CN108601849A

CN108601849A - 一种在淋巴细胞中高水平的和稳定的基因转移的方法

Info

Publication number: CN108601849A
Application number: CN201680068108.1A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·胡德塞克; 佐尔坦·伊维奇
Original assignee: Julius Maximilian University Of Wuerzburg
Current assignee: Julius Maximilian University Of Wuerzburg
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2018-09-28
Also published as: JP2022097517A; JP2018532426A; JP7142571B2; CA2999608A1; EP3352798A1; US20190169637A1; BR112018005620A2; AU2016325384A1; KR20180054718A; HK1256068A1; AU2016325384B2; EA201890772A1; WO2017050884A1

Abstract

本发明公开的方法描述了一种能够以空前的效率、灵活性、实用性和速度将转基因稳定整合到淋巴细胞和其他哺乳动物细胞中的新技术。该新方法是基于使用mRNA编码的转座酶[例如睡美人(Sleeping Beauty)转座酶]与微环DNA编码的转座因子的组合。该新方法能够实现更高的基因转移速率，同时比常规方法毒性低，所述常规方法即使用质粒DNA编码的转座酶与质粒DNA编码的转座因子的组合。本发明的应用包括但不限于将编码免疫受体(例如T细胞受体或合成嵌合抗原受体)的转基因稳定整合到人T淋巴细胞中，其中免疫受体对肿瘤细胞表达的分子具有特异性。转座酶mRNA和转座子微环DNA可通过包括但不限于如电穿孔和核转染的电转移方法导入淋巴细胞中。

Description

一种在淋巴细胞中高水平的和稳定的基因转移的方法

技术领域

本发明涉及基因转移的方法和技术以及免疫治疗的方法和技术。

背景技术

越来越多的基因修饰的细胞和组织被应用于生物体的诊断和治疗当中。例如通过引入一个或几个转基因赋予细胞新的特性，或通过引入一个或几个基因修饰子来调节或除去不同的特性和功能来进行基因修饰。基因修饰的细胞应用在治疗中的一个令人印象深刻的例子是工程化T细胞的应用，通过基因转移对该工程化T细胞进行修饰使其表达能够识别肿瘤细胞表达的分子的T细胞受体(TCR)或合成的嵌合抗原受体(CAR)，并因此赋予该工程化T细胞的抗肿瘤特异性。临床前的肿瘤模型以及晚期化疗和放疗的难治性恶性肿瘤患者的临床试验中有令人信服的证据表明，这些工程化TCR-和CAR-修饰的T细胞具有抗肿瘤能力和治疗潜力(Hudecek Blood 2010；Hudecek Cancer Immunol Res 2013；HudecekCancer Immunol Res 2015；Hudecek Leukemia 2015；Kalos Science Transl Med 2011；Grupp N Engl J Med 2013；Davila Science Transl Med 2014；Maude N Engl J Med2014)。

实现基因转移到T细胞中的最常用策略是使用病毒递送***，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒载体。病毒递送***已被用于将包括TCR和CAR的转基因稳定整合到人T淋巴细胞中，从而能够制造在临床前和临床时使用的肿瘤反应性TCR-/CAR-T淋巴细胞。尤其例如，已经证实整装了对CD19具有特异性的合成嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在中试研究中对B细胞恶性肿瘤具有显著的疗效(参考文献1-3)。在迄今为止报道的所有CD19-CAR T细胞疗法具有功效的临床试验中，都是使用整合的慢病毒(LV)或γ-逆转录病毒(RV)载体来实现CAR基因的转移和表达。然而，与病毒的基因转移载体相关的应用有许多概念性的、技术上的和策略上的缺陷，包括随时间推移的转基因沉默、优先整合到基因组的转录活性位点中时伴随着其他基因的非期望激活(例如癌基因)和遗传毒性的非期望潜能；以及制造、储存和处理整合病毒的费用和繁琐的努力——其中后者妨碍了它们在治疗应用中更广泛地应用于制造基因修饰的T细胞。因此，病毒载体在安全性方面以及在全球范围内建立CAR T细胞治疗所需的载体生产的成本和规模一直受到持续关注。

转座子技术是实现稳定基因转移的另一种策略。转座子或转座因子(TE)是能够稳定整合到宿主细胞基因组中的遗传元件，这个整合到宿主细胞基因组中的过程称为转座(Ivics Mobile DNA 2010)。早在20世纪50年代，Barbara McClintock在玉米的遗传学研究中就推测到了TE的存在，但直到20世纪70年代末才描述了用于细菌TE的第一个转座功能模型(Shapiro PNAS 1979)。同时显而易见地是，TE存在于每个生物体的基因组中，并且基因组测序显示约45％的人类基因组是来源于转座子(International Human GenomeSequencing Consortium Nature 2001)。然而，与已经确定功能性(或自主性)TE的无脊椎动物相反，人类和大多数高等脊椎动物不包含功能性TE。据推测，进化过程中的选择压力抵抗TE的致突变潜力，导致其在数百万年前的进化过程中发生功能性失活。

自主TE包含编码位于两个反向末端重复序列(ITR)之间的转座酶的DNA，所述两个反向末端重复序列(ITR)由ITR之间编码的转座酶识别并且其能够催化TE转座到任何双链DNA序列中。转座子有两种不同的类型：通过RNA中间体和“复制-和-粘贴”机制调动的I类或反转录转座子，以及通过切除-整合或“剪切-和-粘贴”机制调动的II类或DNA转座子(IvicsNat Methods 2009)。似乎大多细菌、低等真核生物(例如酵母)和无脊椎动物的转座子是物种特异性的，并且不能用于脊椎动物细胞中DNA的有效转座。直到通过序列改组来源于鱼类的非活性的TE[这些转座子因此被称为“睡美人(Sleeping Beauty)”(Ivics Cell 1997)]后，才人工重建出第一个有活性的转座子，并将转座子导入包括人类细胞在内的脊椎动物细胞，成功地实现了DNA整合。睡美人是属于Tcl/marine转座子家族的II类DNA转座子(NiGenomics Proteomics 2008)。与此同时，从包括果蝇、青蛙甚至人类的不同物种的基因组中鉴定或重建了额外的功能转座子，所有这些功能转座子都被证明可以将DNA转座到脊椎动物以及人类宿主细胞的基因组中。这些转座子每一个都具有与转座效率、表达稳定性、基因有效载荷能力等相关的优点和缺点。

发明简述

本发明公开的方法描述了一种能够以有着空前的效率、灵活性、实用性和速度的新技术，其能将转基因稳定整合到淋巴细胞和其他哺乳动物细胞中的新技术。该新方法是基于使用mRNA编码的转座酶[例如睡美人(Sleeping Beauty)转座酶]与微环DNA编码的转座因子的组合。该新方法能够实现更高的基因转移率，同时比常规方法毒性低，所述常规方法即使用质粒DNA编码的转座酶与质粒DNA编码的转座因子的组合。

以下效果将有助于通过根据本发明的微环实现更高的基因转移率：

·与质粒相比，微环的半衰期更长，

·与质粒相比，微环更容易从细胞质迁移到细胞核中，

·与大型环状质粒相比，小型超螺旋MC更易于转座子的调动。

根据本发明所述内容，这些效果不限于微环，而且也适用于编码包含转基因表达盒的转座因子的任何其他DNA，条件是这种DNA具有比适合作为转座因子的供体质粒的常规质粒更小的尺寸。因此，根据本发明所述内容，也可以使用编码包含转基因表达盒的转座因子的任何DNA，只要编码转座因子的DNA是编码如下定义的转座因子的DNA。

由于根据本发明实现了更高的基因转移率，将有助于在良好生产规范(GMP)下实施本发明的方法和用途。例如，当本发明用于产生CAR T细胞时，CD3/CD28刺激可用于在转染前活化T细胞，并且和现有技术方法不同，本发明不需要使用饲养细胞来扩增CAR T细胞，以获得达到治疗相关剂量的CAR T细胞。

根据本发明所述内容，低剂量的转染的微环DNA(与质粒DNA相比)有助于减少由微环带来的毒性。此外，这种效果不限于微环，而且也适用于编码包含转基因表达盒的转座因子的任何其他DNA，条件是这种DNA具有比适合作为转座因子供体质粒的常规质粒更小的尺寸。因此，根据本发明所述内容，也可以使用编码包含转基因表达盒的转座因子的任何DNA，只要编码转座因子的DNA是编码如下定义的转座因子的DNA。

本发明的另一个优点是由于在微环中缺乏抗生素抗性基因，排除了抗生素抗性基因向宿主细菌的水平基因转移和抗生素抗性基因非目的性地整合到宿主基因组中的情况。

根据本发明所述内容，发现mRNA可以作为一种转座酶的来源。这一发现是出乎意料的，因为mRNA的寿命短，并不知道其是否是一种为本发明提供足够量的转座酶的合适的来源。根据本发明所述内容，使用mRNA作为转座酶的来源具有两个优点：首先，因为由mRNA提供的转座酶寿命短，已经整合的转座子重新移动的风险较低。其次，mRNA作为转座酶的供应，消除了转座酶表达盒意外整合到宿主基因组中的风险，这种风险可能导致基因组整合转座子不可控地、持续地转座。

本发明的优势还在于它提供了携带转基因的转座子的接近随机的整合性能，而不偏爱高表达的或与癌症相关的基因。此外，当使用本发明所述应用时，与LV整合相比，在基因组安全港中发生转基因整合的比例明显更高，其接近随机整合的完美预期。因此，本发明可通过使用无病毒转座来制备重组哺乳动物细胞，例如淋巴细胞(例如CAR T细胞)。本发明载体的卓越的安全性、高水平的稳定转座率和易操作性，使得本发明成为例如在先进的细胞治疗和基因治疗的应用中优选的基因转移策略。

本发明的应用包括但不限于将编码免疫受体(例如T细胞受体或合成的嵌合抗原受体)的转基因稳定整合到人T淋巴细胞中，其中免疫受体赋予其对肿瘤细胞表达的分子具有特异性。转座酶mRNA和转座子微环DNA可通过包括但不限于电转如电穿孔以及核转染的方法导入淋巴细胞。

发明详述

迄今为止，现有技术中已经公开了使用质粒DNA编码的转座酶和质粒DNA编码的转座子(TE)将转基因转座并稳定整合到哺乳动物细胞基因组中的技术。更具体地说，现有技术中已经公开了使用质粒DNA编码的转座酶和质粒DNA编码的转座子将编码肿瘤反应性的TCR和CAR的转基因转座并稳定整合到人T淋巴细胞基因组中的技术。

在人T淋巴细胞中，使用质粒DNA编码的转座酶和质粒DNA编码的转座子(TE)(通过包括电转在内的各种方法导入T淋巴细胞中)会导致非常低水平的稳定基因转移(通常<10％)(Huang Mol Therapy 2008；Field PLoS1 2013)，将遗传物质导入T细胞会伴随着高水平的毒性，需要进一步筛选程序(机械的程序，例如基于珠子或FACS分选；和/或生物的程序，例如抗原依赖性刺激)和体外扩增(通常为数周)(Singh Immunol Rev 2014)以获得足以用于其预期治疗用途的基因修饰的T细胞的量。然而，最值得注意的是，使用质粒DNA编码的转座酶和质粒DNA编码的CAR转座子进行基因转移的CAR-修饰的T淋巴细胞在临床前和临床应用中显示效果较差(与通过慢病毒或逆转录病毒进行基因转移的基因修饰的CAR T细胞相比)，甚至缺乏治疗效果。

在本发明中，发明人首次将mRNA编码的转座酶(SB100X)与微环DNA编码的转座子(编码eGFP或对CD19具有特异性的CAR)组合用于实现将基因转移导入人T淋巴细胞中。利用该方法，发明人实现了非常高水平的稳定TE整合(>50％)、长期稳定的转基因表达(在相同水平下稳定至少4周)、与使用质粒DNA编码的转座酶(SB100X)和质粒DNA编码的转座子(编码eGFP或对CD19具有特异性的CAR)相比，对T淋巴细胞的毒性明显更低。

由于本发明的新方法具有更高的基因转移率和更低的毒性，可以显著降低体外培养时间以获得治疗所需细胞的数目，和/或在给定时间内基因修饰的T淋巴细胞的总产量显著增加，甚至无需进一步筛选或扩展程序即可使其直接用于治疗。

我们的发明首次描述了使用微环DNA编码的转座子(TE)与mRNA编码的转座酶组合以实现将TE稳定整合到哺乳动物细胞的基因组中。

更具体地，本发明首次描述了使用微环DNA编码的转座子(TE)与mRNA编码的转座酶组合以实现将TE稳定整合到淋巴细胞的基因组中。

此外，本发明首次描述了使用微环DNA编码的转座子(TE)与任何潜在的转座酶的来源(包括但不限于mRNA、质粒DNA、微环DNA、线性DNA、一种多肽)组合以实现将转基因导入淋巴细胞中的用途。

此外，在本发明的较佳实施例中，本发明首次描述了将含有肿瘤反应性的TCR或CAR的遗传信息的微环DNA编码的转座子与mRNA编码的睡美人(“Sleeping beauty”)转座酶SB100X组合用于产生用于癌症免疫治疗的具有肿瘤反应性的人T淋巴细胞。

此外，本发明描述了一种有利的技术进步，即通过使用微环DNA编码的转座子(TE)与mRNA编码的转座酶组合，获得与已建立的常规使用方法相比显著更高且稳定的基因转移率和显著降低的毒性，所述常规方法即使用质粒DNA编码的转座酶和质粒DNA编码的转座子(TE)导入到淋巴细胞中。

我们发现，稳定的基因转移可以通过使用微环DNA编码的转座子(TE)与mRNA编码的转座酶的组合来完成，这种方法尚未被本领域的现有技术公开，是具有新颖性的；而且这是出人意料的，因为众所周知，mRNA寿命短暂，并且在***到T淋巴细胞和其他哺乳动物细胞的细胞核或细胞质后迅速降解。

因此，既不能预料到也不能预期作为转座酶来源的mRNA合适并且足以使转座从微环DNA发生，也不能预料到或预期与使用质粒DNA编码的转座酶和质粒DNA编码的转座子的常规的已经建立的方法相比，使用mRNA作为转座酶的来源将导致甚至更高的转座率。

在本发明中，术语“微环DNA”是一种载体，即缺乏细菌复制起点和抗生素抗性基因的超螺旋DNA分子。因此它们主要由真核表达盒组成(参见例如F.Jia et al.Naturemethods,Vol.7,no.3,p.197-199,March 2010)。

在本发明中，“基因组安全港”是同时满足以下5个标准的人类染色体区域：不是超保守的，距离miRNA基因超过300kb，距离转录起始位点(TSS)超过50kb，距离癌症相关的基因超过300kb，和外部转录单位。

在本发明中，“超保守的”基因组染色体区域是在人类、小鼠和大鼠基因组中完全保守的非编码的基因内或基因间区域。

较佳实施例

本发明的较佳实施例是使用mRNA编码的SB100X转座酶和微环DNA编码的CAR转座子来产生肿瘤反应性的CAR修饰的T淋巴细胞用于过继性癌症免疫治疗。

在一个实用的实施例中，所述CAR对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38、CD138或肿瘤细胞、病变细胞或正常细胞表面表达的任何其他分子。

在另一个实用的实施例中，微环DNA可以编码a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因、转导标记或任何其他天然存在的或合成的分子，所述分子适合被导入细胞中。

在另一个实用的实施例中，修饰的细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/d T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞或任何其他适合作为遗传修饰的哺乳动物细胞类型。

在一个实用的实施例中，通过电转如电穿孔、核转染，化学转染物质如脂质体、fugene、磷酸钙，纳米颗粒或其他任何可以想到的材料适合导入细胞中的方法，mRNA和DNA微环导入细胞中。

在一个实用的实施例中，介导转座因子转座到基因组的转座酶是SleepingBeauty、PiggyBac、Frog Prince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，以及其具有相同、较低和/或较高的转座活性的衍生物。

在本发明的另一个实用的实施例中，SB100X转座酶本身可以作为微环DNA、线性DNA、多肽或任何其它适合完成微环DNA编码的TE转座的来源。

特别地，本发明的较佳实施例如以下项目所定义：

1、一种应用，所述应用为使用一种编码转座因子的微环DNA以及一种转座酶的来源的组合，以稳定地将转座因子整合到哺乳动物细胞的基因组中。

2、如项目1所述的应用，其中所述转座酶的来源是编码所述转座酶的核酸。

3、如项目2所述的应用，其中编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的mRNA、编码所述转座酶的质粒DNA、编码所述转座酶的微环DNA或编码所述转座酶的线性DNA。

4、如项目3所述的应用，其中编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的mRNA。

5、如项目3所述的应用，其中编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的微环DNA。

6、如项目5所述的应用，其中编码所述转座酶的微环DNA和编码所述转座因子的微环DNA是相同的微环DNA。

7、如项目1所述的应用，其中所述转座酶的来源是转座酶多肽。

8、如前述项目任一项所述的应用，其中所述转座酶是SB100X。

9、如前述项目中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物淋巴细胞。

10、如项目9所述的应用，其中所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。

11、如项目9或10所述的应用，其中所述淋巴细胞是T淋巴细胞。

12、如项目1～8任一项所述的应用，其中所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/d T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。

13、如前述项目中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞或CD4+辅助T细胞。

14、如前述项目中任一项所述的应用，其中所述转座因子包含用于表达T细胞受体或嵌合抗原受体的遗传信息，并且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

15、如项目14所述的应用，其中所述T细胞受体或嵌合抗原受体是肿瘤反应性的，并且通过所述应用获得的所述人T淋巴细胞是适用于癌症的过继免疫治疗的肿瘤反应性人T淋巴细胞。

16、如项目14或15所述的应用，其中所述转座因子包含嵌合抗原受体的遗传信息。

17、如项目16所述的应用，其中所述嵌合抗原受体对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体、GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38或CD138具有特异性。

18、如前述项目中任一项所述的应用，其中编码所述转座因子的微环DNA编码a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

19、如前述项目中任一项所述的应用，其中所述应用是在体外应用。

20、如项目2～6或8～19任一项所述的应用，其中编码所述转座酶的核酸和编码所述转座因子的DNA微环通过电转如电穿孔或核转染、化学转染如磷酸钙、或纳米颗粒导入细胞。

21、如项目2～7或9～20任一项所述的应用，其中介导转座因子转座到基因组的所述转座酶是Sleeping Beauty、PiggyBac、Frog Prince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，或其具有转座活性的衍生物。

22、一种应用，所述应用为使用一种编码包含转基因表达盒的转座因子的DNA以及一种转座酶的来源的组合，以将转座因子稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中；其中，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和/或缺乏抗生素抗性基因。

23、如项目22所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点。

24、如项目22所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA缺乏抗生素抗性基因。

25、如项目22～24任一项所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和缺乏抗生素抗性基因。

26、如项目22～25任一项所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA可以通过从质粒中删除所述复制起点和/或所述抗生素抗性基因获得，所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

27、一种应用，所述应用为使用一种编码包含转基因表达盒的转座因子的DNA和一种转座酶的来源的组合，以将转座因子稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中；其中，所述编码转座因子的DNA可以通过缩短质粒的至少一个碱基对而获得，并且其中所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

28、如项目22～27任一项所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过3.0kb，优选不超过2.0kb。

29、如项目22～28任一项所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.5kb。

30、如项目22～29任一项所述的应用，其中所述编码转座因子的所述DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.0kb。

31、如项目22～30任一项所述的应用，其中所述编码转座因子的DNA是项目1～21任一项所用的微环DNA。

32、如项目22～31任一项所述的应用，其中所述转基因是如项目14～17任一项所定义的T细胞受体或嵌合抗原受体，且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

33、如项目22～31任一项所述的应用，其中所述转基因是a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

34、如项目22～33任一项所述的应用，其中所述应用是在体外应用。

35、如项目22～34任一项所述的应用，其中所述转座酶的来源为如项目2～6、8或21中任一项所定义的转座酶的来源。

36、如项目22～31和33～35中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物细胞为如项目9～14中任一项所定义的哺乳动物细胞。

37、如前述项目中任一项所述的应用，其中所述哺乳动物细胞是原代细胞，优选原代人细胞。

38、如前述项目中任一项所述的应用，其中所述应用是非病毒的应用。

39、一种获得包含稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，其中所述方法包括：

将编码转座因子的微环DNA与编码转座酶的核酸的组合导入哺乳动物细胞中，从而获得所述重组哺乳动物细胞。

40、如项目39所述的方法，其中所述编码转座酶的核酸为如项目3～6、8或21中任一项所定义的编码转座酶的核酸。

41、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述转座酶是SB100X。

42、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物淋巴细胞。

43、如项目42所述的方法，其中所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。

44、如项目42或43所述的方法，其中所述淋巴细胞是T淋巴细胞。

45、如项目39～41任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/d T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。

46、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞或CD4+辅助T细胞。

47、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述转座因子包含用于表达T细胞受体或嵌合抗原受体的遗传信息，和所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

48、如项目47所述的方法，其中所述T细胞受体或嵌合抗原受体是肿瘤反应性的，并且通过所述方法获得的所述人T淋巴细胞是适用于癌症的过继免疫治疗的肿瘤反应性人T淋巴细胞。

49、如项目47或48所述的方法，其中所述转座因子包含嵌合抗原受体的遗传信息。

50、如项目49所述的方法，其中所述嵌合抗原受体对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体、GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38或CD138具有特异性。

51、如前述项目中任一项所述的方法，其中编码所述转座因子的微环DNA编码a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

52、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法。

53、如前述项目中任一项所述的方法，其中编码所述转座酶的核酸和编码所述转座因子的DNA微环通过电转如电穿孔或核转染、化学转染如磷酸钙、或纳米颗粒导入细胞。

54、如项目39～41或43～53任一项所述的方法，其中介导转座因子转入基因组的所述转座酶是Sleeping Beauty、PiggyBac、Frog Prince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，或其具有转座活性的衍生物。

55、如前述项目中任一项所述的方法或应用，其中编码转座因子的微环DNA与编码转座酶的核酸的所述组合是一起被导入哺乳动物细胞当中。

56、如项目54所述的方法或应用，其中所述编码转座因子的微环DNA和编码转座酶的核酸是相同的微环DNA。

57、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述编码转座酶的核酸和编所述码转座因子的微环DNA以1：1或更大的摩尔比导入哺乳动物细胞中；较佳地，所述摩尔比为2:1～10:1；更佳地，所述摩尔比为3:1～9:1；进一步更佳地，所述摩尔比为4:1至8:1。

58、一种获得包含稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，其中所述方法包括：

将编码含有转基因表达盒的转座因子的DNA和编码转座酶的核酸的组合导入哺乳动物细胞中，从而获得所述重组哺乳动物细胞；

其中，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和/或缺乏抗生素抗性基因。

59、如项目58所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点。

60、如项目58或59所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA缺乏抗生素抗性基因。

61、如项目58～60任一项所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和缺乏抗生素抗性基因。

62、如项目58～61任一项所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA可以通过从质粒中删除所述复制起点和/或所述抗生素抗性基因获得，所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

63、一种获得含有稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：

其中，所述编码转座因子的DNA可以通过缩短质粒的至少一个碱基对而获得，并且其中所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

64、如项目58～63任一项所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过3.0kb，优选不超过2.0kb。

65、如项目58～64任一项所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.5kb。

66、如项目58～65任一项所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.0kb。

67、如项目58～66任一项所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA是项目1～21任一项所用的微环DNA。

68、如项目58～67任一项所述的方法，其中所述转基因是如项目14～17中任一项所定义的T细胞受体或嵌合抗原受体，并且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

69、如项目58～67任一项所述的方法，其中所述转基因是a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

70、如项目58～69任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法。

71、如项目58～70任一项所述的方法，其中所述编码转座酶的核酸为如项目40中所定义的编码转座酶的核酸。

72、如项目58～67或69～71任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为如项目9～14中任一项所定义的哺乳动物细胞。

73、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是原代细胞，优选原代人细胞。

74、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述方法是非病毒的方法。

75、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述的组合是通过同时导入所述编码转座因子的DNA或微环DNA和编码转座酶的核酸来导入的。

76、如项目75所述的方法，其中所述编码转座因子的DNA或微环DNA和所述编码转座酶的核酸是同一个DNA微环。

77、如项目39～54或56～74任一项所述的方法，其中所述组合是通过依次导入所述编码转座酶的核酸和编码转座因子的DNA或微环DNA来导入的。

78、如项目39～54或56～74任一项所述的方法，其中所述组合是通过依次导入所述编码转座因子的DNA或微环DNA和编码转座酶的核酸来导入的。

79、如前述项目中任一项所述的方法或应用，其中所述编码转座因子的微环DNA是线性化DNA或环状DNA。

80、如前述项目中任一项所述的方法或应用，其中所述转座酶的来源或编码转座酶的核酸是编码转座酶的微环DNA；其中所述微环DNA是线性化微环DNA或环状微环DNA。

81、如前述项目中任一项所述的方法，其中所述编码转座酶的核酸和所述编码转座因子的DNA或微环DNA以1:1或更大的重量比值导入哺乳动物细胞中；较佳地，所述重量比值是2:1至10:1；更佳地，所述重量比值是3:1至9:1；进一步更佳地，所述重量比值是4:1至8:1。

82、一种通过前述项目中任一项所述的方法获得的重组哺乳动物细胞。

83、一种重组人T细胞，其中所述重组人T细胞包含至少一个拷贝的含有转基因表达盒的转座因子。

84、如项目82或83所述的重组细胞，其中所述细胞中转座因子的拷贝数至少为1、至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

85、如项目82或83所述的重组细胞，其中所述细胞中转座因子的拷贝数至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

86、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的0％～5％的拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

87、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少5％拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

88、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少10％的拷贝体被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

89、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少15％的拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

90、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少20％的拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

91、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少40％的拷贝被整合到满足以下所有条件的基因组染色体区域中：

(v)外部转录单位。

92、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意一个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

93、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意两个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

94、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意三个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

95、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意四个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

96、如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的拷贝数至少为1、至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

97、如项目81～94任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞的转座因子的瞬时拷贝的拷贝数至少为1、至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

98、一种如前述项目中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞应用于药物中。

99、一种如项目82～97任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞应用于治疗癌症。

100、如项目98或99所述的重组细胞应用于如项目97或98所述的应用，其中所述应用是应用于免疫疗法。

101、如项目100所述的重组细胞应用于如项目100所述的应用，其中所述免疫疗法的应用是治疗自身免疫疾病的应用。

102、如项目100所述的重组细胞应用于如项目100所述的应用，其中所述免疫疗法的应用是用于治疗感染性疾病的应用。

103、如项目102所述的重组细胞应用于如项目102所述的应用，其中所述感染性疾病是细菌感染、病毒感染或真菌感染。

104、如项目98～103任一项所述的重组细胞应用于如项目98～103任一项所述的应用，其中所述重组细胞是T细胞。

105、如项目82～97任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞应用于基因治疗。

106、一种包含编码转座因子的微环DNA和编码转座酶的核酸的组合物。

107、如项目106所述的组合物，其中所述编码转座酶的核酸为如项目3～6、8或21中任一项所定义的编码转座酶的核酸。

108、如项目106或107所述的组合物，其中所述转座因子为如项目14～18中任一项所定义的转座因子。

109、如项目1～18、20～33、35～51、53～69或71～81任一项所述的应用或方法，其中所述应用或方法是在体内应用或体内方法。

110、如项目109所述的应用或方法，其中所述应用或方法是基因治疗的应用或基因治疗的方法。

附图说明

图1为微环DNA和SB100X mRNA。

(A)产生微环(MC)DNA的示意图。通过由PhiC31整合酶介导的亲本质粒的位点特异性分子内重组产生MC-DNA元件。亲本质粒DNA包含几个工程化的I-SceI限制性位点，最终导致细菌骨架的消化而保留MC-DNA。MC-DNA仅含有转基因及其启动子，而不再携带细菌复制起点或抗生素抗性标记。

(B)通过亲代常规质粒的位点特异性分子内重组制备MC载体的示意图。MC仅含有转基因及其启动子，而不含细菌复制起点和抗生素抗性基因。EF1，延伸因子1α启动子；CMV，巨细胞病毒启动子；ORI，细菌复制起点；AntibioR，抗生素抗性基因；LIR，左反向重复；RIR，右反向重复；空心圆＝重组位点。

(C)限制性消化并通过凝胶电泳对纯化的MC DNA进行分析。用PmeI或PacI消化250ng的MC-GFP、MC-CD19 CAR或MC-SB100X，并在0.8％琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳进行分析。泳道M：1kbp DNA ladder(PlasmidFactory)；泳道1：PacI消化的MC-GFP；泳道2：PmeI消化的MC-CD19 CAR；泳道3：PmeI消化的MC-SB100X。

(D)通过凝胶电泳分析体外转录的SB100X mRNA。ARCA封端的SB100X mRNA在变性的琼脂糖凝胶上约1400bp处作为不同的单一条带移动。泳道M：RNA标记(FlashGel，Lonza)；泳道1：SB100X mRNA。

图2为来自MC-DNA的转座最大化的SB100X mRNA的滴定。

(A)SB介导的T淋巴细胞重编程的步骤。用抗CD3/抗CD28微珠活化T细胞约36小时，利用4D核转录***进行转座酶(如质粒DNA、MC-DNA或mRNA)和转座子供体(如质粒DNA或MC-DNA)的共转染。连续流式细胞计数分析以确定转基因阳性的T细胞的百分比。在一个代表性实验中，转座子含有编码CD19特异性CAR的转基因。此处，转基因阳性的T细胞使用包含在转基因盒内的tEGFR转导标记进行富集，并在功能检测之前用CD19+ EBV转化的B细胞(TM-LCL)通过抗原特异性刺激7天进行扩增。

(B)在用指定比例的mRNA SB100X和MC-CD19 CAR(mRNA-MC)、质粒(P-P)或MC-DNA(MC-MC)进行核转染后的CD8+T细胞系中，对第14天的tEGFR表达量进行流式细胞分析。用于核转染的细胞量为2x10⁶个T细胞；P-P：1ug SB100X DNA+1ugpT2；MC-MC：与P-P等摩尔量；mRNA-MC：与MC-MC等量的MC(与P-P等摩尔量)，是mRNA的多倍。模拟＝在不含转座酶和不含转座子的溶液中进行核转染。

(C)用不同比例的SB100X mRNA和MC-CD19 CAR、P-P或MC-MC转染后第14天的tEGFR表达量的比较。数据为三次独立实验的平均值±SD。使用Student t检验进行统计学分析，*p<0.01，**p<0.001，表示数据之间具有统计学的显著差异。

(D)基因修饰的CD8+ T细胞的存活和扩增。在转染48小时后，进行7-AAD染色以确定存活T细胞的百分比(散点图和左图)。根据转染后第14天获得的EGFRt+ T细胞的绝对数量和百分比计算CAR修饰的T细胞的产量(右图)。显示的数据为平均值±SD。

图3为与/来自常规质粒DNA的转座相比，来自MC-DNA的SB100X mRNA的转座提高了基因转移速率和靶细胞的活力。

(A)用质粒(P-P)、微环DNA(MC-MC，等摩尔)或SB100X mRNA和MC-CD19 CAR(mRNA-MC，4:1比例)进行转染14天后，利用流式细胞术评估tEGFR阳性T细胞的百分比。

(B)、(C)用P-P、MC-MC或mRNA-MC转染后，利用流式细胞术分析比较tEGFR或GFP的表达量与细胞活力。图中显示了(B)的六个独立实验或(C)中三个独立实验的平均值±SD。使用Student t检验进行统计学分析。*p<0.01，**p<0.001，***p<0.001表示数据之间具有统计学的显著差异。

(D)用P-P、MC-MC或mRNA-MC转染后，利用流式细胞术分析评估与IL-2共同培养的28天中tEGFR表面表达量的稳定性。

(E)用P-P、MC-MC或mRNA-MC转染后两周内T细胞的扩增。用台盼蓝拒染法对CD8+ T细胞数进行计数。图中显示细胞总数(左图)或基因修饰的细胞数(右图)。数据代表三次独立实验的平均值±SD。

图4为用慢病毒转导或转座子***产生的表达CD19 CAR的T细胞的体外效应子功能的比较。

(A)在tEGFR富集和用饲养细胞进行特异性扩增后，CD8+和CD4+ T细胞上tEGFR表达的典型的流式细胞术散点图。

(B)通过慢病毒转导(LV)或转座子***(P-P、MC-MC或mRNA-MC)，针对表达CD19+的和对照的肿瘤细胞系产生的表达CD19 CAR的CD8+ T细胞的特异性细胞毒性。裂解百分比数值依据模拟的对照T细胞系的数值进行归一化。来自三个独立实验(E:T＝10:1)的针对K562/CD19的细胞毒性数据被归一化(依据模拟细胞的细胞溶解活性)并通过单向ANOVA进行分析。

(C)与表达CD19+的肿瘤细胞系共培养24小时后获得的上清液的细胞因子释放测定。数据表示来自三个独立实验的CD8+和CD4+T细胞产生的IFN-γ或IL-2的平均值±SD，并且通过单向ANOVA进行分析。

(D)用表达CD19的靶细胞系刺激CD19 CAR T细胞并且不添加外源细胞因子，利用CFSE染料稀释评估72小时内CD19 CAR T细胞的增殖。为了进行分析，汇集一式三份的孔并分析活的(7AAD^-、CD8+或CD4+ T细胞的增殖。计算三个独立实验的细胞***指数，并且通过单向ANOVA分析数据。

(E)重复图4D所示的实验：用K562/CD19+靶细胞刺激后，利用CFSE染料稀释评估72小时内CD19-CAR T细胞的增殖。没有外源细胞因子被添加到测定培养基中。为了进行分析，汇集一式三份的孔并分析活的(7AAD-)T细胞的增殖。通过使用FlowJo软件在n＝3次的独立实验中获得的数据计算细胞增殖指数(即平均细胞***数)，并通过单向ANOVA分析数据(**p<0.001)。

图5为用SB100XmRNA和MC-CD19 CAR转座进行修饰的CD19 CAR T细胞的体内肿瘤反应性

(A)上图：用Raji-ffluc细胞接种NSG小鼠，7天后用10x10⁶个CD19 CAR T细胞(CD8+和CD4+ T细胞，各5×10⁶)处理的、未修饰的对照T细胞处理的或剩余未处理的小鼠。通过生物发光成像分析小鼠的类别。虚线表示T细胞转移当天。图中显示了第7天(T细胞转移当天)第10天(T细胞转移3天后)和第14天(T细胞转移7天后)的生物发光图像。下图：用Raji-fluc/eGFP细胞接种NSG小鼠，7天后用5×10⁶个CD19-CAR T细胞(CD8+和CD4+ T细胞的比率为1:1，各2.5×10⁶)处理的、未修饰的对照T细胞处理的或剩余未处理的小鼠。通过用SB100X mRNA和CD19-CAR MC(4:1比例)转染产生CD19-CAR T细胞。在第7天(T细胞输注前，上排)和第14天(T细胞输注7天后，下排)获得生物发光图像。数据代表用不同供体制备的T细胞进行的至少2次独立实验中获得的结果。

(B)左图：在每个时间点针对每个处理组从每只小鼠的整个身体上感兴趣部位获得的生物发光信号的平均值绘制的曲线图。数据来自图5A上图所示的小鼠。右图：在每个时间点针对每个处理组从每只小鼠的整个身体上感兴趣部位获得的生物发光信号的平均值绘制的曲线图。数据来自图5A下图所示的小鼠。加粗虚线代表T细胞输注的日子。数据代表用不同供体制备的T细胞进行的至少2次独立实验中获得的结果。

(C)左图：与对照T细胞或无T细胞(未处理)处理的小鼠相比，对表达CD19 CAR的T细胞处理的小鼠的存活能力进行Kaplan-Meier分析。右图：在用SB转座(SB100X mRNA和CD19-CAR MC)(n＝5)和LV转导(n＝5)制备的CD19-CAR T细胞处理的、对照T细胞处理的(n＝3)或未接受治疗(n＝2)的小鼠组中的存活能力进行Kaplan-Meier分析。数据代表用不同供体制备的T细胞进行的至少2次独立实验中获得的结果。

(D)用CD19-CAR T细胞处理的小鼠其外周血和骨髓中人T细胞的频率。在T细胞转移后的第3、7和14天(即肿瘤接种后的第10、14、21天)获得血液样品，并在实验结束时收集骨髓。具有代表性的流式细胞术散点图显示了CD8+和CD4+ T细胞(门控基于活的7-AAD^-CD45⁺细胞)。数据代表用不同供体制备的T细胞进行的至少2次独立实验中获得的结果。

(E)在实验的第18天(对照/未处理的小鼠)和第35天(CD19-CAR组)获得的NSG小鼠的骨髓中CD45⁺ffLuc/eGFP⁺Raji细胞的频率。水平线代表平均值。数据代表用不同供体制备的T细胞进行的至少2次独立实验中获得的结果。

图6为使用splinkerette PCR(spPCR)测定用SB100XmRNA和MC-CD19 CAR修饰的T细胞的转基因拷贝数。

(A)每个spPCR反应中，上样3μl PCR产物于典型的琼脂糖凝胶上。如先前所述，利用有限稀释克隆获得的CAR+ T细胞克隆的基因组DNA使用转座子左反向末端重复的特异性引物通过spPCR进行扩增。泳道M：100bp DNA ladder(NEB)；克隆1-10：10个CAR T细胞克隆的输入基因组DNA；MC：仅用MC-CD19 CAR转染的样品的输入基因组DNA，无SB100X mRNA；模拟：核转染/未转染的T细胞的输入基因组DNA；NDC：无DNA对照。

(B)n＝10的不同CD8+CAR T细胞克隆的总结数据，通过用SB100X mRNA和MC-CD19CAR(4:1比例)进行的SB100X转座进行遗传修饰。图中所示为每个T细胞的平均拷贝数与SD。

(C)用SB100X mRNA和MC CD19-CAR(4:1比例)修饰的CD4+(n＝10)和CD8+(n＝9)CD19-CAR T细胞克隆的基因拷贝数。图中显示的CD8+CD19-CAR T细胞克隆实验是(B)中所示实验的重复。

图7为人类T细胞中SB和LV***位点的特性和安全性评估。

(A)人类基因组的基因相关的特征中LV和SB***频率的比较。根据随机预期频率上的SB和LV***位点的富集倍数绘制图标。虚线表示在x轴上的类别中通过随机机会预期的***频率上倍数为1的富集。TSS和TES分别是转录起始位点和终止位点。

(B)基因组***位点频率与基因转录状态之间的相关性。基于其增长的表达水平(从左到右)，将活化的T细胞的基因聚类成10个相同大小的组。虚线表示标准化为1的预期随机***频率。SB(黑色)的趋势线使用线性设置进行拟合。指数设置用于拟合LV数据集的前9个数据点的趋势线(图中显示R平方值)。***频率在最活跃基因组中的增加并不遵循指数增加的趋势。

(C)SB和LV在T细胞基因组安全港中的整合频率。基因组安全港是人类染色体中同时满足以下5个x轴标准的区域：不是超保守的，距离miRNA基因超过300kb，距离转录起始位点(TSS)超过50kb，距离癌症相关的基因超过300kb，和外部转录单位。左图显示了满足各个标准的SB、LV和随机***的百分比。右图显示了符合所有5个标准的***百分比。

图8为使用MC和质粒编码的SB转座酶和转座子转导eGFP。

(A)用1μg的编码eGFP和SB100X(P-P)的常规质粒或相应的等摩尔量的MC(MC-MC)分别转染CD8+ T细胞。通过流式细胞术评估eGFP的表达量。数据代表三个独立实验的平均值±SD，p<0.001。

(B)转染后第28天通过流式细胞术评估eGFP表达的稳定性。图中显示了在三个独立实验中获得的数据的平均值±SD。

(C)通过7-AAD染色和流式细胞术分析评估转染后48小时的T细胞的活力。数据代表三个独立实验的平均值±SD。使用Student t检验进行统计学分析，p<0.05。

图9为CD4⁺T细胞中的MC SB转座。

用1μg的编码CD19-CAR转座子和SB100X转座酶(P-P)的常规质粒或相应的MC(MC-MC，使用等摩尔量的DNA)分别转染CD4+T细胞(n＝3)。图中显示了第14天EGFRt表达的具有代表性的流式细胞术散点图(门控基于活细胞，即7-AAD阴性的细胞)。

图10为CD8⁺初始T细胞和记忆T细胞亚群中的MC SB转座。

对CD8⁺初始T细胞(CD45RA⁺RO^-62L⁺，T_N)、中枢记忆T细胞(CD45RA^-RO⁺62L⁺，T_CM)和效应记忆T细胞(CD45RA^-RO⁺62L⁺，T_EM)进行纯化，并用SB100X mRNA和CD19-CAR MC进行转染。流式细胞术的散点图显示了转染后第14天的EGFRt的表达量(门控基于活细胞，即7-AAD阴性的细胞)。

图11为T细胞中SB和LV***位点周围的染色体DNA的核苷酸组成。

每个数据的点代表T细胞中SB和LV***位点周围的染色体DNA中5个核苷酸区的平均TA含量。图中描述的是20kbp(A，B)和2.6kbp(C，D)的分析窗口。随机数据集描述了10.000个计算机生成的人类染色体任意基因座周围的TA含量。

图12为人T细胞染色体上SB靶位点的基本组成。

表格中显示了58个核苷酸长的核苷酸频率矩阵，“V”-数字表示连续的核苷酸。三角形表示***位点。表格反映了每种核苷酸相对于四种核苷酸A、C、G和T的相对频率(百分比)。

图13为在T细胞的转录活性和抑制染色质中SB和LV***位点的示意图。

RNA聚合酶II(PolII)覆盖的染色体区域或具有特定组蛋白修饰(在x轴上列出)的染色体区域根据由活化的人T细胞获取的可用数据集来确定。图中Y轴上显示了与随机对照(虚线)相比，ChIP-Seq峰中整合位置表示中的倍数变化。

图14为转染后第14天的EGFRt表达量的流式细胞分析。对导入了SB100X mRNA和CD19-CAR MC的非活化T细胞(A)或未激活的模拟转染的T细胞(B)进行基因转移。

图15为转染后第14天的EGFRt表达量的流式细胞分析。(A)对导入了SB100X mRNA和CD19-CAR MC的非活化T细胞进行基因转移，并使用CD19⁺EBV-LCL进行扩增。(B)在标准的4小时细胞毒性测定中分析针对CD19⁺靶细胞的细胞溶解活性。

图16为转染后第14天的EGFRt表达量的流式细胞分析。(A)对导入了SB100X mRNA和CD19-CAR MC的非活化T细胞进行基因转移，转染后维持在无抗原依赖性扩增的T细胞培养基中。(B)在标准的4小时细胞毒性测定中分析针对CD19⁺靶细胞的细胞溶解活性。

图17为转染后第14天的EGFRt表达量的流式细胞分析。对非活化的CD4⁺T细胞(A)和导入了SB100X MC和CD19-CAR MC(1:1比例)的非活化的CD8+T细胞(B)进行基因转移(左侧散点图)或进行假性转染(右侧散点图)。(C)在标准的4小时细胞毒性测定中分析针对CD19⁺靶细胞的CD8⁺CD19 CAR T细胞溶解活性。

图18为转染后第14天的EGFRt表达量的流式细胞分析。使用Agile Pulse MAX***用电穿孔将SB100X MC和CD19-CAR MC(1：1比率)导入CD8⁺T细胞中进行基因转移。

图19为SB100X和CD19-CAR MC DNA的滴定以及与产生的CD19-CAR转座子拷贝数的相关性。(A-B)在将滴定含量的编码SB100X的MC和编码CD19-CAR的MC转染到CD8⁺T细胞后的第14天，EGFRt表达量的流式细胞分析。(A)一个代表性实验的流式细胞散点图。(B)EGFRt+T细胞的百分比(左图)和EGFRt标记染色后的平均荧光强度(右图)。数据代表来自不同供体的T细胞的n＝2次独立实验的平均值±SD。(C)FACS纯化多克隆EGFRt⁺CD8⁺T细胞，并通过微滴式数字PCR分离用于转座子拷贝数分析的基因组DNA。数据显示了平均转座子拷贝数并且为来自不同供体的T细胞的n＝2次独立实验的平均值±SD。

图20为(A)在转染SB100X MC和CD19-CAR MC后第9天，在Vγ9Vδ2γδT细胞中EGFRt表达量的流式细胞分析。(B)用CD19+EBV-LCL刺激后Vγ9Vδ2γδT细胞中EGFRt表达量的流式细胞分析。(C)在标准的4小时细胞毒性测定中分析CD19-CAR修饰的和模拟转导的Vγ9Vδ2γδT细胞针对CD19⁺靶细胞的细胞溶解活性。(D)用CD19⁺靶细胞刺激后，CD19-CAR修饰的和模拟转导的Vγ9Vδ2γδT细胞通过在20小时共培养后除去的上清液中利用ELISA分析其分泌的细胞因子。

图21为在将SB100X MC和CD19-CAR MC转染到大部分PBMC后第9天的EGFRt表达量的流式细胞分析。在Vγ9Vδ2γδT细胞(CD3+Vγ9Vδ2+)、NKT细胞(CD3+，CD56+)和NK细胞(CD3-，CD56+)上的EGFRt表达。

具体实施方式

实施例1：使用具有mRNA编码的超活跃睡美人转座酶100X(SB100X)和微环DNA编码的eGFP或CD19-CAR转基因进行睡美人介导的转座来制备CAR修饰的人CD8+和CD4+ T细胞。

材料和方法：

人类受试者

从参加由维尔茨堡大学的机构审查委员会(Würzburg，UKW)批准的研究方案，并提供书面知情同意书的健康捐献者获取血液样本。并用葡聚糖-泛影葡胺(Sigma，St.Louis，MO)离心法分离外周血单核细胞(PBMC)。

细胞系

293T细胞用补充有10％胎牛血清和100U/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基进行培养(ATCC：CRL-11268，美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州)。K562(ATCC:CCL-243)、K562/ROR1、K562/CD19、Raji(ATCC：CCL-86)、JeKo-1(ATCC：CRL-3006)和JeKo-1-ffluc细胞用补充有10％胎牛血清和100U/ml青霉素/链霉素的RPMI1640培养基进行培养(全部细胞培养基和补充品购于：GIBCO，Carlsbad，CA)。

免疫分型

将PBMC细胞系和T细胞系用下列一种或多种缀合的单克隆抗体进行染色：CD3、CD4、CD8、CD25、CD45、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69和相应的同种型对照(BD Biosciences，San Jose，CA)。将转导的T细胞系用生物素缀合的抗EGFR抗体(ImClone SystemsIncorporated，Branchburg，NJ)和链霉亲和素-PE(BD Biosciences，San Jose，CA)进行染色(参照参考文献27)。按照制造商的指示，使用7-AAD(BD Biosciences)染色对活细胞/死细胞进行鉴别。在FACSCanto上进行流式分析，在FACSAriaII(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)上进行分选-纯化并使用FlowJo软件(Treestar，Ashland，OR)分析数据。

慢病毒载体的构建，慢病毒的制备和CAR-T细胞的产生

包含CD19特异性CAR的epHIV7慢病毒载体的构建已有记载，其中所述CAR具有一个短的间隔子和一个4-1BB共刺激结构域(Hudecek Clin Cancer Res 2013)。所有CAR构建体在CAR的下游编码一个截短的表皮生长因子受体(EGFRt；也称为tEGFR)序列(Wang Blood2011)。基因通过T2A核糖体跳跃元件进行连接。

使用Calphos磷酸钙转染试剂(Clontech，Mountain View，CA)将各自的慢病毒载体质粒和包装载体pCHGP-2pCMV-Rev2和pCMV-G共转染至293T细胞中以产生CAR/EGFRt和ffluc/eGFP编码的慢病毒上清液。转染后16小时更换培养基，在24小时、48小时和72小时后收集慢病毒。如所述现有技术产生CAR-T细胞(Hudecek Clin Cancer Res 2013)。简而言之，从健康供体的PBMC中分选出CD8+大批T细胞、CD8+T_CM和CD4+大批T细胞，用抗CD3/CD28珠子(Life Technologies)进行活化，并用慢病毒上清液进行转导。在第1天通过spinoculation进行慢病毒转导，并将T细胞在含有10％人血清、谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素和50U/mL IL-2的RPMI-1640中进行增殖。利用台盼蓝染色来定量存活的T细胞。扩增后，富集EGFRt⁺T细胞被并用被辐射后的B-LCL刺激细胞。

转座子载体的构建

转座子载体pT2/HB(Addgen#26557)购买于Addgene。为了获得编码增强型绿色荧光蛋白(pT2/HB:eGFP)的转座子载体，一种经过密码子优化的基因使用商业供应商(GeneArt，Regensburg)合成和通过HindIII和BamHI限制性位点亚克隆至pT2/HB中，所述基因编码一个HindIII限制性位点、一个EF1/HTLV杂合启动子、一个Kozak序列上游的NheI限制性位点和一个编码增强型GFP(eGFP)的序列、再然后是终止密码子、以及NotI和BamHI限制性位点。为了获得编码CD19特异性CAR(pT2/HB:CD19-CAR)的转座子载体，通过对慢病毒载体进行限制性消化获得上述CD19-CAR_tEGFR基因(部分：慢病毒载体的构建)，并利用NheI和NotI限制性位点将其亚克隆到pT2/HB:eGFP中，以替换eGFP转基因。编码超超活跃睡美人100X(SB100X)转座酶的载体购买于Addgene(Addgene#34879：pCMV(CAT)T7-SB100)。

DNA微环和SB100X mRNA的制备

DNA微环由Plasmid Factory(Bielefeld)公司使用其专有方案制备：i)pT2/HB:eGFP→MC-GFP；ii)pT2/HB:CD19-CAR→MC-CD19 CAR；和iii)pCMV(CAT)T7-SB100→MC-SB100X。微环利用亲和层析进行纯化。SB100X mRNA由EUFETS(Idar-Oberstein)公司根据标准方案利用体外转录(IVT)制备，或使用mMessage mMachine试剂盒(Ambion)自行制备。

通过SB转座产生表达GFP和CAR的T细胞

从健康供体的PBMC中分选出CD8+大批T细胞、CD8+T_CM和CD4+大批T细胞，并用抗CD3/CD28珠子(Life Technologies)活化细胞，接着根据制造商的说明书(Lonza，)，在一个含有质粒DNA、微环DNA和/或mRNA的核转染缓冲液/补充物的4D核转染装置中，使用针对活化的人T淋巴细胞优化的方案对细胞进行核转染。在T细胞培养基(RPMI/10％人血清/谷氨酰胺/青霉素-链霉素)中维持T细胞并使其增殖。在核转染后定期进行表型分析，以确定表达的导入转基因的T细胞的比例。使用台盼蓝染色进行细胞计数，以确定核转染后以及扩增期间不同时间点的细胞培养物中活细胞的数量。

细胞毒性、细胞因子分泌和CFSE增殖测定

将稳定表达萤火虫萤光素酶的靶细胞以5×10³个细胞/孔与效应T细胞以不同的效应物与靶细胞(E:T)的比率进行孵育，每个比率孵育三个复孔。孵育4小时后，将荧光素底物加入到共培养物中，并且使用光度计(Tecan)检测相比于只有靶细胞的孔，同时含有靶细胞和T细胞的孔中的发光信号的减少值。使用标准公式计算其中特异性的裂解(参见参考文献31)。为了分析细胞因子的分泌，将50×10³个T细胞和靶细胞以1:1(K562/CD64)、2:1(Raji)或4:1(K562/CD19和K562)的比例铺板于三个复孔中，通过多重细胞因子免疫测定法(Luminex)或ELISA(Biolegend)检测在温育24小时后取出的上清液中的IFN-γ、TNF-α和IL-2。为了分析其增殖能力，用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记50×10³个T细胞，洗涤后与靶细胞以2:1(Raji)或4:1(K562/CD19，K562/ROR1和K562)在没有外源细胞因子的CTL培养基中铺板于三个复孔中。孵育72小时后，用抗CD3或抗CD4或抗CD8单克隆抗体和7-AAD标记细胞以排除分析死细胞的可能。通过流式细胞技术分析样品，并通过CFSE稀释评估活的T细胞的细胞***。使用FlowJo软件计算其增殖指数。

T细胞在NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠中的过继转移

所有小鼠实验均经过UKW机构动物护理和使用委员会批准。6-8周龄的雌性NSG小鼠购买于查尔斯河实验室或自行繁殖。在第0天通过尾静脉注射给将5×10⁵个表达萤火虫荧光素酶的Raji肿瘤细胞接种至6-8周龄的雌性NSG小鼠中。在第7天，小鼠数量n＝5的组通过静脉注射方式注射5×10⁶个CAR-修饰的T细胞或未修饰的对照T细胞(含有等比例的CD8+和CD4+ T细胞)。通过生物发光成像以确定肿瘤的负荷和分布，并进行Kaplan-Meier分析以检测小鼠的存活。

T细胞克隆中转座子***的拷贝数测定

在SB100X mRNA和CD19-CAR MC转染到T细胞至少一个月后，进行有限稀释制备T细胞克隆，并用FspBI和DpnI限制酶消化它们的基因组DNA。进行两步法巢式PCR(详见下文)，并通过凝胶电泳分析PCR产物。

更具体地说，在将SB100X mRNA和MC转座子转染到EGFRt+T细胞少一个月后，从得到的EGFRt+ T细胞克隆分离出基因组DNA。每个克隆的1μg DNA用FspBI(Thermo)和DpnI(NEB)进行消化。后者的消化被应用于亲本MC片段上，否则可能会干扰拷贝数的测定。对消化后的DNA进行柱纯化，并用20μl洗脱。将5μl洗脱液与50pmol的FspBI突出端特异性的接头在16℃过夜连接。该接头通过在10mM Tris-ClpH8、50mM NaCl、0.5mM EDTA中100-100pmol的寡核苷酸L(+)和L(-)FspBI进行退火产生。使用1μl连接产物作为模板，和引物连接子(对连接接头具有特异性)以及T-Bal-rev(对转座子的5'端反向重复序列具有特异性)一起进行第一次PCR反应，反应条件如下：94℃3分钟；10个循环：94℃30秒，梯度变化至63℃(1℃/秒)，30秒，72℃1分钟；25个循环：94℃30秒，梯度变化至61℃(1℃/秒)30秒，72℃1分钟；72℃10分钟。使用1μl经过100倍稀释的PCR反应产物，以及引物Nested和T-Bal进行巢式PCR，反应条件如下：94℃3分钟；10个循环：94℃30秒，梯度变化至65℃(1℃/秒)，30秒，72℃1分钟；25个循环：94℃30秒，梯度变化至63℃(1℃/秒)30秒，72℃1分钟；72℃10分钟。将5μl巢式PCR反应的产物上样到1％琼脂糖凝胶上以显现出条带，这些条带对应于具有侧翼基因组DNA的***位点。

SB***文库的构建和测序

从n＝3个供体的CD8+ CAR T细胞系中分离出基因组DNA，使用超声波仪进行剪切，通过三步法PCR扩增每个整合位点周围的基因组区域(详见下文)。将PCR终产物上样至1％琼脂糖凝胶上进行电泳，将其中的200-500bp染色条带进行纯化并测序(IlluminaHiSeq，BeckmanCoulter Genomics)。

更具体地说，在转染至少一个月后，分离三个供体的CD8⁺EGFRt⁺T细胞的基因组DNA。其中2μg DNA使用Covaris M220超声波仪装置进行剪切，使得其平均片段大小为600bp，体积为50μl并装在Screw-Cap microTUBE中，剪切装置使用以下设置：峰值入射功率为50W，负载比为20％，每次脉冲的循环次数为200，处理28秒。按照制造商的操作建议，将1.2μg剪切后的DNA使用NEBNext End Repair Module(NEB)进行平端化和5'端磷酸化，并使用NEBNext dA-Tailing Module(NEB)加3'端A-尾巴结构。用Clean and Concentrator Kit试剂盒(Zymo)纯化DNA，并在8μl 10mM Tris pH8(EB)中将其洗脱，再加入50pmol T-接头(见下文)和T4连接酶(NEB)，保持总体积为20μl体积，在16℃过夜连接。T-接头通过在10mMTris-Cl pH8、50mM NaCl、0.5mM EDTA中100-100pmol的寡核苷酸Linker_TruSeq_T+和Linker_TruSeq_T-进行退火产生。在热灭活后，将包含未整合的转座子供体质粒DNA片段的连接产物用50μl DpnI(NEB)消化3小时，并将DNA进行柱纯化并用20μl EB中洗脱。将6μl洗脱液用于PCR I，并分别加入25pmol对接头具有特异的引物和对转座子反向重复序列具有特异性的引物：Linker和T-Bal-Long，反应条件为：98℃30秒；10个循环：98℃10秒，72℃30秒；15个循环：98℃10秒，梯度变化至62℃(1℃/秒)30秒，72℃30秒，72℃5分钟。所有的PCR反应均在NEBNext High-Fidelity 2×PCR Master Mix上进行(PCR引物序列参见下表)。将PCR产物进行柱纯化，用20μl EB洗脱，并将其中10μl用于PCR II，引物为Nested和LAM-SB-50，反应程序如下：98℃30s；12个循环：98℃10秒，梯度变化至65℃(1℃/秒)30秒，72℃30秒，72℃5分钟。柱纯化的PCR II的三分之一产物用于PCR III，并加入引物PE-nest-ind-N和SB-20-bc-ill-N(其中N是Illumina TrueSeq的索引编号，用于对不同T细胞供体的样品进行条形码编码，以便在Illumina测序后追踪它们)使用以下PCR程序对不同T细胞供体的样品进行条形码化：98℃30秒；12个循环：98℃10秒，梯度变化至64℃(1℃/秒)30秒，72℃30秒，72℃5分钟。PCR终产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，将200-500bp的染色条带从凝胶分离并进行纯化。使用单末端100核苷酸测序设置在贝克曼库尔特基因组公司(BeckmanCoulter Genomics)的Illumina HiSeq仪器上对文库进行测序。

生物信息学分析

对每个供体利用条形码进行读数分配，使用R software(参考文献51)中的Shortread工具进行修剪，并且一旦五分之二的核苷酸的phred评分小于20时，就会对其余序列进行质量修整。所读到的片段用Bowtie(参考文献52)进行组装使其唯一地映射到hg19人类基因组。任何SB***位点如果至少有10个独立读出片段的支持，其都被认为是有效的。使用R软件中的SeqLogo工具计算SB***位点的核苷酸组成并进行绘图。

我们使用BEDtools v2.17.0(参考文献53)用于注释***位点或在注释的人类基因组特征(http://genome.ucsc.edu)中的一组计算机生成的10,000个随机基因组位点。该组癌症相关基因来源于http://www.bushmanlab.org/links/genelists(参考文献39)。通过从hg19基因组组装体的染色体长度中减去所有注释的转录物的坐标来创建非基因类别。为了使SB和HIV的***位点频率与基因表达水平相关联，发明人使用了公开的活化的人T细胞的基因表达数据(参考文献37)。

在活化的人T细胞上获得的ChIP-Seq数据的BED文件可从http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lmi/epigenomes/hgtcell.aspx(参考文献54)和MACS ChIP-Seq峰值调用算法(参考文献55)“macs14-t*.bed-g hs--nomodel--nolambda--space＝30”抽调。

获得超保守元件的基因组坐标(参考文献56)并下载所有人类的miRNA基因(http://www.mirbase.org/ftp.shtml)。通过将hg19人类基因组组装的所有安全港子类别的所有坐标相交来获得“基因组安全港”坐标。

统计

使用Prism软件(GraphPad)进行统计学分析。p<0.05的结果被认为是具有显著差异的。

结果

使用MC编码的转座酶和转座子进行转座可实现高水平的稳定的基因转移并降低与DNA转染相关的毒性

从一组亲本pT2转座子供体载体以及编码高活性SB100X转座酶的质粒(图1B)中制备MCs，所述载体表达与EGFRt转导标记(参考文献27和28)或eGFP顺式的优化的CD19-CAR。然后，转染到健康供体的CD8⁺T细胞中，比较转座子和转座酶作为MC(MC-MC)或质粒(P-P)递送时可实现的转基因表达的转座率和稳定性。在所有实验中，转染等量的转座子和转座酶载体，和等摩尔量的MC及其相应的质粒。在转染后的所有分析的时间点显示，用MC组合物修饰的T细胞中有显著的更高的转座率。在第14天，CAR修饰的(即EGFRt⁺)T细胞中MC修饰的转座率平均百分比为49.8％，而质粒修饰的仅为12.8％，因此在转染MC编码而非质粒编码的SB100X转座酶和CAR转座子后平均百分比增加了4.4倍(n＝7，p<0.0001)。EGFRt⁺T细胞的百分比在第14天后保持稳定，并且随着时间的推移甚至在静息T细胞中适度增加，这可能是由于CD19-CAR(参考文献33)的内在信号传导(图3B)。选择用于EGFRt并用CD19⁺饲养细胞扩增的T细胞在多次扩增循环中并且在至少再培养6周内显示出稳定的转基因表达。从来自多个供体的含eGFP的CD8⁺T细胞中(图8A，B)以及含CD19-CAR和eGFP两者的CD4⁺T细胞中获得了转座效率类似的数据，证实了目前观察到的MC在介导转座时优于常规质粒(图9)。

质粒DNA电转染后的严重毒性限制了通过SB转座快速制备治疗相关数量的基因修饰的T细胞。发明人发现，除了介导优越的转座之外，MC对T细胞的毒性也较小。转染48小时后，用MC修饰的CD8⁺T细胞中活T细胞的百分比与质粒修饰相比平均高1.4倍(CD19-CAR)和3.2倍(eGFP)(两者：n＝3，p<0.05)(图2D；图3B；图8C)。即使没有抗原依赖性扩增，由于MC转座速率较高以及毒性较低，在培养14天内可以获得大约6倍高的产量的CD19-CAR T细胞，(n＝4，p<0.05)(图3E)。总体来说，这些数据表明在介导人T细胞的转座中，使用MC作为转座子和转座酶供体载体是可行的、高效的并且优于质粒DNA。

使用mRNA编码的SB转座酶从MC转座

接着，研究提供SB100X作为mRNA而不是MC DNA是否足以完成来自MC转座子供体载体的转座。通过滴定实验来确定SB100X mRNA和MC(1:1，2:1，4:1，8:1)的最佳比例，并在转染后第14天通过流式细胞技术分析EGFRt的表达。在所有比例情况下，mRNA-MC组合比质粒组合的转座速率更高(图2B，C)。当SB100X mRNA和CD19-CAR MC使用4:1的比率时获得的转座速率最高，比质粒组合(P-P)的基因转移速率高3.7倍(n＝3；p<0.001)，与MC组合相比无显著差异(图2B，C)。进一步增加SB100X mRNA的量(8:1比率)会导致转座效力的下降，这可能是由于过量生产造成的抑制效应引起的(参考文献34)。在转染48小时后，SB100X mRNA与MC转座子组合使用存活的T细胞的比例与质粒相比明显更高(高1.4倍；n＝3；p<0.05)。在14天的培养期结束时，这再次转化为显著产量更高的基因修饰的T细胞(平均高3.6倍；n＝4)(图3B)。重要的是，发明人用优化的SB100X mRNA和CD19-CAR MC组合(4:1比率)完成的转座速率在纯化的初始T细胞、中央记忆T细胞和效应记忆CD8⁺T细胞中相似地高(图10)，表明该基因转移策略不会引入这些表型和功能上不同的子集在用CD19-CAR修饰的CD8⁺T细胞群体中的偏倚。总体来说，这些数据表明，作为相对寿命短的mRNA，SB100X足以完成MC转座子供体载体的转座，并且与质粒相比具有优越水平的稳定基因转移和增强的T细胞活力。

在体外和体内MC的转座赋予CD19-CAR T细胞有效的抗肿瘤功能

接着分析通过MC和质粒的SB转座进行CAR修饰的T细胞的功能，并将它们的效力与通过LV转导并用相同CD19-CAR构建体修饰的T细胞进行比较。从n＝3个供体中制备CAR-修饰的和对照的未转导的CD8⁺和CD4⁺T细胞系的组，并且使用EGFRt标记将表达CAR的T细胞富集至纯度>90％(图4A)。首先，使用稳定表达CD19的K562细胞和Raji以及JeKo-1淋巴瘤作为靶细胞以评估细胞溶解活性。通过mRNA-MC、MC-MC和P-P转座修饰的各种CD8⁺CD19-CAR T细胞系被赋予类似的有效的和特异性的裂解，其水平与观察到的通过LV转导产生的CAR T细胞的水平相当(图4B)。与CD19⁺淋巴瘤共培养后的细胞因子定量分析也显示出，在所有的CD8⁺和CD4⁺CD19-CART细胞系中IFN-γ和IL-2的产量相当(图4C)。此外，通过CFSE稀释，在所有CD8⁺和CD4⁺CD19-CAR T细胞系中发现有类似的生产性增殖(在72小时内≥3次细胞***)，无论其是否已通过SB转座或LV转导进行了基因修饰(图4D，E)。

接着在***性CD19⁺淋巴瘤异种移植模型(NSG/Raji-ffLuc)中分析抗肿瘤功效，并且分析集中在用SB100X mRNA和CD19-CAR MC修饰的CAR T细胞上，因为这将是最与临床转化相关的组合。该实验证实了由单剂量SB修饰的CD8⁺和CD4⁺CD19-CAR T细胞介导的有效抗肿瘤作用，导致所有处理的小鼠中(分别n＝5或n＝4)快速地根除淋巴瘤，而接受对照T细胞的小鼠显示出进行性的有害淋巴瘤(图5A，B)。在反应高峰时在外周血中能够检测到经过SB修饰的CAR T细胞，并在清除淋巴瘤后持续存在于所有小鼠的骨髓中(图5D)。流式细胞技术证实了骨髓中淋巴瘤被完全消除(图5E)。Kaplan-Meier分析显示，在观察期结束时整个SB CD19-CAR治疗组的小鼠存活率与用于比较的LV转导的CD19-CAR T细胞治疗的小鼠存活率相当(图5C)。总体来说，这些数据表明，通过MC转座子供体载体的SB转座产生的CD19-CART细胞在体外和体内都高度有效，并且介导与由LV转导产生的CD19-CAR T细胞同样有效的抗肿瘤应答。

转座子***位点分析揭示了一种接近随机的基因组整合模式

为了解决与安全性相关的问题，用SB100X mRNA和CD19-CAR MC修饰的T细胞制备用于基因拷贝数和***位点分析的基因组DNA。通过有限稀释获得的CD8⁺T细胞克隆中有平均n＝5(分别为3-8和3-11范围)个CD19-CAR转座子拷贝，以及CD4⁺T细胞克隆中有平均n＝6(范围3-12)个转座子拷贝(图6B，C)。接着构建来自多克隆CD8⁺CD19-CAR T细胞的***位点文库，用于Illumina MySeq平台上的大规模平行测序。对MC衍生的CAR转座子的26,834个特异的***位点进行了绘制和表征。人类CD4⁺T细胞中LV整合位点的数据库作为参考并用于比较(参考文献35)。转座子***位点周围20k bp窗口中的核苷酸频率分析显示，来自MC的转座发生在接近随机核苷酸频率的区域，而LV***偏向于富含GC的染色体片段(图11A，B)。然而，在***位点周围的较小的1.5k bp窗口中，两种载体***均表现出对富含AT的DNA的偏好(图11C，D)。检测到回文的ATATATAT基序，其含有与所有本发明的MC衍生的转座子相邻的SB的TA二核苷酸靶序列，类似于已被发现的从常规供体质粒中转座的转座子(参考文献36)。(图12)。

接着分析CD19-CAR转座子***到基因组的不同位点，例如外显子和内含子、基因和癌症相关基因中是否有偏好性。研究发现，来自MC的转座仅对基因类别有着适度但具有统计学显著性(p<0.001)的偏好；然而，在所有评估的类别中，这种偏好远小于LV整合中发现的偏好(图7A)。重要的是，相对于预期的随机频率，转座子***仅显示1.15倍的基因富集和1.29倍的癌症相关基因富集，而在这些类别中LV相关的***分别是2.11倍富集和2.64倍富集(p<0.01和p<0.05)。一致地，CD19-CAR转座子也以接近随机的方式***非基因区域(相对于随机而言是0.89倍)，而LV转基因在这些区域中随机的代表性不足(相对于随机而言是0.23倍)(图.7A)。

此外还确定了基因内转座子***频率与基因表达水平之间是否存在关联。使用活化的人类T细胞的可用转录组文件(参考文献37)，根据其表达水平将基因分类为10个规模相等的组，并计数每组中的转座子和LV***。数据显示，MC衍生的转座子以接近随机的方式整合到低表达和高表达的基因中，并且仅表现出微小的对高表达基因的偏好(图7B)。相反，LV表现出整合至高表达基因的强烈偏好，并且***频率与各基因表达水平之间呈指数关系(R² 0.976)(图7B)。发明人还发现，在具有H3K36-和H3K79-三甲基化和RNA聚合酶II标签的染色体区域中有LV***的高度富集，所有这些标记都是高表达基因的染色质标记。LV***在由H4K20-，H3K27-和H3K9-三甲基化表示的转录失活和异染色体片段中的代表性不足(图13)。相反地，转座子***仅显示出对活性转录标记物的轻微亲和性，同样有利于整合到转录沉默的染色质结构域中(图13)。总体来说，这些数据显示了从MC调动的SB转座子在人类T细胞的基因组中显示出近乎随机的整合模式，且与LV相反，其不具有对高表达或转录活性基因的偏好。

从MC调动的CD19-CAR转座子被有效地整合到基因组安全港中

理想情况下，转座会发生在基因组区域，其中CAR转基因的***不会影响基因修饰T细胞的转录完整性。因此，已经建立应用标准来定义这种基因组安全港(GSH)(参考文献38和39)到我们的MC修饰的CD19-CAR T细胞的***位点文库，并将它们与LV***位点数据集进行比较。基因组中计算机产生的随机位置以28％的频率映射到GSH。其中发现有20.8％的CD19-CAR转座子***位点但只有3％的LV整合位点满足所有5个GSH标准(图7C)。特别地是，与LV相比，有明显很高比例的转座子***位点位于距离癌症相关的基因(59％比38％)和外部基因(48％比12％)超过300k bp，这构成了两个最重要的标准(图7C)。在本发明的分析中，在已知的癌基因(参考文献39)中没有发生SB转座子和LV***，并且在仅构成基因组的一小部分的超保守基因组区域中没有发生SB转座子和LV***。总之，发明人证明了功能性重组哺乳动物细胞如CAR T细胞可以通过例如来自MC DNA的SB介导的转座产生。MC衍生的转座子具有非常有利的基因组整合概况。

因此，根据本发明内容，本发明增强的转座策略提供了一种优于已知病毒基因转移如基于LV的基因转移的安全优势。

实施例2：在未活化的T细胞中用mRNA编码的超活跃睡美人转座酶100X(SB100X)和微环DNA编码的CD19-CAR转基因进行睡美人介导的转座

材料和方法：

人类受试者

从参加由维尔茨堡大学的机构审查委员会批准的研究方案，并提供书面知情同意书的健康捐献者获取外周血。

转座子和慢病毒载体的构建

合成具有EF1/HTLV杂交启动子、Kozak和eGFP序列，然后是终止密码子的基因盒(GeneArt)，并亚克隆到pT2/HB转座子供体载体(Addgene，#26557)中。然后，将eGFP替换为编码CD19-CAR(FMC63靶向结构域，IgG4-Fc铰链间隔区，CD3ζ和4-1BB共刺激)的基因，其顺式于T2A元件和衍生自前述的慢病毒载体epHIV7(参考文献27和28)的截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。pCMV(CAT)T7-SB100X载体购于Addgene(#34879)。

微环DNA和SB100X mRNA的制备

由PlasmidFactory(Bielefeld)公司利用位点特异性重组技术，从亲本pT2质粒产生编码eGFP和CD19-CAR_EGFRt转座子的MC以及SB100X，并通过亲和层析对其进行纯化。使用mMessage mMachine试剂盒(Ambion)内部制备或在EUFETS(Idar-Oberstein)公司制备聚(A)-尾和ARCA-封端的SB100X mRNA。

基因修饰的T细胞的产生和体外分析

通过聚蔗糖-泛影葡胺离心法从外周血中获得外周血单核细胞。使用免疫磁珠(Miltenyi)阴性分选从PBMC中纯化出CD8⁺和CD4⁺T细胞。SB100X转座酶mRNA和CD19-CAR编码的MC(重量比4:1)的转染或者在分选后立即进行，或者在含有10％人血清、谷氨酸盐、100U/mL青霉素-链霉素(T细胞培养基)和50U/mL IL-2的RPMI-1640中过夜培养后进行。根据制造商的说明(Lonza)，在4D-Nucleofector上进行1×10⁶个T细胞的转染。转染后，将T细胞在补充有50U/mL IL-2的T细胞培养基中进行增殖。通过台盼蓝染色定量活的T细胞。T细胞用以下缀合的单克隆抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L和用于活/死细胞鉴别的7-AAD(BD Biosciences)。通过用生物素缀合的抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.)和链霉亲和素-PE染色来检测CAR⁺(即EGFRt⁺)T细胞。在FACSCanto(BD)上进行流式细胞分析，并使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。在一些实验中，在功能测试之前，将T细胞用照射的CD19⁺饲养细胞扩增7天，并按照参考文献29-31所述进行功能分析。

细胞毒性、细胞因子分泌和CFSE增殖测定

将表达萤火虫萤光素酶的靶细胞以5×10³个细胞/孔与效应T细胞以不同的效应物与靶细胞(E:T)的比率进行孵育，每组实验进行三次重复。孵育4小时后，将荧光素底物加入到共培养物中，并且使用光度计(Tecan)检测相比于只有靶细胞的孔，同时含有靶细胞和T细胞的孔中的发光信号的减少值。使用标准公式计算其中特异性的裂解。为了分析细胞因子的分泌，将50×10³个T细胞和靶细胞以2:1(Raji和Jeko-1)或4:1(K562/CD19和K562)的比例铺板于三个复孔中，通过ELISA(Biolegend)检测在温育24小时后取出的上清液中的IFN-γ和IL-2产量。为了分析其增殖能力，用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记50×10³个T细胞，洗涤后与靶细胞以4:1(K562/CD19和K562)在没有外源细胞因子的培养基中铺板于三个复孔中。孵育72小时后，用抗CD8/CD4单克隆抗体和7-AAD标记细胞以排除分析死细胞的可能。通过流式细胞技术分析样品，并通过CFSE稀释评估活的T细胞的细胞***。使用FlowJo软件计算其增殖指数。

结果：

从PBMC中分离出CD8⁺T细胞，并用编码SB100X的mRNA和编码CD19-CAR的MC(重量比为4:1)进行转染。转染后，在重组IL-2(50U/ml)的存在下，将T细胞在T细胞培养基中静置过夜。然后用照射过的CD19⁺Raji淋巴瘤细胞(效应物:靶细胞比例＝1:7)刺激T细胞并扩增。模拟转染对照组的T细胞，在重组IL-2(50U/ml)存在下静置过夜，然后用抗CD3/抗CD28珠子(Dynal)刺激并扩增。转染后第14天进行EGFRt表达的流式细胞分析结果表明，在转染了SB100X mRNA和CD19-CAR MC的T细胞(图14A)而非模拟转导的T细胞(图14B)中显示了高比率的稳定的基因转移。功能分析证实了CD19-CAR T细胞的高水平特异性细胞溶解活性、细胞因子分泌(IFN-g、IL-2、TNF-α)和特异性生产性增殖。

在另一个实验中，在转染后，用经照射的CD19⁺TM EBV-LCL(EB病毒转化的类淋巴母细胞系)代替Raji淋巴瘤细胞(效应物:靶细胞比例＝1:7)刺激CD8⁺T细胞并进行扩增。核转染后第14天进行的EGFRt表达的流式细胞分析显示出高比率的稳定的CD19-CAR基因转移(图15A)。功能分析证实在用CD19+靶细胞刺激后，CD19-CAR T细胞对CD19⁺靶细胞具有高水平的特异性细胞溶解活性(图15B)、生产细胞因子以及进行了生产性增殖。

在另一个实验中，在转染后，在补充了50U/mL IL-2的T细胞培养基中维持CD8⁺T细胞。核转染后第14天进行的EGFRt表达的流式细胞分析显示出高比率的稳定的CD19-CAR基因转移(图16A)。功能分析证实在用CD19⁺靶细胞刺激后，CD19-CAR T细胞表现出高水平特异性细胞溶解活性(图16B)、细胞因子分泌(IFN-γ、IL-2、TNF-α)以及特异性生产性增殖。

实施例3：在未活化的T细胞中用微环DNA编码的超活跃睡美人转座酶100X(SB100X)和微环DNA编码的CD19-CAR转基因进行睡美人介导的转座

材料和方法：

人类受试者

转座子和慢病毒载体的构建

微环DNA和SB100X mRNA的制备

由PlasmidFactory(Bielefeld)公司利用位点特异性重组技术从亲本pT2质粒产生编码eGFP和CD19-CAR_EGFRt转座子的MC以及SB100X，并通过亲和层析对其进行纯化。

基因修饰的T细胞的产生和体外分析

通过聚蔗糖-泛影葡胺离心法从外周血中获得外周血单核细胞。使用免疫磁珠(Miltenyi)阴性分选从PBMC中纯化出CD8⁺和CD4⁺T细胞。转座酶和转座子供体MC载体的转染或者在分选后立即进行，或者在含有10％人血清、谷氨酸盐、100U/mL青霉素-链霉素和50U/mL IL-2的RPMI-1640中过夜培养后进行。根据制造商的说明(Lonza)，在4D-Nucleofector上进行1×10⁶个T细胞的转染。转染后，将T细胞含有10％人血清、谷氨酸盐、100U/mL青霉素-链霉素和50U/mL IL-2的RPMI-1640中进行增殖。通过台盼蓝染色定量活的T细胞。T细胞用以下缀合的单克隆抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L和用于活/死细胞鉴别的7-AAD(BD Biosciences)。通过用生物素缀合的抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.)和链霉亲和素-PE染色来检测CAR⁺(即EGFRt⁺)T细胞。在FACSCanto(BD)上进行流式细胞分析，并使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。在一些实验中，在功能测试之前，将T细胞用照射的CD19⁺饲养细胞扩增7天，并按照参考文献29-31所述进行功能分析。

细胞毒性、细胞因子分泌和CFSE增殖测定

将表达萤火虫萤光素酶的靶细胞以5×10³个细胞/孔与效应T细胞以不同的效应物与靶细胞(E:T)的比率进行孵育，每组实验进行三次重复。孵育4小时后，将荧光素底物加入到共培养物中，并且使用光度计(Tecan)检测相比于只有靶细胞的孔，同时含有靶细胞和T细胞的孔中的发光信号的减少值。使用标准公式计算其中特异性的裂解(参考文献2)。为了分析细胞因子的分泌，将50×10³个T细胞和靶细胞以2:1(Raji和Jeko-1)或4:1(K562/CD19和K562)的比例铺板于三个复孔中，通过ELISA(Biolegend)检测在温育24小时后取出的上清液中的IFN-γ和IL-2产量。为了分析其增殖能力，用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记50×10³个T细胞，洗涤后与靶细胞以4:1(K562/CD19和K562)在没有外源细胞因子的培养基中铺板于三个复孔中。孵育72小时后，用抗CD8/CD4单克隆抗体和7-AAD标记细胞以排除分析死细胞的可能。通过流式细胞技术分析样品，并通过CFSE稀释评估活的T细胞的细胞***。使用FlowJo软件计算其增殖指数。

结果：

从PBMC中分离出CD4⁺和CD8⁺T细胞，并用编码SB100X的MC和编码CD19-CAR的MC进行转染(CD4⁺和CD8⁺T细胞分别转染)。转染后，将T细胞在补充有50U/ml IL-2的T细胞培养基中静置过夜。然后用抗CD3/抗CD28珠子刺激T细胞并扩增。模拟转染对照组的T细胞，在补充有50U/ml IL-2的T细胞培养基中静置过夜，然后用抗CD3/抗CD28珠子刺激并扩增。转染后第14天进行EGFRt表达的流式细胞分析，结果显示在转染了SB100X MC和CD19-CAR MC的T细胞而非模拟转染的T细胞中出现了高比率的稳定的基因转移(图17A，B)。在功能实验中，在用CD19⁺靶细胞刺激后，CD19-CAR转导的T细胞被赋予了CD19⁺靶细胞的高水平特异性细胞溶解活性(图17C)、产生细胞因子并进行生产性增殖。

实施例4：使用常规电穿孔仪在T细胞中用微环DNA编码的超活跃睡美人转座酶100X(SB100X)和微环DNA编码的CD19-CAR转基因进行睡美人介导的转座

材料和方法：

人类受试者

转座子和慢病毒载体的构建

微环DNA的制备

由PlasmidFactory(Bielefeld)公司利用位点特异性重组技术，从亲本pT2质粒产生编码eGFP和CD19-CAR_EGFRt转座子的MC以及SB100X，并通过亲和层析对其进行纯化。

基因修饰的T细胞的产生和体外分析

通过聚蔗糖-泛影葡胺离心法从外周血中获得外周血单核细胞。使用免疫磁珠(Miltenyi)阴性分选从PBMC中纯化出CD8⁺T细胞。用抗CD3/抗CD28珠子(Dynal)活化T细胞2天。根据制造商的说明(BTX)，使用Agile Pulse MAX***进行转座子和转座酶MC载体的转染。电穿孔后，将T细胞维持在补充有50U/ml IL-2的T细胞培养基中过夜，然后用抗CD3/抗CD28珠子(Dynal)进行刺激。通过台盼蓝染色定量活的T细胞。T细胞用以下缀合的单克隆抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L和用于活/死细胞鉴别的7-AAD(BDBiosciences)。通过用生物素缀合的抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.)和链霉亲和素-PE染色来检测CAR⁺(即EGFRt⁺)T细胞。电穿孔后第14天，在FACSCanto(BD)上进行流式细胞分析，并使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。

细胞毒性、细胞因子分泌和CFSE增殖测定

将表达萤火虫萤光素酶的靶细胞以5×10³个细胞/孔与效应T细胞以不同的效应物与靶细胞(E:T)的比率进行孵育，每组实验进行三次重复。孵育4小时后，将荧光素底物加入到共培养物中，并且使用光度计(Tecan)检测同时含有靶细胞和T细胞的孔中的发光信号，计算相比于只有靶细胞的孔其发光信号的减少值。使用标准公式计算其中特异性的裂解(参考文献2)。为了分析细胞因子的分泌，将50×10³个T细胞和靶细胞以2:1(Raji和Jeko-1)或4:1(K562/CD19和K562)的比例铺板于三个复孔中，通过ELISA(Biolegend)检测在温育24小时后取出的上清液中的IFN-γ和IL-2产量。为了分析其增殖能力，用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记50×10³个T细胞，洗涤后与靶细胞以4:1(K562/CD19和K562)在没有外源细胞因子的培养基中铺板于三个复孔中。孵育72小时后，用抗CD8/CD4单克隆抗体和7-AAD标记细胞以排除分析死细胞的可能。通过流式细胞技术分析样品，并通过CFSE稀释评估活的T细胞的细胞***。使用FlowJo软件计算其增殖指数。

结果：

从外周血单核细胞中分离出CD8⁺T细胞。在某一实施例中，在4mm比色皿(体积：100μL)中将4μg SB100X编码的MC和4μg CD19-CAR编码的MC(比率1:1)分别通过电穿孔转至3×10⁶和5×10⁶个CD8⁺T细胞中。电穿孔通过使用2个脉冲进行，每个脉冲具有1200V的幅度、0.1毫秒(ms)的脉冲持续时间和0.2ms的脉冲间隔。电穿孔后，将T细胞在补充有IL-2(50U/ml)的T细胞培养基中静置过夜，然后用抗CD3/抗CD28珠子刺激并扩增。模拟转染对照T细胞，在补充有IL-2的培养基中静置过夜，然后用抗CD3/抗CD28珠粒刺激并扩增。转染后第14天进行EGFRt表达的流式细胞分析，结果显示在转染了SB100X MC和CD19-CAR MC的T细胞(图18)，而非模拟转导的T细胞中出现高比率的稳定的基因转移。在功能实验中，在用CD19⁺靶细胞刺激后，CD19-CAR转导的T细胞被赋予了CD19⁺靶细胞的高水平特异性细胞溶解活性(图17C)、产生细胞因子并进行生产性增殖。

实施例5：在睡美人介导的转座后进行T细胞基因组中转座子拷贝数的滴定

材料和方法：

人类受试者

转座子和慢病毒载体的构建

微环DNA的制备

基因修饰的T细胞的产生和体外分析

通过聚蔗糖-泛影葡胺离心法从外周血中获得外周血单核细胞。使用免疫磁珠(Miltenyi)阴性分选从PBMC中纯化出CD8⁺和CD4⁺T细胞，并用抗CD3/抗CD28珠子(Dynal)刺激T细胞。在第2天进行转座酶和转座子微环载体的转染。根据制造商的说明(Lonza)，在4D-Nucleofector上进行1×10⁶个T细胞的转染。核转染后，将T细胞含有10％人血清、谷氨酸盐、100U/mL青霉素-链霉素和50U/mL IL-2的RPMI-1640中进行增殖。通过台盼蓝染色定量活的T细胞。T细胞用以下缀合的单克隆抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L和用于活/死细胞鉴别的7-AAD(BD Biosciences)。通过用生物素缀合的抗EGFR抗体(ImCloneSystems Inc.)和链霉亲和素-PE染色来检测CAR⁺(即EGFRt⁺)T细胞。在FACSCanto(BD)上进行流式细胞分析，并使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。在一些实验中，在功能测试之前，将T细胞用照射的CD19⁺饲养细胞扩增7天，并按照参考文献29-31所述进行功能分析。

微滴式数字PCR

进行微滴式数字PCR(ddPCR)之前，在终体积为30μL的反应体系中，使用3μL NEB3.1缓冲液和1μL仅切割甲基化的、非整合载体的DpnI酶(20,000U/mL)在37℃消化300ng样品。加入1μL CviQI(10,000U/mL)、0.5μL NEB 3.1缓冲液和3.5μL水，使得反应终体积为35μL，在25℃裂解DpnI消化的样品2小时。

为了产生微滴，在室温下将引物(600nM)、探针(200nM)和消化的模板(各17ng)添加到即用的ddPCR超级混合物(Bio-Rad)，使得终体积为25μL。将20μL的PCR混合物加入到DG8柱的特定孔中，然后向每个孔中加入70μL微滴生成油并在室温下孵育2分钟。将孔覆盖后放入QX100微滴发生器中。几分钟后，每孔会产生大约20,000个微滴。将40μL产生的微滴转移至96孔PCR板中，在PX1PCR密封器(Bio-Rad)中用单个密封箔进行密封。在具有2℃/秒升温速率的循环仪中使用以下条件进行PCR反应：95℃10分钟，94℃30秒，40个循环：60℃60秒，98℃10分钟。

通过QX100微滴读取器进行每个微滴的荧光测量，并用核糖核酸酶P/MRP 30亚基(RPP30)作为拷贝数的参考(每个基因组2个拷贝)。使用QuantaSoft软件进行分析。下表是用于微滴式数字PCR拷贝数分析的引物和寡核苷酸：

结果：

使用SB100X编码的MC和CD19-CAR编码的MC进行转染。我们通过滴定转染到T细胞中SB100X MC和CD19-CAR MC载体的量，以确定对T细胞基因组中基因转移率和基因拷贝数(即转座子拷贝数)的影响。我们使用连续稀释的SB100X MC和CD19-CAR MC(2倍连续稀释，SB100X MC DNA的范围从500ng到31ng，CD19-CAR MC DNA的范围从600ng到37.5ng)(图19A)。在转染后第14天，使用EGFRt标志物通过流式细胞技术确定基因修饰的T细胞的百分比(图19B)。我们发现，当转染较高量的MC载体时有较高的基因转移率，并且当转染较低量的MC载体时有较低的基因转移率(图19A，B)。此外我们还发现，当转染较高量的MC载体时，通过流式细胞技术检测表达EGFRt标记物的MFI水平较高，并且当转染较低量的MC载体时，通过流式细胞技术检测表达EGFRt标记物的MFI水平较低(图19A，B)。

然后，使用包括所有EGFRt⁺T细胞(EGFRt的低表达、中表达和高表达)的门控策略使FACS分选的EGFRt⁺T细胞纯度达到90％以上，并使用ddPCR对分离出的基因组DNA进行后续的拷贝数分析。我们发现已转染的MC DNA载体的量与CD19-CAR转座子拷贝数之间存在相关性，即当转染较高量的MC载体时，能够获得较高的转座子拷贝数，而当转染较低量的MC载体时，能够获得较低的转座子拷贝数(图19C)。当转染500ng的SB100X MC DNA和600ng的CD19-CAR MC DNA载体时，T细胞基因组中平均转座子拷贝数为11.3。当转染31ng的SB100XMC DNA和37.5ng的MC-DNA载体的CD19-CAR MC DNA时，T细胞基因组中的平均转座子拷贝数降至2.8(图19C)。

总体而言，这些数据表明可以滴定转染到T细胞中的MC编码的SB100X和MC编码的CD19-CAR的量以获得期望的基因转移率、期望的转基因表达水平和期望的基因拷贝数。这有助于将基因拷贝数(即转座子拷贝数)微调至所需数量——例如，降低基因拷贝数以减少基因组***的数量，从而降低基因毒性和***诱变的风险；增加基因拷贝数以增加转基因表达的水平；降低或增加转基因的表达以获得最佳的功能性输出——例如，降低或增加CAR的表达以获得CAR修饰的T细胞的最佳功能性输出。

实施例6：使用MC转座子将睡美人介导的基因转移至除CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺杀伤T细胞以外的白细胞亚群中

材料和方法：

人类受试者

转座子和慢病毒载体的构建

合成具有EF1/HTLV杂交启动子、Kozak和eGFP序列，然后是终止密码子的基因盒(GeneArt)，并亚克隆到pT2/HB转座子供体载体(Addgene，#26557)中。然后，将eGFP替换为编码CD19-CAR(FMC63靶向结构域，IgG4-Fc铰链间隔区，CD3ζ和4-1BB共刺激)的基因，其顺式于T2A元件和衍生自先前描述的慢病毒载体epHIV7(参考文献27和28)的截短的表皮生长因子受体(EGFRt)。pCMV(CAT)T7-SB100X载体购于Addgene(#34879)。

微环DNA的制备

基因修饰的白细胞的产生和体外分析

通过聚蔗糖-泛影葡胺离心法从外周血中获得外周血单核细胞，将细胞在含有10％人血清、谷氨酸盐、100U/mL青霉素-链霉素的RPMI-1640中过夜培养后，进行转座酶和转座子微环载体的转染，并补充50U/mL IL-2和终浓度为5μM的唑来膦酸盐。根据制造商的说明(Lonza)，在4D-Nucleofector上进行10×10⁶个外周血单核细胞的转染。核转染后，将外周血单核细胞在含有10％人血清、谷氨酸盐、100U/mL青霉素-链霉素、50U/mL IL-2和唑来膦酸盐(终浓度为5μM)的RPMI-1640中进行增殖。在转染后第9天，通过台盼蓝染色定量活的T细胞。T细胞用以下缀合的单克隆抗体染色：Vγ9Vδ2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD45RA、CD45RO、CD56、CD62L和用于活/死细胞鉴别的7-AAD(BD Biosciences)。通过用生物素缀合的抗EGFR抗体(ImClone Systems Inc.)和链霉亲和素-PE染色来检测CAR⁺(即EGFRt⁺)T细胞。在FACSCanto(BD)上进行流式细胞分析，并使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。在一些实验中，在功能测试之前，使用免疫磁珠来分离T细胞并将T细胞用照射的CD19⁺饲养细胞扩增7天，并按照参考文献29-31所述进行功能分析。

结果：

将SB100X MC和CD19-CAR MC转染到大量的外周血单核细胞中。向培养基中添加IL-2以促进T细胞、NKT细胞和NK细胞的增殖。向培养基中添加唑来膦酸盐以促进γδ(gammadelta)T细胞的扩增。在转染后第9天进行EGFRt表达量的流式细胞分析，结果显示出基因高比例稳定地转移至Vγ9Vδ2γδT细胞中(图20A)。然后用CD19+EBV-LCL(EB病毒转化的类淋巴母细胞系)刺激γδT细胞并在补充有IL-2和唑来膦酸盐的T细胞培养基中进行增殖。在增殖循环结束时，进行EGFRt表达量的流式细胞术分析，结果显示γδT细胞表达的CD19-CAR的百分比进一步地增加了(图20B)。在细胞毒性测定和细胞因子分泌测定中，证实了CD19-CAR修饰的γδT细胞对CD19+靶细胞的特异性识别(图20C，D)。在另一实验中，将SB100X MC和CD19-CAR MC转染到大量的外周血单核细胞中，并向培养基中添加IL-2以促进T细胞、NKT细胞和NK细胞的增殖，向培养基中添加唑来膦酸盐以促进γδ(gamma delta)T细胞的扩增。在转染后第9天进行EGFRt表达量的流式细胞分析，结果显示出基因高比率稳定地转移至Vγ9Vδ2γδT细胞(CD3+Vγ9Vδ2+)、NKT细胞(CD3+，CD56+)、NK细胞(CD3-，CD56+)，和B细胞(CD3-，CD19+)(图21)。

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Claims

1.一种应用，所述应用为使用一种编码转座因子的微环DNA以及一种转座酶的来源的组合，以稳定地将转座因子整合到哺乳动物细胞的基因组中。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转座酶的来源是编码所述转座酶的核酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的mRNA、编码所述转座酶的质粒DNA、编码所述转座酶的微环DNA或编码所述转座酶的线性DNA。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的mRNA。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的微环DNA。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的微环DNA和编码所述转座因子的微环DNA是相同的微环DNA。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转座酶的来源是转座酶多肽。

8.如前述权利要求任一项所述的应用，其特征在于，所述转座酶是SB100X。

9.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是哺乳动物淋巴细胞。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。

11.如权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述淋巴细胞是T淋巴细胞。

12.如权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/d T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。

13.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞或CD4+辅助T细胞。

14.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述转座因子包含用于表达T细胞受体或嵌合抗原受体的遗传信息，并且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述T细胞受体或嵌合抗原受体是肿瘤反应性的，并且通过所述应用获得的所述人T淋巴细胞是适用于癌症的过继免疫治疗的肿瘤反应性人T淋巴细胞。

16.如权利要求14或15所述的应用，其特征在于，所述转座因子包含嵌合抗原受体的遗传信息。

17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体、GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38或CD138具有特异性。

18.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，编码所述转座因子的微环DNA编码a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

19.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用是在体外应用。

20.如权利要求2～6或8～19任一项所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸和编码所述转座因子的DNA微环通过电转如电穿孔或核转染、化学转染如磷酸钙、或纳米颗粒导入细胞。

21.如权利要求2～7或9～20任一项所述的应用，其特征在于，介导转座因子转座到基因组的所述转座酶是Sleeping Beauty、PiggyBac、Frog Prince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，或其具有转座活性的衍生物。

22.一种应用，所述应用为使用一种编码包含转基因表达盒的转座因子的DNA以及一种转座酶的来源的组合，以将转座因子稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中；其中，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和/或缺乏抗生素抗性基因。

23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点。

24.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏抗生素抗性基因。

25.如权利要求22～24任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和缺乏抗生素抗性基因。

26.如权利要求22～25任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA可以通过从质粒中删除所述复制起点和/或所述抗生素抗性基因获得，所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

27.一种应用，所述应用为使用一种编码包含转基因表达盒的转座因子的DNA和一种转座酶的来源的组合，以将转座因子稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中；其中，所述编码转座因子的DNA可以通过缩短质粒的至少一个碱基对而获得，并且其中所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

28.如权利要求22～27任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过3.0kb，优选不超过2.0kb。

29.如权利要求22～28任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.5kb。

30.如权利要求22～29任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的所述DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.0kb。

31.如权利要求22～30任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA是权利要求1～21任一项所用的微环DNA。

32.如权利要求22～31任一项所述的应用，其特征在于，所述转基因是如权利要求14～17任一项所定义的T细胞受体或嵌合抗原受体，且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

33.如权利要求22～31任一项所述的应用，其特征在于，所述转基因是a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

34.如权利要求22～33任一项所述的应用，其特征在于，所述应用是在体外应用。

35.如权利要求22～34任一项所述的应用，其特征在于，所述转座酶的来源为如权利要求2～6、8或21中任一项所定义的转座酶的来源。

36.如权利要求22～31和33～35中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞为如权利要求9～14中任一项所定义的哺乳动物细胞。

37.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是原代细胞，优选原代人细胞。

38.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用是非病毒的应用。

39.一种获得包含稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述编码转座酶的核酸为如权利要求3～6、8或21中任一项所定义的编码转座酶的核酸。

41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座酶是SB100X。

42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是哺乳动物淋巴细胞。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。

44.如权利要求42或43所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞是T淋巴细胞。

45.如权利要求39～41任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/d T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。

46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞或CD4+辅助T细胞。

47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座因子包含用于表达T细胞受体或嵌合抗原受体的遗传信息，和所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述T细胞受体或嵌合抗原受体是肿瘤反应性的，并且通过所述方法获得的所述人T淋巴细胞是适用于癌症的过继免疫治疗的肿瘤反应性人T淋巴细胞。

49.如权利要求47或48所述的方法，其特征在于，所述转座因子包含嵌合抗原受体的遗传信息。

50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体、GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38或CD138具有特异性。

51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，编码所述转座因子的微环DNA编码a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是体外方法。

53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，编码所述转座酶的核酸和编码所述转座因子的DNA微环通过电转如电穿孔或核转染、化学转染如磷酸钙、或纳米颗粒导入细胞。

54.如权利要求39～41或43～53任一项所述的方法，其特征在于，介导转座因子转入基因组的所述转座酶是Sleeping Beauty、PiggyBac、Frog Prince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，或其具有转座活性的衍生物。

55.如前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于，编码转座因子的微环DNA与编码转座酶的核酸的所述组合是一起被导入哺乳动物细胞当中。

56.如权利要求54所述的方法或应用，其特征在于，所述编码转座因子的微环DNA和编码转座酶的核酸是相同的微环DNA。

57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座酶的核酸和编所述码转座因子的微环DNA以1：1或更大的摩尔比导入哺乳动物细胞中；较佳地，所述摩尔比为2:1～10:1；更佳地，所述摩尔比为3:1～9:1；进一步更佳地，所述摩尔比为4:1至8:1。

58.一种获得包含稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点。

60.如权利要求58或59所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏抗生素抗性基因。

61.如权利要求58～60任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和缺乏抗生素抗性基因。

62.如权利要求58～61任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA可以通过从质粒中删除所述复制起点和/或所述抗生素抗性基因获得，所述质粒选自由以下组成的组：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

63.一种获得含有稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：

pT；

pT2；

具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；

和

任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。

64.如权利要求58～63任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过3.0kb，优选不超过2.0kb。

65.如权利要求58～64任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.5kb。

66.如权利要求58～65任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.0kb。

67.如权利要求58～66任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA是权利要求1～21任一项所用的微环DNA。

68.如权利要求58～67任一项所述的方法，其特征在于，所述转基因是如权利要求14～17中任一项所定义的T细胞受体或嵌合抗原受体，并且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。

69.如权利要求58～67任一项所述的方法，其特征在于，所述转基因是a/b或g/d T细胞受体、细胞因子、***基因或转导标记。

70.如权利要求58～69任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是体外方法。

71.如权利要求58～70任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座酶的核酸为如权利要求40中所定义的编码转座酶的核酸。

72.如权利要求58～67或69～71任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为如权利要求9～14中任一项所定义的哺乳动物细胞。

73.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是原代细胞，优选原代人细胞。

74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是非病毒的方法。

75.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述的组合是通过同时导入所述编码转座因子的DNA或微环DNA和编码转座酶的核酸来导入的。

76.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA或微环DNA和所述编码转座酶的核酸是同一个DNA微环。

77.如权利要求39～54或56～74任一项所述的方法，其特征在于，所述组合是通过依次导入所述编码转座酶的核酸和编码转座因子的DNA或微环DNA来导入的。

78.如权利要求39～54或56～74任一项所述的方法，其特征在于，所述组合是通过依次导入所述编码转座因子的DNA或微环DNA和编码转座酶的核酸来导入的。

79.如前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述编码转座因子的微环DNA是线性化DNA或环状DNA。

80.如前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述转座酶的来源或编码转座酶的核酸是编码转座酶的微环DNA；其中所述微环DNA是线性化微环DNA或环状微环DNA。

81.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座酶的核酸和所述编码转座因子的DNA或微环DNA以1:1或更大的重量比值导入哺乳动物细胞中；较佳地，所述重量比值是2:1至10:1；更佳地，所述重量比值是3:1至9:1；进一步更佳地，所述重量比值是4:1至8:1。

82.一种通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的重组哺乳动物细胞。

83.一种重组人T细胞，其特征在于，所述重组人T细胞包含至少一个拷贝的含有转基因表达盒的转座因子。

84.如权利要求82或83所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞中转座因子的拷贝数至少为1、至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

85.如权利要求82或83所述的重组细胞，其特征在于，所述细胞中转座因子的拷贝数至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

86.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的0％～5％的拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

87.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少5％拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

88.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少10％的拷贝体被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

89.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少15％的拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

90.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少20％的拷贝被整合到满足以下所有标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

91.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少40％的拷贝被整合到满足以下所有条件的基因组染色体区域中：

(v)外部转录单位。

92.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意一个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

93.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意两个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

94.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意三个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。

95.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的至少一个，优选全部的拷贝被整合到满足以下至少任意四个标准的基因组染色体区域中：

(i)不是超保守的，

(ii)距离miRNA基因超过300kb，

(iii)距离转录起始位点超过50kb，

(iv)距离癌症相关的基因超过300kb，和

(v)外部转录单位。。

96.如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的染色体基因组中的转座因子的拷贝数至少为1、至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

97.如权利要求81～94任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的转座因子的瞬时拷贝的拷贝数至少为1、至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6、至少为7、至少为8、至少为9或至少为10。

98.一种如前述权利要求中任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞应用于药物中。

99.一种如权利要求82～97任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞应用于治疗癌症。

100.如权利要求98或99所述的重组细胞应用于如权利要求97或98所述的应用，其特征在于，所述应用是应用于免疫疗法。

101.如权利要求100所述的重组细胞应用于如权利要求100所述的应用，其特征在于，所述免疫疗法的应用是治疗自身免疫疾病的应用。

102.如权利要求100所述的重组细胞应用于如权利要求100所述的应用，其特征在于，所述免疫疗法的应用是用于治疗感染性疾病的应用。

103.如权利要求102所述的重组细胞应用于如权利要求102所述的应用，其特征在于，所述感染性疾病是细菌感染、病毒感染或真菌感染。

104.如权利要求98～103任一项所述的重组细胞应用于如权利要求98～103任一项所述的应用，其特征在于，所述重组细胞是T细胞。

105.如权利要求82～97任一项所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞应用于基因治疗。

106.一种包含编码转座因子的微环DNA和编码转座酶的核酸的组合物。

107.如权利要求106所述的组合物，其特征在于，所述编码转座酶的核酸为如权利要求3～6、8或21中任一项所定义的编码转座酶的核酸。

108.如权利要求106或107所述的组合物，其特征在于，所述转座因子为如权利要求14～18中任一项所定义的转座因子。

109.如权利要求1～18、20～33、35～51、53～69或71～81任一项所述的应用或方法，其特征在于，所述应用或方法是在体内应用或体内方法。

110.如权利要求109所述的应用或方法，其特征在于，所述应用或方法是基因治疗的应用或基因治疗的方法。