CN108642119B - 一种立体选择性酶催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利介绍了一种采用生物催化剂催化酯化拆分2‑(4‑甲基苯基)丙酸对映体的方法。利用脂肪酶的高催化效率和高立体选择性,在有机溶剂介质中催化酯化拆分外消旋2‑(4‑甲基苯基)丙酸,制备(S)‑2‑(4‑甲基苯基)丙酸。该反应体系运用有机溶剂体系,很大程度的改善了脂肪酶的热稳定性和催化效率,大大提高了底物转化率和光学活性,其底物的光学活性≥97.84%。与其他拆分技术相比,该方法反应条件温和,操作简单,对环境污染小,且能获得较高光学纯度的(S)‑2‑(4‑甲基苯基)丙酸,其作为关键中间体,为洛索洛芬钠的制备提供了一种可行的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物催化法制备手性化合物,特别涉及一种应用固定化南极酵母脂肪酶B立体选择性催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法。
背景技术
2-(4-甲基苯基)丙酸(MPPA)是合成具有抗炎和镇痛作用的洛索洛芬钠的关键中间体。洛索洛芬钠作为一种芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAID),与临床上同类药物相比,其特点主要体现在:更强(临床效果好)、更快(口服30分钟血浆浓度即达峰值)、更安全(副作用小);以及适应症广,临床上可广泛用于类风湿性关节炎、腰痛、肩周炎、颈肩腕综合症等的抗炎镇痛、手术、外伤后及拔牙后的镇痛消炎和急性上呼吸道炎症的解热镇痛等。据报道,洛索洛芬钠的单次剂量镇痛效果比布洛芬和酮洛芬强约10-20倍,由于在小剂量治疗疾病的过程中,功能强大,疗效显着,安全性强,在日本、美国、中国等国受到广泛应用并且销售量逐年上升。然而,这些手性药物大多是以外消旋体的形式出售,单一纯的对映异构体药物非常少。据文献报道,非甾体高效抗炎药一般是(S)型对映体具有抗炎活性,而(R)型对映体无药效或有毒副作用。为了减少给药量和对人体产生的毒副作用,有必要开发一种洛索洛芬单一对映体的制备方法,(S)-2-(4-甲基苯基)丙酸是合成(S)-洛索洛芬的重要中间体,故手性拆分2-(4-甲基苯基)丙酸具有重要意义。
目前,获得单一手性化合物的主要方法有化学合成法和外消旋体拆分法。相比于化学合成法,外消旋体拆分法具有拆分步骤简单、污染物少、纯度高、能耗低、产率高等优点,因此在工业应用中占据主导地位。常见的外消旋体拆分方法包括手性液-液萃取法、膜法、结晶法、色谱法以及酶或微生物法。其中,色谱法的拆分纯度高,但生产成本高,只适用于实验使用的小规模制备;手性液液萃取法容易实现连续生产、容易工业放大、操作简单、生产成本低、适用范围广等,目前在工业生产中受到广泛关注,但是在实际应用过程中存在手性萃取剂选择性低,产率较低的问题;膜法易于实现连续生产,但传质效率低、易污染、适用手性化合物分离的高选择性的膜材料较少。相比于上述拆分方法,酶催化反应不需要手性分离介质、手性试剂、手性溶剂等,可直接将化学合成的外消旋体转化为单一对映异构体。酶催化酯化拆分具有条件温和,选择性高,副反应少,杂质成分少,产率高,反应操作简单等优点,并且污染少,很大程度降低了化工生产对环境造成的影响,符合绿色化学理念,具有很好的发展前景。
本发明利用脂肪酶较高的催化活性和立体选择性,在有机溶剂体系中催化酯化外消旋体2-(4-甲基苯基)丙酸,制备高光学活性的(S)-2-(4-甲基苯基)丙酸。由于脂肪酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性,并且不同有机溶剂对酶的活性和立体选择性有影响,故本方法根据脂肪酶的催化活性和立体选择性,对其有机溶剂的种类进行了筛选。与水溶液体系比较,固定化酶与有机介质不相溶,易于回收和重复利用;可以更加方便从低沸点的有机溶剂中分离得到产物,显著降低生产成本。该技术解决了一般拆分技术所存在的低光学纯度和产率低的问题,同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便。
发明内容
本发明的目的主要是提出一种利用固定化南极假丝酵母脂肪酶B催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法。并针对脂肪酶在水相介质中热稳定性和立体选择性低,导致转化率较低的问题,通过改用有机介质体系,提高脂肪酶热稳定性和催化活性,从而提高转化率和光学活性。
本发明的技术方案:本发明以有机溶剂作为反应介质,以外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸和醇作为反应底物,将其底物溶解在有机溶剂中,2-(4-甲基苯基)丙酸对映体浓度为200-2000 mmol/L,醇浓度为600-1000 mmol/L;加入一定量的脂肪酶作为生物催化剂,脂肪酶的浓度为40-80 mg/mL;在一定温度下,于25 mL的封闭反应管体系中搅拌、加热反应一定时间,反应结束后,取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测,并计算产物光学纯度和底物转化率。其反应方程式如式1:
式1 脂肪酶催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体
其中,R表示R1 = C2H5,R2 = n-C4H9,R3 = n-C5H11, R4 = n-C6H13, R5 = n-C7H15,R6 =n-C8H13。
所述有机溶剂选自正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、环己烷、异丙醚、甲基叔丁基醚。
所述脂肪酶选自褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A、固定化南极假丝酵母脂肪酶B、荧光假单胞菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、固定化米曲霉、疏棉状嗜热胞菌脂肪酶、固定化米黑根毛脂肪酶。
所述醇选自乙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇的一种。
本发明相比现有技术有如下优势:
本发明利用脂肪酶作为反应催化剂,可以提高底物立体选择性,减少副产物的生成,获得高产率和高纯度的(S)-2-(4-甲基苯基)丙酸。采用有机溶剂作为有机介质,可以改善脂肪酶的热稳定性和催化效率,从而提高产品的纯度和产率,并且脂肪酶不溶于有机溶剂,便于酶的回收和重复利用;有机溶剂沸点一般不是太高,可以方便分离产物,减少能耗。本发明采用固定化南极酵母脂肪酶B对2-(4-甲基苯基)丙酸对映体进行拆分,通过控制有机溶剂种类、醇种类、反应温度、对映体浓度、醇浓度、酶浓度、反应时间等条件,可提高(S)-2-(4-甲基苯基)丙酸的纯度和产率。本方法实施操作简便,绿色环保,易于分离产物,催化剂重复使用率高。
【具体实施方案】
本发明具体的方法步骤如下:
一、测试与分析
本发明所述实施例中产物的光学纯度和底物转化率采用美国Waters 1525高效液相色谱仪分析,Inertsil® ODS-3色谱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)。流动相组成为V(甲醇):V(水)=30:70,其中水相含0.5%(v)乙酸、25 mmol/L的羟丙基-β-环糊精,pH = 4.0(用三乙胺调节)。流速为0.8 mL/min,UV检测波长为225 nm,柱温为25.0 ℃,进样量10 μL。
二、实施例
实施例1
将2.5 mmol的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和2.5 mmol正己醇加入至25 mL容量瓶中,并加入正己烷定容。于25 mL的反应管中,用移液管移取2 mL反应液,并分别加入60 mg不同商品化脂肪酶,在600 rpm、50 ℃下加热反应5 h;反应结束后,利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明:利用固定化南极假丝酵母脂肪酶 B作为催化剂时,优先识别(R)-2-(4-甲基苯基)丙酸,其底物转化率为47.79%,底物的光学纯度为27.24%。
实施例2
在25 mL反应管中,加入0.1 mmol 2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.1 mmol 正己醇作为反应底物,1 mL 不同的有机溶剂作为反应介质,加入50 mg固定化南极假丝酵母脂肪酶B,在600 rpm、50 ℃条件下反应1 h。反应结束后,利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明:利用正己烷作为反应介质时,其底物转化率为53.79 %,底物的光学纯度为30.91 %。
实施例3
在25 mL反应管中,加入0.1 mmol 2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.1 mmol 不同种类的醇作为反应底物,1 mL 正己烷作为反应介质,加入50 mg固定化南极假丝酵母脂肪酶B,在600 rpm、50 ℃条件下反应10 min。反应结束后,利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明:利用正己醇作为酰基供体时,其底物转化率为5.93 %,底物的光学纯度为3.38 %。
实施例4
在25 mL反应管中,加入0.6 mmol 2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.6 mmol 正己醇作为反应底物,1 mL 正己烷作为反应介质,加入50 mg固定化南极假丝酵母脂肪酶B,在600 rpm、50 ℃条件下反应 2 h。反应结束后,利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明:底物转化率为 24.00%,底物的光学纯度为 14.50%。
实施例5
在25 mL反应管中,加入0.6 mmol 2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.6 mmol 正己醇作为反应底物,1 mL 正己烷作为反应介质,加入50 mg固定化南极假丝酵母脂肪酶B,在600 rpm、80 ℃条件下反应 2 h。反应结束后,利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明:底物转化率为 75.26%,底物的光学纯度为 95.62 %。
实施例5
在25 mL反应管中,加入0.6 mmol 2-(4-甲基苯基)丙酸对映体和0.8 mmol正己醇作为反应底物,1 mL 正己烷作为反应介质,加入50 mg固定化南极假丝酵母脂肪酶B,在600rpm、80 ℃条件下反应4.5 h。反应结束后,利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。分析结果表明:底物转化率为 89.34 %,底物的光学纯度为 97.84 %。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,可以做各种改进并实施,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (1)
1.一种应用具有高催化活性和立体选择性的脂肪酶催化酯化拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法,其特征在于,所述的方法是以外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸和醇为底物,在有机溶剂体系中通过脂肪酶的立体选择性催化酯化作用得到剩余底物中的(S)-2-(4-甲基苯基)丙酸;
包含下述操作步骤:
选择一种有机溶剂作为反应介质,加入一定量的外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸和醇,再向反应管中投加一定量的脂肪酶作为生物催化剂,在一定的温度下搅拌反应一定时间,反应结束后,稀释反应液并取一定体积的反应液烘干,再加入乙腈溶解底物并取样进行检测;
所述有机溶剂选自正己烷;所述脂肪酶选自固定化南极假丝酵母脂肪酶B;所述醇选自正己醇;反应温度为40℃-100℃;对于1mL反应介质,脂肪酶的用量为40-80mg;外消旋的2-(4-甲基苯基)丙酸浓度为200-2000mmol L-1;醇的浓度为600-1000mmol L-1;酯化反应的时间为1-8h。
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