CN108627576A - 一种人血浆中他达拉非的定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，包括如下步骤：（1）标准工作溶液的配制；（2）样品处理；（3）标准曲线制作；（4）定量分析：将试验样品按照步骤（3）的方法处理，并按步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到试验样品中他达拉非的浓度。本发明应用液质联用技术(HPLC‑MS/MS)测定人血浆中他达拉非的浓度，准确定量人血浆中他达拉非的浓度，通过色谱柱、溶解液、流动相、质谱条件等的合理选择，流速、洗脱方式、质谱条件等工艺条件的优化，操作简便，重复性高，准确性好，可操作性强，可以直接运用于生物等效性中样品检测分析。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，更具体地，涉及一种应用液质联用技术(HPLC-MS/MS)对人血浆中他达拉非的定量分析方法。
背景技术
据估计，全世界范围内有超过1.5亿的***功能障碍(ED)患者，随着全球人口老龄化，ED患者的数量还将不断攀升。他达拉非片是环磷酸鸟苷(cGMP)特异性磷酸二酯酶5(PDE5)的选择性可逆抑制剂，当性刺激导致局部释放一氧化氮，PDE5受到他达拉非抑制，使***海绵体内cGMP水平提高，这导致平滑肌松弛，血液流入***组织，产生***，如无性刺激。2013年底，礼来在中国推出了每日一次的5mg小剂量口服剂型的希爱力(他达拉非)，相同疗效，价格仅万艾可(西地拉非)的三分之一。中国仿制药市场强大的需求，既便宜又效果质量不错的药品需求可以减轻经济负担。开发他达拉非的生物检测方法并应用于他达拉非的仿制药一致性评价具有广阔的前景。
仿制药一致性评价中，如何确定更好更稳定的进行生物等效性评价，药物的检测分析显得非常重要。他达拉非生物样品的成分复杂、基体干扰大，同时样品较难获得而且量少，被分析物的浓度通常很低，因此对生物样品分离分析技术提出的要求越来越高，亟需建立一种高灵敏度、高选择性的他达拉非含量分析方法。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的不足，从样品前处理和检测技术两方面着手，提供了一种人血浆中他达拉非的定量分析方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，包括如下步骤：
(1)标准工作溶液的配制：称取他达拉非，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.100～5.000mg·mL-1的他达拉非储备液，将所述他达拉非储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成梯度浓度为40.0～40000ng·mL-1的他达拉非工作溶液；按上述步骤重复一次，配置成梯度浓度为40.0～320000ng·mL-1的他达拉非平行工作溶液；称取他达拉非-d3，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.050～2.000mg·mL-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成300～500ng·mL-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0～10℃下保存，备用；
取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，其浓度范围为2.00～2000ng·mL-1；取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非平行工作溶液，混匀，配置成相应梯度的质控样品，其梯度浓度范围为2.00～16000ng·mL-1；
(2)样品处理：取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水，往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入等体积的所述内标工作溶液，往空白人血浆和水分别加入等体积的甲醇水溶液；向上述每个混合液中加入乙腈，混匀，离心，转移上清液至甲醇水溶液中，混匀，将各提取物保存；
(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定，以他达拉非和内标他达拉非的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中他达拉非的浓度为横坐标制作标准曲线；
(4)定量分析：将试验样品按照步骤(3)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到试验样品中他达拉非的浓度。
他达拉非的结构式如下：
优选地，步骤(3)中所述LC-MS/MS分析测定过程的工作条件为：
a.色谱条件：色谱柱为UItimateXB C18；流动相A：含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30℃；流速：1.0mL/min；色谱柱平衡状态时的柱压：11.5～12.5MPa；洗脱方式为梯度洗脱；
b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：4500V；涡旋离子喷雾温度：650℃；气帘气种类：30psi；碰撞池气体：中级；雾化气种类Gas1：50psi；辅助气Gas 2：60psi；数据收集时间：3min。
优选地，步骤(1)中所述他达拉非储备液的浓度为1.00mg·mL-1，所述内标储备液的浓度为0.500mg·mL-1，所述他达拉非工作溶液的梯度浓度分别为40.0、80.0、400、1600、4000、20000、36000、40000ng·mL-1，所述他达拉非平行工作溶液的浓度梯度为40.0、120、1800、30000、320000ng·mL-1，所述内标工作溶液的浓度为400ng·mL-1。
优选地，步骤(1)所述质控样品的梯度浓度分别为2.00、6.00、90.0、1500、16000ng·mL-1，所述质控样品于-15～-90℃储存；所述校正标样的梯度浓度分别为2.00、4.00、20.0、80.0、200、1000、1800、2000ng·mL-1，所述校正标样为新鲜配制。
优选地，步骤(2)所述离心的条件为以1700×g的速度离心15min。
优选地，步骤(1)还往所述他达拉非储备液、内标工作溶液中分别加入体积比为9:1的甲醇-二甲亚砜溶液进行稀释，配制得到准确度/稳定性评价溶液。
优选地，步骤(3)所述色谱条件还包括：进样体积5.00μL；自动进样器清洗溶液为甲醇；自动进样器洗针体积：200μL；压脚提升量：50mm；自动进样针清洗时浸泡时间2s；自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；自动进样器温度：4.0℃；自动进样器清洗时间：1s。
优选地，步骤(3)所述质谱条件还包括：入口电压10V，碰撞室出口电压15V。
优选地，步骤(3)所述LC-MS/MS分析测定过程中他达拉非的监测离子对为390.2/268，内标他达拉非-d3的监测离子对为393.2/271；每次扫描一个离子对时所停留的时间150ms，去簇电压90V，碰撞能量17.00eV，保留时间1.27min。
现有技术相比，本发明有益效果在于：(1)提高了提取回收率，基本都在70％以上。(2)减少了基质效应，绝对基质因子达到了0.85～1.15之间。(3)增强了选择性，减少对分析物和内标定量分析的干扰。(4)改善了检测灵敏度，确定了定量范围，使得预期的定量下限样品满足定量分析要求。本发明应用液质联用技术(HPLC-MS/MS)测定人血浆中他达拉非的浓度，准确定量人血浆中他达拉非的浓度，通过色谱柱、溶解液、流动相、质谱条件等的合理选择，流速、洗脱方式、质谱条件等工艺条件的优化，使得本发明他达拉非的定量检测方法切实可行，操作简便，仪器自动化程度高，重复性高，准确性好，可操作性强，可以直接运用于生物等效性中样品检测分析。
附图说明
图1为本发明人血浆中他达拉非的定量分析方法的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明建立的人血浆中他达拉非的定量分析方法，包括如下步骤：
(1)标准工作溶液的配制：称取他达拉非，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.100～5.000mg·mL-1的他达拉非储备液，将所述他达拉非储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成梯度浓度为40.0～40000ng·mL-1的他达拉非工作溶液；按上述步骤重复一次，配置成梯度浓度为40.0～320000ng·mL-1的他达拉非平行工作溶液；称取他达拉非-d3，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.050～2.000mg·mL-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成300～500ng·mL-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0～10℃下保存，备用；
取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，其浓度范围为2.00～2000ng·mL-1；取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非平行工作溶液，混匀，配置成相应梯度的质控样品，其梯度浓度范围为2.00～16000ng·mL-1；
(2)样品处理：取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水，往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入等体积的所述内标工作溶液，往空白人血浆和水分别加入等体积的甲醇水溶液；向上述每个混合液中加入乙腈，混匀，离心，转移上清液至甲醇水溶液中，混匀，将各提取物保存；
(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定，以他达拉非和内标他达拉非的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中他达拉非的浓度为横坐标制作标准曲线；
(4)定量分析：将试验样品按照步骤(3)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到试验样品中他达拉非的浓度。
以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。
实施例1实验溶液和工作溶液的配制
流动相A[记作MPA]：在装有1000mL超纯水的玻璃瓶中加入1.00mL甲酸和约631mg甲酸铵，振荡混匀，制成含0.1％甲酸和10mM甲酸铵的水溶液。储存条件：室温。有效期：2周。
流动相B[记作MPB]：在装有1000mL乙腈的玻璃瓶中加入1.00mL甲酸，振荡混匀，制成色谱级乙腈溶液。储存条件：室温。有效期：2周。
甲醇：水(50:50，v:v)[记作R01]：在一个玻璃瓶中加入500mL甲醇和500mL水，振荡混匀。储存条件：室温。有效期：1个月。
甲醇：二甲亚砜(9:1，v:v)[记作R02]：在一个玻璃瓶中加入18.0mL甲醇和2.00mL二甲亚砜，振荡混匀。储存条件：室温。有效期：3个月。
他达拉非的储备液通过两次独立称量，分别配制获得。所有配制的储备液都应保存在0～10℃冰箱中。有效期设定为一年，但在一年内可以评价其稳定性，以测定的实际稳定性数据为准。配制校正标样和质控样品的工作溶液必须来自两次独立称量的储备液。
他达拉非储备液[记作S01]，1.00mg/mL：分别称取一定量的他达拉非并放置于两个玻璃瓶中，记录重量，分别标记为S01-1、S01-2。根据他达拉非的纯度、水分、是否成盐及其形式等信息来计算该分析物的真实重量，加入适量的R02，配得最终浓度为1.00mg/mL的他达拉非储备液，涡旋混合；必要时可超声辅助化合物溶解。
内标储备液[记作I01]，0.500mg/mL：称取一定量的他达拉非-d3于玻璃瓶中，记录重量，标记为I01。根据他达拉非-d3的纯度、水分、是否成盐及其形式计算该内标的真实重量。加入适量的R02，配得最终浓度为0.500mg/mL的他达拉非-d3内标储备液，涡旋混合；必要时可超声辅助化合物溶解。
内标工作溶液(400ng/mL)[记作I02]：在玻璃瓶中加入49.96mL的R01，然后用移液器往瓶中加入40.0μL的他达拉非-d3内标储备液I01，涡旋混合。I02储存于0～10℃冰箱中，有效日期为两个月。
分析物工作溶液的配制：在玻璃瓶或聚丙烯离心管中，加入如下表中所指定体积的R01、源溶液，涡旋混合。所有配制的工作溶液都保存在0～10℃的冰箱中。在获得工作溶液的长期储存稳定性数据前，其有效期设定为两个月。
注：S01-1为他达拉非储备液，后续用于配制校正标样；S01-2为他达拉非平行储备液，后续用于配制质控样品；C01-C13代表工作溶液。
校正标样的配制：在聚丙烯离心管中，如下表中所示，用移液器加入适量的空白人正常血浆，再加入相应的源溶液，涡旋混匀(大约30秒)，配制成相应的校正标样。在方法验证的每个分析批中，校正标样都应当新鲜配制。
注：校正标样的配制体积可以根据实际需要调整，但最终的目标浓度必须保持一致，
并如实记录。
质控样品的配制：在聚丙烯离心管中，如下表中所示，用移液器加入适量的空白人正常血浆，然后，再加入相应的源溶液，涡旋混匀(大约30秒)，配制成相应的质控样品。为了便于以后使用及减少冻融次数，将质控样品分成若干等份。具体如下：转移适量体积(建议200μL)的质控样品至预先标记好的聚丙烯冻存管中，储存备用。储存配制的质控样品在-15～-35℃或-60～-90℃温度下的冰1中。
注：质控样品的配制体积可以根据实际需要调整，但最终的目标浓度必须保持一致，并正确记录。*QC-16000为稀释QC(DQC)样品，用于稀释10倍可靠性评价。
准确度/稳定性评价溶液的配制：往玻璃瓶或聚丙烯离心管中加入如下表中指定体积的源溶液，然后加入适量的指定稀释溶液，配制出设定浓度的准确度或稳定性评价溶液，涡旋混合。然后将该溶液储存在0～10℃冰箱中，有效期为1周。也可新鲜配制后立即进行分析测试。
注：溶液的配制体积可以根据实际需要调整，但最终的目标浓度必须保持一致，并如实记录。SC2溶液用于分析物平行配制的两份储备液的称量准确度比较，也可用于分析物储备液的稳定性评价。
实施例2
一种人血浆中他达拉非的LC-MS/MS定量分析方法，包括如下步骤：
(1)标准工作溶液的配制：他达拉非工作溶液的梯度浓度分别为40.0、80.0、400、1600、4000、20000、36000、40000ng·mL-1，他达拉非平行工作溶液的浓度梯度为40.0、120、1800、30000、320000ng·mL-1；校正标样的梯度浓度分别为2.00、4.00、20.0、80.0、200、1000、1800、2000ng·mL-1，质控样品的浓度浓度分别为2.00、6.00、90.0、1500、16000ng·mL-1；
内标工作溶液为400ng·mL-1；准确度/稳定性评价溶液DIS为20.0ng·mL-1，SC1为2000ng·mL-1，SC2为20.0ng·mL-1；
上述溶液的配制只要保证终浓度即可，其配制方法可基于实施例1中各溶液的制备方法，也可为其他方法。
(2)样品处理：采用移液器，在一块96孔深孔板上分别加入25.0μL的空白基质(空白人血浆)、水、试验样品，以及步骤(1)得到的校正标样、质控样品，分别记作空白基质组、空白试剂组、样品组、校正组和质控组；采用移液器，往空白基质组、空白试剂组分别加入25.0μL的R01，往样品组、校正组、质控组中分别加入25.0μL的内标工作溶液I02；
采用移液器，给每个样品加入400μL的乙腈，涡旋混合5min，在4℃离心机中以1700×g的速度离心15分钟；采用移液器转移50.0μL的上清液至装有950μL R01的96孔板中，涡旋混匀，准备进样分析；在进样分析前，将样品处理后的所有提取物保存在自动进样器的温度下或0～10℃的冰箱中。
(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正组、质控组提取物进行以下LC-MS/MS测定分析，每个分析批制备一条由8个浓度水平校正标样组成的标准曲线，同时利用质控样品进行检测。
色谱条件：
色谱柱：Ultimate XB C18，2.1×50.0mm，5.0μm，Welch；
流动相A(MPA)：含0.1％的甲酸和10mM甲酸铵的水溶液；
流动相B(MPB)：乙腈；
流速：1.00mL/min；
进样体积：5.00μL；
色谱柱平衡状态时的大致柱压：12.0Mpa；
自动进样器清洗溶液：甲醇；
自动进样器洗针体积：200μL；
压脚提升量：50mm；
自动进样器进样针清洗时浸泡时间：2s；
动进样器清洗模式：进样前及进样后；
自动进样器清洗设置：先冲后泡；
自动进样器清洗时间：1s；
自动进样器温度：4℃；
柱温箱温度：30℃。
色谱梯度：
注：单个样品的进样分析周期(Cycle Time)：大约3.5分钟(从一个样品开始进样时至下一个样品开始进样时的时间差)。
质谱条件：
离子源：ESI；
离子化模式：正离子模式；
检测模式：多反应监测；
电喷雾电压：4500V；
涡旋离子喷雾温度：650℃
气帘气种类：30psi；
碰撞池气体种类：中级；
雾化气种类(Gas1)：50psi；
辅助气种类(Gas 2)：60psi；
入口电压：10v；
碰撞室出口电压：15v；
数据收集时间：3.00min。
*注：停留时间，此处指的是在监测离子对时，每次扫描一个离子对时所停留的时间。
按上述色谱和质谱条件对校正标样、质控样品进行检测，色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst 1.6.2(AB Sciex)进行处理，以他达拉非和内标他达拉非-d3的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中他达拉非的浓度为横坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中他达拉非的浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归，所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线，具体为y＝0.00414x+0.000686(r＝0.9994)，浓度单位ng/mL，结果表明，他达拉非在2.00～2000ng/mL范围内线性良好。
(4)定量分析：通过液液萃取的处理方式从人血浆中提取他达拉非，涡旋离心后，将上清液进行氮吹浓缩，吹干后进行复溶，然后按照步骤(3)中的条件进行LC-MS/MS液质联用分析；所用试验样品的体积为50.0mL，样品处理的血浆抗凝剂为EDTA-K2。按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到试验样品中他达拉非的浓度。
实施例3
本实施例对实施例2中LC-MS/MS方法测定人血浆中他达拉非浓度的准确度、精密度进行评价。取20.0μL上述QC-2、QC-6、QC-90、QC-1500四个浓度的质控样品各一份，按上述方法操作，于1日内每个浓度3个样品重复测定3次，并分别在不同天连续测定3个分析批，计算精密度，结果如下表所示：
| 分析批 | 准确度(％) | 精密度(n＝5)(％) |
| QC-2 | 96.9 | 4.1 |
| QC-6 | 104.5 | 4.3 |
| QC-90 | 101.8 | 3.9 |
| QC-1500 | 103.6 | 1.8 |
本发明建立的人血浆样品中他达拉非的含量LC-MS/MS检测方法，提取回收率在75％以上；减少了基质效应，绝对基质因子达到了0.85～1.15之间；增强了选择性，减少对分析物和内标定量分析的干扰；检测高效稳定、灵敏，可操作性强，对于他达拉非等效性的研究具有重要的意义，可以直接运用于生物等效性中样品检测分析，在他达拉非仿制药一致性评价中具有广阔的应用前景。
以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）标准工作溶液的配制：称取他达拉非，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.100～5.000 mg•mL-1的他达拉非储备液，将所述他达拉非储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成梯度浓度为40.0～40000 ng•mL-1的他达拉非工作溶液；按上述步骤重复一次，配置成梯度浓度为40.0~320000 ng•mL-1的他达拉非平行工作溶液；称取他达拉非-d3，加入体积比9:1的甲醇-二甲亚砜溶液配制成浓度为0.050～2.000 mg•mL-1的内标储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液稀释成300～500 ng•mL-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在0~10℃下保存，备用；
取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，其浓度范围为2.00~2000 ng•mL-1；取空白人正常血浆，分别加入所述他达拉非平行工作溶液，混匀，配置成相应梯度的质控样品，其梯度浓度范围为2.00~16000 ng•mL-1；
（2）样品处理：取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水，往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入等体积的所述内标工作溶液，往空白人血浆和水分别加入等体积的甲醇水溶液；向上述每个混合液中加入乙腈，混匀，离心，转移上清液至甲醇水溶液中，混匀，将各提取物保存；
（3）标准曲线制作：将步骤（2）得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定，以他达拉非和内标他达拉非的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中他达拉非的浓度为横坐标制作标准曲线；
（4）定量分析：将试验样品按照步骤（3）的方法处理，并按步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到试验样品中他达拉非的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，步骤（3）中所述LC-MS/MS分析测定过程的工作条件为：
a.色谱条件：色谱柱为UItimateXB C18；流动相A：含0.1%甲酸和10mM甲酸铵的水溶液；流动相B：乙腈；柱温箱温度：30℃；流速：1.0 mL/min；色谱柱平衡状态时的柱压：11.5～12.5 MPa；洗脱方式为梯度洗脱；
b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：4500V；涡旋离子喷雾温度：650℃；气帘气种类：30psi；碰撞池气体：中级；雾化气种类Gas1：50psi；辅助气Gas 2：60 psi；数据收集时间：3min。
3.根据权利要求1所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于：步骤（1）中所述他达拉非储备液的浓度为1.00 mg•mL-1，所述内标储备液的浓度为0.500 mg•mL-1，所述他达拉非工作溶液的梯度浓度分别为40.0、80.0、400、1600、4000、20000、36000、40000 ng•mL-1，所述他达拉非平行工作溶液的浓度梯度为40.0、120、1800、30000、320000ng•mL-1，所述内标工作溶液的浓度为400 ng•mL-1。
4.根据权利要求1所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，步骤（1）所述质控样品的梯度浓度分别为2.00、6.00、90.0、1500、16000 ng•mL-1，所述质控样品于-15~ -90 ℃储存；所述校正标样的梯度浓度分别为2.00、4.00、20.0、80.0、200、1000、1800、2000 ng•mL-1，所述校正标样为新鲜配制。
5.根据权利要求1所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，步骤（2）所述离心的条件为以1700×g的速度离心15min。
6.根据权利要求1所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于：步骤（1）还往所述他达拉非储备液、内标工作溶液中分别加入体积比为9:1的甲醇-二甲亚砜溶液进行稀释，配制得到准确度/稳定性评价溶液。
7.根据权利要求2所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，步骤（3）所述色谱条件还包括：进样体积5.00μL；自动进样器清洗溶液为甲醇；自动进样器洗针体积：200 μL；压脚提升量：50 mm；自动进样针清洗时浸泡时间2 s；自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；自动进样器温度：4.0℃；自动进样器清洗时间：1 s。
8.根据权利要求2所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，步骤（3）所述质谱条件还包括：入口电压10 V，碰撞室出口电压15V。
9.根据权利要求2所述的一种人血浆中他达拉非的定量分析方法，其特征在于，步骤（3）所述LC-MS/MS分析测定过程中他达拉非的监测离子对为390.2/268，内标他达拉非-d3的监测离子对为393.2/271；每次扫描一个离子对时所停留的时间150 ms，去簇电压90 V，碰撞能量17.00 eV，保留时间1.27 min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181009 |
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