CN108624576B

CN108624576B - 一种l-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108624576B
Application number: CN201810377187.5A
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 袁宇翔; 陈修来; 刘佳; 罗秋玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2038-04-25
Also published as: CN108624576A

Abstract

本发明公开了一种L‑氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。本发明的L‑氨基酸脱氨酶的突变体T436A包括一个位于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)来源的L‑氨基酸脱氨酶Loops上相应氨基酸残基位点的取代，突变体T436A对L‑亮氨酸的催化效率比原L‑氨基酸脱氨酶提高了72.7％，每升转化液中含有106.2g/Lα‑酮异己酸。L‑亮氨酸的摩尔转化率达到97.7％。

Description

一种L-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种L-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。

背景技术

L-氨基酸脱氨酶是一种能够催化L-氨基酸生成α-酮酸的氧化还原酶。一直以来，有着大量对其研究与报道，大多数关于该酶的三维结构、底物特异性。近年来，有关利用该酶生物转化生产α-酮酸逐渐引起研究人员的注意，拥有着广泛的应用前景。由于该酶定位在细胞膜当中，酶与细胞膜上的电子传递链相关，在转化L-氨基酸生成α-酮酸的过程中，电子经过电子传递链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，过程不产生过氧化氢，有利于转化保持在一个温和的环境下持续进行，这为异源表达氨基酸脱氨酶转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸提供了可能。

然而目前利用该酶转化生产α-酮异己酸的产量和转化率都较低，还不能够达到工业化生产的要求，因需要进一步提高α-酮异己酸的产量和转化率。先前有关研究团队开发的一种RBS优化提高α-酮异己酸产量的方法，虽然能够提高α-酮异己酸的产量，但转化率太低(刘龙，陈坚，堵国成，李江华，宋阳.一种RBS优化提高α-酮异己酸产量的方法.申请号201510575189.1)。因此，为提高α-酮异己酸的产量和转化率，增强其工业应用价值，急需提高L-氨基酸脱氨酶对L-亮氨酸的催化效率。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种L-氨基酸脱氨酶的突变体，含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述L-氨基酸脱氨酶的突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种提高L-氨基酸脱氨酶对L-亮氨酸的催化效率的方法，所述方法是将奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶的第436位的氨基酸苏氨酸Thr突变成丙氨酸Ala。

在本发明的一种实施方式中，所述奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶的Genbank登录号为AAA8675，含有474个氨基酸。

本发明的第四个目的是提供一种构建所述突变体的方法，是在奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)L-氨基酸脱氨酶同源建模的基础上，通过结构分析确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带L-氨基酸脱氨酶基因的pET20b载体为模板进行定点突变构建突变质粒T436A-pET20b，将突变后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后得到阳性单克隆T436A。

本发明的第五个目的是提供一种提高α-酮异己酸产量的方法，是利用所述的L-氨基酸脱氨酶突变体菌株作为全细胞催化剂，转化含L-亮氨酸的底物得到α-酮异己酸。

本发明的一种实施方式中，将含有20～25g/L全细胞、100～120g/L底物的体系在30～35℃反应18～22h生成α-酮异己酸。

在本发明的一种实施方式中，所述转化在20mM的Tris缓冲液中进行。

本发明的一种实施方式中，所突变体菌株全细胞的按如下方式收集获得：将种子培养液按照2％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，添加终浓度为0.4mM的IPTG，25℃诱导12h，收集细胞。

本发明的一种实施方式中，用于培养菌株的种子培养基每升含有：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容。

本发明的一种实施方式中，用于发酵的发酵培养基每升含有：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g。

本发明还要求保护所述突变体在发酵生产中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种具有高效催化L-亮氨酸生产α-酮异己酸的L-氨基酸脱氨酶突变体及其制备办法与应用。突变体T436A对L-亮氨酸的催化效率比原L-氨基酸脱氨酶提高了72.7％，α-酮异己酸的产量达到106.2g/L，底物摩尔转化率为97.7％。本转化方法较化学法相比，具有反应条件温和，目标产物单一，易于分离，对环境友好等优势，且工艺简单，便于控制，易于推广应用。

附图说明

图1奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体纯化SDS-PAGE电泳图；泳道1：标准分子量蛋白；泳道2：空白对照；泳道3:T436A纯化制品。

图2奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体催化生成α-酮异己酸产量。□：出发酶wt；■：突变体T436A。

具体实施方式

LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容到1L。

发酵培养基：(TB培养基)：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容到1L。

样品制备：取1mL转化后的转化溶液，在12,000rpm下离心5min，取上清液稀释后，经过0.45μm滤膜过滤，过滤液供液相色谱分析。

α-酮异己酸的含量测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐AminexHPX-87H(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度2.5mmol/L的稀硫酸，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6mL/min，柱温为40℃，在紫外检测波长205nm下检测。

实施例1奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体的制备方法

以连接有奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶编码基因pma(基因序列SEQ ID NO.3所示)的pET20b质粒(简写为pma-pET20b)为模板，利用T436A的突变引物通过一次PCR得到大小为1422bp左右的产物，将PCR产物通过DpnⅠ处理后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选转化子测序验证。

突变引物如下所示(方框为突变位点)：T436A突变引物对：

上述PCR体系均为：

上述PCR条件均为：

95℃预变性3min，95℃变性3min然后进入以下循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min 40s；34个循环；72℃延伸10min，4℃保温。

测序结果表明除了所需要的突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒T436A-pET20b构建成功。

实施例2：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体的表达纯化方法。

将突变体T436A-pET20b转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选转化子进行测序验证。将验证后的阳性转化子在LB培养基中37℃培养过夜，后接入TB发酵培养基37℃培养至3h左右用终浓度为0.4mM的IPTG诱导，降温至25℃培养12h。

收集发酵液，4℃，8000rpm离心20min收集菌体。将收集的细胞在洗涤液中超声，洗涤液组分：500mM NaCI，20mM Tris pH8.0，0.05％w/v Triton X-100，20mM咪唑。细胞裂解物16，000g离心30min，上清液过0.45μm膜后加到载到用洗涤液预平衡的镍螯合柱上，然后再用20倍柱体积的洗涤液洗涤柱子除去杂质，然后用30mL洗脱液洗脱目标蛋白，洗脱液组分：500mM NaCI，20mM Tris pH8.0，500mM咪唑。然后再将洗脱后的蛋白用脱盐柱进一步纯化，再用30KDa的超滤管离心浓缩，得纯化的L-氨基酸脱氨酶突变体。纯化结果如图1所示，纯化后L-氨基酸突变体达到电泳纯，表观分子量52KDa。

实施例3：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶突变体对L-亮氨酸的催化效率

催化反应体系为20mL，包括终浓度为20g/L的重组大肠杆菌全细胞、115g/L底物L-亮氨酸、20mM的Tris缓冲液(pH 8.0)，在200rpm 30℃下保温20h后取样经HPLC分析。催化效率通过生成产物的量来计算。其结果如图2所示。突变体T436A催化12h后可达到87.5g/L，催化20h后产量可以达到106.2g/L，转化率达到97.7％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种L-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly

20 25 30

Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln

35 40 45

Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile

50 55 60

Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Met Ser Val

65 70 75 80

Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala

85 90 95

Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu

100 105 110

His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly

115 120 125

Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp

130 135 140

Glu Lys Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu

145 150 155 160

Ala Ala Gly Phe Asp Thr Pro Leu Asn Thr Arg Ile Ile Lys Gly Glu

165 170 175

Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala

180 185 190

Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro

195 200 205

Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn

210 215 220

Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly

245 250 255

Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Met Gly Ile Asp Ile Pro

260 265 270

Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Val Ser Gly Val Pro Gly

275 280 285

Ala Pro Arg Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu

290 295 300

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser

305 310 315 320

Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Lys Phe Met His Leu Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Ile Gly Glu Asp Leu Phe

340 345 350

Asn Ser Phe Lys Met Pro Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro

355 360 365

Phe Glu Gln Phe Arg Val Ala Thr Ala Thr Gln Asn Thr Gln His Leu

370 375 380

Asp Ala Val Phe Gln Arg Met Lys Thr Glu Phe Pro Val Phe Glu Lys

385 390 395 400

Ser Glu Val Val Glu Arg Trp Gly Ala Val Val Ser Pro Thr Phe Asp

405 410 415

Glu Leu Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile

420 425 430

Asn Thr Ala Thr Val Trp Gly Met Thr Glu Gly Pro Ala Ala Gly Glu

435 440 445

Val Thr Ala Asp Ile Val Met Gly Lys Lys Pro Val Ile Asp Pro Thr

450 455 460

Pro Phe Ser Leu Asp Arg Phe Lys Lys

465 470

<210> 2

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60

ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatcaaga 120

gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180

ggtgccggta ttcaagggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240

actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300

attagttacc aaacatcgcc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360

cgtggcatga atgagaaaat tggtgcggat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420

gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480

gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540

cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600

gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660

atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720

gtgagtgaga aaggggcgat taaaacgtct caagttgtac tcgctggggg tatctggtcg 780

cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840

caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900

catttccgcg aacaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960

atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020

ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080

tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140

acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200

tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260

atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcagcagt gtggggtatg 1320

acagaaggcc cggcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380

attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422

<210> 3

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60

ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatcaaga 120

gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180

ggtgccggta ttcaagggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240

actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300

attagttacc aaacatcgcc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360

cgtggcatga atgagaaaat tggtgcggat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420

gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480

gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540

cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600

gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660

atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720

gtgagtgaga aaggggcgat taaaacgtct caagttgtac tcgctggggg tatctggtcg 780

cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840

caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900

catttccgcg aacaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960

atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020

ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080

tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140

acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200

tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260

atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320

acagaaggcc cggcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380

attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gattaacacg gcagcagtgt ggggtatg 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cataccccac actgctgccg tgttaatc 28

Claims

1.一种L-氨基酸脱氨酶的突变体，其特征在于，氨基酸序列由如SEQ ID NO.2所示核苷酸翻译得到。

2.一种编码权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶的突变体的基因。

3.一种提高L-氨基酸脱氨酶对L-亮氨酸的催化效率的方法，其特征在于，将奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)来源的SEQ ID NO.3编码的L-氨基酸脱氨酶的第436位的氨基酸苏氨酸突变成丙氨酸。

4.一种构建权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，在奇异变形杆菌SEQ ID NO.3编码的L-氨基酸脱氨酶同源建模的基础上，通过结构分析确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带SEQ ID NO.3编码的L-氨基酸脱氨酶基因的pET20b载体为模板进行定点突变构建突变质粒T436A-pET20b，将突变后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后得到阳性单克隆突变体T436A。

5.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的L-氨基酸脱氨酶的突变体。

6.一种生产α-酮异己酸的方法，其特征在于，利用权利要求5所述的基因工程菌作为全细胞催化剂，转化含L-亮氨酸的底物得到α-酮异己酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将含有20～25g/L全细胞、100～120g/LL-亮氨酸的体系在30～35℃反应18～22h生成α-酮异己酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述全细胞按如下方式收集获得：将权利要求5所述基因工程菌的种子液按照1～3％的接种量接种到发酵培养基中，35～37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，添加终浓度为0.4～0.6mM的IPTG，25～28℃诱导10～12h，收集细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用于发酵的发酵培养基每升含有：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g。

10.权利要求1所述的L-氨基酸脱氨酶的突变体在发酵生产α-酮异己酸中的应用。