CN108624505A - 一种慢病毒冷冻干燥保护剂及慢病毒冻干粉 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种慢病毒冷冻干燥保护剂及慢病毒冻干粉，所述保护剂成分包括甘油、蔗糖、甘露醇、L‑精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶及磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠/磷酸二氢钠）；所述慢病毒冻干粉由慢病毒与该保护剂在冷冻状态下冻干形成；所述慢病毒冻干粉在零下80℃稳定性较好，可有效保持慢病毒颗粒活性。

Description

一种慢病毒冷冻干燥保护剂及慢病毒冻干粉
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其是一种慢病毒冷冻干燥保护剂即慢病毒冻干粉。。
背景技术
慢病毒（lentivirus）是来源于人类免疫缺陷病毒的一类经人工改造的逆转录病毒，由包膜蛋白（如VSVG）与衣壳蛋白（如p24）包裹遗传物质DNA核酸构成，DNA核酸编码结构蛋白gag、聚合酶Pol、运输调控蛋白Rev等关键分子。慢病毒的优势是可以介导外源基因通过LTR元件整合至宿主基因组，从而外源基因可以随宿主基因一起稳定遗传。因此，自开发以来，慢病毒主要应用于基础研究领域即作为运输工具携带外源基因进入宿主细胞或者动物体内，增强或者减弱特定目的基因的表达，研究相关基因的功能。但是自2013年美国科学家报道以CART细胞成功治愈1名急性淋巴性白血病晚期患儿后，慢病毒在细胞免疫治疗领域获得非常关注。
CART细胞由慢病毒修饰人源T细胞得到，其特征是集成抗原识别信号与下游激活信号于一体，直接识别肿瘤细胞并发挥杀伤效应，避开对抗原递呈细胞等辅助信号的依赖。因此，CART细胞比传统T细胞治疗效果更有效。当前，国内外有几百项临床试验正在开展CART细胞治疗研究，并且已有2个基于CART技术的药物通过FDA评审，应用于血液***癌症病人的治疗。
慢病毒是CART细胞制备过程中关键原材料。慢病毒的质量控制直接影响CART细胞的制备及杀伤活性。CART细胞生产环节包括以携带目的基因的慢病毒载体侵染T细胞，其中慢病毒的滴度对侵染是否成功非常关键。慢病毒载体实质由蛋白质构成，无法在常温及4℃条件下长时间保存，对热稳定性较差，反复冻融会降低其滴度，甚至形成不同程度降解物。然而，当前并没有理想的慢病毒冻存保护液，常规的-80℃保存或者加入甘油保护剂也会降低其活性。此外，当需要长距离运输时，即使用较大量的干冰储存，可能由于温度差异导致慢病毒活性降低。
冻干粉是生物大分子药物常用保存形式。慢病毒外壳由多种蛋白质组成，其实质是蛋白质组合体，具备蛋白质基本特性，即对热敏感、容易失活等。但是当前并没有可稳定保存的慢病毒冻干粉。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题在于提供一种慢病毒冷冻干燥保护剂。
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于上述保护剂的慢病毒冻干粉。
为解决上述技术问题，本发明技术方案是：
一种慢病毒冷冻干燥保护剂，由甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶及磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠/磷酸二氢钠）组成，其中，
甘油 0.1-5.0%（V/V）
蔗糖 1-200mg/mL
甘露醇 1-200mg/mL
L-精氨酸 0.1-10mg/mL
甘氨酸 0.1-10mg/mL
PEG6000 1-10%
明胶 0.5-5%
磷酸盐缓冲液 5-100mmol/L
优选的，上述慢病毒冷冻干燥保护剂，组方如下：
甘油 1.0%（V/V）
蔗糖 20mg/mL
甘露醇 25mg/mL
L-精氨酸 1mg/mL
甘氨酸 2mg/mL
PEG6000 2%
明胶 1.5%
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
优选的，上述慢病毒冷冻干燥保护剂pH值为7.0-7.6。
上述慢病毒冷冻干燥保护剂的制备方法，具体步骤为：
（1）按照组方称取甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶及磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠/磷酸二氢钠）；
（2）将甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶及磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠/磷酸二氢钠）溶于适量灭菌蒸馏水中，充分溶解，调节溶液pH值为7.0～7.6，以0.22µm滤膜过滤除菌。
上述慢病毒冷冻干燥保护剂在制备慢病毒冻干粉方面的应用。
一种慢病毒冻干粉，由慢病毒和上述慢病毒冷冻干燥保护剂组成。
优选的，上述慢病毒冻干粉，所述慢病毒源于人免疫缺陷病毒，去除毒力基因、仅保留组装元件及侵染元件的病毒。
优选的，上述慢病毒冻干粉，每1个西林瓶（复溶后体积0.25～0.5ml）含：
慢病毒 0.5～1×107TU
甘油 1.0%（V/V）
蔗糖 20mg/mL
甘露醇 25mg/mL
L-精氨酸 1mg/mL
甘氨酸 2mg/mL
PEG6000 2%
明胶 1.5%
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
优选的，上述慢病毒冻干粉，复溶后pH值为7.0～7.6。
优选的，上述慢病毒冻干粉，可应用于科研用CART细胞、CAR-NK细胞、CAR-DC细胞的制备。
上述慢病毒冻干粉制备方法，具体步骤为：
（1）以微量移液枪将0.25～0.5ml慢病毒浓缩液转移至1个西林瓶中；
（2）以真空冷冻干燥步骤1中的浓缩液、封盖，于-80℃保存。
本发明的有益效果：
本发明所述的慢病毒冷冻干燥保护剂可有效降低慢病毒冷冻/复溶过程中活性损失，弥补当前慢病毒直接低温冻存无有效保护剂的缺陷。
本发明所得到慢病毒冻干粉比液体状态的慢病毒更易于运输，不需要特殊超低温冷链支持，在基于慢病毒的治疗药物开发方面有很好的应用价值。
附图说明
图1. 慢病毒冻干粉外观。
图2. 慢病毒冻干前及复溶后感染活性检测。
具体实施方式
实施例1 慢病毒冷冻干燥保护剂配制
（1）称取适量磷酸氢二钠与磷酸二氢钠粉末，以去离子水充分混合溶解，以2M氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.6之间，0.45µm滤膜过滤，得到磷酸盐缓冲液（50mmol/L，pH7.0～7.6）常温备用。
（2）按照以下成分及终浓度要求称取甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶，加入磷酸盐缓冲液中，充分混合溶解，并再次测量溶液pH值并调节至7.0～7.6之间，0.22µm滤膜过滤，得到慢病毒冷冻干燥保护剂。
保护剂组分及含量：
甘油 1.0%（V/V）
蔗糖 20mg/mL
甘露醇 25mg/mL
L-精氨酸 1mg/mL
甘氨酸 2mg/mL
PEG6000 2%
明胶 1.5%
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
实施例2 慢病毒冻干粉制备
（1）本发明按照常规方法制备RCR缺陷型慢病毒原液：准备辅助包装质粒（pspax2）、包膜质粒（pMD）、含GFP蛋白的表达质粒（pCDHGFP）以及293T细胞；将准备的3个质粒按照一定比例混合（pspax2：pMD：pCDHGFP=2：1：3）并以PEI试剂转染进入293T细胞；12h后更换新鲜培养基继续培养，分别在48h、72h收集上清得到含慢病毒原液并经0.45µm滤膜过滤后于4℃保存备用。
（2）本发明以阴离子交换层析方法纯化慢病毒原液：称取适量tris碱，以去离子水分别配制平衡缓冲液A（25mM Tris，pH8.0）及洗脱缓冲液B（1M Tris，pH8.0），取适量A液与B液混合，得到洗涤缓冲液C（200mM Tris，pH8.0）；以适量tris碱调节慢病毒原液至25mM，并调节pH值为8.0；然后按照顺序（A液平衡-慢病毒原液过柱-A液洗涤-C液洗涤-B液洗脱）过Qsepharose层析柱，收集B液洗脱组分，得到慢病毒纯化液。
（3）本发明以超滤法置换慢病毒纯化液：取截留分子量60kDa的超滤管，在超净工作台中将慢病毒纯化液移入超滤管，以3000rpm，4℃离心10min；弃置底层管中液体并以慢病毒冷冻干燥保护剂补加至超滤管上层套管中，重复并离心3-4次，得到慢病毒预冻存液。
（4）分装冷冻干燥得到慢病毒冻干粉：将慢病毒预冻存液按照0.5ml分装至1个西林瓶中，经真空冷冻干燥，加盖密封即得到慢病毒冻干粉，于-80℃保存。
实施例3 慢病毒冻干粉活性比较分析
按照实施例1中所述配方与实施例2中所述生产工艺生产3个批次的慢病毒冻干粉，并对冻干前后进行转导活性测定（TU/ML），检测结果如下：
表1 慢病毒冻干粉冻干前后转导活性测定结果

Claims (8)

1.一种慢病毒冷冻干燥保护剂，其特征在于：由甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶及磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钠/磷酸二氢钠）组成，其中，
甘油 0.1-5.0%（V/V）
蔗糖 1-200mg/mL
甘露醇 1-200mg/mL
L-精氨酸 0.1-10mg/mL
甘氨酸 0.1-10mg/mL
PEG6000 1-10%
明胶 0.5-5%
磷酸盐缓冲液 5-100mmol/L。
2.根据权利要求1所述的慢病毒冷冻干燥保护剂，其特征在于：
组分含量如下：
甘油 1.0%（V/V）
蔗糖 20mg/mL
甘露醇 25mg/mL
L-精氨酸 1mg/mL
甘氨酸 2mg/mL
PEG6000 2%
明胶 1.5%
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
溶液pH值为 7.0-7.6。
3.根据权利要求1所述慢病毒冷冻干燥保护剂制备方法，其特征在于：
具体步骤为：
（1）按照组分含量称取甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶及磷酸盐缓冲液；
（2）将甘油、蔗糖、甘露醇、L-精氨酸、甘氨酸、PEG6000、明胶分别加入到磷酸盐缓冲液中，充分溶解，以0.22µm膜过滤，置于4℃保存。
4.权利要求1所述慢病毒冷冻干燥保护剂在慢病毒冻干粉制备方面的应用。
5.一种慢病毒冻干粉，由慢病毒颗粒与权利要求1所述慢病毒冷冻干燥保护剂组成。
6.根据权利要求5所述慢病毒冻干粉，其特征在于：所述慢病毒是自主复制缺陷型病毒，不具有RCR活性。
7.根据权利要求5所述慢病毒冻干粉，其特征在于：每个西林瓶复溶后体积0.5mL，含有：
RCR缺陷型慢病毒 0.5～1×107 TU
甘油 1.0%（V/V）
蔗糖 20mg/mL
甘露醇 25mg/mL
L-精氨酸 1mg/mL
甘氨酸 2mg/mL
PEG6000 2%
明胶 1.5%
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
复溶后pH值为 7.0-7.6。
8.根据权利要求5所述慢病毒冻干粉的制备方法，其特征在于：
具体步骤为：
（1）将慢病毒原液经4000rpm超滤离心10min，补加适量慢病毒冷冻干燥保护剂，重复离心3次，并调整最终体积为0.5mL；
（2）将慢病毒置换液经0.22µm膜过滤除菌，加入到无菌处理的西林瓶，经真空冷冻干燥、密封瓶口即得慢病毒冻干粉。
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