CN108619169A - 一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法，所述的注射液包括数量为5×10⁵‑2×10⁶个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％‑5％的人血白蛋白、质量体积比为1％‑8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％‑5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％‑5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。本发明公开的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液在脑缺血后炎症损伤过程中会释放TNF‑α，IL‑1，IL‑6等促炎性因子，用于输注治疗缺血性脑卒中。

Description

一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法。

背景技术

缺血性中风是中风中最常见类型，它是由于脑内血流阻断，脑内缺血缺氧造成神经损伤，可引发长期或永久性残疾。缺血性中风的现有治疗选择很有限，仅有的选择包括溶栓剂如tPA，或者外科机械取栓再灌注手术，而且这些手段都最好是限定在中风发生后几小时(3-6h)内实施，才有可能取得疗效。很多患者因为种种原因，时常错过了这个极为短暂的最佳治疗时间窗口，最后无奈只能简单地接受支持性或姑息性护理。中风的长期医疗成本是巨大的，许多患者需要延长住院治疗、长期理疗或康复治疗，并可能需要长期的机构护理或家庭护理。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且可以从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液中分离出。MSCs不仅具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，还具有免疫调控能力和低的免疫原性等特性，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞，也因此受到越来越多的生物学领域科学家和医学研究人员的青睐；越来越多的研究证实间充质干细胞(MSCs)通过分泌的细胞因子可发挥免疫调节与降低炎症的作用。缺血性脑卒中是一个复杂的病例过程，炎症反应与脑缺血损伤关系密切。诸多细胞因子产生的过程和作用并不相同，在致炎因子占主导地位时，对脑缺血产生保护作用，通过调节不同细胞因子的表达水平，抑制炎症反应的治疗可能具有潜在的临床价值。研究发现，间充质干细胞可以缓解炎症反应，它的这种促进炎症到增殖阶段转变的生物属性，在严重的炎症抑制治疗中是非常重要的。因此，间充质干细胞越来越广泛的被应用于治疗炎性相关疾病之中。

然而，由于MSCs受体内环境的影响，治疗效果不确定，因此目前干细胞对炎症的修复技术是仍是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供了一种用于缓解急性炎症和用于治疗缺血性脑卒的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明公开了一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，包括以下组分：

数量为5×10⁵-2×10⁶个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。

优选地，本发明中，所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞、IL-1激活的间充质干细胞及TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞中的任意一种。

优选地，本发明中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。

本发明公开了一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、制备间充质干细胞，并培养***间充质干细胞；

步骤二、将***间充质干细胞培养至70％-80％融合，制备激活的间充质干细胞；

步骤三、按照权利要求1所述的配方，配制并称取质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液，并混匀；

步骤四、将数量为5×10⁵-2×10⁶个/mL的激活的间充质干细胞重悬于步骤三混匀后的液体中，并加入余量的生理盐水，制备得到治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液。

优选地，本发明中，所述步骤二中，所述激活的间充质干细胞的制备过程为：

将***间充质干细胞培养至70-80％的融合，抽掉***间充质干细胞培养时使用的间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗***间充质干细胞；

用特定的培养基培养***间充质干细胞；

当***间充质干细胞的浓度达到5×10⁵-2×10⁶个/mL时，得到激活的间充质干细胞。

优选地，本发明中，当所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α的α-MEM的培养基；

当所述激活的间充质干细胞为IL-1激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基；

当所述激活的间充质干细胞为TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α培养基和浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基。

优选地，本发明中，所述步骤一中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，且***脐带间充质干细胞的培养过程为：

a)、取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，剥离华尔通氏胶，将剥离后的华尔通氏胶剪成小于1mm³的小块；

b)、将剪碎的华尔通氏胶均匀涂布于细胞培养器的底部，向所述细胞培养器中缓慢加入10mL无血清培养基，置于37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度环境中培养，将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠消化1min，脐带间充质干细胞收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带间充质干细胞悬液移入50mL离心管，离心后除去上清液，重新加入无血清完全培养基将离心后的脐带间充质干细胞重悬；

c)、按照1传1.5接种10cm培养皿，脐带间充质干细胞培养融合70％时按照所述b)的操作过程传代培养，培养成***脐带间充质干细胞。

优选地，本发明中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，***骨髓间充质干细胞的培养过程为：

1)、于髂前上棘穿刺点，用骨穿针抽取50mL骨髓液，注入50mL的无菌离心管中；用等量含20μ/mL肝素的PBS液稀释，并沿无菌离心管的管壁加入等体积的比重为1.073g/mL的淋巴细胞分离液进行离心，离心转速为2000rpm，离心时间为30min，离心后吸取单个核细胞层；然后用无菌生理盐水离心洗涤2次，每次离心过程的转速为1000rpm，离心时间为5min，弃去上清液，取沉淀；

2)、将离心得到的沉淀用无血清培养基混悬，计数细胞，按5×10⁶个/mL接种于的培养瓶中，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养；培养3天后，更换无血清培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3天1次更换培养液；7-9天后，骨髓间充质干细胞融合达50％-60％时，进行第一次传代；移去无血清培养液，采用浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1min，骨髓MSC收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将骨髓间充质细胞悬液移入50mL无菌离心管中；1000rpm离心8min，弃去上清液；重新加入无血清完全培养基重悬，计数；

3)、按照1传1-1.5接种10cm培养皿；骨髓间充质干细胞培养融合60％-80％时，按照所述2)的操作过程进行传代培养。

优选地，本发明中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，***脂肪间充质干细胞的培养过程为：

S1、分离腹部白色脂肪组织，剔除可见微血管及肌肉组织，无菌PBS洗涤三遍，然后用无菌剪刀将脂肪组织剪碎至1mm³以下的糊状，添加无菌消化液，37℃水浴中匀速搅拌45-50min，至组织块消化干净；200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基等量中和，1500rpm离心10min，弃去上清液，得到脂肪间充质干细胞；

S2、以1×10⁶个/mL的细胞密度，用无血清培养基重悬脂肪间充质干细胞，并接种于培养瓶中，37℃、体积分数为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当脂肪间充质干细胞生长至70％-80％融合时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化脂肪间充质干细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养；脂肪间充质干细胞融合至不超过80％，1000rpm离心8min，弃去上清液，重新加入无血清完全培养基重悬脂肪间充质干细胞，计数；

S3、按照1传1-1.5接种10cm培养皿，脂肪间充质干细胞培养融合60％-80％时按照S2传代培养。

本发明提供的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液用于治疗缺血性脑卒。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明提供的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液利于激活的间充质干细胞在体外混悬状态下微环境的稳定，激活的间充质干细胞在注射液中可保持较高的活力，利于激活的间充质干细胞维持活性，且保证了临床输注的安全性。

2、本发明提供的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液能显著改善急性炎症，用于治疗缺血性脑卒。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液对静脉注射后的RT-PCR检测结果。

图2为本发明所述的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液注射后的神经功能检测结果。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

一、脐带间充质干细胞的制备

在超净工作台中进行操作，a)、脐带分离：取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，剥离华尔通氏胶，将剥离后的华尔通氏胶剪成小于1mm³的小块；

b)、间充质细胞原代培养：将剪碎的华尔通氏胶均匀涂布于细胞培养器的底部，向所述细胞培养器中缓慢加入10mL无血清培养基，置于37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度环境中培养，将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠消化1min，脐带间充质干细胞收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带间充质干细胞悬液移入50mL离心管，1000rpm离心8min，离心后除去上清液，重新加入无血清完全培养基将离心后的脐带间充质干细胞重悬；

c)、传代培养：按照1传1.5接种10cm培养皿，脐带间充质干细胞培养融合70％时按照所述b)的操作过程传代培养，培养成***脐带间充质干细胞。

二、骨髓间充质干细胞的制备

1)、采用常规方法于髂前上棘穿刺点，用骨穿针抽取50mL骨髓液，注入50mL的无菌离心管中；用等量含20μ/mL肝素的PBS液稀释，并沿无菌离心管的管壁加入等体积的比重为1.073g/mL的淋巴细胞分离液进行离心，离心转速为2000rpm，离心时间为30min，离心后吸取单个核细胞层；然后用无菌生理盐水离心洗涤2次，每次离心过程的转速为1000rpm，离心时间为5min，弃去上清液，取沉淀；

2)、将离心得到的沉淀用无血清培养基混悬，计数细胞，按5×10⁶个/mL接种于的培养瓶中，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养；培养3天后，更换无血清培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3天1次更换培养液；7-9天后，骨髓间充质干细胞融合达50％-60％时，进行第一次传代；移去无血清培养液，采用浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1min，骨髓间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将骨髓间充质细胞悬液移入50mL无菌离心管中；1000rpm离心8min，弃去上清液；重新加入无血清完全培养基重悬，计数；

3)、按照1传1-1.5接种10cm培养皿；骨髓间充质干细胞培养融合60％-80％时，按照所述2)的操作过程进行传代培养。

三、脂肪间充质干细胞的制备

S1、按照常规方法分离腹部白色脂肪组织，剔除可见微血管及肌肉组织，无菌PBS洗涤三遍，然后用无菌剪刀将脂肪组织剪碎至1mm³以下的糊状，添加无菌消化液，37℃水浴中匀速搅拌45-50min，至组织块消化干净；200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基等量中和，1500rpm离心10min，弃去上清液，得到脂肪间充质干细胞；

S2、以1×10⁶个/mL的细胞密度，用无血清培养基重悬脂肪间充质干细胞，并接种于培养瓶中，37℃、体积分数为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当脂肪间充质干细胞生长至70％-80％融合时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化脂肪间充质干细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养；脂肪间充质干细胞融合至不超过80％，1000rpm离心8min，弃去上清液，重新加入无血清完全培养基重悬脂肪间充质干细胞，计数；

S3、按照1传1-1.5接种10cm培养皿，脂肪间充质干细胞培养融合60％-80％时按照S2传代培养。

四、治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液制备

所述激活的间充质干细胞的制备方法包括的步骤为：将***间充质干细胞培养至70-80％的融合，抽掉间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗间充质干细胞，用含有TNF-α的α-MEM的培养基、含有IL-1的α-MEM的培养基或者含有TNF-α和含有IL-1的培养基培养12h。TNF-α和IL-1的浓度分别为20ng/ml、50ng/ml。如果间充质干细胞的浓度能够达到5×10⁵-2×10⁶个/mL，表明间充质干细胞已被成功激活。

本发明提供的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其包括以下组分：数量为5×10⁵-2×10⁶个/mL的激活的间充质干细胞，质量体积比为1％-5％的人血白蛋白，质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液，质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液，质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液和余量为生理盐水。

配制100mL本发明所述的激活的间充干细胞注射液，包括：5mL的质量体积比终浓度为1％的人血白蛋白原液、2mL的甘露醇注射液、3mL的复方维生素注射液、5mL的50％葡萄糖注射液、85mL的生理盐水及激活的间充质干细胞。除激活的间充质干细胞外，注射液其余成分需提前配制，并4℃预冷备用。MSC最终重悬注射液中，制成单细胞悬液，每毫升注射液中激活的间充质干细胞的数量为5×10⁵-2×10⁶个。该制备好的激活的间充质干细胞在2-10℃条件中，2小时内细胞保持为单细胞悬液状态，且细胞活力(台盼蓝染色计活力)保持在95％以上。本发明所述质量体积比均代表质量(g)与体积(ml)的比例。

人血白蛋白、复方维生素、甘露醇、葡萄糖均为临床注射液成分，可为细胞提供营养、利于细胞的新陈代谢、维持良好的干细胞体外微环境。

本发明提供的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液非常利于激活的间充质干细胞在体外混悬状态下微环境的稳定，利于干细胞维持活性，且临床输注安全。激活的间充质干细胞在此混悬液中可短时间保持较高的活力，最大程度维持干细胞的特性，使得输注到体内的细胞能发挥更大的治疗潜能。

为了验证本发明提供的激活的间充质干细胞的在缓解急性炎症中的作用，本发明进行了如下实验：

1、缺血性脑卒中模型建立

随机使用C57BL/6J的雄性小鼠30只，重23-27克。用10％水合氯醛或50mg/kg戊巴比妥钠，以0.33-0.35ml/100g对大鼠进行腹腔注射麻醉。碘伏消毒，切皮后进行钝性分离。沿右侧胸锁乳突肌腱向下寻找颈动脉。小心地分离动脉鞘，勿伤及迷走神经。随后分离颈总、颈外、颈内动脉。结扎颈总、颈外动脉。使用动脉夹夹闭颈内动脉，并在颈总动脉处用眼科剪剪一小口。入预先制备好的蘸蜡、头端磨圆的鱼线，结扎。缝合伤口且2小时后进行再灌注。大鼠清醒后，如果出现站立不稳，左侧肢体瘫痪，提尾时向一侧转圈则说明MCAO(大脑中动脉闭塞)模型建立成功。术后2h，监测大鼠的各项指标，并通过尾静脉注射MSC，术后8h再次监测大鼠各项指标。术后12小时，进行神经功能评分并断头取脑，TTC染色，分析脑死的体积。

2、治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液移植治疗缺血性脑卒中

采用完全随机法将已成模的大鼠分为4组，每组6只大鼠：

(1)空白治疗组：使用1mL无细胞注射液对动物尾静脉进行注射，所述的无细胞注射液包含质量体积比为1-5％的人血白蛋白，质量体积比为1-8％的甘露醇注射液，质量体积比为1-5％的复方维生素注射液，质量体积比为1-5％的50％葡萄糖注射液和余量为生理盐水；

(2)TNF-α激活的脐带间充质干细胞注射液治疗组：使用1mL注射液对动物尾静脉进行注射，该注射液包含无细胞注射液和浓度为5×10⁵-2×10⁶个/mL的TNF-α激活的间充质干细胞。

(3)IL-1激活的脐带间充质干细胞注射液治疗组：使用1mL注射液对动物尾静脉进行注射，该注射包含无细胞注射液和浓度为5×10⁵-2×10⁶个/mL的IL-1激活的间充质干细胞。

(4)TNF-α+IL-1激活的脐带间充质干细胞治疗组，使用1mL注射液对动物尾静脉进行注射，该注射包含无细胞注射液和浓度为5×10⁵-2×10⁶个/mL的TNF-α+IL-1激活的间充质干细胞。本试验采用单次注射的方式。

结果：

1、TNF-α+IL-1激活的间充质明显降低了缺血性脑卒中大鼠体内的炎性因子的含量和表达

术后2h及术后8h，抽取大鼠血液，通过RT-PCR检测大鼠体内炎性因子TNF-α，IL-1和IL-6含量。图1结果显示，和对照组、TNF-α激活组和IL-1激活组相比，TNF-α+IL-1激活组的大鼠体内炎性因子的激活被明显抑制。

2、TNF-α+IL-1激活的MSC明显减少了大鼠的脑梗塞体积：

术后24小时，进行神经功能评分并断头取脑，TTC染色，分析脑死的体积。如图2所示，和对照组、TNF-α激活的MSC组、IL-1激活的MSC组相比，TNF-α和IL-1激活的MSC组的大鼠脑梗塞体积明显减少。

以上结果证实，TNF-α和IL-1共同预处理的间充质干细胞注射液能显著改善急性炎症和缺血性脑卒中大鼠脑梗塞体积。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节与这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，包括以下组分：

数量为5×10⁵-2×10⁶个/mL的激活的间充质干细胞、质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液以及余量的生理盐水。

2.根据权利要求1所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞、IL-1激活的间充质干细胞及TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。

4.一种根据权利要求1～3任一项所述的治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、制备间充质干细胞，并培养***间充质干细胞；

步骤二、将***间充质干细胞培养至70％-80％融合，制备激活的间充质干细胞；

步骤三、按照权利要求1所述的配方，配制并称取质量体积比为1％-5％的人血白蛋白、质量体积比为1％-8％的甘露醇注射液、质量体积比为1％-5％的复方维生素注射液、质量体积比为1％-5％的50％葡萄糖注射液，并混匀；

步骤四、将数量为5×10⁵-2×10⁶个/mL的激活的间充质干细胞重悬于步骤三混匀后的液体中，并加入余量的生理盐水，制备得到治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液。

5.根据权利要求4所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述激活的间充质干细胞的制备过程为：

将***间充质干细胞培养至70-80％的融合，抽掉***间充质干细胞培养时使用的间充质干细胞培养皿中的培养基，用磷酸缓冲液冲洗***间充质干细胞；

用特定的培养基培养***间充质干细胞；

当***间充质干细胞的浓度达到5×10⁵-2×10⁶个/mL时，得到激活的间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，当所述激活的间充质干细胞为TNF-α激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α的α-MEM的培养基；

当所述激活的间充质干细胞为IL-1激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基；

当所述激活的间充质干细胞为TNF-α和IL-1同时激活的间充质干细胞时，所述特定的培养基为含有浓度为20ng/mL的TNF-α培养基和浓度为50ng/mL的IL-1的α-MEM的培养基。

7.根据权利要求4所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，且***脐带间充质干细胞的培养过程为：

a)、取新鲜足月健康胎儿脐带，用含2倍100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗去除血渍，剥离华尔通氏胶，将剥离后的华尔通氏胶剪成小于1mm³的小块；

b)、将剪碎的华尔通氏胶均匀涂布于细胞培养器的底部，向所述细胞培养器中缓慢加入10mL无血清培养基，置于37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度环境中培养，将原代细胞培养7天后，更换无血清培养液，培养至细胞达到70％的融合，移去无血清培养液，添加浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸钠消化1min，脐带间充质干细胞收缩脱离瓶壁，此时加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA溶液，并使用移液管轻轻吹打，将脐带间充质干细胞悬液移入50mL离心管，离心后除去上清液，重新加入无血清完全培养基将离心后的脐带间充质干细胞重悬；

c)、按照1传1.5接种10cm培养皿，脐带间充质干细胞培养融合70％时按照所述b)的操作过程传代培养，培养成***脐带间充质干细胞。

8.根据权利要求4所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，***骨髓间充质干细胞的培养过程为：

1)、于髂前上棘穿刺点，用骨穿针抽取50mL骨髓液，注入50mL的无菌离心管中；用等量含20μ/mL肝素的PBS液稀释，并沿无菌离心管的管壁加入等体积的比重为1.073g/mL的淋巴细胞分离液进行离心，离心转速为2000rpm，离心时间为30min，离心后吸取单个核细胞层；然后用无菌生理盐水离心洗涤2次，每次离心过程的转速为1000rpm，离心时间为5min，弃去上清液，取沉淀；

2)、将离心得到的沉淀用无血清培养基混悬，计数细胞，按5×10⁶个/mL接种于的培养瓶中，置37℃、体积分数为5％的二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养；培养3天后，更换无血清培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3天1次更换培养液；7-9天后，骨髓间充质干细胞融合达50％-60％时，进行第一次传代；移去无血清培养液，采用浓度分别为0.25％和0.1％的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1min，骨髓间充质干细胞收缩脱离瓶壁，加入先前移去的培养上清液，中和胰蛋白酶-EDTA，并使用移液管轻轻吹打，将骨髓间充质细胞悬液移入50mL无菌离心管中；1000rpm离心8min，弃去上清液；重新加入无血清完全培养基重悬，计数；

3)、按照1传1-1.5接种10cm培养皿；骨髓间充质干细胞培养融合60％-80％时，按照所述2)的操作过程进行传代培养。

9.根据权利要求4所述的一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，***脂肪间充质干细胞的培养过程为：

S1、分离腹部白色脂肪组织，剔除可见微血管及肌肉组织，无菌PBS洗涤三遍，然后用无菌剪刀将脂肪组织剪碎至1mm³以下的糊状，添加无菌消化液，37℃水浴中匀速搅拌45-50min，至组织块消化干净；200目筛网过滤收集滤液，然后使用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基等量中和，1500rpm离心10min，弃去上清液，得到脂肪间充质干细胞；

S2、以1×10⁶个/mL的细胞密度，用无血清培养基重悬脂肪间充质干细胞，并接种于培养瓶中，37℃、体积分数为5％二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，当脂肪间充质干细胞生长至70％-80％融合时，使用0.25％胰蛋白酶溶液消化脂肪间充质干细胞，以1：3的接种比例接种到新的培养瓶中进行传代培养；脂肪间充质干细胞融合至不超过80％，1000rpm离心8min，弃去上清液，重新加入无血清完全培养基重悬脂肪间充质干细胞，计数；

S3、按照1传1-1.5接种10cm培养皿，脂肪间充质干细胞培养融合60％-80％时按照S2传代培养。