CN108611373A - Gfpt1稳定低表达的du145/vcap细胞系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种GFPT1低表达的DU145/VCAP细胞系的构建方法。利用慢病毒体系构建GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系。转染shGFPT1及慢病毒包装质粒到HEK293T细胞中，收集病毒上清，感染DU145/VCAP细胞，通过嘌呤霉素筛选转染后的DU145/VCAP细胞，获得GFPT1低表达的DU145/VCAP稳定细胞系并且通过免疫荧光观察慢病毒的感染效率，最终经Western Blot技术检测细胞株GFPT1的表达量下调70％以上，成功构建GFPT1低表达的细胞系，可作为研究GFPT1在***癌肿瘤中的分子作用机制及所参与代谢调控作用的理想细胞系。

Description

GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系及其构建方法
技术领域
本发明是构建一种稳定低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP细胞株及其构建方法，涉及生物医学领域。
背景技术
GFPT1蛋白是编码己糖胺合成的第一限速酶，这一基因催化形成6-磷酸葡萄糖胺，控制葡萄糖进入己糖胺合成途径，与细胞内的N-及O-连接的蛋白质的糖基化修饰相关。研究发现，与正常组织及细胞相比，在***癌细胞及***病人的组织样品中其蛋白质的O-糖基化水平明显增加，O-糖基化修饰作为潜在的营养感受器，可以调节转录、代谢等众多细胞进程，并与癌症等人类重大疾病密切相关。而己糖胺合成的限速酶GFPT1的蛋白表达水平在***癌细胞中也明显增高，同时GFPT1的突变会导致形成先天的肌无力综合征。在欧洲及美国***癌是男性中发病率最高的肿瘤，因此研究GFPT1对***癌中新的肿瘤标志物及细胞代谢紊乱的标志蛋白的研究具有重要意义，同时也可用于***癌临床早期诊断、预后判断等辅助性治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP细胞系及其构建方法，该细胞株可作为细胞模型，用于研究GFPT1对肿瘤尤其是***癌发生发展的调控机制以及对细胞代谢通路的影响等生物学功能。
本发明提供的一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株，是以***癌细胞株DU145/VCAP作为宿主细胞，感染带GFPT1的shRNA基因的慢病毒，经过嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选、扩增后获得低表达GFPT1蛋白的稳定细胞株。
本发明提供的一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株的构建方法，包括如下步骤：
包装细胞的转染
1)转染前一天将慢病毒包装细胞293T接种于60mm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。
2)在293T细胞中以1:8:9的比例转染5μg包装质粒及病毒质粒分别为pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段)。
3)转染8-12h后吸去培养基并加入3ml完全培养基。
4)转染后72h，将上清放入15ml离心管中，3000转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒(后续实验凡是接触过病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。
靶细胞感染与筛选
1)感染前24h将靶细胞DU145/VCAP接种于35mm dish或六孔板中以使第二天细胞密度达到50％左右。
2)取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中，并于37℃、5％CO2培养箱内培养。
3)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h后吸去培养基，换用完全培养基转至10cmdish中，继续培养。
4)24h后用含1.5μg/ml puromycin的培养基换液，等细胞长成后验证目标基因的表达。
本发明涉及利用慢病毒体系构建GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系。转染shGFPT1及慢病毒包装质粒到HEK293T细胞中，收集病毒上清，感染DU145/VCAP细胞，通过嘌呤霉素筛选转染后的DU145/VCAP细胞，获得GFPT1低表达的DU145/VCAP稳定细胞系并且通过免疫荧光观察慢病毒的感染效率，最终经Western Blot技术检测细胞株GFPT1的表达量下调70％以上，成功构建GFPT1低表达的细胞系，可作为研究GFPT1在***癌肿瘤中的分子作用机制及所参与代谢调控作用的理想细胞系。
附图说明
图1：低表达人GFPT1基因的DU145/VCAP稳定细胞株在倒置荧光显微镜(20倍)的细胞荧光鉴定图；
图2：低表达人GFPT1基因的DU145/VCAP稳定细胞株Western Blot鉴定图。泳道1为对照，泳道2，3为稳定细胞株shGFPT1的sh1，sh2，，抗体为Rabbit Anti-GFPT1 Antibody。
具体实施方式
以下实例所采用的培养基为DMEM+10％FBS
慢病毒感染及细胞系筛选
1)转染前一天将慢病毒包装细胞293T接种于60mm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。
2)在293T细胞中以1:8:9的比例转染5μg包装质粒及病毒质粒质粒分别为pVSVg:PSPAX2:shRNA(包含shControl及shGFPT1片段1及片段2)。
shGFPT1片段1(sh1)的序列：GCTATGACTTCGAATCTGA
shGFPT1片段2(sh2)的序列：AGGCAAAGACAAGAAAGGA
3)转染8-12h(在此为10h)后吸去培养基并加入3ml完全培养基。
4)转染后72h，将上清放入15ml离心管中，3000转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒(后续实验凡是接触过病毒液的吸管都要用84消毒液清洗)。
靶细胞感染与筛选
1)感染前24h将靶细胞DU145/VCAP接种于35mm dish以使第二天细胞密度达到50％左右。
取1ml病毒液加入5μg/ml polybrene后加入到预感染的DU145/VCAP细胞中，并于37℃、5％CO2培养箱内培养。
2)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h(在此为20h)后吸去培养基，换用完全培养基转至10cm dish中，继续培养。
3)24h后用含1.5μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的培养基换液，验证目标基因的表达。
通过Western Blot实验验证细胞系的建立
蛋白质样品的制备
1)配制RIPA蛋白裂解液(每个600mm的培养皿用100ul)加入蛋白酶抑制剂。
2)收集细胞，并用预冷的PBS清洗细胞，用配制好的蛋白裂解液将细胞吹散，将细胞移到离心管中，放入DNA混合仪中混匀，4℃30min。
3)将离心管放入离心机中，13000转4℃15min，将上清移至另一离心管中。
4)以BCA法测定蛋白浓度测浓度
空白对照：RIPA
混合不同浓度的BSA(0.125μg/μl,0.25μg/μl,0.5μg/μl,1μg/μl,2μg/μl)各20μl，制成标准品备用并稀释2μl的样品到18μl的RIPA。
BCA***:A:B＝50:1比例配置测量的溶液，最终按照200μlBCA+20μl样品或者标准品，振荡后37℃孵育30min，用酶标仪测量蛋白浓度。
5)取所需质量的样品，加入5X SDS Loading buffer(含DTT 0.1M),并将混合物在95℃加热10min使蛋白质变性。
免疫印迹技术(Western Blot)
1)将凝胶固定到电泳装置上后，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，加样，在不加入样品的胶孔中加入等体积的1×SDS Loading buffer进行配平。
2)连接好电源后用80V电压跑胶，当样品经过浓缩胶到达分离胶时，将电压增大到120V直至溴酚蓝接近凝胶末端然后结束电泳。
3)取出电泳好的凝胶，并切除外源及上层的积层胶。
4)转膜：将膜及4片滤纸剪成所需胶的大小。先将PVDF膜浸于甲醇中浸泡5分钟。按照顺序：正级-海绵+滤纸+膜+胶+滤纸+海绵-负极，将膜夹紧，每一层都要压平，防止产生气泡。
5)将组装好的夹子放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，放入冰盒，转子后加盖，并将电泳槽***加入冰水混合物后放在磁力搅拌器上接通电源。恒流400mA 2h。
6)将转好的膜放入TBST中洗涤5min，洗涤两次。
7)封闭：用TBST配置5％的脱脂牛奶并混匀，将PVDF膜浸泡在含5％脱脂牛奶的TBST中，室温摇晃0.5-1h。
8)将膜放入TBST中洗涤5min，洗涤三次，将PVDF膜放在杂交袋中，再将用5％BSA稀释的一抗加入杂交袋中，轻轻赶走气泡，封口，4℃摇床过夜或者置于摇床上室温孵育1-2h。
9)将PVDF膜取出，用TBST清洗3次，每次15min。
10)在膜上加上用TBST配置的5％脱脂牛奶稀释好的二抗，置于摇床上室温孵育2h。
将膜用TBST清洗3次，每次15min。
11)将Thermo的发光液按1:1的比例将A、B液混合。用镊子夹起PVDF膜的边缘，用吸水纸吸去膜边缘多余水分，将其放在保鲜膜上，加入发光夜，避光孵育5分钟,曝光。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> GFPT1稳定低表达的DU145/VCAP细胞系及其构建方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(19)
<400> 1
gctatgactt cgaatctga 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(19)
<400> 2
aggcaaagac aagaaagga 19

Claims (3)

1.一种低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株的构建方法，其特征在于：以***癌DU145/VCAP细胞作为宿主细胞通过慢病毒感染导致细胞中GFPT1蛋白的表达量下调,包括以下步骤：
1)转染前16-24小时将1.5×106-2×106的293T细胞接种于细胞培养皿用于慢病毒包装；
2)在293T细胞中转染3-5μg包装质粒及病毒质粒，质粒分别为质量比1:8:9-1:9:10的包装质粒中的pVSVg:包装质粒中的PSPAX2:病毒质粒中shRNA(shRNA中包含shControl及shGFPT1片段)；
3)转染8-12h后更换培养基；
4)转染后72-96h，将上清放入离心管中，3000-5000转离心10-15分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒；
5)感染前将7×105-1×106个靶细胞DU145/VCAP接种于培养皿培养24-36h，取1ml病毒液加入polybrene使其终浓度为5-10μg/ml后,加入到预感染的DU145/VCAP细胞中；
6)感染的DU145/VCAP细胞培养8h～24h后更换培养基，继续培养36h～48h；
7)用含终浓度为1.5-2μg/ml puromycin(嘌呤霉素)的培养基更换感染的DU145/VCAP细胞培养的培养基,对细胞进行筛选，存活的细胞即为低表达GFPT1蛋白的DU145/VCAP稳定细胞株。
2.如权利要求1所述构建方法，通过免疫荧光及免疫共沉淀技术(Western)检测GFPT1的感染效率及表达量的变化。
3.一种采用权利要求1或2所述构建方法获得的低表达人GFPT1蛋白的DU145/VCAP细胞株。
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