CN108601755B - 用于预防或治疗肌无力相关疾病的、包含水合蒎醇的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水合蒎醇或其药学上可接受的盐，该水合蒎醇或其药学上可接受的盐可促进成肌细胞分化以形成肌管，从而预防肌无力并有效改善肌肉功能。因此，含有所述水合蒎醇或其药学上可接受的盐的药物组合物可以有效地用于预防或治疗肌无力相关疾病。

Description

用于预防或治疗肌无力相关疾病的、包含水合蒎醇的组合物
技术领域
本发明涉及促进成肌细胞分化的组合物，该组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的；用于预防或治疗肌无力相关疾病的药物组合物；用于增加肌肉力量的组合物；用于增加肌肉力量的饲料或饲料添加剂；用于治疗肌无力相关疾病的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤；用于增加肌肉力量的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤；用于改善由肌无力引起的皱纹的组合物；以及用于改善由肌无力引起的皱纹的方法。
本发明还涉及使用水合蒎醇或其药学上可接受的盐促进成肌细胞分化的方法，以及用于生成分化的成肌细胞的方法。
背景技术
导致肌无力的疾病包括：随年龄增长而发展的肌肉减少症、由蛋白质代谢失衡或肌肉使用减少引起的肌肉萎缩、饥饿、消耗性疾病(癌症等)、以及随着年龄增长而发展的心萎缩(acardiotrophy)。
肌肉减少症是指由于衰老过程中骨骼肌肉质量的减少而引起的肌肉力量的降低。不仅观察到骨骼肌肉质量的减少(这是肌肉减少症最重要的特征)，还观察到肌纤维类型的变化。类型1和类型2随着年龄的增长以相似的速率减少，而由于肌肉减少症，类型2肌纤维厚度变化不大，但是类型1肌纤维厚度显着降低。据报道，这种肌肉减少症导致老年人的衰老和功能障碍(Roubenoff R.，Can.J.Appl.P hysiol.26,78-89,2001)。
虽然肌肉减少症是由各种因素引起的，但对每个因素的研究仍然不足。它是由生长激素减少或神经***改变、体力活动改变、新陈代谢改变、性激素水平升高、脂肪或分解代谢细胞因子、以及蛋白质合成和分化平衡的改变引起的(Roube noff R.and Hughes VA,J.Gerontol.A.Biol.Sci.Med.Sci.55,M716-M724,2000)。卫星细胞激活的减少被认为是造成骨骼肌肉质量减少的重要因素，骨骼肌肉质量减少是肌肉减少症的主要特征。卫星细胞是位于基底膜和肌纤维的肌膜之间的小单核细胞。它们被刺激(例如损伤或运动)激活以增殖为成肌细胞，并且随着分化的进行，它们与其他细胞融合以形成多核肌纤维。因此，随着卫星细胞的活性降低，受损肌肉的再生能力或对分化信号响应降低，导致肌肉形成减少。
肌肉萎缩是由营养不良或长期不使用肌肉引起的，这是由于蛋白质合成和降解的正常平衡的破坏导致蛋白质降解。
另一方面，心萎缩是由饥饿、消耗性疾病(癌症等)以及衰老引起的，心肌纤维变得干燥和薄并且它们的核变得浓缩且大小不一。因此，肌束和整个心脏的体积变小，心外膜下脂肪组织明显减少，并且冠状动脉变得弯曲。褐色消耗性色素(脂褐素)出现在心肌纤维核的两端，随着脂肪组织的减少，整个心脏变得呈现褐色。
肌肉减少症主要有三种治疗方法。首先是运动。据报道，运动可以在短期内增加骨骼肌蛋白质的合成，并且增加老年人的肌肉力量和运动能力。然而，它不适合长期治疗(Timothy J.Doherty，J.Appl.Physiol.95,1717-1727,2003)。第二种是药物治疗，可以使用***或同化激素，但是它表现出副作用，例如诱导女性的男性化和男性的***症状等。其他经批准的治疗方法包括DHEA(脱氢表雄酮)和生长激素，其已被报道在包括SARMs(选择性雄激素受体调节剂)的部位处是有用的治疗方法(D.D.Thompson，J.MusculoskeletNeuronal Interact 7,344-345,2007)。饮食疗法也被认为是治疗方法，但营养评估显示营养不良或现代饮食习惯不适合维持合理的总体重。
近来，本段括号中的文献已经提出在体外分离和分化细胞后将卫星细胞引入体内的干细胞疗法、以及通过直接激活体内的卫星细胞以促进肌生成(myogenes is)来维持或增强肌肉的方法作为肌无力(如肌肉减少症)的治疗方法(ShihuanK uang and MichaelA.Rudnicki,Trends in Molecular Medicine 14,82-91,2008)。
因此，为了治疗肌无力相关疾病，需要一种用更基本而又不引起副作用的方法来分化肌肉细胞的方法，因此有必要开发能够促进成肌细胞分化的物质。
发明内容
技术问题
为了开发用于肌无力相关疾病的治疗剂(该治疗剂通过促进成肌细胞的分化增加肌肉质量并有效地恢复肌肉功能)，本发明人进行了大量努力，结果发现，水合蒎醇促进成肌细胞的分化，因此可以用于预防和治疗肌无力相关疾病，从而完成了本发明。
解决方案
本发明的一个目的是提供用于促进成肌细胞分化的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于促进成肌细胞分化的方法。
本发明的另一个目的是提供分化的成肌细胞的制备方法。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗肌无力相关疾病的药物组合物。
本发明的另一目的是提供用于增加肌肉力量的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于增加肌肉力量的饲料或饲料添加剂。
本发明的另一个目的是提供用于治疗肌无力相关疾病的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤。
本发明的另一个目的是提供用于增加肌肉力量的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤。
本发明的另一个目的是提供用于改善由肌无力引起的皱纹的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于改善由肌无力引起的皱纹的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤。
发明的有益效果
根据本发明的水合蒎醇或其药学上可接受的盐可以促进成肌细胞分化形成肌管，因此它不仅可以预防肌无力，而且可以有效改善肌肉功能。因此，包含所述水合蒎醇或其药学上可接受的盐的药物组合物可以有效地用于预防或治疗肌无力相关疾病。
附图说明
图1是示意性地示出了用于评价促进肌生成能力的肌细胞生成素报告盒(cassette)的结构和实验步骤的照片。
图2是示出当用水合蒎醇处理由载体转化的用于萤光素酶检测的成肌细胞时，各浓度下的萤光素酶活性的图。
图3提供了示出当用0.1μM水合蒎醇处理成肌细胞时，生肌调节因子(MyoD、肌细胞生成素和肌球蛋白重链(MyHC))的mRNA的图。
图4显示了当用0.1μM的水合蒎醇处理成肌细胞时，肌球蛋白重链的蛋白质表达水平。
图5是示出用水合蒎醇处理来验证小鼠运动能力改善的实验的示意图。
图6是用于进行握力测试的装置的照片。
图7是示出在向肌无力的小鼠施用水合蒎醇后，作为握力测试的结果的各施用浓度下增加肌肉力量的作用的图。
图8是用于进行平板运动测试(treadmill test)的装置的照片。
图9是示出进行平板运动测试的过程的图。
图10是示出在向肌无力的小鼠施用水合蒎醇后，作为平板运动测试的结果的各施用浓度下受损肌肉恢复的效果的图。
图11提供了示出由水合蒎醇引起的肌肉尺寸变化的图。
图12提供了示出由水合蒎醇引起的肌肉重量变化的图。
图13是示出作为老年小鼠的反复握力测量结果的相对力量的图。
图14是示出作为老年小鼠的平板运动测试结果的跑步时间的图。
图15是示出老年小鼠的由水合蒎醇引起的肌肉重量变化的图。
图16是示出老年小鼠的由水合蒎醇引起的肌肉尺寸变化的图。
图17是示出老年小鼠运动受限后，由水合蒎醇改变的跑步时间的图。
具体实施方式
为了实现上述目的，本发明的一个实施方式提供了一种用于促进成肌细胞分化的组合物，该组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐。
如本文所用的，术语“水合蒎醇”是具有式C10H18O2的萜烯醇之一，其中萜烯是可燃的不饱和烃，该不饱和烃包括具有式(C5H8)n的碳水化合物及其衍生物(例如醇、醛、酮等)。
如本文所用的，术语“药学上可接受的盐”是指不会对施用化合物的生物体造成严重刺激并且不会损害化合物的生物学活性和性质的化合物制剂。药用盐可以是与酸形成的酸加成盐，所述酸例如是无机酸(例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等)；有机羧酸(例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸、水杨酸等)；以及磺酸(例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等)。例如，药学上可接受的羧酸盐包括与锂、钠、钾、钙、镁等形成的金属盐或碱土金属盐；氨基酸盐(如赖氨酸，精氨酸和胍)；以及有机盐(如二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羟甲基)甲胺、二乙醇胺、胆碱和三乙胺等)。
如本文所用的，术语“成肌细胞分化”是指单核成肌细胞通过融合形成肌管的过程。与肌肉前体细胞对应的成肌细胞在自我更新的情况下表现出Pax7+标记，并且在增殖的情况下表现出Pax7+/MyoD+。可以使用Pax7-、MHC+、肌钙蛋白C+和肌细胞生成素+标记来区分形成肌管的分化阶段的细胞。
在本发明的一个实施方式中，通过验证水合蒎醇的萤光素酶活性和肌细胞生成素的启动子活性的关系，验证了水合蒎醇具有促进肌肉分化的优异能力(图2)。
具体而言，本发明的一个实施方式涉及用于促进成肌细胞分化的组合物，其中水合蒎醇的浓度范围为0.01nM至1μM。该组合物可以是含血清的DMEM分化培养基，但是可以包括但不限于能够促进成肌细胞分化的任何培养基或组合物。在上述组合物中，可以包含0.05nM至100nM，特别是0.1nM至10nM浓度的水合蒎醇，但不限于此。另外，组合物还可以包含细胞培养或分化所需的其他物质。
如本文所用的，组合物可以是增加生肌调节因子的mRNA水平或由该mRNA表达的蛋白质的水平的组合物。
本文使用的术语“生肌调节因子”是指碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，是起到调节肌肉生成作用的因子。碱性螺旋-环-螺旋是指作为转录因子家族的特征的蛋白质结构模体，并且与螺旋-转角-螺旋不同。
本发明的一个实施方式涉及一种用于促进成肌细胞分化的组合物，其中生肌调节因子是选自MyoD、肌细胞生成素和肌球蛋白重链(MyHC)中的一种。
在本发明的一个实施方式中，通过qRT-PCR验证了水合蒎醇可以增加MyoD、肌细胞生成素和肌球蛋白重链(MyHC)的mRNA(图3)。而且，在本发明的一个实施方式中，通过免疫荧光检验法验证了水合蒎醇可以增加肌球蛋白重链的蛋白质表达(图4)。
同时，可以通过RT-PCR、定量实时PCR、竞争性RT-PCR、实时定量RT-PCR、RNA酶保护分析(RPA)、Northern印迹、DNA芯片分析等来分析mRNA，但是本发明不限于此。
此外，蛋白质水平可以通过western印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀测定、补体结合测定、免疫荧光检验法、免疫层析法、荧光激活细胞分选仪分析(FACS)以及蛋白质芯片技术分析等来确定，但是本发明不限于此。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种用于促进成肌细胞分化的方法，该方法包括用水合蒎醇或其药学上可接受的盐处理成肌细胞的步骤。
具体而言，成肌细胞可以是分离的成肌细胞。
在本发明的一个实施方式中，比较了用水合蒎醇处理的组和未用水合蒎醇处理的组中的萤光素酶活性，发现用水合蒎醇处理的组中的萤光素酶活性是优异的(图2)，因此用水合蒎醇处理成肌细胞的步骤是促进成肌细胞分化的重要步骤。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种用于分化的成肌细胞的制备方法，该制备方法包括用水合蒎醇或其药学上可接受的盐处理成肌细胞以分化成肌细胞的步骤。
水合蒎醇或其药学上可接受的盐如上所述。
具体而言，成肌细胞可以是分离的成肌细胞。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种用于预防或治疗肌无力相关疾病的药物组合物，该药物组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐。
水合蒎醇的浓度如上所述。
如本文所用的，术语“肌无力”是指一个或多个肌肉的力量降低的状态。肌无力可能局限于一个肌肉、身体的一侧、上肢或下肢，或可能出现在整个身体中。此外，可通过医学检查以客观的方式量化包括肌肉疲劳和肌痛在内的主观肌无力症状。
如本文所用，术语“肌无力相关疾病”是指可由肌无力引起的任何疾病，例如肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、心萎缩(acardiotrophy)等，但不限于此。
因此，本发明的组合物可用于通过促进成肌细胞的分化来预防或治疗肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、心萎缩。
具体而言，本发明中的肌肉减少症是指由于衰老而骨骼肌肉质量的逐渐减少，直接导致肌肉力量降低，这可能导致各种身体功能的下降和紊乱。
此外，肌肉萎缩是四肢肌肉呈现左右对称性的逐渐萎缩，导致脊髓中的运动神经纤维和细胞逐渐变性的疾病，其可能诱发肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和脊髓进行性肌萎缩(SPMA)。
肌营养不良症是一种渐进性的肌肉萎缩和肌无力发展的疾病，其是指以肌纤维病理性坏死为特征的退行性肌病。肌肉细胞膜损伤导致肌肉纤维坏死和退化，这导致肌肉无力和萎缩。
肌营养不良症可根据肌无力的程度和分布、发病年龄、发展速度、症状严重程度、以及家族史进行细分，肌营养不良症的非限制性示例包括杜氏(Duchenne)肌营养不良、贝克(Becker)肌营养不良、肢带型肌营养不良症、埃-德二氏(Emery-Dreifuss)肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良症、肌强直性肌营养不良症、眼咽肌营养不良症、远端肌营养不良症、以及先天性肌营养不良症。
本发明中的心萎缩是一种心脏因外部或内部因素而萎缩的疾病，其可表现出心肌纤维变得干燥和薄的褐色萎缩(可在饥饿、消耗性疾病和衰老中发现)。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用组合物来抑制或减缓肌无力相关疾病发作的任何作用。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用组合物来改善或缓解由肌无力相关疾病引起的症状的任何作用。
除了上述的水合蒎醇或其药学上可接受的盐之外，本发明的药物组合物可以含有用于施用的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂的示例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶(acaciarubber)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油。
可以使用本领域公知的方法将本发明的药物组合物制备成药物制剂，以供水合蒎醇或其药学上可接受的盐的快速、持续或延迟的释放。在制剂的制备过程中，优选地用载体混合或稀释活性成分，或将活性成分封装在容器形式的载体中。
另外，本发明的药物组合物可以适用于任何制剂，但优选制备为肠胃外用的制剂。胃肠外制剂可以是用于注射、敷用的制剂，或是喷雾剂型的制剂(如气溶胶)。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。对于非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射的酯类(如油酸乙酯)等。
为了配制成注射型制剂，可以通过将水合蒎醇或其药学上可接受的盐与稳定剂或缓冲液在水中混合从而制备成溶液或悬浮液，并且可以配制成安瓿或小瓶的剂量单位。
可以将本发明的包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的药物组合物直接注射到个体的需要增强肌肉力量的部位，所述个体是已经发展为肌无力相关疾病或可能发展为该疾病的个体，其中，分化的成肌细胞可以通过在体内和体外应用于成肌细胞来制备，然后注射到个体的需要增强肌肉力量的部位，所述个体是已经发展为肌无力相关疾病或可能发展为该疾病的个体。
此外，组合物可以包含其他成分，例如被称为肌无力相关疾病治疗剂的物质，只要它们不干扰通过水合蒎醇或其药学上可接受的盐预防或治疗肌无力相关疾病即可。
具体而言，本发明的药物组合物可以促进成肌细胞的分化。在本发明的一个实施方式中，在用水合蒎醇处理成肌细胞后，通过qRT-PCR评估与肌肉细胞分化有关的生肌调节因子的mRNA，并证实了促进肌肉细胞分化的作用非常大(图3)。另外，将小鼠们的两只后肢固定10天，然后允许再次活动3天，随后进行握力测试和平板运动测试，结果证实用水合蒎醇处理的组中的握力测量值更高并且跑步时间更长(图7和10)。这些结果表明水合蒎醇具有增加肌肉力量和恢复受损肌肉的作用。
这些结果表明水合蒎醇或其药学上可接受的盐有效地促进成肌细胞的分化，可用于预防和治疗肌无力相关疾病。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于预防或改善肌无力相关疾病的组合物，该组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐。在肌无力相关疾病发作之前或之后，本发明的组合物可以与治疗该疾病的药物同时或分开使用，以预防或改善肌无力相关疾病。
肌无力相关疾病是指由于肌无力而可能发展的所有疾病，例如肌肉减少症、肌肉萎缩、肌营养不良症、以及心萎缩，但不限于此。优选地，组合物可以促进成肌细胞的分化。
如本文所用的，术语“改善”是指至少减少与正在治疗的病症有关的参数(例如症状的程度)的所有作用。
与常规饮料一样，本发明的组合物可以含有各种调味剂或天然碳水化合物作为附加成分。对于上述天然碳水化合物，可以使用单糖(如葡萄糖，果糖等)、二糖(如麦芽糖，蔗糖)、天然调味剂(如糊精，环糊精)、或合成调味剂(如糖精或阿斯巴甜)等。天然碳水化合物的比例可以由本领域技术人员适当地确定。
此外，本发明的组合物可以进一步含有各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸或其盐、藻酸或其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮品中使用的碳酸化剂等。另外，本发明的组合物可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜汁的果肉。这些组分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域技术人员适当地选择。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于增加肌肉力量的组合物，该组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐。
本文使用的术语“增加肌肉力量”是指增强身体性能、增强最大耐力、增加肌肉质量、增强肌肉恢复、减少肌肉疲劳、改善能量平衡，或其组合。
用于增加肌肉力量的组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐，该组合物可以通过将成肌细胞分化成肌肉细胞的能力来增加肌肉质量从而增加总的肌肉质量，由此增强最大耐力、增强身体性能以及减少肌肉疲劳。此外，由于肌肉细胞可以快速更换，所以肌肉损伤可以迅速被治愈。
除了上述的水合蒎醇或其药学上可接受的盐以外，本发明的用于增加肌肉力量的组合物可以含有用于施用的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂如上所述。
在本发明的一个实施方式中，用水合蒎醇处理小鼠，并将小鼠的两只后肢固定10天，然后再次活动3天，然后进行握力测试和平板运动测试。结果证实在施用了水合蒎醇的实验组中，握力的测量值增加并且跑步时间更长(图7和10)。
如本文所用的，组合物可以是能够增加肌肉尺寸或重量的组合物。
在本发明的一个实施方式中，通过免疫荧光分析和肌纤维直径测量证实了：与对照组相比，模型小鼠以及老年小鼠中用水合蒎醇处理的小鼠的肌肉尺寸和重量增加(图11、图12、图15以及图16)。
本发明的一个实施方式提供了一种用于增加肌肉力量的饲料或饲料添加剂，该饲料或饲料添加剂包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐。
如本文所用的，“饲料”是指提供维持动物生命所必需的有机或无机营养素的物质。饲料包括动物(如牲畜等)所需的诸如能量、蛋白质、脂质、维生素以及矿物质的营养素，并且可以是植物饲料(如谷物、根/果实、食品加工副产物、藻类、纤维、油脂、淀粉、瓜类、以及粮食副产品)、以及动物饲料(如蛋白质、无机材料、油和脂肪、矿物质、单细胞蛋白质)等，但不限于此。
如本文所用的，术语“饲料添加剂”是指加入饲料中以改善动物的生产能力或健康的物质，其包括但不限于氨基酸、维生素、酶、调味剂、硅酸盐试剂、缓冲剂、提取剂、低聚糖等。
本发明的饲料或饲料添加剂中所包含的水合蒎醇或其药学上可接受的盐的含量没有特别限定，但可以是0.001％至1％(w/w)的范围，优选地，为0.005％至0.9％(w/w)的范围，并且最优选地，为0.01％至0.5％(w/w)的范围。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于治疗肌无力相关疾病的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于增加肌肉力量的方法，该方法包括向个体施用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤。
如本文所用的术语“个体”是指所有动物，包括哺乳动物(包括大鼠、牲畜、人类)等。
如本文所用的术语“施用”总体上指通过任何合适的方法向个体提供某种物质，并且施用途径可以是任何常规途径，只要该物质可以到达目标皮肤即可。
肌无力相关疾病如上所述。
在本发明的一个实施方式中，已经发现当将水合蒎醇施用给小鼠时，增强了小鼠的肌肉力量并增加了肌肉的尺寸和重量，因此包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物可用于治疗肌无力相关疾病(图10至16)。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于改善由肌无力引起的皱纹的组合物，该组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于改善由肌无力引起的皱纹的方法，该方法包括向个体施用或应用包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物的步骤。
如本文所用的，“肌无力”如上所述。
如本文所用的，“皱纹”是指由于皮肤老化、肌肉质量减少等引起的皮肤弹性降低而使皮肤卷曲或褶曲的现象。形成皱纹的皮肤的弯曲受到肌肉运动的影响，特别是在脸部的情况下，在眼睛周围或从鼻子向下至嘴巴可能会出现弯曲，这可能不仅是由面部肌肉运动的反复面部表情引起的，还可能是由重力引起的皮肤下垂、不常使用面部肌肉、或者随着年龄的增加而肌肉质量或肌肉力量降低引起的。
根据本发明的用于改善皱纹的组合物包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐，该组合物不仅促进肌肉细胞的分化(图2和3)，而且还具有增加肌肉力量和促进受伤的肌肉恢复的作用(图7、图10、图13以及图14)，并表现出增加肌肉尺寸和重量的作用(图11、图12、图15和图16)，从而诱导细胞分化，增强肌肉力量，以及恢复面部肌肉的弹性，因此该组合物可改善与他们密切相关的皮肤皱纹。
具体而言，上述组合物可以是药物组合物或化妆品组合物，并且药物组合物如上所述。
根据本发明的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物可以是下述形式：是面霜、化妆水(lotion)、精华液、凝胶、软膏(ointment)、泡沫、面部化妆水(face lotion)、面膜(pack)、润肤蜜(emollient lotion)、乳液、粉底、妆前乳、香皂、液体清洁剂、沐浴剂、防晒霜或防晒油等。
根据本发明的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物可以进一步包含至少一种添加剂，该添加剂选自水、表面活性剂、保湿剂(moisturizer)、16-4低级醇、螯合剂、杀菌剂、抗氧化剂、抗菌剂(antiseptic)、抗氧化剂、防腐剂(preservati ve)、色素以及调味剂。
发明的详细描述
本发明的模式
以下，将参照实施例对本发明的构成和作用进行详细说明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受以下实施例的限制。
实施例1：使用分泌的荧光素酶报告***验证水合蒎醇对成肌细胞分化的促进能力
实施例1-1：表达萤光素酶的成肌细胞系C2C12的制备和用于验证促进肌生成的方法
使用分泌的MyoG萤光素酶测定***评估水合蒎醇对成肌细胞分化的促进能力(图1)。
具体而言，将肌细胞生成素的启动子部分(肌生成时表达增加的蛋白质)克隆到分泌的荧光素酶载体(pMetLuc2-Reporter Vector，Clontech)中，然后将该载体转染到成肌细胞C2C12中，以制备能够稳定表达萤光素酶的肌细胞生成素启动子－分泌的萤光素酶C2C12成肌细胞系。
通过其中随着肌细胞生成素启动子被激活而萤光素酶被分泌到培养基中的***，可以定量地验证成肌细胞向肌管细胞的分化程度。为了诱导分化成肌肉细胞，向C2C12成肌细胞中加入补充有2％马血清的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，Invitrogen)培养基。在此，表达的MEF2和MyoD与肌细胞生成素启动子结合，然后萤光素酶被表达并分泌到细胞外。由于分泌的萤光素酶存在于培养基中，因此可以测量分泌的荧光素酶以验证肌生成的程度。
实施例1-2：水合蒎醇对肌肉细胞分化的促进能力的验证
用0.1nM至10μM范围内的每个浓度的水合蒎醇验证成肌细胞分化促进能力。具体的实验方法如下。
第一天，将在实施例1-1中制备的C2C12细胞以5×103个细胞/孔的浓度接种到含有补充有10％牛血清(FBS)的DMEM培养基的96孔板中。在第二天早上，将孔板的培养基替换为组分相同的补充有10％牛血清的DMEM培养基(生长培养基，GM)。下午，收集培养基(GM)。然后，用100μL的补充有2％马血清的DMEM培养基(分化培养基1，DM1)处理每个孔，该培养基用每种浓度下的水合蒎醇稀释。第三天，收集DM1培养基，并用与第二天相同的培养基(DM2)处理孔。第四天，收集DM2。
如上所述，从生长培养基(GM)开始至第一天分化培养基(DM1)和第二天分化培养基(DM2)，收集含有在C2C12细胞的分化过程中分泌的荧光素酶的培养基，并将5μL作为底物的腔肠素加入到50μL收集的含有萤光素酶的培养基中，使用光度计测量所产生的光。通过从DM1和DM2的测量值中减去DM0的测量值，数字化测量各浓度的水合蒎醇的肌生成促进能力。当将用甲醇(MeOH)处理的阴性对照组的值设为1时，比较用水合蒎醇处理的实验组的增加值和减少值，以评估水合蒎醇的肌生成促进能力。用Ready-To-Glow TM分泌的荧光素酶报告***(Clontech)作为荧光素酶测定试剂盒，并且重复实验三次。
作为评估的结果，与阴性对照相比，即使在用0.01nM低浓度水合蒎醇处理的情况下，萤光素酶活性也增加了1.2倍或更高。另外，用0.01nM至10μM的水合蒎醇处理的组显示出比对照组更高的萤光素酶活性，特别是在0.1nM浓度时，萤光素酶活性增加约1.5倍(图2)。
因此，证实了即使是低浓度的水合蒎醇也可以促进肌肉细胞的分化，特别是在0.1nM的浓度下观察到最大的分化促进能力。
实施例2：生肌调节因子的mRNA水平和由该mRNA表达的蛋白质的水平
实施例2-1：生肌调节因子的mRNA水平的验证
进行实验以验证水合蒎醇对生肌调节因子的mRNA的作用。具体而言，用0.1μM水合蒎醇处理置于生长培养基中的成肌细胞(C2C12成肌细胞)48小时，然后进行qRT-PCR，以测量MyoD、肌细胞生成素、以及肌球蛋白重链(MyHC)的水平。
实验结果表明，在用水合蒎醇处理的成肌细胞组中，生肌调节因子(MyoD、肌细胞生成素、以及肌球蛋白重链(MyHC))的mRNA增加。具体而言，Myo D和肌细胞生成素分别增加2倍和4倍，肌球蛋白重链增加约25倍或更高(图3)。这些结果表明水合蒎醇具有肌生成促进能力。
实施例2-2：肌球蛋白重链蛋白表达水平的验证
在实施例2-1中mRNA增加的生肌调节因子中，进行实验以验证水合蒎醇对肌球蛋白重链表达的作用。具体而言，在用0.1μM水合蒎醇处理置于分化培养基中的C2C12成肌细胞72小时后，通过免疫荧光检验法测量肌球蛋白重链蛋白的表达水平。
测量结果证实了用水合蒎醇处理的成肌细胞组中的荧光强度比用DMSO处理的组更强(图4)。这些结果表明水合蒎醇具有肌生成促进能力。
实施例3：水合蒎醇对受损肌肉细胞的恢复作用的验证
实施例3-1：用于验证动物运动能力改善的实验准备
在该动物实验中总共使用了45只5周龄的雄性C57BL/6小鼠(DaehanBioLin k)。整体方案如图5所示。在适应周围环境2周后，自7周龄起每天2次口服施用水合蒎醇。对照组施用200μL水/20g(小鼠)，水合蒎醇以1：2：4[8.8mg/200μL/20g(小鼠)，17.6mg/200μL/20g(小鼠)和35.3mg/200μL/20g(小鼠)]的比例施用，以验证剂量依赖性。在8周龄时，使用外科缝合器(Autosuture Royal 35W缝合器)将小鼠的两只后肢固定10天。(A novel hindlimbimmobilization pro cedure for studying skeletal muscle atrophy and recoveryin mouse.J ApplPhysi ol 106:2049-2059,2009)。移除外科缝合器后，允许它们再次活动3天(重新活动)，然后进行运动能力改善-验证测试(平板和抓握测试)。
另一方面，如下将用于小鼠的水合蒎醇的口服剂量转化为人类的口服剂量(表1至表3)(Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dos e inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers.July2005Pharmacology and Toxicology)。
[表1]
Figure GDA0003013990230000201
HED＝以mg/kg计的动物剂量×以kg计的动物重量/以kg计的人类重量
人类常数Kmhuman和小鼠常数Kmmouse分别是37和3。
[表2]
Figure GDA0003013990230000211
[NOAEL(未观察到的不良作用水平)]÷[kmhuman/kmmouse]＝人类等效剂量(HED)，其中可以通过使小鼠的口服剂量除以12.3(kmhuman/kmmouse＝37/3)，将小鼠的口服剂量转化为人的口服剂量。
可以通过如下转换小鼠(20g)的口服剂量来计算人类(70kg)的水合蒎醇的口服剂量(表3)。
[表3]
小鼠(㎎/㎏) 人类(㎎/70㎏)
8.8 50
17.6 100
35.3 200
实施例3-2：握力测试
使用小鼠的握力测量装置(BIOSEB)测量握力(图6)。具体而言，将实施例3-1的小鼠的前肢放置在附接于能够监测力的仪表板上的金属丝网上，在抓住尾巴并向下拉的同时测量抓握金属丝网的力。连续重复该测试三次。
作为握力测试的结果，用蒸馏水处理的阴性对照组显示出3.5N或更小的测量值，这与后肢运动不受限的组(非固定组)几乎相同。另一方面，口服施用水合蒎醇的组显示出4.0N或更大的测量值。另外，随着施用更高浓度的水合蒎醇，握力的测量值呈现增加的趋势(图7)。这些结果表明，水合蒎醇具有增加肌肉力量的作用。
实施例3-3：平板运动测试
图8所示的设备用于平板运动测试。
如图9所示，参照用于平板运动测试的平板运动方案(treadmill protocol)进行平板运动测试(DOI 10.1016/j.cell.2006.11.013_Cell,Volume 127Supplementa lData)。
在平板运动测试前一天，以6m/min的速度使设备热身(warmed up)10分钟。在起点，使电刺激配置为流动，以使小鼠被迫运动。第二天，以8m/min的速度开始测试，并且以速度每20min增加2m/min。在平板运动测试开始一小时后，保持12m/min的速度，角度增加5°并关闭电刺激。20分钟后，保持5°的角度，只将速度增加2m/min。在上述条件下，测量并记录小鼠的跑步时间。
作为平板运动测试结果，与后肢运动不受限的非固定组相比，口服施用蒸馏水的阴性对照组的跑步时间约短20分钟或更多。在口服施用水合蒎醇的组中，与施用蒸馏水的组相比，以8.8mg/kg浓度施用水合蒎醇的小鼠的跑步时间略长，但仍然短于非固定组。另一方面，以17.6mg/kg浓度施用水合蒎醇的小鼠的跑步时间几乎与非固定组相似，并且与非固定组相比，用35.3mg/kg剂量的水合蒎醇处理的小鼠的跑步时间更长(图10)。这些结果表明，水合蒎醇具有改善肌肉力量和促进受损肌肉恢复的作用。
实施例3-4：水合蒎醇对肌肉尺寸和肌肉重量的作用的验证
另外，在实施例3-3的运动受限之后，使用针对层粘连蛋白(存在于肌纤维周围的蛋白质)的抗体通过免疫荧光分析对胫骨前肌(TA)的切片(sections)进行染色，并测量每根肌纤维的直径。
结果，口服施用水合蒎醇的小鼠的肌纤维直径大于口服施用蒸馏水的对照组的肌纤维直径(图11)。另外，作为肌肉重量测量的结果，比目鱼肌、腓肠肌(GA)、胫骨前肌(TA)以及趾长伸肌(EDL)的重量均显着增加(图12)。
这些结果表明，水合蒎醇具有增加肌肉尺寸和肌肉重量的作用。
实施例4：水合蒎醇对老年小鼠肌肉力量的作用的验证
实施例4-1：验证动物运动能力改善的实验准备
进行实验以确认水合蒎醇是否增加老年小鼠的肌肉力量。使21个月龄的雌性C57BL/6小鼠适应环境2周，然后口服施用药物5周。具体而言，对阴性对照组施用水，对阳性对照组以2mg/kg(小鼠)的浓度施用双氯醇胺，并且使施用水合蒎醇实验组以17.6或35.3mg/kg(小鼠)的浓度口服施用水合蒎醇。然后，再次进行运动测试(握力、平板运动)以验证作用。
实施例4-2：握力测试
握力测试与实施例3-2相同。
结果，第一次测量的握力值没有差异，但是当重复测量握力时，由于运动引起的疲劳增加，口服施用水的阴性对照组显示出握力随时间而减弱。另一方面，口服施用水合蒎醇的组没有显示出类似于施用双氯醇胺的阳性组的疲劳增加(图13)。
这些结果表明，水合蒎醇减轻老年小鼠的肌肉疲劳，并具有增加肌肉力量的作用。
实施例4-3：平板运动测试
平板运动测试与实施例3-3相同。
结果，与未施用水合蒎醇的阴性对照组相比，口服施用浓度为17.6mg/kg(小鼠)的水合蒎醇的实验组显示出明显更长的跑步时间，并且施用浓度为35.3mg/kg的水合蒎醇的小鼠也显示出比阴性对照组更长的跑步时间(图14)。
这些结果表明，水合蒎醇具有提高老年小鼠耐力的作用。
实施例4-4：水合蒎醇对肌肉尺寸和肌肉重量的作用的验证
另外，通过实施例3-3的方法验证了水合蒎醇对老年小鼠的肌肉尺寸和肌肉重量的改变。
在实施例4-3中，检查了实验组和阴性对照组的肌肉重量，结果，以35.3mg/kg(小鼠)的浓度喂食水合蒎醇的老年小鼠的腓肠肌(GA)的重量增加到显著水平(图15)。另外，如实施例3-3那样，通过使用层粘连蛋白抗体的免疫荧光分析来测量胫骨前肌(TA)切片的肌纤维的直径。结果，喂食水合蒎醇的老年小鼠的肌纤维直径进一步增加(图16)。
这些结果表明，水合蒎醇具有增加老年小鼠肌肉尺寸和肌肉重量的作用。
实施例4-5：水合蒎醇对运动受限条件下的老年小鼠的肌肉力量的作用
此外，研究了水合蒎醇是否增加运动受限后的老年小鼠的肌肉力量。
使用外科缝合器(Autosuture Royal 35W stapler)将小鼠的两只后肢固定5天，并且在移除外科缝合器之后，使它们再次活动(重新活动)，然后通过平板运动测试评估运动能力。其结果是，在施用蒸馏水的对照组中，运动受限后在平板上的跑步时间比运动受限之前减少，然而在施用水合蒎醇的实验组中，跑步时间不被运动受限影响(图17)。
这些结果表明，水合蒎醇可改善运动受限的老年小鼠的耐力，从而显示出改善肌肉力量的作用。
从以上实施例可以看出，本发明的包含水合蒎醇或其药学上可接受的盐的组合物具有促进老年小鼠以及模型小鼠的肌生成和受损肌肉恢复的作用，因此可以用作用于促进成肌细胞分化的组合物、用于预防或治疗肌无力相关疾病的药物组合物、以及用于增加肌肉力量的组合物。
从以上描述中，本领域技术人员应该理解，可以在不脱离本发明的精神或其基本特征的情况下以其他形式来体现本发明。就此而言，上述实施例应在各方面上被理解为说明性的而不是限制性的。本发明的范围应该被解释为包括可以从后述的所附权利要求的含义和范围或任何其等同概念中得出的任何修改或修改形式，而不是基于以上描述来理解。

Claims (7)

1.水合蒎醇或其药学上可接受的盐在制备用于治疗肌无力相关疾病的组合物中的用途，其中肌无力相关疾病是肌肉减少症。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水合蒎醇的浓度范围为0.01nM至1μM。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物增加生肌调节因子的mRNA水平或由所述mRNA表达的蛋白质的水平。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述生肌调节因子是选自MyoD、肌细胞生成素和肌球蛋白重链（MyHC）中的一种。
5.用于促进成肌细胞分化的非治疗方法，其特征在于，该方法包括用水合蒎醇或其药学上可接受的盐处理分离的成肌细胞的步骤。
6.用于分化的成肌细胞的制备方法，其特征在于，该制备方法包括用水合蒎醇或其药学上可接受的盐处理成肌细胞以分化所述成肌细胞的步骤。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物促进成肌细胞向肌肉细胞的分化。
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