg ataacttggt gcgtttgtca 2940

agcaaggtaa gtgaacgacc cggtcatacc ttcttaagtt cgcccttcct ccctttattt 3000

cagattcaat ctgacttacc tattctaccc aagcatcgat atgaaaaagc ctgaactcac 3060

cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca 3120

gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt 3180

cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt 3240

tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggaattca gcgagagcct 3300

gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga 3360

actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat gcgatcgctg cggccgatct 3420

tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg 3480

gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga 3540

cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga 3600

ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga 3660

caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata 3720

cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg 3780

ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg cggctccggg cgtatatgct 3840

ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc 3900

ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac 3960

acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga 4020

tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag gaatagagta gatgccgacc 4080

gggatccact taacgttact gaaatcatca aacagcttga cgaatctgga tataagatcg 4140

ttggtgtcga tgtcagctcc ggagttgaga caaatggtgt tcaggatctc gataagatac 4200

gttcatttgt ccaagcagca aagagtgcct tctagtgatt taatagctcc atgtcaacaa 4260

gaataaaacg cgtttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa tgcattaatg 4320

cattggacct cgcaacccta gtacgccctt caggctccgg cgaagcagaa gaatagctta 4380

gcagagtcta ttttcatttt cgggagacga gatcaagcag atcaacggtc gtcaagagac 4440

ctacgagact gaggaatccg ctcttggctc cacgcgacta tatatttgtc tctaattgta 4500

ctttgacatg ctcctcttct ttactctgat agcttgacta tgaaaattcc gtcaccagcc 4560

cctgggttcg caaagataat tgcactgttt cttccttgaa ctctcaagcc tacaggacac 4620

acattcatcg taggtataaa cctcgaaaat cattcctact aagatgggta tacaatagta 4680

accatggttg cctagtgaat gctccgtaac acccaatacg ccggccgaaa cttttttaca 4740

actctcctat gagtcgttta cccagaatgc acaggtacac ttgtttagag gtaatccttc 4800

tttctagagg atcctctacg ccggacgcat cacggcgatt cgagaactgg agttcccaat 4860

gaacacccgt gactcagtcc gccgtacttc atatttataa tcacgacacg cattgcttgc 4920

gttgaatgga acttggaagc atcgctgttg cggacactgt gagaagtacc taggtaccac 4980

aagggacatt tccgaaggcc ccacagcatt tccgggcgag cagcgccgct cagaataatc 5040

atacccagca aaacaccgga agagctacga aacatcagga ttgaaagcac ggaaatggtc 5100

tgatgtatta ttaatgaccg tttgacgaag tatggagccc acagcatggc tcgtggcata 5160

cataaggccc ggacggtcga cgggcaacaa acggatgcag acgccgttgg gagccatcat 5220

ccctcgagat agagactggg cacaatgtct gcaaaggtgc tagaagacac tccttcgcct 5280

tcgtccgagc cgccctcgga gacgtccgct gagaagcctt cgtcaccacg tgatgttcat 5340

ggcatcaagg tcagttccat cccttttccc cagcgtgtgc cctaccaatc actaacatac 5400

gggacagtgg gtgcttgtcg tggtctcgct gctctcgtcc ctctttctct acgccctgga 5460

caataccgtc gttgccaatg tccagcccaa ggttgtccta accttcggcc atgtcgcgtt 5520

ggttccctgg ctcggcgtct cctttgccct agcctcggcc gccacgaccc tgatctggtc 5580

caaagcgtac ggaaccttct ccgcgaagaa gctgtacatt ggtagcactg ccgtattcat 5640

ggctggctcg gccctgtgcg gtgccgcccc agacatcgac agcttcatcg tcggccgcgc 5700

cattgcagga gccgccgggt gcggcatgta catgggtctg ttgacccttc tttccgtcac 5760

gactgacaac atcgagcggc ccaagtacct cagtctcacg ggcttgattt ggggtattgg 5820

tacggtgctc gggcccgtcg tcggcggcgc gttcggtgac agcagcgcca cctggcgttg 5880

ggcgttttac ctgaatctgc tggtcggcgt ggtggtcgcc ccgatttatt tccttctcct 5940

gcctgatttc cagccacaga agggcgagcc gctcctggcg cgtctggcac aaatcgacta 6000

cctcggcggc ctgctgtcca ttggcggtct gctgtgtctg atcatggcca tgaactttgg 6060

cggcgtgctg tggccgtgga accaccgcaa cagcattggt ctgttcgtgg gggctggcgt 6120

gcttatcatc ctcttcgtcg ttcagcaggt cttactcatc ggcacgtcat ttaactcgcg 6180

catgttccca atgcatttct ggcgcagccg ctcgttgatt gtgctgttcc tcactatgag 6240

tgagtttcca actcgacatc tgtaaccctg cgatcatccg ctgactttcg cagtgctggc 6300

aacgtttggc agctttatcg gcatctacta cctgcccatc tactaccagt tcgcacgcgg 6360

cagcaccgcc atggagacct ccgttcattt gctccccttc attctgttcc tggtggcctt 6420

caacctggct aacggccagt tcatggccaa gacgggctac tactacccgt ggtacatagt 6480

cgggggcgcg ttggaactca tcggcggcgt tttaatgtgt aagtatccca tcctcttccc 6540

tccccatccc cttttggcag acgagcaatc cgctgacaaa cgcagacttt gtcgacgaga 6600

acacaagcga tgccaaaatc tatgggtaca caatcatcct tggcacgggc gtgggctgtt 6660

tctgccaggc gggctttgcc gtggcgcaga tgaaagtgaa ggcttccgag atcccgtact 6720

gcgtgggttt catgaccgtt ggccagatgt tgggaattgt gcttggcacg ggcatcgcgg 6780

gtgctctgtt cgtcaactcg gcccaggatt ccctccgcgc tgttttccct gatgccagcg 6840

aggaggagat ctccaatgcc atttccggcg tcggcagcga gctgctgact tctgccgggc 6900

cagctaagga gcaggccggg atccaaggca ttacccgggc 6940

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 8

gcagtcggtc ccaattccc 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

atgcctaatc cggtcaactt g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 10

ccgtaggtgt gaacctgcgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 11

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，加热的温度为97至100℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，加热的时间为10分钟。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤2)之后的步骤3)，将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理5分钟以上，优选将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理8至15分钟后，恢复至室温得到冷冻处理的裂解的菌体悬浮液以用作PCR模板使用。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤4)，将步骤2)中的所述裂解的菌体悬浮液或步骤3)中的冷冻处理的裂解的菌体悬浮液离心，得到上清液作为PCR模板。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述菌丝体与所述TE缓冲液的质量体积比为(0.1mg-10mg)：100μl。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述TE缓冲液包括8mM至12mM的Tris-HCl和0.05mM至0.5mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7至8。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述TE缓冲液包括10mM至12mM的Tris-HCl和0.1mM至0.2mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7.5至7.8。

9.根据权利要求1至8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。

10.一种嗜热属(Thermomyces)真菌阳性遗传转化子的鉴定方法，其包括如下步骤：

以如权利要求1至9中的任意一项所述的方法获取所述嗜热属(Thermomyces)真菌的PCR模板，然后进行PCR筛选。