CN108607092B - 一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天然中药蛋白领域，更具体地涉及一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用；所述当归蛋白N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA。所述当归蛋白用于制备辅助肿瘤治疗药物，化疗前给予当归蛋白可以减轻化疗药物顺铂对小鼠脾脏的损伤；放射治疗前给予当归蛋白，可使受照小鼠的外周血白细胞数量、胸腺指数、脾脏指数、脾结节数量（CFU‑S）和脾脏的CAT活力分别显著增加135%、103%、23%、219%和180%，还可提升受照鼠脾脏的GST和GSH‑Px活力，改善脾白髓损伤，其整体保护效果强于阿米福汀，可使受照鼠体重下降率显著减少了94%，从而提高其生存质量。

Description

一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及天然中药蛋白领域，更具体地涉及一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术
化疗药物顺铂（DDP）是以铂为基础的具有临床活性的广谱抗癌特效药之一，但因其选择性不高，对肿瘤细胞有强大的杀伤作用外，也可抑制以脾脏为代表的免疫***。
放射治疗是杀灭肿瘤的行之有效的手段，承担着2/3肿瘤病人的治疗。但因放疗产生的自由基引起的辐射损伤副作用大，严重削弱了机体局部和整体的抵抗力，患者往往会因为这些副作用的发生而被迫中断放疗。所以肿瘤放疗副作用的防治将直接影响着放疗能否持续，是决定最终能否彻底根治肿瘤的主要因素之一，日益受到人们的关注和重视。
阿米福汀（AMFT）又名WR-2721，是唯一被批准应用于临床的放射防护剂。在放疗前预先使用阿米福汀，可明显减轻化疗药物所产生的肾脏、骨髓、心脏、耳及神经***的毒性。但在临床使用过程中，阿米福汀逐渐被发现具有较大的毒性，会使大部分患者出现头晕、恶心、呕吐等不良反应。由于阿米福汀价格昂贵，使用后的副作用却不少，近年来其临床使用逐渐减少，甚至退出临床使用。因此，市场急需开发新的化疗与放射防护剂。
当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]是伞形科当归属的一种多年生草本植物，活血补血之良药，其根可入药材，甘温质润。当归做为我国著名的中草药之一，被尊称为“药王”，对循环***、呼吸***、造血***、免疫***以及神经***等均具有一定的功效。当归总蛋白具有清除DPPH自由基能力，且既在极显著促进正常肝细胞L-02的增殖（P<0.01）的同时，又能极显著抑制白血病细胞K562的增殖（P<0.01）。
本发明从中药当归中得到当归PR-10家族蛋白——ASPR。病程相关蛋白-10家族（PR-10）蛋白广泛分布于各种属以及植物各器官中，属于植物抗逆蛋白，与植物抵抗生物胁迫（病原体）与非生物胁迫（干旱，热量，寒冷和盐分）的能力有关。
本发明提供了当归蛋白及其在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用，以开发新的化疗与放疗防护剂。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
所述当归蛋白的制备方法为：
以10倍体积0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液 （pH 8.0） 浸泡当归饮片，4 ℃抽提过夜，次日用4层纱布过滤残渣，滤液于12000 rpm、4 ℃离心10min，收集上清。将所得的上清进行80%硫酸铵沉淀，收集沉淀，溶于2倍体积的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中，经Sephadex G-50层析柱分离，收集第二个洗脱峰，即为目的蛋白ASPR，分子量为18.33 kDa，经测序获得N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA。所述当归蛋白可用于制备防治放射损伤药物。
所述当归蛋白的使用浓度为0.5-2 mg/mL；将无菌过滤过的当归ASPR蛋白以无菌的PBS或生理盐水稀释至使用浓度。使用方法为给予顺铂或放射治疗前连续肌肉注射或静脉注射当归ASPR蛋白3 d，每次0.5 mL。
本发明的优点在于：
（1）本发明首次将当归ASPR蛋白用于顺铂损伤与急性放射损伤模型。
（2）本发明证实当归ASPR蛋白对顺铂导致的脾脏损伤具有保护作用，其能减轻顺铂对小鼠脾脏的损伤。
（3）本发明证实当归ASPR蛋白对于急性放射损伤具有保护作用，放射治疗前给予当归ASPR蛋白，可使受照小鼠的外周血白细胞数量、胸腺指数、脾脏指数、脾结节数量（CFU-S）和脾脏的CAT活力分别显著增加135%、103%、23%、219%和180%，还可提升受照鼠脾脏的GST和GSH-Px活力，改善脾白髓损伤，其整体保护效果强于阿米福汀，可使受照鼠体重下降率显著减少了94%从而提高其生存质量。
本发明药物的具体用途：
（1）可用于预防癌症患者因化疗或放疗引起的副作用，如放射性肺损伤、放射性造血***损伤以及放射性肝损伤等。
（2）可用于医疗与工业用放射源的操作人员等日常预防放射损伤，例如检修核工业设备时和抢救辐射事故病人。
（3）可用于宇航人员预防太空的宇宙射线伤害。
（4）可用于预防其他氧化损伤。
本发明药物的药理作用：
本发明的当归ASPR蛋白能显著增加受照鼠脾组织CAT活力，还可提升其脾脏的GST和GSH-Px活力，改善其脾白髓损伤，增加其脾结节（CFU-S）及外周血白细胞数量，提升其脾脏和胸腺指数，维持其体重，从而提高其生存质量。
附图说明
图1 当归ASPR蛋白SDS-PAGE。M：蛋白Marker ；1：当归蛋白（ASPR）。
图2 当归ASPR蛋白对顺铂损伤小鼠脾脏的影响。A、小鼠脾脏表观图；B、小鼠脾脏指数n=5,与正常组相比,** P<0.01,与顺铂损伤对照组相比,# P<0.05。
图3 当归ASPR蛋白对受照鼠体重增长率的影响。n=10, 与正常组相比, ** P <0.01, 与放射对照组相比,## P <0.01。
图4 当归ASPR蛋白对受照鼠外周血白细胞的影响。n=10, 与正常组相比,** P <0.01,与放射对照组相比,# P <0.05，## P <0.01。
图5 当归ASPR蛋白对受照鼠胸腺指数的影响。n=10, 与正常组相比,** P <0.01,与放射对照组相比,## P <0.01，# P <0.05。
图6 当归ASPR蛋白对受照鼠脾脏指数的影响。n=10, 与正常组相比,** P <0.01,与放射对照组相比,# P <0.05。
图7 当归ASPR蛋白对受照鼠脾脏表观学及组织学特征的影响（×200倍） n=10。
图8 当归ASPR蛋白对受照鼠脾结节数量的影响。n=10， 与正常组相比，* P <0.05，与放射对照组相比，## P <0.01。
图9 当归ASPR蛋白对受照鼠CAT活力水平的影响。n=10， 与正常组相比，* P <0.05，与放射对照组相比，# P <0.05。
图10 当归ASPR蛋白对受照鼠GST活力水平的影响。n=10，与正常组相比，** P <0.01。
图11 当归ASPR蛋白对受照鼠GSH-Px活力水平的影响。n=10，与放射对照组相比，# P <0.05。
具体实施方式
实施例1 当归ASPR蛋白的纯化
以10倍体积0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）浸泡切成小块的当归， 4 ℃静置过夜，约15 h，次日用4层纱布过滤残渣，滤液于12000 rpm、4 ℃离心10 min，所得的上清为当归蛋白粗提液；粗蛋白液进行硫酸铵一步沉淀（0-80%），沉淀过夜并收集其沉淀蛋白，溶于2倍体积的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，将硫酸铵沉淀的溶解液上样于经平衡液（0.05 mol/L ，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液）充分平衡后的Sephadex G-50层析柱，用平衡液洗脱并收集第二个洗脱峰，经SDS-PAGE电泳检测纯度。
实验结果：
当归蛋白经粗提取、硫酸铵一步沉淀、SephadexG-50凝胶过滤层析最终得到在SDS-PAGE上显示为单一条带，分子量为18.33 KDa的当归蛋白，如图1所示。该蛋白的N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA ，该蛋白分子量18.33 kDa，为PR-10家族蛋白，命名为ASPR。
实施例2：当归ASPR蛋白对顺铂损伤小鼠的防护作用
1、实验动物与分组
雄性昆明小鼠，购自吴氏动物，体重为20 ± 2 g。实验前正常饲养三天。将小鼠随机分成5组，每组5只，各组及其处理如下：正常组（CON）与顺铂损伤组（DDP）先连续注射3 d的生理盐水0.3 mL，末次给予 2 h后， CON组注射生理盐水0.3 mL，DDP组注射0.5 mg/mL顺铂溶液0.3 mL（7.5 mg/kg）；蛋白加药组分别为ASPR1 （0.5 mg/mL）+DDP组, ASPR2 （1.25mg/mL）+DDP组和ASPR3 （2.0 mg/mL）+DDP组，三组小鼠分别注射蛋白溶液0.5 mL 3d，在末次给药 2h后，再注射顺铂溶液0.3 mL。
2、检测指标---脾脏指数
所有小鼠在造模2 d后处死，取出小鼠的脾脏，去除残留血液后，进行质量称量与记录，并计算其指数。
脾脏指数=（脾脏质量/处死前体重）×100%。
实验结果：
如图2所示，与正常组相比，顺铂损伤对照组的脾脏变小，与顺铂损伤对照组相比，各蛋白加药组脾脏均变大。各组小鼠脾脏指数的测定结果也表明，与正常组相比，顺铂损伤对照组的脾脏指数极显著降低（P<0.01），仅为正常组的57.19%。与顺铂损伤对照组相比，各蛋白加药组脾脏指数均有回升，其中当归ASPR蛋白中剂量组显著恢复了40.35%（P<0.05）。
因此我们选择最佳蛋白剂量点1.25 mg/mL做接下来的实施例3。
实施例3：对一次性全身放射小鼠放射防护的预防作用
1、实验动物
雄性昆明小鼠，购自吴氏动物，体重为20 ± 2 g。自由饮水和进食，饲料为专用辐照料，定时排风。实验前饲养三天无异常。
2、照射条件和实验分组
将试验用昆明小鼠随机分为5组：正常组CON（未给药未放射）、放射对照组XRT（只放射未给药）、阿米福汀组（AMFT+XRT）（200 mg/kg，放射前30 min注射）、当归ASPR蛋白组（ASPR+XRT）（1.25 mg/mL），放射前给药组连续腹腔注射3 d当归ASPR蛋白，最后一次注射2h后进行放射。放射源为X射线，照剂量为6 Gy，剂量率为2 Gy/min，进行一次性全身照射。照射后普通喂养7d。
3、检测指标
3.1小鼠体重增长
放射前进行所有小鼠的体重测量，之后每天于固定时间称量小鼠体重并记录，计算出小鼠7天内的体重增长情况。
体重增长率=（第7天小鼠体重-放射前小鼠体重）/放射前小鼠体重×100%。
3.2外周血白细胞数变化
所有小鼠在放射7天后进行颈椎脱臼处死。处死后的小鼠立刻进行心脏取血，每只小鼠取血20 μl，用380 ul的白细胞稀释液（冰醋酸2.0 mL+1%龙胆紫1.0 mL，蒸馏水定容至100 mL，混匀）稀释后，取稀释液滴入计数板中，静置2-3 min，待白细胞下沉后置于普通光学显微镜下进行白细胞计数。
3.3 胸腺指数和脾脏指数
摘取小鼠的胸腺和脾脏去除残留血液后，进行质量的称量与记录，并计算其脏器指数。
胸腺指数=（胸腺质量/处死前体重）×100%。
脾脏指数=（脾脏质量/处死前体重）×100%。
3.4 外源性脾结节法测定小鼠造血干细胞
参照经典的外源性脾结节法。取出部分脾脏，置于Bouin氏液（苦味酸饱和水溶液30 mL，10%甲醛10 mL，冰醋酸2 mL）中固定24 h，再用95%酒精漂洗后作宏观脾结节计数，即计数脾凸面结节。Bouin氏液与脾脏体积总和的比例大于5：1。
3.5 脾脏表观学及组织学评估
取部分脾组织以10%***溶液固定，然后将其按组织包埋程序包埋在石蜡中；固定后，将组织切片切成4μm切片并用H＆E染色。
3.6 脾脏抗氧化能力的检测
将部分脾脏制成10 %的组织匀浆，4000 rpm离心20 min ，上清分装为待测液，分别用南京建成试剂盒测定脾组织匀浆中CAT，GST和GSH-Px活力。
4、统计分析：采用Excel 2013中的Student's t-检验，以P<0.05为显著差异，P<0.01为极显著差异。
5、结果
如图3所示，与正常组相比，小鼠经6 Gy全身放射后的第七天，体重呈负增长状态（P<0.01）。与放射对照组相比，放射前预给药阿米福汀或当归蛋白都可极显著地抑制受照小鼠的体重下降（P<0.01），预给药阿米福汀组可使受照小鼠体重下降率减少59%（P<0.01），预给药当归蛋白ASPR的受照小鼠体重下降率则减少94%（P<0.01）。
如图4所示，与正常组相比，放射对照组小鼠外周血白细胞数极显著下降（P<0.01）。与放射对照组相比，放射前预给药阿米福汀可使受照小鼠白细胞数目显著增加106%（P<0.05），预给药当归蛋白ASPR的受照小鼠血白细胞数显著增加135%（P<0.05）。如图5所示，与正常组相比，放射对照组胸腺指数极显著降低（P<0.01）。与放射对照组相比，预给药阿米福汀或当归蛋白都可使受照鼠胸腺指数显著提高（P<0.05， P<0.01），但当归蛋白ASPR的作用效果强于阿米福汀。
如图6所示，与正常组相比，放射对照组的小鼠脾脏指数极显著降低（P<0.01）。与放射对照组相比，预给药阿米福汀可使受照小鼠的脾脏指数显著提高33%（P<0.05），放射前预给药当归蛋白可使受照小鼠脾脏指数分别显著增加23%（P<0.05）。
脾组织学病理切片结果如图7所示，单纯放射组小鼠的脾脏红髓白髓混乱，无明显的界限。预先给予阿米福汀或当归蛋白对此都有不同程度的改善作用，可见界限分明的完整白髓。
如图7所示，正常小鼠的脾脏表面光滑平整，单纯放射组小鼠脾表面不平整，出现肉眼可见的凸起的脾结节小泡，即脾集落形成单位（CFU-S）。预先给予阿米福汀或当归蛋白后，受照小鼠脾脏表面都出现了数量不等的脾结节。经Bouin液处理后，各组小鼠脾集落形成单位数如图8所示。由图8可知，正常组小鼠无CFU-S，放射对照组出现少量的CFU-S。与放射对照组相比，预先给予阿米福汀可提高小鼠的CFU-S量但没有显著性，预给药当归蛋白则使受照小鼠的CFU-S增加了两倍以上。
由图9、图10和图11可知，与正常组相比，单纯放射组小鼠脾脏的CAT、GSH-Px和GST活力显著降低（P<0.05；P<0.01）。与单纯放射组相比，预给予阿米福汀或当归ASPR蛋白均可不同程度地提升受照鼠脾脏的抗氧化酶活力。其中预给予阿米福汀对受照鼠脾脏的CAT和GSH-Px活力均有显著的提升作用，对于受照鼠脾脏的GST活力也有一定的提升作用。当归ASPR蛋白对受照鼠脾脏的CAT活力有显著的提升作用，其效果略强于阿米福汀，对于受照鼠脾脏的GSH-Px和GST活力也有一定的提升作用。
综上所述，与放射对照组相比，放射前预先给予当归ASPR蛋白可使受照小鼠外周血白细胞数显著增加135%（P<0.05），胸腺指数显著增加103%（P<0.05），脾脏指数显著增加23%（P<0.05），CFU-S显著增加219%（P<0.05），对脾白髓损伤有明显的改善作用，可使脾脏的CAT活力显著增加180 %（P<0.05），最终使受照鼠体重下降率显著减少了94%（P<0.01）。
CFU-S是反映脾脏造血功能的重要指标，虽然当归蛋白对脾脏抗氧化体系及脾脏指数的保护效果稍弱于阿米福汀，但其对脾脏CFU-S的提升效果比阿米福汀强得多。此外，当归蛋白对受照鼠的WBC、胸腺指数和CFU-S的提升效果均强于阿米福汀，最终对全身放射所导致的体重下降的抑制作用也强于阿米福汀。小鼠体重增长率可以直观地反映小鼠的生存质量，是小鼠放射损伤程度的综合指标。因此，当归ASPR蛋白对放射损伤的综合保护效果强于阿米福汀。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 当归蛋白
<400> 1
Gly Ile Gln Lys Thr Glu Val Glu Ala Pro Ser Thr Val Ser Ala
1 5 10 15

Claims (1)

1.一种当归蛋白在制备辅助肿瘤治疗药物中的应用，所述当归蛋白N端序列为GIQKTEVEAPSTVSA，分子量18.33 KDa，所述辅助肿瘤治疗药物为预防化疗、放射损伤药物；
所述当归蛋白的制备方法为：以10倍体积0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液混合浸泡切成小块的当归，在4℃静置过夜，次日用4层纱布过滤残渣，滤液于12000 rpm、4 ℃离心10 min，所得的上清为当归蛋白粗提液；当归蛋白粗提液进行0-80%硫酸铵一步沉淀，沉淀过夜并收集其沉淀蛋白，溶于2倍体积的0.05 mol/L pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，将硫酸铵沉淀的溶解液上样于经平衡液0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液充分平衡后的Sephadex G-50层析柱，用平衡液洗脱并收集第二个洗脱峰为目的蛋白。
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