CN108603174A - 在适用于临床应用的无血清悬浮细胞培养体系中产生重组腺相关病毒(aav)载体的可扩展方法 - Google Patents

在适用于临床应用的无血清悬浮细胞培养体系中产生重组腺相关病毒(aav)载体的可扩展方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于利用质粒转染细胞的方法和组合物。在某些实施方案中，本发明公开了其中转染效率通过在转染过程期间使被转导的细胞与不含核酸的聚乙烯亚胺(PEI)接触而显著提高的方法和组合物。还公开了根据所公开的方法和组合物生成的治疗上有用的腺相关病毒载体。

Description

在适用于临床应用的无血清悬浮细胞培养体系中产生重组腺 相关病毒(AAV)载体的可扩展方法
相关申请
本专利申请要求2015年12月1日提交的美国专利申请No.62/261,815的优先权，所述专利申请全文以引用方式明确地并入本文。
技术领域
本发明涉及利用核酸，例如质粒进行细胞转导(转染)的领域。更具体地讲，本发明提供了用于产生转导细胞的组合物和方法，所述细胞任选产生腺相关病毒(AAV)载体。
引言
整个说明书中引用了数种出版物和专利文献以便描述本发明所属领域的现状。这些引用文献中的每一个均以引用方式并入本文，如同全文阐述一样。
发明内容
本发明提供诸如编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸之类的核酸(质粒)、和聚乙烯亚胺(PEI)、任选地与细胞组合的组合物。在一个实施方案中，组合物包含质粒/PEI混合物，其具有多种组分：(a)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(b)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(c)聚乙烯亚胺(PEI)溶液。在具体方面，质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且组分(a)、(b)和(c)的混合物任选地温育约10秒至约4小时的时间段。
在其它实施方案中，核酸(质粒)和聚乙烯亚胺(PEI)的组合物还包含细胞。在具体方面，使细胞与组分(a)、(b)和(c)的质粒/PEI混合物接触。
在附加的实施方案中，核酸(质粒)和聚乙烯亚胺(PEI)、任选地与细胞组合的组合物，还包含游离PEI。在具体方面，细胞与游离PEI接触。
在各种其它实施方案中，细胞与组分(a)、(b)和(c)的混合物接触至少约4小时、或约4小时至约140小时，或约4小时至约96小时。在具体方面，细胞与组分(a)、(b)和(c)的混合物以及任选的游离PEI接触至少约4小时。
本发明的组合物可存在于容器中。在具体方面，容器为烧瓶、板、袋或生物反应器，并且任选地是无菌的，和/或容器任选地适用于维持细胞活力或生长。
本发明组合物和方法的质粒尤其包括编码病毒蛋白诸如AAV衣壳蛋白的核酸。此类质粒和细胞可与游离PEI接触。在具体方面，质粒和/或细胞与游离PEI接触至少约4小时、或约4小时至约140小时，或约4小时至约96小时。
还提供一种产生转染细胞的方法，所述方法包括：提供质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将所述核酸(质粒)与PEI溶液混合以产生质粒/PEI混合物。在具体方面，将所述质粒/PEI混合物温育约10秒至约4小时范围内的时间段。在此类方法中，将细胞与所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物，然后将游离PEI加入产生的核酸/PEI细胞培养物中以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；并且然后将产生的游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染的细胞。在具体方面，所述质粒包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。
还提供了一种产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生重组AAV载体，所述方法包括：提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将前述质粒与PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到产生的质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及将所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染细胞，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
另外提供了用于产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括：提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；将前述质粒与PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与本发明所述所产生的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到如本发明所述产生的质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；将所述质粒/PEI细胞培养物或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；收获产生的转染细胞和/或从产生的转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；并将产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
还提供了用于产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生具有编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。在一个实施方案中，方法包括：提供以下组分的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液；将所述质粒(i)和(ii)与PEI溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与产生的质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及将所述质粒/PEI细胞培养物或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞，所述转染细胞产生包编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
本发明的方法和组合物还包括一个或多个步骤或特征结构。示例性步骤或特征结构包括但不限于，收获产生的转染细胞和/或从产生的转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物的步骤。附加的示例性步骤或特征结构包括但不限限于从细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
此外，还提供产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。在一个实施方案中，方法包括：提供以下组分的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，将所述质粒(i)和(ii)与所述PEI溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物(并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段)；使细胞与产生的质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到产生的质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；将所述质粒/PEI细胞培养物或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；收获产生的转染细胞和/或从产生的转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；以及从产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
另外提供用于产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。在一个实施方案中，方法包括：提供以下组分的混合物：(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；和(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，其中所述质粒(i)和(ii)在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且其中任选地将组分(i)、(ii)和(iii)的混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；使细胞与产生的混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；将游离PEI添加到产生的质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；将所述质粒/PEI细胞培养物或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；收获产生的所述转染细胞和/或从产生的转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；以及从产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
组合物和方法还可以包括一个或多个附加步骤或特征结构。此类步骤或特征结构包括但不限于：其中所述质粒/PEI细胞培养物、或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物、或所述核酸/PEI细胞培养物温育在约4小时至约140小时范围内的时间段，或温育在约4小时至约96小时范围内的时间段。此类步骤或特征结构包括但不限于：其中所述质粒/PEI混合物具有在约0.1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约0.1:1范围内的PEI：质粒重量比，或其中所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养基具有在约0.1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约0.1:1范围内的PEI：质粒重量比。此类步骤或特征结构包括但不限于：其中所述质粒/PEI混合物具有在约1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有约5:1至约1:1范围内的PEI：质粒重量比，或其中所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养基具有在约1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约1:1范围内的PEI：质粒重量比。
适用于本发明组合物和方法的PEI形式(游离PEI、总PEI、质粒/PEI混合物或与质粒/PEI混合物接触的细胞)包括水解的线性聚乙烯亚胺。在具体方面，PEI(游离PEI、总PEI、质粒/PEI混合物或与质粒/PEI混合物接触的细胞)包含呈游离碱形式的具有在约4,000至约160,000范围内和/或在约2,500至约250,000分子量范围内的水解的线性聚乙烯亚胺，或呈游离碱形式的具有约40,000分子量和/或约25,000分子量的水解的线性聚乙烯亚胺。
在各种实施方案中，所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物中的总PEI中的氮(N)比质粒中的磷(P)的摩尔比在约1:1至约50:1范围内(N:P)。在其它实施方案中，所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物中的总PEI中的氮(N)比质粒中的磷(P)的摩尔比为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1(N:P)。
根据本发明的组合物和方法可使质粒/PEI混合物温育一段时间。在具体方面，温育在约30秒至约4小时的范围内。在更具体方面，质粒/PEI混合物的温育在约1分钟至约30分钟的范围内。
根据本发明的组合物和方法可具有各种含量百分比(按摩尔比计或按重量(质量)计)的PEI。在具体方面，游离PEI的量在总PEI的约10％至约90％范围内，或游离PEI的量在总PEI的约25％至约75％范围内，或游离PEI的量为总PEI的约50％。
根据本发明的组合物和方法可在各种时间点时将PEI加入质粒和/或细胞中。在具体实施方案中，在所述质粒/PEI混合物与所述细胞接触之前、同时或之后，将所述游离PEI加入所述细胞中。
根据本发明的组合物和方法包括哺乳动物细胞(例如，HEK293E或HEK 293F细胞)。此类细胞可粘附或处于悬浮培养基中。在具体方面，细胞在无血清培养基中生长或维持。
根据本发明的组合物和方法可具有特定密度和/或细胞生长期和/或活力的细胞。在具体实施方案中，当与所述质粒/PEI混合物接触时和/或当与所述游离PEI接触时，所述细胞的密度在约1×105个细胞/mL至约1×108个细胞/mL的范围内。在附加的具体实施方案中，当与所述质粒/PEI混合物接触或与所述游离PEI接触时，所述细胞的活力为约60％或大于60％，或其中当与所述质粒/PEI混合物接触时，所述细胞成处于对数生长期，或当与所述质粒/PEI混合物接触或与所述游离PEI接触时，所述细胞的活力为约90％或大于90％，或其中当与所述质粒/PEI混合物或与所述游离PEI接触时，所述细胞成处于对数生长期。
编码的AAV包装蛋白包含AAV rep和/或AAV cap。此类AAV包装蛋白包括例如，任何AAV血清型的AAV rep和/或AAV cap蛋白。
编码的辅助蛋白包含例如腺病毒E2和/或E4、VARNA蛋白和/或非AAV辅助蛋白。
根据本发明的组合物和方法可具有特定量和比率的核酸(质粒)。在具体实施方案中，包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒和包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒的总量在约0.1μg至约15μg/mL细胞的范围内。在附加的具体实施方案中，包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒与包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒的摩尔比在约1:5至约1:1的范围内或在约1:1至约5:1的范围内。
质粒可包括不同或相同质粒上的核酸。在一个实施方案中，第一质粒包含编码AAV包装蛋白的核酸并且第二质粒包含编码辅助蛋白的核酸。在更具体的实施方案中，包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒比包含编码AAV包装蛋白的核酸的第一质粒比包含编码辅助蛋白的核酸的第二质粒的摩尔比在约1-5:1:1、或1:1-5:1、或1:1:1-5的范围内。
根据本发明的组合物和方法包括任何血清型的AAV载体或其变体。在一个实施方案中，重组AAV载体包括：AAV血清型1-12，AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或修饰的或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或野生型AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白中的任一种。在附加的具体实施方案中，AAV载体包含AAV血清型或AAV假型，其中所述AAV假型包含不同于ITR血清型的AAV衣壳血清型。
提供或包括AAV载体的根据本发明的组合物和方法还可以包括其它元件。此类元件的示例包括但不限于：内含子、表达控制元件、一种或多种腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)和/或填充物核苷酸序列。此类元件可在编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸内或侧接所述核酸，或所述表达控制元件可与编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸能操作地连接，或所述AAV ITR侧接于编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的5'或3'端，或所述填充物多核苷酸序列可侧接编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸5'或3'端。
表达控制元件包含组成型或可调节控制元件，诸如组织特异性表达控制元件或启动子(例如提供在肝脏中的表达)。
ITR可以为下列中的任一种：AAV2或AAV6血清型或它们的组合。AAV载体可包含与下列中的任一种具有75％或更多的序列同一性的任何VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11或AAV2i8VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或包含选自下列中任一种的修饰或变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11和AAV-2i8AAV血清型。
在本发明的组合物和方法中，可将细胞传代培养，诸如通过培养物中稀释或移除细胞来降低细胞密度。在一个实施方案中，在质粒/PEI混合物接触之前将细胞传代培养至减小的细胞密度。
在本发明的组合物和方法中，可以各种密度使用细胞。在一个实施方案中，在与所述质粒/PEI混合物接触之前将细胞培养或传代培养至约0.1×106个细胞/ml至约5.0×106个细胞/ml范围内的细胞密度。
在本发明的组合物和方法中，细胞可与PEI(游离PEI、总PEI、质粒/PEI混合物)接触一段时间、短时间或长期。在一个实施方案中，在传代培养之后，细胞与质粒/PEI混合物接触2天至5天的时间段。在另一个实施方案中，在传代培养之后，细胞与质粒/PEI混合物接触3天至4天的时间段。
本发明的组合物和方法提供增强的转染效率和/或由细胞重组产生载体。在一个实施方案中，与不将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物相比，在将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物中的步骤的情况下，引导入所述转染细胞中的质粒的量大至少50％。在另一个实施方案中，与不将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物相比，在将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物中的步骤的情况下，产生的重组AAV载体的量为至少50％或更大。在另一实施方案中，与不将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物相比，在将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物中的步骤的情况下，产生的重组AAV载体的量大1-5倍、5-10倍或10-20倍。
附图说明
图1示出了当使用2.8μg/mL、5.6μg/mL和11.2μg/mL的质粒DNA时，溶于TrisHC1或H2O中的PEI“Max”40KDa(A)和PEI 25KDa(B)的转染效率。与PEI 25KDa相比，PEI“Max”40KDa示出一致的更高的转染效率。
图2A-2B示出了游离PEI对12孔板中的转染效率和rAAV载体产生的影响。A)在12孔板中利用无血清悬浮培养物中的三种质粒(pAAV-eGFP-WRPE、pAAV-Rep2/Cap2、pAD2-辅助)转染293F细胞。B)游离PEI对rAAV滴度的影响。在转染时添加或不添加游离PEI的情况下，PEI/DNA重量比为2:1或4:1。将量为2.8μg/mL的DNA与摩尔比为1:1:1的三种质粒一起使用。首先将稀释的PEI与稀释的DNA以1:1的重量比混合以形成复合物。将过量的PEI稀释于50μL培养基中，并且然后直接加入细胞中。
图3A-3B示出了游离PEI对旋转瓶中的转染效率和rAAV滴度的影响。A)转染效率通过使用游离PEI增加。B)游离PEI对rAAV滴度的影响。PEI/DNA重量比为2:1，DNA量为2.8μg/mL。在转染时将PEI量的1/2和1/3用作游离PEI。
图4示出生物反应器中293F细胞生长曲线和活力。细胞以0.25×106个细胞/mL(单元1)、0.35×106个细胞/mL(单元2)和0.5×106个细胞/mL(单元3)接种。在生物反应器中在细胞培养的7天期间每12小时记录细胞密度(N)和活力(V)。
图5A-5B示出了生物反应器中的细胞转染。A)用三种质粒转染293F细胞最多至72小时。用倒置荧光显微镜检测GFP阳性细胞。B)用流式细胞术测量转染效率。在转染后48h-72h检测到50％-60％的GFP阳性细胞。转染效率在第3天转染和第4天转染之间相似。
图6A-6B示出了rAAV滴度和载体功能测定。A)通过qPCR评估第4天转染时载体滴度显著高于第3天。在转染条件下第4天时并且在150rpm的搅拌速度下，最高滴度为1.38E+11vg/mL。B)通过转导测定法测量载体功能。将相同体积的细胞裂解物加入HEK293细胞中。用倒置荧光显微镜检测GFP阳性细胞。转导结果与rAAV滴度一致，即滴度越高，转导率越高。
具体实施方式
本文公开了高效利用分子诸如核酸(例如质粒)转导细胞的组合物和方法。当用编码蛋白或包含转录成感兴趣的转录物的序列的核酸转导时，这种高效转导细胞可高效地产生蛋白和/或转录物。另外，当利用序列(诸如编码病毒包装蛋白和/或辅助蛋白的质粒)转导时，此类细胞可产生重组载体，所述重组载体包含编码蛋白或包含转录成感兴趣转录物的序列的核酸，其继而以高收率产生重组病毒载体。
本发明提供了细胞转导和/或病毒(例如AAV)载体生产平台，其包括将其与目前的“工业标准”病毒(例如AAV)载体生产过程区分的特征结构。本发明的组合物和方法的特征在于在特定条件下将PEI与核酸混合。将PEI与核酸混合导致PEI诱导的核酸有效压缩以形成被称为多聚复合物的稳定复合物。将核酸引入细胞中的方法包括在特定条件下提供与PEI混合的核酸，并将所得混合物施用于细胞。此外，本发明的组合物和方法的特征在于与游离PEI接触的细胞，或相对于将PEI/核酸混合物施用于细胞的步骤，以特定序列使细胞与游离PEI接触。本发明的组合物和方法的特征在于：1)高效率核酸细胞转导/转染；3)赋予载体预料不到的显著收率的试剂和加工步骤的独特组合；和4)可用于产生不同AAV血清型/衣壳变体的模块化平台。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸和多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。核酸和多核苷酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的序列(例如变体核酸)。
核酸或质粒还可是指编码蛋白的序列。此类蛋白可以为野生型或变体、修饰、修饰或嵌合蛋白。“变体蛋白”可意指修饰的蛋白，使得与野生型蛋白相比，修饰的蛋白具有氨基酸改变。
由核酸或质粒编码的蛋白包括治疗性蛋白。非限制性示例包括凝血因子(例如因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa或蛋白C)、CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、***、LDL受体、脂蛋白脂肪酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体贮积病的酶(ARSA)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、β-25葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、溶酶体氨基己糖苷酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子(例如***1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、胶质源性生长因子、转化生长因子α和β等)、细胞因子(例如α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、***基因产物(例如单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子等)、药物抗性蛋白(例如，提供对用于癌症治疗的药物的抗性)、肿瘤抑制蛋白(例如p53、Rb、Wt-1、NF、Von Hippel-Lindau(VHL)、腺瘤性息肉病菌(APC))、具有免疫调节性质的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白Tregitopes或hCDR1、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab陪伴蛋白1(无脉络膜症)、LCA 5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(回旋形萎缩)、视网膜劈裂蛋白1(遗传性视网膜劈裂症)、USH1C(Usher综合征1C)、X-连接视网膜色素变性GTP酶(XLRP)、MERTK(RP的AR形式：色素性视网膜炎)、DFNB1(间隙连接蛋白26聋症)、ACHM 2、3和4(色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)、TPP1、CLN2、导致溶酶体贮积病的基因缺陷(例如硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷脂转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘脂激活蛋白等)、用于基因组编辑的一种或多种锌指核酸酶、或用作基因组编辑的修复模板的供体序列。
核酸或质粒也可指在转录时产生转录物的序列。此类转录物可以为RNA，诸如抑制性RNA(RNAi，例如，小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。
非限制性示例包括抑制下列项的表达的抑制性核酸：亨廷顿(HTT)基因、与齿状核红核苍白球丘脑下核(dentatorubropallidolusyan)萎缩相关的基因(例如，萎缩蛋白1，ATN1)；脊髓球肌萎缩中的X染色体上的表达雄激素受体，脊髓小脑失调症蛋白1抗体、脊髓小脑失调症蛋白2抗体、脊髓小脑失调症蛋白3抗体、和脊髓小脑失调症蛋白7抗体，由(CACNA1A)编码的Cav2.1P/Q电压依赖性钙通道，TATA结合蛋白，脊髓小脑失调症蛋白8抗体相反链(也被称为ATXN8OS)，脊髓小脑性共济失调(1、2、3、6、7、8、12、17型)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚单位Bβ亚型，脆性X综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性X相关震颤/共济失调综合征中的FMR1(脆性X智力低下1)、脆性XE智力低下中FMR1(脆性X智力低下2)或AF4/FMR2家族成员2；肌强直性营养不良中的肌强直蛋白-蛋白激酶(MT-PK)；Friedreich共济失调中的Frataxin；肌萎缩侧索硬化中的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；参与帕金森氏病和/或阿尔茨海默氏病的发病机理的基因；载脂蛋白B(APOB)和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、血胆甾醇过多；HIV感染中的HIV Tat，人类免疫缺陷病毒转录基因的反式激活因子；HIV感染中HIV TAR，HIV TAR，人免疫缺陷病毒反式激活因子应答元件基因；HIV感染中的C-C趋化因子受体(CCR5)；RSV感染中的劳斯氏肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白、丙型肝炎病毒感染中的肝特异性微RNA(miR-122)；p53，急性肾损伤或移植肾功能延迟恢复或肾损伤急性肾衰竭；预先反复或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2，也称为蛋白酶体亚基β-9型(PSMB 9)，转移性黑素瘤；LMP7，也被称为蛋白酶体亚基β-8型(PSMB 8)，转移性黑素瘤；MECL1，也称为蛋白酶体亚基β型10(PSMB10)，转移性黑素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的纺锤体驱动蛋白，慢性粒细胞白血病中的细胞凋亡抑制B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的polo样激酶1(PLK1)，丙型肝炎感染中的甘油二酯酰基转移酶1(DGAT1)，家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素能受体，青光眼；糖尿病黄斑区(DME)或年龄相关性黄斑变性中的RTP801/Redd1，也称为DAN损伤诱导型转录物4蛋白；年龄相关性黄斑变性或脉络膜血管新生中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)，非动脉炎性缺血性视神经病中的半胱天冬酶2；先天性多发性硬化症中的角蛋白6A N17K突变蛋白；流感病毒感染中的甲型流感病毒基因组/基因序列；严重急性呼吸综合征(SARS)感染中的SARS冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉病毒基因组/基因序列；乙肝和丙肝感染中的乙肝和丙肝病毒基因组/基因序列；单纯疱疹病毒(HSV)感染中的HSV基因组/基因序列，柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性肌张力障碍中的基因如扭转素A(TOR1A)的致病性等位基因的沉默(等位基因特异性沉默)，移植中的泛I类和HLA-特异性等位基因；常染色体显性遗传性视网膜色素变性(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)；或所述抑制性核酸结合至前述基因或序列中的任一种的转录物。
核酸(质粒)可以为单链、双链或三链的、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论核酸(质粒)时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述具体多核苷酸的序列或结构。
“质粒”是核酸或多核苷酸的一种形式，其通常具有用于质粒表达(例如，转录、复制等)或增殖(复制)的附加元件。如本文所使用的，质粒也可用于参考此类核酸或多核苷酸序列。因此，在所有方面，本发明的组合物和方法适用于核酸和多核苷酸，其例如用于将核酸或多核苷酸引入细胞中、利用核酸或多核苷酸转导(转染)细胞、产生转导(转染)的具有核酸或多核苷酸的细胞，以产生病毒(例如AAV)载体的细胞、产生病毒(例如AAV)载体、产生具有病毒(例如AAV)载体的细胞培养基等。
本发明的组合物和方法包括聚乙烯亚胺(PEI)。PEI是一种阳离子聚合物并能够与核酸形成稳定的复合物，其被称为多聚复合物。尽管不希望受任何理论的束缚，但据信多聚复合物通过内吞作用引入细胞中。
PEI可以为线性PEI或支链PEI。PEI可以呈盐形式或游离碱形式。在具体实施方案中，PEI为线性PEI，诸如任选水解的线性PEI。水解的PEI可以完全或部分水解。水解线性PEI具有比非水解线性PEI更大比例的游离(可质子化氮)，典型地具有比非水解线性PEI多至少1-5％的游离(可质子化)氮，典型地具有比非水解线性PEI多5-10％的游离(可质子化)氮，或最典型地具有比非水解线性PEI多10-15％的游离(可质子化)氮。
在具体实施方案中，PEI可具有呈游离碱形式的在约4,000至约160,000范围内的分子量和/或在约2,500至约250,000范围内的分子量。在另外的具体实施方案中，PEI可具有呈游离碱形式的约40,000的分子量和/或约25,000的分子量。具体地讲，线性PEI呈游离碱形式具有约40,000的分子量和/或约25,000分子量。另外，还可使用化学改性的线性PEI或支链PEI。PEI可商购获得(例如，Polysciences,Inc.,Warrington,PA,USA)。
在本发明组合物和方法中，将核酸(诸如质粒)与PEI混合以形成PEI混合物或溶液。此类混合物或溶液可被称作“质粒/PEI混合物”或“核酸/PEI混合物”。因此，术语“质粒/PEI混合物”和“核酸/PEI混合物”意指PEI已与核酸/质粒混合。因此，如本文所述的PEI可在与细胞接触用于转导之前或基本上同时与核酸(质粒)混合。
如本文所使用的，术语“游离PEI”意指基本上或完全不含核酸(质粒)的PEI。因此，如本文所述的PEI也可呈游离PEI的形式。因此，“质粒/PEI混合物”或“核酸/PEI混合物”不同于游离PEI。如果游离PEI是基本上游离的，则如按分子量计或按质量计所测定的，存在的核酸(质粒)序列的量将不超过约5％。当然，该量可以小于5％，例如约4.5％或更小、约4％或更小、约3.5％％或更小、约3％或更小、约2.5％或更小、约2％或更小、约1.5％或更小、约1％或更小、或约0.5％或更少。
如本文所使用的，术语“总PEI”意指以PEI/质粒混合物和游离PEI形式存在的PEI的总量。因此总PEI包括与质粒混合的PEI和基本上或完全不含核酸序列(诸如质粒)的PEI。
PEI数量、比率、组成、溶液、溶剂和缓冲液、pH、盐、以及细胞接触和温育的计时和持续时间的公开内容适用于以下各项中的任一项、任两项或全部三项：1)质粒/PEI混合物或核酸/PEI混合物中的PEI；2)游离PEI形式的PEI(即，基本上或完全不含核酸或多核苷酸序列诸如质粒的PEI)；和3)总PEI(质粒/PEI混合物中或核酸/PEI混合物中的PEI+游离PEI)。
在具体实施方案中，PEI为溶液，诸如水性(例如水)溶液。在附加的具体实施方案中，PEI为酸化或中和的PEI。术语“酸化的PEI”意指通过将PEI溶解于酸性溶剂中制得的PEI溶液。酸化的PEI溶液的酸度典型地为约0至约3.0的pH，更典型地为约0.5至约2.0的pH。术语“中和的PEI”是指通过将PEI溶解于中性溶剂或缓冲液中制得的PEI溶液。中和的PEI溶液可具有在约6.0至约8.0范围内的pH，典型地在约6.5至约7.5范围内的pH，更典型地在约6.8至约7.2范围内的pH，最典型地在约7.0至约7.2范围内，例如约7.1的pH。
任何溶剂或缓冲液均可用于将PEI溶液的pH建立或维持在上述范围内而不破坏PEI的转染活性。酸性溶剂的示例包括无机酸诸如盐酸(HCl)，和具有酸性范围内的pH的有机酸诸如甘氨酸-盐酸溶液。中性溶剂/缓冲液的非限制性示例包括Tris(trizma碱)和HEPES。缓冲液的范围可以从约1mM到约100mM，更典型地从约2mM到约50mM，最典型地从约5mM到约20mM。
PEI溶液可任选地包括盐。盐的非限制性示例包括钠(Na)盐、钾(K)盐和镁(Mg)盐。在具体方面，PEI溶液的盐浓度范围是从约50mM到约500mM，更典型地从约100mM到约250mM，并且最典型地从约125mM到约175mM。
核酸(质粒)和PEI的混合通过将核酸(质粒)和PEI混合于溶液中来进行。混合可在与基于PEI的细胞转导相容的任何溶液中发生。非限制性示例如本文所述。混合后，可将核酸(质粒)/PEI混合物温育约1分钟至约8小时；约10秒至约4小时；约1分钟至约60分钟；约1分钟至约30分钟；约10分钟至约45分钟；约10分钟至约30分钟；和/或约20分钟至约30分钟的时间段。通常，时间包括约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟和约30分钟。
PEI和核酸(质粒)混合的比率不受限制。典型的比率包括在约1:0.01至约1:100的摩尔(或重量)比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔(或重量)比范围内的质粒混合物，以产生质粒/PEI混合物。更典型的摩尔(或重量)比包括在约1:1至约1:5的摩尔(或重量)比范围内，或在约1:2至约1:4的摩尔(或重量)比范围内的质粒混合物，以产生质粒/PEI混合物。在附加实施方案中，PEI：质粒重量比在约0.1:1至约5:1范围内，或在约5:1至约0.1:1范围内。在其它实施方案中，游离PEI/质粒/PEI细胞培养物具有在约0.1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约0.1:1范围内的PEI：质粒重量比。在具体实施方案中，质粒/PEI混合物具有在约1:1至约5:1范围内，或在约5:1至约1:1范围内的PEI：质粒重量比。在其它具体实施方案中，游离PEI/质粒/PEI细胞培养物具有在约1:1至约5:1范围内，或在约5:1至约1:1范围内的PEI：质粒重量比。
用于产生细胞转导的组合物和方法的核酸(质粒)的量变化。在具体实施方案中，在游离PEI/质粒/PEI细胞中，总PEI中的氮(N)与质粒中的磷酸(P)的摩尔比在约1:1至约50:1(N:P)的范围内，或者在游离PEI/质粒/PEI细胞中，总PEI中的氮(N)与质粒中的磷酸(P)的摩尔比在约1:1至10:1(N:P)的范围内，或者在游离PEI/质粒/PEI细胞中，总PEI中的氮(N)与质粒中的磷酸(P)的摩尔比为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1(N:P)。在附加的具体实施方案中，包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒和包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒的总量在约0.1μg/mL细胞至约15μg/mL细胞的范围内。
将核酸(质粒)/PEI的混合物施用于细胞通过将核酸(质粒)/PEI混合物加入细胞中使得核酸(质粒)/PEI的混合物接触细胞来进行。其中添加(接触)核酸(质粒)/PEI混合物溶液的细胞可以为粘附性细胞或呈悬浮形式的细胞。此类细胞可包括与其它细胞的共培养物。
细胞与核酸(质粒)/PEI的混合物接触的时间段不受限制，以实现细胞转导。细胞与游离PEI的接触通常在细胞与核酸(质粒)/PEI混合物接触同时(或紧接着)或之后发生。如果在细胞与核酸(质粒)/PEI混合物接触和细胞与游离PEI接触之间存在时间间隔，则时间间隔可以为约1秒至约140小时，典型地约1秒至约96小时，更典型地约1秒至约48小时或约72小时，最典型地约1秒至约24小时或更短，例如约16小时、约12小时、约8小时或约6小时或更短。
就长期接触而言，细胞可受PEI的细胞毒性影响，从而导致死亡(非活性)细胞的量增加，由此降低转染效率。细胞与总PEI接触后的温育时间的范围可以从几秒到几天。具体地讲，细胞可以与核酸(质粒)/PEI或总PEI接触例如以下时间段：约1分钟至约48小时；约1分钟至约24小时；约1分钟至约16小时；约1分钟至约8小时；约1分钟至约4小时；约1分钟至约120分钟；约5分钟至约60分钟；约10分钟至约45分钟；或约10分钟至约30分钟。
为降低PEI的细胞毒性，在使细胞与核酸(质粒)/PEI接触后，可用新鲜培养基替换培养基。转染后的培养基更换可使PEI细胞毒性最小化，但细胞转染效率没有明显损失。
当与质粒/PEI混合物接触时或当与游离PEI接触时，在与质粒/PEI混合物接触或与游离PEI接触之前或之时，用于转染的细胞具有在约1×105个细胞/mL至约1×108个细胞/mL范围内的密度。典型地，细胞具有在约2×105细胞/mL至约5×106细胞/mL范围内的密度。更典型地，细胞具有在约3×105细胞/mL至约3×106细胞/mL，例如约4×105细胞/mL至约2×106细胞/mL、或约3×105细胞/mL至约1×106细胞/mL范围内的密度。
在与质粒/PEI混合物接触或与游离PEI接触之前或之时，用于转染的细胞可任选地处于对数(指数)生长期。在与质粒/PEI混合物接触和/或与游离PEI接触之前或之时，用于转染的细胞可任选地具有60％或大于60％的活力，例如70％、80％或90％或大于90％的活力。
如本文所述可接触的细胞包括哺乳动物细胞，诸如人细胞。此类细胞可以为能够在体外生长或维持活力，或已适于体外组织培养的原代细胞或细胞系。细胞系的示例包括HEK(人胚肾)细胞，其包括HEK293细胞，诸如HEK293F(293F)和HEK293T(293T)细胞。
更通常地，如本文所述，此类被接触的细胞可被称为“宿主细胞”。“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以为、或已经被用作编码包装蛋白(例如AAV包装蛋白)的核酸(质粒)，编码辅助蛋白的核酸(质粒)、编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸(质粒)或其它转移核酸(质粒)的受体。所述术语包括已转导或转染的原始细胞的子代。因此，如本文使用，“宿主细胞”一般是指已经用外源核酸序列转导或转染的细胞。应当理解，由于天然的、意外的或故意的突变，单个亲本细胞的子代在形态学或在基因组或总核酸补体方面不一定与原始亲本完全相同。
适于维持细胞活力或提供细胞生长和/或增殖的多种细胞生长培养基可商购获得或可容易地生产。此类培养基的示例包括无血清真核生长培养基，诸如用于维持哺乳动物(例如人)细胞的活力或提供生长的培养基。非限制性示例包括Ham's F12或F12K培养基(Sigma-Aldrich)、FreeStyle(FS)F17培养基(Thermo-Fisher Scientific)、MEM、DMEM、RPMI-1640(Thermo-Fisher Scientific)以及它们的混合物。此类培养基可补充有维生素和/或微量元素和/或盐和/或氨基酸，诸如哺乳动物(例如人)细胞必需的氨基酸。
术语“转导”和“转染”是指在将分子诸如核酸(质粒)引入宿主细胞中。当外源核酸已被引入细胞膜内时，细胞已被“转导”或“转染”。因此，因此，“转导细胞”是其中被引入“核酸”或“多核苷酸”的细胞，或其中被引入外源核酸的细胞的后代。在具体实施方案中，“转导”细胞(例如，在哺乳动物中，诸如细胞或组织或器官细胞中)是在并入外源分子例如核酸(例如，转基因)之后，细胞的遗传变化。“转导”细胞可繁殖并且引入的核酸被转录和/或蛋白被表达。
在“转导”或“转染”细胞中，核酸(质粒)可以或可以不整合到受体细胞的基因组核酸中。如果引入的核酸整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则其可被稳定地保持在该细胞或生物体中，并进一步传递至受体细胞或生物体的子代细胞或生物体或由所述子代细胞或生物体遗传。最后，引入的核酸可存在于受体细胞或宿主生物体的染色体外或仅暂时存在。许多技术是已知的(参见，例如，Graham等人，(1973)Virology，52:456，Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning，实验室手册，Cold Spring HarborLaboratories，New York，Davis等人，(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，以及Chu等人(1981)Gene 13:197)。此类技术可用于将一种或多种外源DNA部分导入合适的宿主细胞中。
术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)或可通过***或并入核酸操纵的其它载体。此类载体可用于基因操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，并在细胞中转录或翻译***的多核苷酸。“表达载体”是一种专用载体，其包含具有宿主细胞中的表达所需的必要调节区的基因或核酸序列。载体核酸序列通常包含至少一个用于在细胞中增殖的复制起点以及任选的附加元件，诸如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、ITR、可选择的标记(例如抗生素抗性)、聚腺苷酸化信号。出于本发明的目的，如本文所使用的“载体”是在如本文所使用的“质粒”的范围内。
病毒载体来源于或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。具体的病毒载体包括慢病毒、假型慢病毒和细小病毒载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体。
作为载体的修饰语，诸如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如AAV)载体，以及作为序列的修饰语，诸如重组多核苷酸和多肽，术语“重组”意指组合物已经以通常不在自然界中发生的方式操纵(即，工程化)。重组载体例如AAV载体的具体示例可以为通常在野生型病毒(例如AAV)基因组中不存在的多核苷酸***病毒基因组中的情况，即为异源性的。尽管在本文提及载体，诸如病毒和AAV载体以及序列诸如多核苷酸时，不总是使用术语“重组”，但包括多核苷酸在内的重组形式明确地被包括，虽然存在任何此类省略。
通过使用分子方法从病毒(例如AAV)中移除野生型基因组，并用非天然核酸，诸如转录成转录物或编码蛋白的核酸替代，由病毒(诸如AAV)的野生型基因组衍生重组病毒“载体”或“AAV载体”。通常，对于AAV而言，AAV基因组中的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”病毒载体(例如，AAV)区别于病毒(例如AAV)基因组，因为病毒基因组的全部或一部分已用关于病毒(例如AAV)的基因组核酸的非天然序列(即，异源性)序列替代。因此，并入非天然序列将病毒载体(例如AAV)定义为“重组”载体，其在AAV的情况下可被称为“rAAV载体”。
可以将重组载体(例如lenti-、parvo-、AAV)序列包装-本文中称为用于后续离体、体外或体内感染(转导)细胞的“颗粒”。在将重组载体序列壳体化或包装成AAV颗粒的情况下，该颗粒也可称为“rAAV”。此类颗粒包括壳体化或包装载体基因组的蛋白。具体的示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下为衣壳蛋白，诸如AAV VP1、VP2和VP3。
载体“基因组”是指重组质粒序列的部分，其最终被包装或衣壳化以形成病毒(例如AAV)颗粒。在使用重组质粒以构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包含不对应于重组质粒的载体基因组序列的“质粒”部分。这种重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(其是繁殖和重组病毒产生所需的过程)而言是重要的，但其本身不被包装或衣壳化成病毒(例如AAV)颗粒。因此，载体“基因组”是指由病毒(例如AAV)包装或衣壳化的核酸。
术语“空衣壳”和“空颗粒”是指AAV病毒体，其包含AAV蛋白外壳，但其全部或部分地缺少编码蛋白或被转录成由AAV ITR侧接的感兴趣的转录物的核酸。因此，空衣壳不用于将编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸转移到宿主细胞中。然而，空衣壳制剂可在其它应用，诸如ELISA中具有实用性。
术语“包装蛋白”是指AAV所依赖以用于其复制的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能。因此，该术语包括AAV复制中所需的蛋白和RNA，包括参与激活AAV基因转录、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅助功能可来源于已知辅助病毒中的任一种，诸如腺病毒、疱疹病毒(除单纯疱疹病毒1型之外)和牛痘病毒。
如本文所使用的，“AAV包装蛋白”是指反式作用于生产性AAV复制的AAV衍生序列。因此，AAV包装蛋白由主AAV开放阅读框(ORF)，rep和cap编码。已示出rep蛋白具有许多功能，尤其包括：识别、结合和切割DNA复制的AAV源；DNA解旋酶活性；和调节自AAV(或其它异源性)启动子的转录。Cap(衣壳)蛋白提供必要的包装功能。AAV包装蛋白用于本文以补充自AAV载体缺失的反式AAV功能。
“编码AAV包装蛋白的核酸”一般是指包括提供自AAV载体缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，所述AAV载体待用于产生转导重组AAV载体。编码AAV包装蛋白的核酸通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达以补充AAV复制所必需的缺失的AAV功能；然而，核酸构建体缺乏AAV ITR，并且自身既不能复制也不能包装。编码AAV包装蛋白的核酸可以呈质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体的形式。已经描述了许多核酸构建体，例如编码Rep和Cap表达产物的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见，例如，Samulski等人，(1989)J.Virol.63:3822-3828；以及McCarty等人，(1991)J.Virol.65:2936-2945。已经描述了编码Rep和/或Cap表达产物的多种载体(例如，美国专利5,139,941和6,376,237)。
术语“编码辅助蛋白的核酸”一般是指包含核苷酸序列的一种或多种核酸分子，所述核苷酸序列编码提供一种或多种辅助功能的蛋白。具有编码一种或多中辅助蛋白的一种或多种核酸的载体可转染到合适的宿主细胞中，其中所述载体然后能够支持宿主细胞中的AAV病毒体生产。该术语明确排除了感染性病毒颗粒，因为它们存在于自然界中，诸如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒颗粒。
因此，辅助蛋白载体可以呈质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。具体地讲，已经证明辅助功能不需要完整的腺病毒基因补体。例如，已经示出不能DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体允许AAV复制。Ito等人，(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi等人，(1971)Virology 45:317。
已示出E2B和E3区域内的突变体支持AAV复制，这指示E2B和E3区域可能不参与提供辅助功能。Carter等人，(1983)Virology 126:505。然而，具有E1区域的缺陷或具有缺失的E4区的腺病毒不能支持AAV复制。因此，对于腺病毒辅助蛋白而言，EIA和E4区域可能是AAV复制直接或间接地所需的。Laughlin等人，(1982)J.Virol.41:868；Janik等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carter等人，(1983)Virology 126:505。其他表征的Ad突变体包括：EIB(Laughlin等人，(1982),supra；Janik等人，(1981),supra；Ostrove等人，(1980)Virology 104:502)；E2A(Handa等人，(1975)J.Gen.Virol.29:239；Strauss等人，(1976)J.Virol.17:140；Myers等人，(1980)J.Virol.35:665；Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2927；Myers等人，(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter,I CRC Handbook of Parvoviruses中的Adeno-Associated Virus HelperFunctions,(P.Tijssen编辑，1990))；E3(Carter等人，(1983)，如上)；以及E4(Carter等人，(1983)，如上；Carter(1995))。
对由具有E1B突变的腺病毒提供的辅助蛋白的研究报道了E1B55k是AAV病毒体产生所需的，然而E1B19k则不是。此外，国际公布WO 97/17458和Matshushita等人，(1998)Gene Therapy 5:938-945描述了编码各种Ad基因的辅助功能载体。辅助载体的示例包括腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4ORF6编码区、腺病毒E2A 72kD编码区、腺病毒E1A编码区和缺少完整EI BS5k编码区的腺病毒E1B区(参见，例如国际公布WO01/83797)。
本文使用“转基因”以方便地表示旨在或已被引入细胞或生物体的核酸。转基因包括任何核酸，诸如转录成转录物或编码多肽或蛋白的基因。
“表达控制元件”是指影响能操作地连接的核酸的表达的核酸序列。控制元件，包括本文所述的表达控制元件诸如启动子和增强子，包括AAV载体的载体序列可包括一个或多个“表达控制元件”。通常，包括此类元件以有利于适当的异源多核苷酸转录和适当情况下的翻译(例如，启动子、增强子、用于内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。此类元件通常以顺式作用，被称为“顺式作用”元件，但也可以反式作用。
表达控制可处于转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平。通常，调节转录的表达控制元件靠近转录核酸的5'端(即“上游”)并置。表达控制元件也可位于转录序列的3'末端(即“下游”)处或转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以邻近或远离转录序列定位(例如，距多核苷酸1-10个、10-25个、25-50个、50-100个、100-500个或更多个核苷酸)，甚至以相当远的距离定位。然而，由于某些载体(诸如AAV载体)的长度限制，表达控制元件将通常在距转录核酸的1至1000个核苷酸内。
在功能上，能操作地连接的核酸的表达至少部分地可由元件(例如启动子)控制，使得元件调节核酸的转录以及适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列的5'。与不存在启动子时表达的量相比，启动子通常增加由能操作地连接的核酸表达的量。
如本文所使用，“增强子”可指邻近异源多核苷酸定位的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也起作用，并且可位于核酸序列的下游或内。因此，增强子元件可以位于核酸上游或下游的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多个碱基对。增强子元件通常使可操作连接的核酸的表达增加高于由启动子元件提供的表达。
表达构建体可包含用于驱动特定细胞或组织类型中的表达的调控元件。表达控制元件(例如启动子)包括在特定组织或细胞类型中具有活性的那些，在本文中被称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。组织特异性表达控制元件通常在特定细胞或组织(例如肝脏)中具有活性。表达控制元件通常在特定的细胞、组织或器官中具有活性，因为它们被转录激活蛋白或其它转录调节因子识别，其对于特定的细胞、组织或器官类型是独特的。此类调节元件是本领域技术人员已知的(参见例如Sambrook等人(1989)和Ausubel等(1992))。
在本发明的质粒中并入组织特异性调节元件为核酸的表达提供了至少部分的组织向性。在肝脏中具有活性的启动子的示例为TTR启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子；白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.,71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人，Gene Ther.3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人Hum.Gene.Ther.,7:1503-14(1996)]等等。在肝脏中有活性的增强子的示例是载脂蛋白E(apoE)HCR-1和HCR-2(Allan等人，J.Biol.Chem.,272:29113-19(1997))。
表达调控元件还包括能够驱动多核苷酸在许多不同细胞类型中表达的普遍存在的或混杂的启动子/增强子。此类元件包括但不限于巨细胞病毒(CMV)最接近早期启动子/增强子序列、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列和在多种哺乳动物细胞类型中具有活性的其它病毒启动子/增强子、或自然界中不存在的合成元件(参见，例如，Boshart等人，Cell,41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
表达调控元件还可以以可调节的方式赋予表达，即信号或刺激增加或减少能操作地连接的异源多核苷酸的表达。响应于信号或刺激增加能操作地连接的多核苷酸的表达的可调节元件也被称为“诱导型元件”(即，由信号诱导)。具体示例包括但不限于激素(例如类固醇)诱导型启动子。典型地，由此类元素赋予的增加或减少量与存在的信号或刺激量成正比；信号或刺激量越大，表达的增加或减少就越大。具体的非限制性示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子；类固醇激素诱导型小鼠***肿瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子***(WO 98/10088)；四环素抑制***(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))；四环素诱导***(Gossen等人，Science.268:1766-1769(1995))；还参见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518(1998))；RU486诱导型***(Wang等人，Nat.Biotech.15:239-243(1997)和Wang等人，Gene Ther.4:432-441(1997)]；和雷帕霉素可诱导体系(Magari等人，J.Clin.Invest.100:2865-2872(1997)；Rivera等人，Nat.Medicine.2:1028-1032(1996))。可用于这种环境的其它可调节控制元件为由特定生理状态，例如温度、急性期、发育调节的那些。
表达控制元件还包括核酸的天然元件。当期望异源多核苷酸的表达应当模拟天然表达时，可使用天然控制元件(例如启动子)。当异源多核苷酸的表达要在时间上或发育上，或以组织特异性方式或响应于特异性转录刺激进行调节时，可使用天然元件。还可使用其它天然表达控制元件，诸如内含子、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列。
术语“能操作地连接”是指将编码序列表达所必需的调控序列置于相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。有时将相同的定义施用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于其中生成杂交核酸分子的第一和第二核酸分子的核酸序列的排列。
在与核酸可操作连接的表达控制元件的示例中，所述关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，能操作地连接的两个DNA序列意指两个DNA以此使得至少一个DNA序列能够对另一个序列施加生理效应的关系(顺式或反式)排列。
因此，载体的附加元件包括但不限于表达控制(例如启动子/增强子)元件、转录终止信号或终止密码子、侧接序列如AAV ITR序列中的一个或多个拷贝的5'或3'非翻译区(例如聚腺苷酸化(polyA)序列)、或内含子。
其它元件包括例如填料或填充物多核苷酸序列，例如以改善包装并减少污染核酸的存在。AAV载体通常接受具有一般为约4kb至约5.2kb或略多的尺寸范围的DNA***片段。因此，对于较短的序列而言，包含填充物或填料以便将长度调整至对于AAV载体包装入病毒颗粒中而言可接受的病毒基因组序列的正常大小或接近正常大小。在各种实施方案中，填料/填充物核酸序列是核酸的未翻译(非蛋白编码)区段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填料或填充物多核苷酸序列具有当与具有介于约3.0-5.5Kb之间、或介于约4.0-5.0Kb之间、或介于约4.3-4.8Kb之间的总长度的序列组合(例如***载体中)时的长度。
内含子也可用作填料或填充物多核苷酸序列，以便实现将AAV载体包装成病毒颗粒的长度。用作填料或填充物多核苷酸序列的内含子和内含子片段也可增强表达。
由“核酸”或“质粒”编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”包括如在天然存在的野生型蛋白的情况下，全长天然序列以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要该子序列、修饰形式或变体在一定程度上保留天然全长蛋白的功能性即可。例如，蛋白可具有缺失、取代或添加并保留至少部分的功能或活性。
术语“修饰”或“变体”及其语法变体意指偏离参考序列的多肽或其子序列。因此修饰和变体序列可具有与参考序列基本上相同、更多或更少的表达、活性或功能，但至少保留参考序列的部分活性或功能。
修饰的非限制性示例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-500、500-750、750-850或更多个核苷酸或残基)。
氨基酸修饰的示例是参考序列的保守氨基酸取代或缺失(例如，子序列或片段)。在具体实施方案中，修饰或变体序列保留未修饰序列的至少部分功能或活性。
包括转录的核酸和编码蛋白的核酸的所有哺乳动物和非哺乳动物形式。因此，本发明包括来自非哺乳动物、不是人的哺乳动物和人的基因和蛋白，所述基因和蛋白以与人基因和蛋白基本相似的方式起作用。
在产生如本文所述的重组病毒(例如AAV)载体之后，如果需要，可使用多种常规方法从宿主细胞中纯化和/或分离病毒(例如，rAAV)病毒体。此类方法包括柱层析、CsCI梯度法等。例如，可以使用多个柱纯化步骤，诸如在阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上进行纯化。(参见,例如国际公布WO 02/12455和美国专利申请公布20030207439)。另选地，或除此之外，可使用CsCl梯度步骤。(参见,例如美国专利申请公布20120135515和20130072548)。此外，如果使用感染性病毒以表达包装和/或辅助蛋白，则可使用各种方法使残余病毒失活。例如，可通过加热至约60℃的温度并持续例如20分钟或更长时间使腺病毒失活。因为AAV是热稳定然而辅助腺病毒是热不稳定的，因此该处理有效地灭活辅助病毒。
当用作组合物的修饰语时，术语“分离的”是指组合物由人工制造或完全或至少部分地从其天然存在的体内环境中分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种其通常天然与之缔合的物质，例如一种或多种污染物，如蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。
关于本发明的RNA分子，术语“分离的”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。另选地，该术语可指已经与在其天然状态下(即在细胞或组织中)其会缔合的RNA分子充分分离，使得其以“基本上纯的”形式存在的RNA分子(术语“基本上纯的”在下文定义)。
关于蛋白，本文中有时使用术语“分离的蛋白”或“分离和纯化的蛋白”。该术语主要指通过表达分离的核酸分子产生的蛋白。另选地，该术语可指已经与可与其天然缔合的其它蛋白充分分离，以便以“基本上纯”的形式存在的蛋白。
术语“分离的”不排除由人工制备的组合，例如包装或衣壳化载体基因组的重组载体(例如rAAV)序列或病毒颗粒以及药物制剂。术语“分离的”也不排除组合物的另选物理形式，诸如杂合体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(例如磷酸化、糖基化、脂质化)或衍生化形式，或在由人工产生的宿主细胞中表达的形式。
术语“基本上纯的”是指包含至少50-60重量％的感兴趣的化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白等)的制剂。该制剂可包含至少75重量％、或约90-99重量％的感兴趣的化合物。纯度通过适用于感兴趣的化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。
可通过使用重组DNA技术方法来制备核酸分子、表达载体(例如载体基因组)、质粒。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过各种手段制备分离的核酸分子。例如，可使用各种标准克隆、重组DNA技术，经由细胞表达或体外翻译和化学合成技术来制备核酸(质粒)。纯度可通过测序、凝胶电泳等来测定。例如，可使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术来分离核酸。此类技术包括但不限于：(1)基因组DNA或cDNA库与探针杂交以检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享结构特征的多肽，例如使用表达文库进行；(3)使用能够对感兴趣的核酸序列退火的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)对序列数据库进行计算机搜索以获得相关序列；和(5)扣除核酸库的差异筛选。
本发明的核酸可以以DNA形式保持在任何便利的克隆载体中。在一个实施方案中，核酸保持在质粒中。另选地，核酸可保持在适于在哺乳动物细胞中表达的载体中。
本发明的核酸、载体、表达载体(例如rAAV)和重组病毒颗粒、方法和用途允许治疗遗传疾病。对于缺陷态疾病而言，基因转移可用于将正常基因引入受影响的组织用于替代疗法，以及使用反义突变形成疾病的动物模型。对于失衡的疾病状态而言，基因转移可用于在模型***中创建一种疾病状态，其然后可用于努力抵消疾病状态。使用核酸序列的位点特异性整合来纠正缺陷也是可能的。
病毒载体诸如慢病毒载体和细小病毒载体(包括AAV血清型及其变体)提供了用于离体、体外和体内将核酸递送到细胞中的方式，其编码蛋白使得细胞表达编码的蛋白。AAV是可用作基因治疗载体的病毒，因为它们可穿透细胞并引入核酸/遗传物质，使得核酸/遗传物质可以稳定维持在细胞中。另外，例如，这些病毒可将核酸/遗传物质引入特定位点。因为AAV不与人的致病性疾病相关，所以AAV载体能够将异源多核苷酸序列(例如，治疗性蛋白和药剂)递送到人患者但不导致显著的AAV发病或疾病。
可使用的病毒载体包括但不限于多种血清型的腺相关病毒(AAV)载体(例如AAV-1至AAV-12等)和杂合/嵌合AAV载体、慢病毒载体和假型慢病毒载体(例如埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和猫免疫缺陷病毒(FIV))、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体(具有或不具有组织特异性启动子/增强子)、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、非病毒载体等。
AAV和慢病毒颗粒可有利地用作有效基因递送的载体。此类病毒体对于此类应用具有多个期望的特征，包括***和非***细胞的向性。使用这些载体的早期临床经验也被证明没有持续的毒性，并且免疫应答很小或不可检测。已知AAV通过受体介导的内吞作用或通过胞吞作用在体内和体外感染多种细胞类型。这些载体***已经靶向视网膜上皮细胞、肝脏、骨骼肌、气道、脑、关节和造血干细胞在人类中进行测试。例如，基于质粒DNA或微环的非病毒载体也是合适的基因转移载体。
因此，在本发明的各种实施方案中，载体包括慢病毒或细小病毒载体，诸如腺病毒载体。在具体实施方案中，重组载体是细小病毒载体。细小病毒是具有单链DNA基因组的小病毒。“腺相关病毒”(AAV)属于细小病毒家族。
AAV载体和慢病毒载体通常不包括与发病机理相关的病毒基因。此类载体通常具有完整或部分缺失的一个或多个野生型AAV基因，例如rep和/或cap基因，但保留至少一个功能性侧翼ITR序列，如将重组载体拯救、复制和包装到AAV载体颗粒中所必需的。例如，仅包括载体的基本部分，例如分别为ITR和LTR元件。因此AAV载体基因组将包括复制和包装所需的顺式序列(例如功能性ITR序列)。
重组AAV载体、以及其方法和用途包括任何病毒株或血清型。作为非限制性示例，重组AAV载体可基于任何AAV基因组，诸如AAV 1、AAV 2、AAV 3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV2i8。此类载体可基于相同的菌株或血清型(或亚组或变体)，或者彼此不同。作为非限制性示例，基于一种血清型基因组的重组AAV载体可与包装载体的衣壳蛋白中的一种或多种相同。此外，重组AAV载体基因组可基于不同于包装载体的AAV衣壳蛋白中的一种或多种的AAV(例如AAV2)血清型基因组。例如，AAV载体基因组可以基于AAV2，然而三种衣壳蛋白中的至少一种可以为例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV-2i8或其变体。AAV变体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV-2i8衣壳的变体和嵌合体。
在具体实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV-2i8、以及其变体(例如，衣壳变体，诸如氨基酸***、添加、取代和缺失)，例如如WO 2013/158879(国际专利申请PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313(国际专利申请PCT/US2014/047670)和US 2013/0059732(美国专利申请No.13/594,773，其公开了LK01、LK02、LK03等)中所示的。
AAV和AAV变体(例如，衣壳变体)血清型(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)可能或可能不与其它AAV血清型不同，所述其它AAV血清型包括例如AAV1-AAV12(例如，不同于AAV1-AAV12血清型中的任一种的VP1、VP2和/或VP3序列)。
如本文所使用的，术语“血清型”是一个区别点，其用于指具有在血清学上与其它AAV血清型不同的衣壳的AAV。血清学特殊性基于与另一种AAV相比，对一种AAV缺乏抗体之间的交叉反应性来确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的不同(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。尽管存在包含衣壳变体的AAV变体可能不与参考AAV或其他AAV血清型在血清学上不同的可能性，但它们与参考或其它AAV血清型相比至少有一个核苷酸或氨基酸残基不同。
在传统定义下，血清型意指感兴趣的病毒已经针对对于所有现存和已表征的血清型具有特异性的血清进行了中和活性的测试，并且未发现中和感兴趣的病毒的抗体。随着更多的自然出现的病毒分离物被发现和/或衣壳突变体生成，可能或可能不存在与当前存在的血清型中任一种的血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具有血清学差异的情况下，这种新病毒(例如AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，中和活性的血清学测试尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行，以根据传统血清型定义确定它们是否是另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广义上是指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及可能在给定血清型的亚群或变体内的，不是血清学上不同的病毒(例如AAV)。
在各种示例性实施方案中，与参考血清型相关的AAV载体具有包括与一个或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV-2i8至少80％或更多(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同的序列或由该序列组成的多核苷酸、多肽或其序列(例如，诸如ITR、或VP1、VP2和/或VP3序列)。
本发明的组合物、方法和用途包括AAV序列(多肽和核苷酸)及其子序列，其表现出与参考AAV血清型，诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV-2i8的序列同一性小于100％，但与已知的AAV基因或蛋白，诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV-2i8基因或蛋白等不同或不一致。在一个实施方案中，AAV多肽或其子序列包括序列或由序列组成，所述序列与任何参考AAV序列或其子序列，诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV-2i8(例如，VP1、VP2和/或VP3衣壳或ITR)具有至少75％或更多相同的同一性，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等直至100％的同一性。在具体方面，AAV变体具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。
包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV-2i8的重组AAV载体和变体，相关、杂交和嵌合序列可使用技术人员已知的重组技术构建，以包括与一个或多个功能AAV ITR序列侧接的一个或多个核酸序列(转基因)。
可将核酸(质粒)、载体、重组载体(例如rAAV)和重组病毒颗粒掺入药物组合物中。此类药物组合物可用于尤其体内或体外施用和递送于受试者。在具体实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。此类赋形剂包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答的任何药剂，并且其可施用但不具有不适当的毒性。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”是指适用于施用、体内递送或接触的一种或多种途径的生物学可接受的制剂，其为气态、液态或固态或它们的混合物。“药学上可接受的”和“生理上可接受的”组合物是不是生物学上或其它方面不可取的材料，例如，所述材料可施用于受试者但不引起显著的不可取的生物学效应。因此，例如在将核酸、载体、病毒颗粒或蛋白施用于受试者时可使用此类药物组合物。
药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体如水、盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括于其中，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，助剂物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可以存在于此类载体中。
药物组合物可以以盐的形式提供并且可以由许多酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐趋于比相应游离碱形式更溶于水性或其它质子溶剂中。在其他情况下，制剂可以是在使用前与缓冲液组合的冻干粉末，其可包含以下物质中的任一种或全部：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH范围为4.5-5.5。
药物组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如水包油或油包水)、混悬剂、糖浆剂、酏剂、分散剂和悬浮剂、涂层、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载体包括片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬或软)、微珠、粉末、颗粒和结晶。补充活性化合物(例如防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可掺入组合物中。
可将药物组合物配制成与具体给药途径或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径给药的载体、稀释剂或赋形剂。
组合物和方法可以是无菌的。可制备组合物并且方法可在适用于此类过程的容器中进行。此类容器包括盘、烧瓶、滚瓶、袋、生物反应器、容器、管、小瓶等。容器可由包括但不限于玻璃、塑料和聚合物的材料制成，聚合物诸如聚苯乙烯、聚丁烯、聚丙烯等。
组合物和方法步骤可以指定的顺序或重新排列的顺序来执行。方法步骤可以分阶段进行，或者以间隔时间段进行。换句话说，可以执行方法步骤，然后在下一个步骤之间可出现时间间隔，此类间隔的范围例如从约1秒到约60秒；从约1分钟到约60分钟；从约1小时到约24小时；从约1天至约7天；或从约1周至约48周。
用于产生腺病毒载体的方案已描述于美国专利5,998,205、6,228,646、6,093,699和6,100,242；以及国际专利申请WO 94/17810和WO94/23744中，所述专利文献全部内容以引用方式并入本文。
本发明可用于用于人和兽医医学应用的细胞和载体。因此合适的受试者包括哺乳动物，诸如人，以及非人哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如小鼠和血液凝固疾病的其它动物模型，诸如HemA和本领域技术人员已知的其它动物模型。
如本文所使用的，“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含任选与药物载体(赋形剂、稀释剂、赋形剂或填充剂)结合的预定质量，其在以一个或多个剂量施用时，被计算为产生期望的效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂量形式可在例如安瓿和小瓶内，其可包括液体组合物或处于冷冻干燥或冻干状态下的组合物；例如，无菌液体载体可以在施用或体内递送之前加入。单个单位剂型可包括在多剂量试剂盒或容器中。重组载体(例如rAAV)序列、重组病毒颗粒及其药物组合物可以单一单位剂型或多个单位剂型包装以易于施用和获得剂量均匀性。
本发明提供了具有包装材料和其中的一个或多个组件的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，其包括对组分的描述或对其中组分的使用说明。试剂盒可包含一组此类组分，例如核酸(质粒)、PEI、细胞。
试剂盒是指容纳试剂盒的一个或多个组分的物理结构。包装材料可无菌地保持组分，并且可由通常用于此类目的的材料(例如纸材、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管材等)制成。
标签或插页可包括其中的一种或多种组分的识别信息。标签或插页可包括标识制造商、批号、制造地点和日期、到期日期的信息。标签或插页可包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插页可包括对于在方法、用途或制造方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明。说明书可包括对于生产组合物和实施本文所述方法中任一种的说明。
标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，其独立或固接到组件、试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附接到容纳试剂盒组件的安瓿、管材或小瓶。标签或插页可另外包括计算机可读介质，诸如印刷有条形码的标签，磁盘，光盘诸如CD或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带、或电子存储介质诸如RAM和ROM或这些混合，诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储型卡。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了适宜的方法和材料。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其它参考文献、基因库引用和ATCC引文以参考形式全文并入。在冲突的情况下，以说明书(包括定义)为准。
上文并且整个说明书和权利要求书中使用了涉及本发明的生物分子的各种术语。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征结构可由用于相同、等同或相似目的的另选的特征结构替代。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征结构(例如，PEI、质粒、载体(例如，rAAV或重组病毒颗粒)是具有等同或相似特征结构的示例。
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“质粒”或“核酸”包括多种此类质粒或核酸，提及“载体”包括多种此类载体，并且提及“病毒”或“颗粒”包括多种此类病毒/颗粒。
如本文所用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括此类范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及80％或更多的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
提及具有更多(更大)或更少的整数分别包括大于或小于参考数值的任何数值。因此，例如，提及小于100，包括99、98、97等，一路下降到数值一(1)；并且小于10，包括9、8、7等，一路下降到数值一(1)。
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括此类范围内的值的分数和整数，以及此类范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数值范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此提及1-50的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。
提及一系列范围包括将该系列内的不同范围的边界的值组合的范围。因此，为了说明提及的一系列范围，例如具有1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850，包括具有1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等等。
本文通常使用肯定语言描述多个实施方案和方面来公开本发明。本发明还具体地包括其中全部或部分排除特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中一般不就本发明不包括的内容进行表达，但本发明中未明确排除的方面在本文中公开。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本实施例包括各种材料和方法的描述。
细胞培养：在补充有4mM GlutaMAX(Life Technologies，目录号35050-061)的FreeStyleTMF17(F17)表达培养基(Gibco目录号A13835-01)或FreeStyleTM293(FS)表达培养基(Gibco目录号12338-018)中培养购自Thermo Fisher Scientific(由Thermo FisherScientific提供的InvitrogenTM，R790-07)的FreeStyleTM293F(293F)细胞。细胞在各种细胞培养装置中培养，包括旋转瓶和生物反应器。对于旋转瓶培养(Bellco Glass，目录号1965-83100或Corning，目录号3152)，将细胞在37℃培养箱中在70rpm搅拌和8％CO2的潮湿气氛下培养；对于生物反应器(DASGIP并联生物反应器***，Eppendorf)，通过将参数(DO30％，pH7.2，170或150rpm)程序化来控制细胞培养。通常，细胞以0.25-0.5×106/mL接种，当细胞密度达到约1.6-2×106/mL时，通过加入新鲜细胞培养基每隔2-3天传代培养。台盼蓝染色后用血细胞计数仪测定细胞密度和活力
质粒：三种质粒用于产生重组腺相关病毒载体(rAAV)：1)包含侧接ITR的eGFP的转基因质粒；2)包含AAV血清型2rep和cap基因的包装质粒；和3)包含腺病毒E2、E4和VARNA基因的腺病毒辅助质粒。所有质粒均购自Aldevron.P并由Aldevron.P制造。
制备PEI溶液：将线性聚乙烯亚胺(PEI)25KDa(Polysciences，目录号23966-2)、PEI“Max”40KDa((Polysciences，目录号24765-2，线性PEI 25Kda的盐酸盐)和PEIpro(Polyplus，目录号115-010)用作转染剂。对于大多数转染研究，将PEI“Max”溶于5mM Tris中以制备0.5mg/mL溶液并将pH调节至7.10。首先将PEI 25Kda溶于80℃的热水中，冷却后，加入Tris缓冲液，以制备0.5mg/m PEI的5mM Tris缓冲溶液，pH7.10。对于一些研究而言，其中在转染时将PEI“Max”40KDa与PEI 25Kda进行比较，将PEI 40KDa和25KDa溶于具有或不具有150mM NaCl的5mM Tris缓冲液中或溶于具有或不具有150mM NaCl的水中，将pH调节至7.10。
转染：使293F细胞在旋转瓶中的FS培养基或F17培养基加4mM GlutaMAX TM补充物中生长。在转染前一天，通过添加新鲜培养基传代培养细胞，在转染当天，使用血细胞计数器测定细胞密度并用新鲜的FS培养基或F17培养基进一步稀释至终浓度为0.35-1×106个细胞/mL，转染在悬浮细胞培养孔或旋转瓶中进行。
将如上所述的三种质粒以摩尔比1:1:1用于转染。用于转染的总DNA量为每毫升细胞培养物0.7至11.2μg。用不同比例的PEI和DNA制备PEI/DNA复合物，在室温下温育1分钟至最多达30分钟，然后将DNA/PEI复合物滴加到细胞培养物中。为评价游离PEI对转染效率和rAAV生产力的影响，以与上述相同的方式制备PEI分子，但不与DNA温育并在加入DNA/PEI复合物后立即加入到细胞培养物中。在转染后24小时、48小时和72小时采集包括细胞和细胞培养基在内的样品用于转染效率和其它测定，并在转染后72小时收获细胞培养物。
使用倒置荧光显微镜(Leica)或流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences)评估转染效率。使用荧光显微镜检测eGFP阳性细胞。使用BD FACS Canto流式细胞仪评估GFP阳性细胞的百分比。
在生物反应器中生产rAAV载体：使用配备有两个倾斜叶片式叶轮的2L DASGIP并联生物反应器***(Eppendorf)来扩大载体生产过程。在研究中将最终工作量调整至400mL。搅拌设定为150rpm或170rpm，在细胞培养过程中使温度保持在37℃并且pH为7.2。通过补充氧气、二氧化碳和空气的气体混合物将溶解氧维持在30％。所有这些参数均由具有DASGIP Control 4.0软件的DASGIP控制***进行监控和控制。在F17培养基中培养的293F细胞以0.4×106细胞/mL的细胞密度接种，活力大于95％。细胞在接种后第2天或第3天通过加入新鲜培养基传代培养，传代后的细胞密度约为0.4-0.7×106个/mL。传代培养后24小时，如图例所述用PEI/DNA复合物转染细胞，转染时细胞密度约为1×106个细胞/mL。在转染时PEI/DNA重量比为2:1，其中PEI的1/2为游离PEI。每24小时收集样品直至72小时。
rAAV载体的定量：通过使冷冻/解冻的三个循环或MicrofluidizerTM(Microfluidics)通过三次从转染的293F细胞收获物释放rAAV载体。通过离心沉淀细胞碎片并收集上清液用于实时PCR和转导测定。
使用TaqMan Master Mix(目录号4304437，Life technologies)利用实时聚合酶链式反应(Q-PCR)(QuanStudio 7，Life Technologies)测定AAV载体基因组拷贝数。用7.6UDNase I(目录号79254，Qiagen)处理10μL细胞裂解物以消化污染的未包装的DNA，然后用0.2％SDS/5mM EDTA/0.2M NaCl在95℃处理10分钟以使DNase I失活并释放载体DNA。引物和探针检测的转基因eGFP序列：正向引物：5’-GCACAAGCTGGAGTACAACTA-3’、逆向引物：5’-TGTTGTGGCGGATCTTGAA‐3’和探针5’-/56-FAM/AGCAGAAGA/ZEN/ACGGCATCAAGGTGA/3IABkFQ/-3’。为产生标准曲线，通过HindIII-HF消化将pAAV-eGFP-WRPE质粒线性化并以自1×108至1.28×103个基因拷贝的1:5系列稀释物使用。所有样品均一式三份进行。
转导测定通过将50μL细胞裂解物添加至接种于48孔板中的HEK293细胞中来进行。在转导时将依托泊苷加入每个孔中至终浓度为3μM。温育48小时后，用倒置荧光显微镜评估GFP阳性细胞。
实施例2
本实施例包括各种结果的描述。
转染培养基对转染效率和rAAV产量的影响：为了开发可扩展的无血清悬浮培养***以大规模生产rAAV载体，将包括FS培养基、F17培养基、SFM4Transfx-293等在内的数种适用于悬浮细胞培养的培养基进行生长293F细胞的评估。研究结果表明，旋转瓶中FS293培养基和F17培养基支持细胞生长-细胞密度达到2.5～3×106个细胞/mL。这两种培养基还支持有效的基因转染到293F细胞中。
游离PEI对转染效率和rAAV产量的影响：高转染效率是实现高rAAV产量的一个步骤。将聚乙烯亚胺(PEI)用作转染试剂以转染处于悬浮培养的293F细胞。
在所评估的多个参数中，PEI分子中的氮(N)与DNA的磷酸盐(P)的摩尔比(N:P比)显著影响转染效率，在N:P比例由低到高变化时，从非常差的转染到高效转染。在用于转染时，还发现在高N:P比率，诸如N:P比率为30下的细胞毒性。
研究了数种不同的PEI分子，包括PEI“Max”40KDa、PEI25KDa、PEIPro等。使用Tris缓冲液或具有或不具有150mM NaCl的DI水制备PEI分子，在pH7.1下，将适量质粒DNA与PEI分子以固定的N:P比率混合，在室温下温育不同的时间段，诸如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟和最多至30分钟，然后用于转染细胞。
数据示出PEI“Max”40KDa和PEI 25KDa两者均提供高效细胞转染，其中PEI“Max”40KDa提供始终高的转染效率(图1)。因此，大多数数据使用PEI“Max”40KDa作为转染剂产生。
如材料和方法中所述，通过使用三种质粒转染293F细胞来产生RAAV载体。使用包括12孔板、细胞培养转瓶和生物反应器在内的不同细胞培养装置来培养293F细胞并产生rAAV载体。以2:1和4:1的重量比制备PEI/DNA混合物以转染细胞。测试每毫升细胞培养物不同DNA量的转染效率，并且三种质粒之间的1:1:1摩尔比通常用于转染。使用FS培养基和F17培养基在无血清悬浮培养物中培养293F细胞。
PEI介导的基因转移是一个非常复杂的细胞生物学过程，涉及与细胞受体结合、胞吞作用、细胞内运输、细胞核进入和基因表达，这只是几个关键步骤。尽管不希望受任何理论的束缚，但适量的游离PEI分子可增强转染效率，并且继而增加rAAV产量。
如图2A所示，与仅用DNA/PEI复合物的转染效率相比，当在将DNA/PEI复合物加入细胞培养物之后立即将游离PEI分子加入细胞培养物中时，细胞转染效率显著提高。在12孔细胞培养板(图2A)、细胞培养转瓶和生物反应器中观察到游离PEI增强PPI转染效率的这种现象。此外，当在转染时加入游离PEI分子时，rAAV载体产量相应地增加-产生多2-3倍的rAAV载体(图2B)。
在更大的细胞培养规模、旋转瓶和生物反应器中进一步测试游离PEI增强转染效率和rAAV产量的该发现。在具有或不具有游离PEI的旋转瓶中的转染结果(图3)与12孔板中发现的一致，即当在转染中使用游离PEI时转染效率显著增强并且rAAV生产力增加2至3倍，自每毫升不含游离PEI的细胞裂解物1.3E+10载体基因组(VG)至每毫升具有游离PEI的细胞裂解物约2.4E+10VG/mL。
转染时的细胞生长状态也对生物反应器中的rAAV载体产量具有显著影响。为进一步评估改善rAAV产量的方式，测试细胞生长状态以确定对rAAV载体收率的影响。在悬浮细胞培养中，将细胞以0.25×106个细胞/mL、0.35×106个细胞/mL和0.5×106个细胞/mL接种，并且建立7天细胞培养内2L生物反应器中的细胞生长曲线(图4)。大致限定细胞生长期并且在48h至84h之间确定指数生长期。在第6天细胞密度的峰值为4.8–5.8×106个细胞/mL，并且然后细胞密度开始下降。培养期间的细胞活力高于90％。
对于转染和rAAV产生，在工作体积约400ml的2L生物反应器中，以0.4×106个细胞/mL的细胞密度接种293F细胞，其中活力大于95％。在试图鉴定质粒转染和rAAV生产的最佳细胞培养窗时，发现在不同细胞培养状态下转染细胞也对rAAV收率具有显著影响。
然后细胞在细胞接种后的第2天或第3天通过加入新鲜的细胞培养基降低细胞密度来进行传代培养，细胞密度在0.4-0.7×106个细胞/mL的范围内。然后在使用所述PEI介导的转染方法，在传代培养之后将细胞转染24小时。通常，转染时的细胞密度将达到7E+05个细胞/ml至1.3E+06个细胞/ml培养基。两个独立实验的条件和相应的结果如表1所示。
表1：生物反应器中的rAAV载体产生
显然，与接种后第2天细胞传代并在接种后第3天转染相比，接种后第3天传代培养细胞并且在接种后第4天转染细胞导致显著更高的rAAV生产力。
值得注意的是，如由图5中的数据所示，在这两个比较条件之间转染效率不呈出现差异。图5A示出如由eGFP基因表达所指示的转染效率的比较结果，并且图5B是更量化的FACS数据，其表明在所有测试条件下转染约50％的细胞；然而，与第3天转染相比，在第4天转染条件下，由qPCR评估的第4天转染的载体滴度显著更高(图6A)，高2倍、高5倍，有时甚至高7至8倍。第4天的转染条件中并且在150rpm搅拌速度下，最高滴度为1.38E+11vg/mL。
通过转导HEK293细胞评估来自这些实验的rAAV-GFP的转导功能，与qPCR分析一致，当将来自每种生产条件的相同体积的细胞裂解物加入HEK293细胞中时，与第3天转染的样品相比，由第4天转染的样品观察到更高的转导(图6B)。这些数据指示，除了转染效率之外，细胞生长阶段和代谢状态还可能在rAAV生产中起重要作用，并且可能存在对rAAV生物合成更加可渗透的细胞代谢窗口。
新开发的PEI介导的rAAV生产***是完全可扩展的，cGMP兼容的多功能rAAV生产平台，其可用于在无血清悬浮细胞培养物中产生任何血清型rAAV载体。与作为转染剂的PEI(诸如高效PEI“Max”40KDa分子)组合，在转染过程中加入游离PEI以及发现的用于转染的启动细胞生长阶段，实现悬浮细胞培养条件下的非常高的rAAV生产力，其比文献中报道的相似无血清悬浮培养***高约10倍(总结于表2中)。
表2：来自无血清悬浮细胞培养方法的载体收率与文献(参考文献)中报道的载体收率的比较结果
虽然上文已经描述和具体例示了本发明的某些实施方案，但是其不旨在将本发明限于此类实施方案。如以下权利要求所述，在不脱离本发明的范围和精神的情况下可对其进行各种修改。

Claims (73)

1.一种组合物，其包含质粒/PEI混合物，所述质粒/PEI混合物包含以下组分：
(a)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(b)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；
(c)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，
其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且其中所述组分(a)、(b)和(c)的混合物任选地温育约10秒至约4小时的时间。
2.根据权利要求1所述的组合物，其还包含细胞。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的所述质粒/PEI混合接触。
4.根据权利要求3所述的组合物，其还包含游离PEI。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述细胞与所述游离PEI接触。
6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触至少约4小时。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约140小时范围内的时间段。
8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约96小时范围内的时间段。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物和所述游离PEI接触至少约4小时。
10.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约140小时范围内的时间段。
11.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物接触在约4小时至约96小时范围内的时间段。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的组合物，其中所述细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含容器，所述容器任选地包括烧瓶、板、袋、或生物反应器，所述容器任选地是无菌的，和/或所述容器任选地施用于维持细胞活力或生长。
14.根据权利要求1所述的组合物，其还包含含有编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒。
15.根据权利要求14所述的组合物，其还包含与所述组分(a)、(b)和(c)的质粒/PEI混合物和所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒接触的细胞。
16.根据权利要求15所述的组合物，其还包含游离PEI，其中所述细胞与所述游离PEI接触。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物、所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒、和所述游离PEI接触至少约4小时。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物、所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒、和所述游离PEI接触在约4小时至约140小时范围内的时间段。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞与所述组分(a)、(b)和(c)的混合物、所述包含编码AAV衣壳蛋白的核酸的质粒、和所述游离PEI接触在约4小时至约96小时范围内的时间段。
20.一种产生转染细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供质粒；
(b)提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；
(c)将(a)的质粒与(b)的PEI溶液混合以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约4秒至约4小时范围内的时间段；
(d)将细胞与所述步骤(c)的质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(e)将游离PEI加入所述步骤(d)中产生的所述核酸/PEI细胞培养物中以产生游离的PEI/质粒/PEI细胞培养物；并且
(f)将所述步骤(e)的游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染的细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述质粒包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸。
22.一种产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体，所述方法包括：
(a)提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(b)提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；
(c)提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；
(d)将步骤(a)和(b)的所述质粒与步骤(c)的所述PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；
(e)使细胞与步骤(d)的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(f)将游离PEI添加到步骤(e)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；以及
(g)将步骤(f)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时，从而产生转染细胞，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
23.根据权利要求20或22所述的方法，其还包括以下步骤：收获步骤(f)或(g)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(f)或(g)中产生的所述转染细胞中收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物。
24.根据权利要求22所述的方法，其还包括从步骤(g)的所述细胞和/或培养基收获物中分离和/或纯化重组AAV载体，由此产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
25.一种用于产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括步骤：
(a)提供包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(b)提供包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；
(c)提供包含聚乙烯亚胺(PEI)的溶液；
(d)将步骤(a)和(b)中的所述质粒与步骤(c)的所述PEI溶液混合，其中所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；
(e)使细胞与步骤(d)中的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(f)将游离PEI添加到步骤(e)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；
(g)将步骤(e)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(f)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；
(h)收获步骤(g)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(g)中产生的所述转染细胞收获培养基，以产生细胞和/或培养基收获物；并且
(i)从在步骤(h)中产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生所述包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
26.一种用于产生转染细胞的方法，所述转染细胞产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体，所述方法包括以下步骤：
(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的混合物：
(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；
(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，
(b)将所述质粒(i)和(ii)与所述(PEI)溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；
(c)使细胞与步骤(b)中产生的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(d)将游离PEI添加到步骤(c)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；
(e)将步骤(c)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(d)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞，所述转染细胞产生包括编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其还包括以下步骤：收获步骤(e)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(e)中产生的所述转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；和/或从步骤(e)的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
28.一种产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括以下步骤：
(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的混合物：
(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；以及
(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，
(b)将所述质粒(i)和(ii)与所述(PEI)溶液(iii)混合使得所述质粒在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，以产生质粒/PEI混合物，并且任选地将所述质粒/PEI混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；
(c)使细胞与步骤(b)中产生的所述质粒/PEI混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(d)将游离PEI添加到步骤(c)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；
(e)将步骤(c)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(d)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；
(f)收获步骤(e)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(e)中产生的所述转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；
(g)从步骤(f)中产生的细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
29.一种产生重组AAV载体的方法，所述重组AAV载体包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸，所述方法包括以下步骤：
(a)提供组分(i)、(ii)和(iii)的混合物：
(i)包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒；
(ii)包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒；和
(iii)聚乙烯亚胺(PEI)溶液，
其中所述质粒(i)和(ii)在约1:0.01至约1:100的摩尔比范围内，或在约100:1至约1:0.01的摩尔比范围内，并且其中任选地将组分(i)、(ii)和(iii)的混合物温育在约10秒至约4小时范围内的时间段；
(b)使细胞与步骤(a)中产生的混合物接触以产生质粒/PEI细胞培养物；
(c)将游离PEI添加到步骤(b)中产生的所述质粒/PEI细胞培养物以产生游离PEI/质粒/PEI细胞培养物；
(d)将步骤(b)中的所述质粒/PEI细胞培养物或步骤(c)中的所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育至少约4小时以产生转染细胞；
(e)收获步骤(d)中产生的所述转染细胞和/或从步骤(d)中产生的所述转染细胞收获培养基以产生细胞和/或培养基收获物；以及
(f)从步骤(e)中产生的所述细胞和/或培养基收获物分离和/或纯化重组AAV载体，从而产生包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的重组AAV载体。
30.根据权利要求3至29中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI细胞培养物、或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物、或所述核酸/PEI细胞培养物温育在约4小时至约140小时范围内的时间段。
31.根据权利要求3至30中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI细胞培养物、或所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物温育在约4小时至约96小时范围内的时间段。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI混合物具有在约0.1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约0.1:1范围内的PEI：质粒重量比，或其中所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养基具有在约0.1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约0.1:1范围内的PEI：质粒重量比。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI混合物具有在约1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约1:1范围内的PEI：质粒重量比，或其中所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养基具有在约1:1至约5:1范围内的PEI：质粒重量比，或具有在约5:1至约1:1范围内的PEI：质粒重量比。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI混合物和/或所述游离PEI包含水解的线性聚乙烯亚胺。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI混合物和/或游离PEI中的PEI包含呈游离碱形式的具有在约4,000至约160,000范围内和/或在约2,500至约250,000分子量范围内的水解的线性聚乙烯亚胺。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的组合物或方法，其中所述质粒/PEI混合物和/或所述游离PEI中的PEI包含呈游离碱形式的具有约40,000分子量和/或约25,000分子量的水解的线性聚乙烯亚胺。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的组合物或方法，其中所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物中的总PEI中的氮(N)比质粒中的磷(P)的摩尔比在约1:1至约50:1范围内(N:P)。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的组合物或方法，其中所述游离PEI/质粒/PEI细胞培养物中的总PEI中的氮(N)比质粒中的磷(P)的摩尔比为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1(N:P)。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的组合物或方法，其中将所述质粒/PEI混合物温育在约30秒至约4小时范围内的时间段。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的组合物或方法，其中将所述质粒/PEI混合物温育在约1分钟至约30分钟范围内的时间段。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的组合物或方法，其中所述游离PEI的量在总PEI的约10％至约90％范围内。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的组合物或方法，其中所述游离PEI的量在总PEI的约25％至约75％范围内。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的组合物或方法，其中所述游离PEI的量为总PEI的约50％。
44.根据权利要求4、5和9至43中任一项所述的组合物或方法，其中在所述质粒/PEI混合物与所述细胞接触之前、同时或之后，将所述游离PEI加入所述细胞中。
45.根据权利要求2至44中任一项所述的组合物或方法，其中所述细胞处于悬浮培养。
46.根据权利要求2至44中任一项所述的组合物或方法，其中所述细胞在无血清培养基中生长或维持。
47.根据权利要求2至46中任一项所述的组合物或方法，其中当与所述质粒/PEI混合物接触时和/或当与所述游离PEI接触时，所述细胞的密度在约1×105个细胞/mL至约1×108个细胞/mL的范围内。
48.根据权利要求2至47中任一项所述的组合物或方法，其中当与所述质粒/PEI混合物接触或与所述游离PEI接触时，所述细胞的活力为约60％或大于60％，或其中当与所述质粒/PEI混合物接触时，所述细胞成处于对数生长期。
49.根据权利要求2至48中任一项所述的组合物或方法，其中当与所述质粒/PEI混合物接触或与所述游离PEI接触时，所述细胞的活力为约90％或大于90％，或其中当与所述质粒/PEI混合物或与所述游离PEI接触时，所述细胞成处于对数生长期。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的组合物或方法，其中所述编码的AAV包装蛋白包含AAV rep和/或AAV cap。
51.根据权利要求50所述的组合物或方法，其中所述编码的AAV包装蛋白包含任何AAV血清型的AAV rep和/或AAV cap蛋白。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的组合物或方法，其中所述编码的辅助蛋白包含腺病毒E2和/或E4、VARNA蛋白和/或非AAV辅助蛋白。
53.根据权利要求2至52中任一项所述的组合物或方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
54.根据权利要求2至52中任一项所述的组合物或方法，其中所述细胞为HEK 293E或HEK 293F细胞。
55.根据权利要求2至54中任一项所述的组合物或方法，其中所述包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒和包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒的总量在约0.1μg至约15μg/mL细胞的范围内。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的组合物或方法，其中所述包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒与包含编码AAV包装蛋白的核酸和/或编码辅助蛋白的核酸的一种或多种质粒的摩尔比在约1:5至约1:1的范围内或在约1:1至约5:1的范围内。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的组合物或方法，其中所述一种或多种质粒包含含有编码AAV包装蛋白的核酸的第一质粒和含有编码辅助蛋白的核酸的第二质粒。
58.根据权利要求57所述的组合物或方法，其中所述包含编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的质粒比包含编码AAV包装蛋白的核酸的第一质粒比包含编码辅助蛋白的核酸的第二质粒的摩尔比在约1-5:1:1、或1:1-5:1、或1:1:1-5的范围内。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的组合物或方法，其中所述重组AAV载体包含AAV血清型1-12，AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或修饰的或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或野生型AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白中的任一种。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的组合物或方法，其中所述AAV载体包含AAV血清型或AAV假型，其中所述AAV假型包含不同于ITR血清型的AAV衣壳血清型。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的组合物或方法，其中所述AAV载体还包含内含子、表达控制元件、一种或多种腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)和/或填充物核苷酸序列。
62.根据权利要求61所述的组合物或方法，其中所述内含子在编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸内或侧接所述核酸，或其中所述表达控制元件与编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸能操作地连接，或者其中所述AAV ITR侧接位于编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸的5'或3'端，或者其中所述填充物多核苷酸序列侧接编码蛋白或被转录成感兴趣的转录物的核酸5'或3'端。
63.根据权利要求61所述组合物或方法，其中所述表达控制元件包含组成型或可调节控制元件或组织特异性表达控制元件或启动子。
64.根据权利要求61所述组合物或方法，其中所述表达控制元件包含赋予在肝脏中表达的元件。
65.根据权利要求61所述的组合物或方法，其中所述ITR包含以下任一种的一种或多种ITR：AAV2或AAV6血清型或它们的组合。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的组合物或方法，其中所述AAV载体包含与下列中的任一种具有75％或更多的序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11或AAV2i8VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，或包含选自下列中任一种的修饰或变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV10、AAV11和AAV-2i8AAV血清型。
67.根据权利要求3-65中任一项的组合物或方法，其中在与所述质粒/PEI混合物接触之前将细胞传代培养至减小的细胞密度。
68.根据权利要求3-65中任一项的组合物或方法，其中在与所述质粒/PEI混合物接触之前将细胞传代培养至约0.1×106个细胞/ml至约5.0×106个细胞/ml范围内的细胞密度。
69.根据权利要求67-68中任一项所述的组合物和方法，其中在传代培养之后，所述细胞与所述质粒/PEI混合物接触2天至5天的时间段。
70.根据权利要求67-68中任一项所述的组合物和方法，其中在传代培养之后，所述细胞与所述质粒/PEI混合物接触3天至4天的时间段。
71.根据权利要求20所述的方法，其中与不将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物相比，在将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物中的步骤的情况下，引导入所述转染细胞中的质粒的量大至少50％。
72.根据权利要求21-71中任一项所述的方法，其中与不将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物相比，在将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物中的步骤的情况下，产生的重组AAV载体的量为至少50％或更大。
73.根据权利要求21-71中任一项所述的方法，其中与不将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物相比，在将游离PEI加入所述质粒/PEI细胞培养物中的步骤的情况下，产生的重组AAV载体的量大1-5倍、5-10倍或10-20倍。
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