CN108588114A - 一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转基因育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转基因育种中的应用，属于玉米分子育种技术领域，所述载体以pEGAD载体为骨架载体，使用EGFP和IPT基因的融合基因替换bar基因作为筛选标记；所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中。所述应用包括以下步骤：将所述的载体转入玉米胚性愈伤组织中，获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；热激处理后，分化生根培养无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织获得转基因植株。所述载体提高了筛选效率，同时实现了转基因筛选标记的剔除，为大范围开展无标记的玉米转基因工作提供了理论和应用基础。

Description

一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转 基因育种中的应用

技术领域

本发明属于玉米分子育种技术领域，尤其涉及一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转基因育种中的应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是世界上最重要的农作物之一，作为世界上众多地区的粮食作物和大部分地区的主要饲料作物，在全世界广泛种植。同时玉米也是重要的工业原料，被广泛用于发酵工业、酒精制造和提供生物能源。玉米的育种改良和农业生产是影响我国粮食安全的重要因素。近几十年，随着诱变育种技术、转基因技术、双单倍体技术和分子标记辅助选择技术等育种新技术在商业育种中的逐步完善和推广应用，玉米育种逐渐形成了常规育种向分子育种、经验育种向精确育种过渡的趋势。

自从世界上首例转基因植物(烟草)问世，利用转基因技术培育作物新品种已经成为重要的育种手段。理论上讲，转基因技术是通过目标基因的交流实现的，与传统育种技术没有本质区别，而且在技术上，转基因育种技术改良的遗传信息更清楚、更明确、更具体，选择效率高。转基因育种技术成功克服了远缘杂交不亲和的困难，将优良的基因导入到受体物种中，实现了育种性状的定向改变，有效地打破了物种间生殖隔离的障碍，丰富了材料的多样性。在实际生产中，实现了减少玉米产量损失和农药化肥使用量的目标，带来了巨大的社会、经济和生态效益。

随着转基因技术的发展，筛选标记的优化一直是发展高效的转化***的一个重要组成部分。有效的将转化细胞从未转化细胞中分离筛选出来，是转基因***的最关键的部分之一。选择标记的存在提高了转基因的效率，但是一旦转基因操作完成，使用的筛选标记在转基因材料中往往没有任何应用价值。而这些筛选标记持续稳定地表达不利于对该材料进行更多基因的转化 (后期可以选用的筛选标记太少)，同时也会引起公众对筛选标记安全性和环境保护方面的担忧。一些人认为转基因植株中存在一些具有抗生素抗性的标记基因，可能在动物的肠道中转移给微生物，产生难以用抗生素抵抗的“超级微生物”，从而影响抗生素的治疗效果；更多的研究则表明转基因植物的基因具有通过基因漂移转移到近缘的非转基因植物的可能，引起近缘物种获得潜在的选择优势，产生抗虫、抗病或抗除草剂的所谓“超级杂草”。为了在成功进行转基因筛选的同时避免或者解决筛选标记带来了负面影响，选用新型的相对安全的筛选标记和筛选标记的剔除等技术策略，为安全转基因应用提供了有效途径。

现在研究中使用的安全筛选标记有糖代谢相关基因、抗逆相关基因和形态学相关基因。这些筛选标记的使用，降低了转基因植株的潜在风险。随着人们对转基因安全意识的提高，开发新型更安全的筛选标记以及筛选标记的剔除仍是植物转基因研究的重要方向。筛选标记的剔除也是安全转基因应用的一个重要发展方向。目前，已开发的转基因标记基因删除技术有共转化法、表达盒转化法、位点特异重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术、转座子法和染色体同源重组法等。

位点特异性重组***由重组酶和重组位点两部分组成，在重组酶的催化和参与下通过小范围内同源序列的联会产生重组，剔除重组位点间的筛选标记获得无标记的转基因植株。Onouchi等利用此方法成功获得了筛选标记基因剔除而只含有目的基因的转基因拟南芥植株。

Cre/lox重组***是目前应用最广泛的位点特异性重组***，由Cre重组酶和其特异性识别位点loxP组成。将筛选标记***到两个同向的loxP位点之间，利用Cre重组酶激活两个loxP位点之间发生重组删除两个lox位点间的标记基因。Cre重组酶识别loxP序列时有着简单高效的优势，整个过程不需要辅助因子的帮助和额外能量的供应，即可介导重组事件的发生，删除两个loxP位点间的DNA片段(图1)。图1为Cre/loxP重组***作用原理。 LB、RB：T-DNA左右边界；loxP：特异性重组位点；GOI：目的基因；SMG：选择标记基因。

Cre重组酶的活性直接决定着重组效率的高低，对整个Cre/lox***的重组起到至关重要的作用。根据应用的方式不同，可以将Cre/lox位点特异性重组***的剔除方式分为简单删除、控制删除和高效删除。简单删除是指将标记基因整合在两个同向lox位点间构建成载体进行转化，重组酶Cre基因则通过有性杂交或二次转化的方法引入到携带有筛选标记的转基因植株中。虽然Cre/lox位点特异性重组***在植物转化中实现了筛选标记的剔除，但是这种方法的操作比较繁琐，此外，重组酶在转基因植株中的表达有时候也会引起植株表型的变异。

为了解决简单删除时操作繁琐、重组酶引起受体组织异常等问题，后续的研究中提出了控制删除的操作策略，这个策略是将Cre基因和选择标记基因构建在2个同向的lox位点间，通过诱导型的启动子或是组织特异性启动子驱动Cre重组酶基因的表达，以删除选择标记基因。Gleave等通过瞬时表达转基因烟草中的Cre重组酶，实现了标记基因的删除，通过重组酶的瞬时表达也可删除标记基因，可以避免了再转化和杂交过程。基于这个原理，Hoff 等构建了pCrox载体***：热激启动子GSP81-1Cre诱导Cre重组酶基因启动，卡那霉素抗性基因Tn903***到两个loxP位点之间，利用GUS基因作为报告基因，并在拟南芥中成功验证了其功能。Zuo等报道了一个化学诱导表达***，通过XVE来诱导Cre基因的表达，同样高效率地获得了无选择标记的转基因拟南芥。控制删除的操作策略的优势在于通过诱导启动子可以瞬时的表达Cre重组酶基因，不用担心重组酶提前或者过量表达带来的不利影响，更加高效的进行了标记基因切除工作。高效删除则是指通过增强Cre 重组酶和lox位点识别效率，来提高删除效率。Luo等将loxP和frt两个特异识别位点构成一个新的杂合识别位点lox-pfrt，通过提高Cre重组酶或Flp 的识别结合效率，在T₁代转基因烟草中检测到平均删除率为33％-79％，部分植株中删除率可达100％。但是该技术现在尚无在玉米中成功应用的报道。

玉米转基因操作中，主要依靠共转化法和转座子标签法，都需要在转基因植株后代通过有性杂交和回交来进行筛选标记基因的剔除，操作复杂，始终无法大量简便的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转基因育种中的应用，在实现外源基因表达的同时，实现了筛选标记基因的自主精确剔除。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种筛选标记自主控制剔除转基因载体，以pEGAD载体为骨架载体，使用绿色荧光蛋白基因 EGFP和异戊烯基转移酶IPT基因的融合基因替换所述pEGAD载体上的bar 基因作为筛选标记；所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中；所述Cre/lox位点特异性重组***连接热激诱导型启动子，由热激诱导型启动子激活重组酶驱动位点特异性重组产生。

优选的，所述Cre/lox位点特异性重组***连接热激诱导型启动子，由热激诱导型启动子激活重组酶驱动位点特异性重组产生。

优选的，所述载体的靶基因区域***花青素合成基因Rsc。

优选的，包括具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

本发明还提供了所述的载体在玉米无标记转基因育种中的应用，包括以下步骤：1)通过农杆菌介导转化法将所述的载体转入玉米胚性愈伤组织中，恢复培养、筛选获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；2)热激处理所述有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织后，恢复培养，筛选获得无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；3)将所述无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织进行分化、生根培养，筛选获得正常生根且无丛生芽的转基因植株。

优选的，步骤1)和2)中所述恢复培养为暗培养；所述恢复培养的时间独立为28～32d；所述恢复培养的温度独立为26～30℃。

优选的，步骤1)或2)中所述筛选独立的在蓝光灯或荧光显微镜460～495 nm激发光下进行。

优选的，步骤1)中所述筛选包括1～4轮。

优选的，步骤2)中所述热激的温度为40～44℃。

优选的，步骤2)中所述热激的时间为1.5～2.5h。

本发明的有益效果：本发明提供的筛选标记自主控制剔除转基因载体，使用绿色荧光蛋白基因EGFP和异戊烯基转移酶IPT基因的融合基因替换 pEGAD载体上的bar基因作为筛选标记；通过绿色荧光蛋白发出的绿色荧光进行正向筛选，实现了转基因玉米愈伤组织可视化的筛选，扩展了玉米转基因筛选标记的范围；同时避免了除草剂筛选过程中玉米愈伤组织的耐受性，大大提高了筛选效率，筛选效率高达91.367％；并且也避免了除草剂筛选过程中的毒害作用，几乎可以完全保持转化愈伤组织存活，提高了转基因效率。本发明中所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中，通过Cre/lox位点特异性重组***精确的实现了转基因筛选标记的剔除；所述筛选标记的自主剔除，不依赖于杂交分离技术。

进一步的，本发明通过农杆菌介导转化法将携带目标基因Rsc的筛选标记自主控制剔除转基因载体转入玉米胚性愈伤组织中，成功将一个花氰色素合成途径中的合成酶类的转录因子Rsc转入玉米材料中，改变了玉米籽粒颜色；为大范围开展无标记的玉米转基因工作提供了理论和应用基础。

附图说明

图1为Cre/loxP重组***作用原理；

图2为实施例1中转化载体pHZM1N-Rsc质粒图谱；

图3为实施例2中不同材料的绿色荧光筛选表型照片；

图4为实施例2转基因阳性愈伤组织PCR检测结果图；

图5为实施例2转基因阳性愈伤组织Southern杂交检测结果图；

图6为实施例2筛选标记中的iptII基因表达表型图；

图7为实施例2T₀代转基因植株再生玉米芽和完整的再生植株；

图8为实施例2中标记剔除后愈伤组织PCR分析结果图；

图9为实施例2中目标基因Rsc在转基因材料中表达照片。

具体实施方式

本发明提供了一种筛选标记自主控制剔除转基因载体，以pEGAD载体为骨架载体，使用绿色荧光蛋白基因EGFP和异戊烯基转移酶IPT基因的融合基因替换pEGAD载体上的bar基因作为筛选标记；所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中。

在本发明中所述骨架载体为pEGAD载体；所述pEGAD载体的来源为市售商品化pEGAD载体；本发明中所述pEGAD载体的全长优选的为 13053bp；所述pEGAD载体上的构建图谱优选的如图2左所示，包括顺次连接的T-DNA的右边界，35s启动子、绿色荧光蛋白基因，EcoR I酶切位点、Xma I酶切位点、Sma I酶切位点、Hind III酶切位点、Bam HI酶切位点、终止子、35d启动子、除草剂抗性基因(basta resistance protein基因)、Kpn I酶切位点、终止子和T-DNA的右边界。

本发明提供的筛选标记自主控制剔除转基因载体，使用绿色荧光蛋白基因EGFP和异戊烯基转移酶IPT基因的融合基因替换pEGAD载体上的bar 基因作为筛选标记。本发明中所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；本发明中所述融合基因是将所述EGFP和IPT基因的核苷酸序列连接获得。本发明中，所述融合基因由CaMV35S启动子控制；所述融合基因组成的筛选标记在转基因过程两个阶段发挥功能：在筛选过程中以绿色荧光作为一个可视化的选择标记进行转化细胞的精确筛选，并利用IPT基因的表达促进转化细胞的快速生长，从而快速得到转化愈伤组织。在筛选标记剔除后，使用绿色荧光消失选择筛选标记剔除的愈伤组织；再生阶段使用IPT基因表达产生丛生芽和无法正常生根的表型效应对标记剔除不完全的转基因植株进行反向选择，从而获得标记剔除完全的转基因植株。在本发明具体时候过程中，所述IPT基因优选的为IPT2基因。

在本发明中，所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中，所述Cre/lox位点特异性重组***优选的连接热激诱导型启动子，由热激诱导型启动子(hsp70)激活重组酶，重组酶驱动位点特异性重组产生，从而实现筛选标记的剔除。

在本发明中，所述筛选标记自主控制剔除转基因载体的靶基因区域***花青素合成基因Rsc。在本发明中，所述花青素合成基因由玉米泛素蛋白启动子ubi启动；当所述Rsc基因有正常活性时，玉米的籽粒糊粉层和胚芽部位有花青素的合成，表现为***，所述花青素合成基因为转基因材料的靶标性状指示。

在本发明中，所述筛选标记自主控制剔除转基因载体的构建图谱优选的如图2右所示，包括顺次连接的T-DNA的右边界，PCR检测标签序列Insert PCR，特异性重组位点lox、hsp70启动子、nls-cre携带核定位信号的重组酶基因、hsp3’热激蛋白启动子3’功能域、35s启动子、EGFP和IPT基因的融合基因、终止子、特异性重组位点lox、玉米泛素蛋白启动子ubi、ApaL1酶切位点、Xma I酶切位点、Sma I酶切位点、Kpn I酶切位点、花青素合成基因Rsc终止子、Lc Term终止元件和T-DNA的右边界。在本发明中，所述筛选标记自主控制剔除转基因载体的全序列优选的如SEQ ID No.1所示；所述筛选标记自主控制剔除转基因载体的制备方法优选的为全序列合成；所述全序列合成优选的委托生物公司进行，在本发明具体实施过程中委托南京金斯瑞公司进行。

本发明所述载体将筛选标记表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中，选用热激诱导型启动子激活重组酶(hsp70)驱动位点特异性重组产生。本发明将筛选标记的完整表达框和Cre酶表达框***到两个lox位点之间，在完成转基因筛选后通过激活重组酶活性诱导重组事件的发生，Cre重组酶识别loxP序列即可介导重组事件的发生，删除两个loxP位点间的DNA片段，获得无筛选标记的转基因植株。本发明提供的Cre/lox位点特异性重组***有着简单高效的优势，整个过程不需要辅助因子的帮助和额外能量的供应。

本发明还提供了所述的载体在玉米无标记转基因育种中的应用，包括以下步骤：1)通过农杆菌介导转化法将所述的载体转入玉米胚性愈伤组织中，恢复培养、筛选获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；2)热激处理所述有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织后，恢复培养，筛选获得无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；3)将所述无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织进行分化、生根培养，筛选获得正常生根且无丛生芽的转基因植株。

本发明通过农杆菌介导转化法将所述的载体转入玉米胚性愈伤组织中具体的包括以下步骤：1.1)制备获得农杆菌感受态细胞；1.2)将所述载体通过电转化的方法转入农杆菌感受态细胞中获得重组农杆菌；1.3)将所述重组农杆菌侵染转化玉米胚性愈伤组织。

在本发明中，所述农杆菌感受态细胞的制备采用本领域常规的农杆菌感受态细胞的制备方法即可，无其他特殊要求。

本发明在获得所述农杆菌感受态细胞后，将所述载体通过电转化的方法转入农杆菌感受态细胞。在本发明中，所述电转化优选的在电转杯中进行，所述电转化的电压优选的为15～20kV/cm电压，所述电转化的时间常数优选的为4.5～5.0ms。

本发明在获得所述重组农杆菌后，将所述重组农杆菌侵染转化玉米胚性愈伤组织。在本发明中，所述侵染转化优选的为将所述玉米胚性愈伤组织与无菌侵染液混合孵育后，离心收集固相组分，将收集到的固相组分与携带重组农杆菌菌液的侵染液混合进行侵染转化获得转基因阳性愈伤组织。本发明中所述侵染液为携带农杆菌工程菌的侵染培养基；所述侵染转化的温度优选为25～30℃，时间优选为5～8min，所述侵染转化过程中优选的先震荡后静置；所述震荡的时间优选的为40～90s，所述静置的时间优选的为4～6min。

本发明在所述浸染转化完成后，将所述玉米胚性愈伤组织转入共培养基中进行第一暗培养；所述第一暗培养的时间优选的为2～4d，更优选的为3d；所述第一暗培养的温度优选为18～20℃，更优选为19℃。本发明在所述第一暗培养后，优选的清洗玉米胚性愈伤组织；所述清洗优选的使用含有0.2g/L 羧苄青霉素的无菌水进行，所述清洗的次数优选为3～5次，所述清洗地目的为去除愈伤组织表面附着的农杆菌残留，抑制筛选过程中的农杆菌污染。

本发明在所述清洗后，优选的将清洗后的玉米胚性愈伤组织转入恢复培养基中进行恢复培养。在本发明中，所述恢复培养温度优选的为26～30℃，更优选的为28℃，所述恢复培养的时间优选的为28～32d，更优选的为30d。本发明在所述恢复培养的7～10d时优选的将所述玉米胚性愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养；在本发明中所述继代培养的时间优选的为20～22d，更优选的为21d。

本发明在所述恢复培养后，筛选获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织。在本发明中所述筛选优选的在蓝光灯或荧光显微镜460～495nm激发光下进行。本发明中所述筛选具体为在上述环境下挑选具有绿色荧光的玉米胚性愈伤组织。在本发明中所述筛选优选的包括1～4轮，更优选的为2～3轮。在本发明具体实施过程中，将筛选到的有绿色荧光的玉米胚性愈伤组织接种到新的继代培养基中培养后，进行下一轮的筛选。在本发明中，以绿色荧光为筛选标记，随着后续的筛选逐步提高阳性玉米胚性愈伤组织的比例，进行高效率，准确的筛选。

本发明在筛选获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织后，优选的对所获得的阳性玉米胚性愈伤组织进行分子检测，所述分子检测优选的采用PCR 的方法，所述分子检测，优选的以所述玉米胚性愈伤组织的基因组DNA为模板，扩增筛选标记基因和靶基因。通过PCR检测验证，绿色荧光筛选得到的玉米胚性愈伤组织均表现出筛选标记基因和靶基因的PCR阳性，表明选用绿色荧光进行转基因愈伤组织的表型筛选，具有较高的准确性，该筛选标记基因可以用于玉米转基因愈伤组织的筛选。

本发明在获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织后，热激处理所述玉米胚性愈伤组织。在本发明中，所述热激的温度优选为40～44℃，更优选的为41～43℃；所述热激的时间优选为1.5～2.5h，更优选的为2.0h。在本发明中所述热激处理的作用为激活热激诱导性启动子Hsp70控制下的重组酶基因Cre的表达，通过Cre/lox位点特异性重组剔除筛选标记基因。

本发明在所述热激后，恢复培养，筛选获得无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织。在本发明中，所述恢复培养的方法和条件参数与上述步骤中的恢复培养一致，在此不再赘述。本发明在所述恢复培养后，将恢复培养的玉米胚性愈伤组织置于蓝光灯火荧光显微镜460～495nm激发光下，挑选无绿色荧光的玉米胚性愈伤组织。

本发明在获得所述无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织后，优选的对其进行第二暗培养；所述第二暗培养的温度优选为26～30℃，更优选的为28℃，所述第二暗培养的时间优选为18～22d，更优选的为20d。

本发明在所述第二暗培养后，将所述无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织进行分化、生根培养，筛选获得正常生根且无丛生芽的转基因植株。在本发明中所述分化培养的温度优选的为26～30℃，更优选的为28℃，所述分化培养的光照周期为16h光照/8h黑暗，所述分化培养的时间优选的为20～40d。在本发明中所述生根培养的温度优选的为26～30℃，更优选的为28℃，所述生根培养的光照周期为16h光照/8h黑暗，所述生根培养的时间优选的为 18～22d，更优选的为20d。本发明在所述分化培养后，筛选能够正常生根且无丛生芽的转基因植株。在本发明中，由于筛选标记中的IPT2基因表达能够产生丛生芽和无法正常生根的表型，因此通过转基因植株是否形成丛生芽或是否生根的表型检验筛选标记基因剔除情况。若筛选标记未完全剔除则转基因植株表现为丛生芽状且无法生成正常的根，筛选标记剔除完全后的愈伤组织分化再生得到的转基因植株无丛生芽，且能够生根，生长正常。

下面结合实施例对本发明提供的一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转基因育种中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

转基因载体pHZM1N-Rsc构建，其步骤如下：

转基因载体pHZM1N-Rsc的设计：

随着转基因技术的发展，筛选标记的优化一直是发展高效的转化***的一个重要组成部分。使用绿色荧光蛋白基因(EGFP)和异戊烯基转移酶(i sopentenyltransferases，IPT)基因的融合基因替换pEGAD载体上的bar基因作为筛选标记。该标记在转基因过程两个阶段发挥功能：在筛选过程中以绿色荧光作为一个可视化的选择标记进行转化细胞的精确筛选，并利用IPT 2基因的表达促进转化细胞的快速生长，从而快速得到转化愈伤组织。在筛选标记剔除后，使用绿色荧光消失选择筛选标记剔除的愈伤组织，再生阶段使用IPT2基因表达产生丛生芽和无法正常生根的表型效应对标记剔除不完全的转基因植株进行反向选择，从而获得标记剔除完全的转基因植株。

将筛选标记表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中，选用热激诱导型启动子激活重组酶(hsp70)驱动位点特异性重组产生。本发明将筛选标记的完整表达框和Cre酶表达框***到两个lox位点之间，在完成转基因筛选后通过激活重组酶活性诱导重组事件的发生，Cre重组酶识别loxP序列即可介导重组事件的发生，删除两个loxP位点间的DNA片段，获得无筛选标记的转基因植株。该体系有着简单高效的优势，整个过程不需要辅助因子的帮助和额外能量的供应。

在靶基因区域添加一个玉米泛素蛋白启动子ubi驱动的花氰色素合成途径中的合成酶类的转录因子基因Rsc。当Rsc基因有正常活性时，玉米的籽粒糊粉层和胚芽部位有花青素的合成，表现为***，成为转基因材料的靶标性状指示。

转基因载体pHZM1N-Rsc合成：

根据本发明设计，获得完整的转基因载体序列SEQ ID NO.1，在南京金斯瑞公司进行载体全序列合成，获得如图2右所示的转基因载体pHZM1 N-Rsc。其中融合基因EGFP-IPT2由CaMV35S启动子控制作为筛选标记，用于转化细胞的筛选；热激诱导性启动子p-Hsp70控制下的重组酶基因Cre 用于热激诱导剔除筛选标记基因。两个完整的表达框置于载体中两个重组位点(lox)之间，构成完整的筛选标记区域。一个ubiquitous启动子驱动的人工花青素(anthocyanins)合成控制基因Rsc作为报告基因，目的基因表达框***到右侧lox位点和RB之间，对转基因材料进行性状指示。LB表示T-D NA区域左边界，RB表示T-DNA区的右边界。

实施例2筛选标记自主控制剔除转基因载体在玉米无标记转基因育种中的应用

(1)载体pHZM1N-Rsc农杆菌工程菌的制备：

1.1)农杆菌感受态制备

摇取50ml EHA105菌液，至OD600＝0.5左右；

5000rpm离心5min，弃去上清液；

加入40ml预冷10％甘油，振荡重悬菌体后，冰上放置30min；

4℃，5000rpm离心5min，弃去上清液；

加入30ml预冷10％甘油，振荡重悬菌体；

4℃，5000rpm离心5min，弃去上清液；

重复步骤5～6；

向EP管中加入2ml 10％甘油，振荡重悬菌体，然后每管200μl分装于 1.5ml EP管中。

1.2)农杆菌电转化和工程菌的制备

将DNA浓度调至1μg/μl，冰上解冻感受态细胞；

取50μl感受态细胞，向其中缓缓加入1～3μl DNA，用枪头清清搅动混匀；

冰上放置30min；

将混有DNA的感受态细胞，吸入预冷的电转杯中；

15～20kV/cm电压，时间常数4.5～5.0ms；

电击完毕后，向电转杯中加入400μl的LB培养液；

吸打混匀后，吸取至EP管中，37℃摇床恢复培养1～2h；

吸取菌液，涂布在相应抗性的LB琼脂平板上。28℃暗培养；

将附有表达载体的农杆菌在含利福平(50mg/L)和质粒相应抗性的LB 液体培养基中(菌液：培养基＝1：1000或1:500)，28℃震荡培养过夜，培养至对数期(OD600值为0.8-1.0)；

在4000gpmin转速、室温下离心5min收集菌体；

菌体用重悬培养基悬浮至OD600值在0.6左右，在侵染前向重悬液中加入乙酰丁香酮(AS)100μmol/L。

1.3)重组农杆菌侵染转化玉米胚性愈伤组织

玉米胚性愈伤组织的制备：

使用Hi-II(A188*B73)玉米幼胚诱导产生愈伤组织，利用Amstrong建立的愈伤组织鉴定标准(疏松干燥、颜色鲜亮、生长迅速的体细胞胚)筛选培养状态良好的胚性愈伤组织。具体步骤如下：

A)玉米的控制授粉

玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉。

雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用别针别好。

授粉前一天，当花丝伸长约2cm时，用剪刀剪去花丝顶部，促进其伸长。

第二天，当花丝伸长后，进行授粉，并挂牌记录。

10-14天收获，4℃存放。

B)幼胚的剥离和培养

收获鲜穗(胚约1mm)后于4℃存放1-2天。

去净玉米雌穗的苞叶和花丝，75％酒精浸泡3-5min，用刀切去果穗头尾部分。

用手术刀切去籽粒胚乳上半部分(根据幼胚大小切去1/2-2/3)。

用小镊子挑出幼胚。

将幼胚放入无菌水中清洗。

C)愈伤组织诱导培养

将幼胚转移到诱导培养基上，胚轴(较平的一面)向下，盾片向上。

27-28℃暗培养3-4周，使之开始脱分化形成I型愈伤组织。

每2-3周继代一次，经过2-3次继代，选择生长迅速，质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织作为转化受体。

本发明使用的培养基见表3。

D)农杆菌介导的遗传转化：

参照Plant Transformation Facility所示方法，选取生长状态良好的胚性愈伤组织作为转基因受体材料农杆菌侵染转化。

使用手术镊将生长状态良好的胚性愈伤组织挑出后置于装有侵染液的 50ml EP管中(不加农杆菌)；

将装有愈伤组织的50ml EP管中的侵染液吸出，加入携带实施案例1 中农杆菌工程菌的侵染液；

振荡1min，室温静置5min；

将侵染完的愈伤组织倒入底部垫有滤纸的平皿中，适度吹干，转入共培养培养基，19℃暗培养3天；

将共培养后的愈伤组织转入50ml EP管中，使用含有0.2g/L羧苄青霉素的无菌水清洗3-5次；

清洗后的愈伤组织倒入底部垫有滤纸的平皿中，适度吹干，转入恢复培养基，28℃暗培养7-10天；

恢复培养后的愈伤组织转入含有0.2g/L羧苄青霉素的继代培养基，28℃暗培养继代培养21天。

转基因阳性愈伤组织的荧光筛选：

继代培养30天后，在蓝光灯上或者在倒置荧光显微镜(Nikon) 460～495nm激发光下观察愈伤组织，挑选有绿色荧光表达的愈伤组织即为转基因阳性愈伤组织。以每一皿中具有绿色荧光表达的愈伤组织重量占有侵染愈伤组织总量的比例为转化率。通过3轮绿色荧光筛选得到了绿色荧光表达的愈伤组织，实验转化效率17.358％，筛选效率为91.367％，随着后续的筛选逐步提高阳性愈伤组织的比例，得到高效率，准确的筛选。实验结果表明使用绿色荧光蛋白进行正向筛选，避免了除草剂筛选过程中玉米愈伤组织的耐受性，大大提高了筛选效率，并且也避免了除草剂筛选过程中的毒害作用，几乎可以完全保持转化愈伤组织存活，提高了转基因效率。图3为不同材料的绿色荧光筛选表型照片，其中A为A188愈伤组织；B为农杆菌侵染后愈伤组织在蓝光灯上的荧光表型；C为农杆菌侵染后愈伤组织在荧光显微镜下的荧光表型；D为转化得到的阳性愈伤组织荧光表型。

转基因阳性愈伤组织的分子检测：

通过3轮绿色荧光筛选，得到具有绿色荧光表达的愈伤组织。

使用CTAB法提取愈伤组织DNA，具体步骤：

取5g叶片，液氮研磨成粉(勿使材料融化)加入50ml离心管中；

加入15ml 1.67倍CTAB缓冲液充分混匀，65℃水浴1小时；

冷却至室温，加入15ml氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻摇晃混匀成乳浊液，之后10000rpm离心15分钟；

将上清液转入洁净离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒数次，勾出DNA，放入另一洁净的10ml离心管；

75％乙醇清洗DNA两遍，室温干燥2-3小时；

500μl去离子水溶解DNA后转入1.5ml离心管，再加入5μl RNase(10 mg/ml)，37℃处理1小时；

加入500μl苯酚，充分混匀，离心5分钟，上清转入另一新离心管；

分别加入250μl苯酚和氯仿，充分混匀，离心5分钟，上清液转入另一新离心管；

加入500μl氯仿，充分混匀，离心5分钟，上清液转入新的10ml离心管；

加去离子水至3ml，然后加入1/10体积的3M醋酸钠，2倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒数次；

75％乙醇清洗沉淀出的DNA两次，转移至1.5ml离心管中，室温干燥并冗余500μl去离子水；

分光光度计测定DNA浓度。

本发明中设计检测引物gfpR/gfpF、RscR/RscF和RR/RF的序列如表1 所示。

表1实验过程PCR扩增的引物序列

配制20μl PCR反应体系：30ng模板DNA，2.0μl 10×buffer，1.0μl 2mM dNTPs，1.5μl 25mM MgCl2，0.4μl 10μM引物和1.5U Taq酶。利用PCR反应程序：在PCR仪上扩增-使用程序94℃变性5min；94℃变性40s；55℃退火45s；72℃延伸50s；共35个循环；72℃延伸5min进行PCR扩增。

PCR扩增产物通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到6个独立转化事件的愈伤组织，对筛选标记基因、目标Rsc基因和跨筛选标记区间的序列进行PCR扩增，分别设计筛选标记检测引物(gfpR/gfpF)、靶基因检测引物 (RscR/RscF)和跨筛选标记区域的检测引物(RR/RF)，检测绿色荧光阳性的愈伤组织中筛选标记基因、靶基因的整合情况。gfpR/gfpF和RscR/RscF 两对引物分别得到879bp、465bp的条带(如图4所示)，跨筛选标记区域设计的引物由于片段过大，无法得到PCR条带。证明目标基因和筛选标记基因成功整合到玉米基因组中。通过PCR检测验证，发现绿色荧光筛选得到的愈伤组织均表现出筛选标记基因和靶基因的PCR阳性，表明选用绿色荧光进行转基因愈伤组织的表型筛选，具有较高的准确性，该筛选标记基因可以用于玉米转基因愈伤组织的筛选。

挑选绿色荧光表达的愈伤组织，采用适合玉米大量DNA提取的CTAB 法提取基因组DNA：

取5g叶片，液氮研磨成粉(勿使材料融化)加入50mL离心管中；

加入15ml 1.67XCTAB Buffer充分混匀，65℃水浴1小时；

冷却至室温，加入15ml氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻摇晃混匀成乳浊液，之后10000rpm离心15分钟；

将上清液转入洁净离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒数次，勾出DNA，放入另一洁净的10ml离心管；

75％乙醇清洗DNA两遍，室温干燥2-3小时；

500μl去离子水溶解DNA后转入1.5ml离心管，再加入5μl RNase (10mg/ml)，37℃处理1小时；

加入500μl苯酚，充分混匀，离心5分钟，上清转入另一新离心管；

分别加入250μl苯酚和氯仿，充分混匀，离心5分钟，上清液转入新离心管；

加入500μl氯仿，充分混匀，离心5分钟，上清液转入洁净的10ml离心管；

加去离子水至3ml，然后加入1/10体积的3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒数次混匀；

75％乙醇清洗沉淀出的DNA两次，转移至1.5ml离心管中，室温干燥后加入500μl去离子水溶解；

用EppendorfBioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪估计dsDNA的浓度和纯度。之后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

纯化后的基因组DNA配制50μl的反应体系(15μg基因组DNA作为模板，限制性内切酶BamHI配制50μl酶切体系，包含模板DNA10μl，酶(10U/μl) 5μl，10×Buffer 5μl和无菌水30μl)，4℃酶切过夜。酶切产物，选用0.8％的

琼脂糖凝胶电泳分离后使用毛细管转移法转膜：

取5μl酶切产物进行电泳分离，检查酶切效果；

制备0.8％琼脂糖凝胶，电泳分离酶切产物，开始使用高电压，待溴酚蓝跑出点样孔2-3cm后降低电压电泳10小时左右；

使用0.25M HCl中浸泡琼脂糖凝胶20分钟，待凝胶中溴酚蓝变成黄色；

0.4M NaOH变性液中处理凝胶45分钟；

去离子水中浸泡30分钟；

采用毛细管转移法将DNA转移至尼龙膜；

转膜结束后2×SSC漂洗尼龙膜；

将尼龙膜室温晾干后80℃烘膜1小时，固定DNA。

制备靶基因杂交探针：

杂交探针从质粒中对靶基因PCR扩增方法获得，扩增引物为RscR/RscF，反应体系为：50ml反应液中含5-10ng质粒NDA、10×PCR Buffer(5.0μl)、 25mM Mg²⁺(5.0μl)、10mMdNTP(1.0μl)、5U/μl Taq(1.0μl)和5μM Primer (4.5μl)；

反应程序为：94℃预变性5min：94℃，变性40sec；N℃，退火45sec， (退火温度及时间根据引物的长度及Tm值来确定)；72℃，延伸50sec(延伸时间根据扩增片段长度的不同有所调整)；扩增循环数：32～35；最后72℃延伸5min；

反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行目标条带的胶回收；

PCR扩增质粒载体获得探针片段，使用随机引物标记试剂盒配制反应体系：DNA模板，4.0μlPCR产物，2μl随机引物，0.4μlλ/HindIII引物，7.6μl ddH₂O；

将上述体系混匀，95℃变性3分钟，迅速置于冰上5分钟；

加入试剂10×buffer 2.5μl，dNTPs 2.5μl，α-³²P-dCTP 5μl和kenow enzyme 1μl混匀后，37℃温育1-2小时

95℃变性5分钟后置于冰上5分钟。

进行同位素标记的分子杂交(将已转尼龙膜放入杂交管中，加入预热的预杂交液；65℃预杂交4-6小时；换新杂交液，加入经过杂交变性的探针， 65℃杂交12-16小时)、洗膜(50mL 2×SSC+0.5％SDS，65℃洗膜30分钟；50mL 1×SSC+0.5％SDS，65℃洗膜30分钟)和成像，在磷屏中压制12小时候进行扫描，根据成像条带数目计算转基因植株的拷贝数。结果如图5所示，其中M为HindIII DNA Marker；P为质粒pHZM1-Rsc阳性对照；1-7 为转基因植株。表明转化愈伤组织中外源基因拷贝数为1-2个。

筛选标记基因的剔除和转基因植株再生，其步骤如下：

(1)筛选标记基因剔除效果和检测：

挑选单拷贝的愈伤组织进行42℃热激处理。每次热激处理2小时；

将热激后的愈伤组织转入新的恢复培养基(见表3)，28℃暗培养7天；

恢复培养后的愈伤组织在蓝光灯上(clarechemical.com transilluminator DR-46B)进行荧光观察；

挑选绿色荧光消除的愈伤组织，28℃暗培养20天后转入分化培养基进行分化处理；

28℃，16/8光周期下进行分化培养，获得再生植株；

再生植株长至3cm时转入生根培养基。

通过再生植株是否形成丛生芽或是否生根的表型检验筛选标记基因剔除情况。若筛选标记未完全剔除则再生植株表现为丛生芽状且无法生成正常的根。图6为ipt2基因表达表型，其中A为分化阶段ipt2基因表达产生丛生芽； B为生根阶段ipt2基因表达造成无法正常生根。

标记剔除完全后的愈伤组织分化再生得到生长正常的转基因再生植株，转入生根培养后得到完整再生植株，T₀代转基因植株如图7所示，a为分化得到转基因再生玉米芽；b为再生得到的玉米苗诱导生根形成完整的再生植株。

(2)转基因植株移栽和温室管理：

待苗长5-8cm，根数达到20条左右时，揭去封口膜，在生根瓶中加入 0.5cm的无菌水，25-28℃温度条件下选用16/8的光照/暗光周期培养，炼苗 2天；

将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉培养基和菌体后将茎尖移栽到花盆(花盆中的土壤量距离花盆边缘1-2厘米处，用温自来水浇透土壤，然后再覆盖一层大约1-2厘米的蛭石与花盆边缘平行，再用温自来水浇透蛭石)中，茎尖要摆放整齐，一个花盆大约可以摆放6株左右的转化苗；

移栽完毕后将花盆转入人工气候室，在上面覆盖一层塑料薄膜防止水分蒸发，并用板子盖住黑暗条件下生长；

炼苗1-2天之后将薄膜掀开，让幼苗正常生长。

转基因植株的分子检测：

四个独立的转化事件均成功获得再生植株，获得17株转基因玉米植株温室种植。使用CTAB法抽提T₀代转基因植株的叶片DNA，分别使用引物 gfpR/gfpF、RscR/RscF和RR/RF进行PCR检测，结果如图8所示，其中P1：选用PCR引物gfpR/gfpF，检测筛选标记基因；热激处理后剔除筛选标记基因，PCR结果为阴性。P2：选用报告基因Rsc引物RscR/RscF，热激剔除筛选标记，但是报告基因依然存在，PCR结果为阳性，得到目标条带。P3：选用跨筛选区域引物RR/RF，若标记剔除成功，得到目标条带，否则无法得到 PCR条带。

分别对四个转化的愈伤组织进行荧光观察和PCR检测(表2)，结果发现通过绿色荧光检测热激剔除效果与通过PCR检测一致，荧光表达的消失可以说明筛选标记的剔除成功。

表2愈伤组织标记剔除效率的绿色荧光分析和PCR鉴定

转基因植株的籽粒颜色表型：

转基因植株温室种植，进行严格自交授粉，挂牌记录授粉材料和日期。 T₀代自交收获13株转基因植株果穗，观察籽粒颜色发现其中有9株出现紫色籽粒，即Rsc基因正常表达。T₀代自交收获，观察果穗上籽粒颜色，并种植 T₁代，自交统计果穗上籽粒颜色，出现***籽粒(图9)。说明Rsc基因可以作为转基因玉米籽粒筛选的报告基因，进行快速筛选。

本实施例中使用的培养基组成见表3。

表3本发明实施例2中使用的培养基组成

培养基的配制参照Frame等、Vega等和Ishida等的报道，并在这些报道的基础上做了一些修改：(1)在共培养培养基中添加了硫酸铜(copper sulfate，CuSO₄)、乙酰丁香酮(acetosyringone，As)、半胱氨酸(L-cysteine， L-cys)和二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)；(2)去除恢复和筛选培养基中的潮霉素或除草剂，根据需要选择是否添加筛选剂；(3)在继代、恢复和筛选培养基中添加低浓度的硝酸银(AgNO₃)；(4)培养基主要成分采用高压灭菌法灭菌处理；(5)葡萄糖(glucose)、抗氧化剂(antioxidants)、维生素 (vitamins)和抗生素(antibiotics)抽滤灭菌后添加。

由上述实施例可知，本发明提供的筛选标记自主控制剔除转基因载体，通过绿色荧光蛋白发出的绿色荧光进行正向筛选，实现了转基因玉米愈伤组织可视化的筛选，扩展了玉米转基因筛选标记的范围；同时避免了除草剂筛选过程中玉米愈伤组织的耐受性，大大提高了筛选效率，筛选效率高达91.367％；并且也避免了除草剂筛选过程中的毒害作用，几乎可以完全保持转化愈伤组织存活，提高了转基因效率。本发明中所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中，通过Cre/lox位点特异性重组***精确的实现了转基因筛选标记的剔除；所述筛选标记的自主剔除，不依赖于杂交分离技术。本发明成功将一个花氰色素合成途径中的合成酶类的转录因子 Rsc转入玉米材料中，改变了玉米籽粒颜色；为大范围开展无标记的玉米转基因工作提供了理论和应用基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种筛选标记自主控制剔除转基因载体及其在玉米无标记转基因育种中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaaccaaacg gagcatagag 60

gatacaaacg agggttgtta cgggataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgt 120

gatgctaggt tttatttcgg ttttctatct cctattgttt ttcacgtttc aacttgattc 180

aaattctagt tttttttaac ttaagcacaa ttaaatacaa cataaaaaca acatggattc 240

aagttctatt tcaattttta ttaactatta tgttgtctag tctgttcaag cacataatac 300

ttataaatat aaaattaaac gaaatcacat atttccacaa atcttgggta ctacactcgg 360

agacgacgat ggattccatc tcaatttgga tgttgattat agctctattt cagttgtcac 420

tgttgtccta acacgcccta ttgtgcatga tagtgcaagt gctcaacgta aaagaaaaga 480

gatcagtaac aagtagcagc actgtacaag gtaagccgtg attcaattaa aactgtttga 540

gcaattcagt tgctagatcg ttccaccatc gataattcga tatgtacgat gatataaaaa 600

gagcccataa gtttgtcttg aaaaggttga tcaaataatt taaattagat gataaaaaac 660

atggaagatg tgggagtgga cgacggctat gaagaatagt actatatcag gtttatacgt 720

aaaatttatt tttgaaatgt ttttataatc tgtttgaatt gtattttttg cttaattatg 780

tgattggatg ttttttcatg aaatgtcgag ttttatttta aataaaattc tgtaaagaga 840

agttgctgcg ctgagaaaac tataaatcga tagtaaaggc tgtacgcaac gtttaagtcc 900

ttgtttgaat gcgtatgaat ctgagaaagt tcagaatgat taaatctttt ttatttaatt 960

ttaatttgag agagattaag ttctctccaa ttctctttaa tttagacgta atcgaacaag 1020

ctggttgcca aactagatga gtacattttg tccactgcca tagagccatc gactacaaaa 1080

gtctagaaca cagtggaaag caccagacaa cgcgcgacca aaagggccca ggccccagcg 1140

ccccagtccg ggggttgtgt tcgccgacct gtgcgtgcct gctcgtcacg tcacgtccct 1200

atttgcccgt cttcctcccc tccagaccct tctcgaacgc cccttcgttc tggatccaac 1260

ggtcggtctc tgccgggctc gaacgttctc gaaaccacgt cacccccgat aaaaccccac 1320

gcacagcctc ctcccttcct caaccatcat tgcaaaagcg aagcaagcaa tccgaattct 1380

ctgcgatttc tctagatctc gaccacccct actagttttg gttcctcctt tcgttcgaga 1440

gagcgtttct agtgccatgg ctaccgagga aagagtgagg aaaagaaagg aatccaatag 1500

agaatcagcc agacgctcga gatacaggaa agccgctcac ctgaaagaac taagcttgtc 1560

caatttactg accgtacacc aaaatttgcc tgcattaccg gtcgatgcaa cgagtgatga 1620

ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag ggatcgccag gcgttttctg agcatacctg 1680

gaaaatgctt ctgtccgttt gccggtcgtg ggcggcatgg tgcaagttga ataaccggaa 1740

atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg cgattatctt ctatatcttc aggcgcgcgg 1800

tctggcagta aaaactatcc agcaacattt gggccagcta aacatgcttc atcgtcggtc 1860

cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc tgtttcactg gttatgcggc ggatccgaaa 1920

agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa acaggctcta gcgttcgaac gcactgattt 1980

cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag cgatcgctgc caggatatac gtaatctggc 2040

atttctgggg attgcttata acaccctgtt acgtatagcc gaaattgcca ggatcagggt 2100

taaagatatc tcacgtactg acggtgggag aatgttaatc catattggca gaacgaaaac 2160

gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc acttagcctg ggggtaacta aactggtcga 2220

gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga tgatccgaat aactacctgt tttgccgggt 2280

cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc caccagccag ctatcaactc gcgccctgga 2340

agggattttt gaagcaactc atcgattgat ttacggcgct aaggatgact ctggtcagag 2400

atacctggcc tggtctggac acagtgcccg tgtcggagcc gcgcgagata tggcccgcgc 2460

tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc tggtggctgg accaatgtaa atattgtcat 2520

gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac aggggcaatg gtgcgcctgc tggaagatgg 2580

cgattagcca ttatctagac acgtggttag tgttcgaggt ttggtttggt gaggtgtgaa 2640

gtgcctgaac tctgatggtt gtttgtgagg tgtggtcgca atagctgcgg cctgtggtga 2700

acttctcaga aataaataag ttttcgttcc taatttgttt tttttcaatt catgtgttgg 2760

tcgccttgtt tcgtatcgtt gcttttcatg ttaaacaggt actcttgtca tgcaagtgat 2820

gatgtgaata cgaggcactg cataatttgc acaggacaga cgaatgcagc agtgtttgtg 2880

attcacctca ctgcctccgt gatgaaaact aatctaaaat tctgtgatga aaactaatct 2940

aaaattggat gtttgatcca ttgagagaca aaatatgtta gtaatattta tcattgtcat 3000

gtgatgcgtg aatccagcag aactcatctg gagcgaagag ccgcagagca cgcagttact 3060

ccctccggct aaaacagact ataatttgga atgtaagagt tcctttacgg caaatagcag 3120

tatacagttc aggtgataat taggactgtt ggataattag gatgaagtaa taaactcaga 3180

gcagcgatgc caccacaact gtggaaaaag aggcagtggc ggtttaaact gaaggcggga 3240

aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta agggagtcag gccttaatta agagctcgca 3300

tgccctttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc agcaggtctc 3360

atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc caagaaggtt 3420

aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa agatatattt 3480

ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca caaaccaagg 3540

caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa ggccatggag 3600

tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctccccgtaa agactggcga acagttcata 3660

cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac 3720

acgcttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag 3780

acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 3840

cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 3900

aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 3960

cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 4020

tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac 4080

ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacggggact ctagcgctac 4140

cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 4200

tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 4260

atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 4320

cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 4380

accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 4440

gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 4500

gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 4560

tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 4620

agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 4680

tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 4740

ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 4800

atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 4860

tgtacaagtc cggagctgcg gccgctgccg ctgcggcagc ggccgaattc gagcacggtg 4920

ccgtcgccgg gaagcccaag gtggtgttcg tgctcggcgc cacagcgaca gggaagtcga 4980

agctcgccat cgccctcgcc gagcgcttca acggtgaggt tatcaacgct gacaaaatcc 5040

aggtccacga tggcgtgccc atcatcacga acaaggtcac agaggaagag cagggcgggg 5100

tgccccacca cctgctcagc gtccgccacc cggacgccga cttcactgcg gaggagttcc 5160

gacgtgaggc ggccagcgcc gtggcccgcg tgctctcggc gggccgcctc cccgtcgtgg 5220

caggcgggtc caacacctac atcgaggcac tggtggaagg cgacggcgcc gccttccgcg 5280

cggcgcacga cctcctcttc gtctgggtgg acgcggagca ggagctgctg gagtggtacg 5340

ccgcgctgcg cgtggacgag atggtggccc gcgggctggt gagcgaggct cgcgcggcgt 5400

tcggcggcgc cggggttgac tacaaccatg gcgtgcgccg cgccatcggc ctgccggaga 5460

tgcacgccta cctggtggcg gagcgcgagg gcgtcgctgg ggaggccgag ctcgcggcca 5520

tgctggaacg cgcggtgcgc gagatcaagg acaacacctt ccgcctcgcg cgcacgcagg 5580

cggagaagat ccggcgcctc agcacgctcg acggctggga cgtccgccgc atcgacgtga 5640

cccccgtgtt cgcgcgcaag gccgatggca ctgagtgcca cgagctgact tggaagaagc 5700

aggtgtggga gccgtgcgag gagatggtga gggctttcct cgagccgtcc ctgactgccg 5760

ttccaggtgt tgcagtaact gaagaaggga acgccggcgt cgtcgctact gctgcacccg 5820

ctggtgatgt cgtcgtccca actggcgatg tcgtcaccgc cgtggctgat gcataagctt 5880

ggatccaccg gatctagata actgatctcg aggagctagc tcgaatttcc ccgatcgttc 5940

aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat 6000

catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt 6060

atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga 6120

aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact 6180

agatcggata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta tgaattaatt cactggccgt 6240

cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 6300

acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca 6360

acagttgcgc agcctgaatg gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 6420

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 6480

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgatttggg tgatggttcc tgcaggatac 6540

gacgtacgtg cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc 6600

atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt 6660

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gaacgacgtc accgcccact atggcattct gctggcgctg tatgcgttgg tgcaatttgc 20220

ctgcgcacct gtgctgggcg cgctgtcgga tcgtttcggg cggcggccaa tcttgctcgt 20280

ctcgctggcc ggcgccagat ctggggaacc ctgtggttgg catgcacata caaatggacg 20340

aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa cgctcttttc 20400

tctta 20405

<210> 2

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720

ggagctgcgg ccgctgccgc tgcggcagcg gccgaattcg agcacggtgc cgtcgccggg 780

aagcccaagg tggtgttcgt gctcggcgcc acagcgacag ggaagtcgaa gctcgccatc 840

gccctcgccg agcgcttcaa cggtgaggtt atcaacgctg acaaaatcca ggtccacgat 900

ggcgtgccca tcatcacgaa caaggtcaca gaggaagagc agggcggggt gccccaccac 960

ctgctcagcg tccgccaccc ggacgccgac ttcactgcgg aggagttccg acgtgaggcg 1020

gccagcgccg tggcccgcgt gctctcggcg ggccgcctcc ccgtcgtggc aggcgggtcc 1080

aacacctaca tcgaggcact ggtggaaggc gacggcgccg ccttccgcgc ggcgcacgac 1140

ctcctcttcg tctgggtgga cgcggagcag gagctgctgg agtggtacgc cgcgctgcgc 1200

gtggacgaga tggtggcccg cgggctggtg agcgaggctc gcgcggcgtt cggcggcgcc 1260

ggggttgact acaaccatgg cgtgcgccgc gccatcggcc tgccggagat gcacgcctac 1320

ctggtggcgg agcgcgaggg cgtcgctggg gaggccgagc tcgcggccat gctggaacgc 1380

gcggtgcgcg agatcaagga caacaccttc cgcctcgcgc gcacgcaggc ggagaagatc 1440

cggcgcctca gcacgctcga cggctgggac gtccgccgca tcgacgtgac ccccgtgttc 1500

gcgcgcaagg ccgatggcac tgagtgccac gagctgactt ggaagaagca ggtgtgggag 1560

ccgtgcgagg agatggtgag ggctttcctc gagccgtccc tgactgccgt tccaggtgtt 1620

gcagtaactg aagaagggaa cgccggcgtc gtcgctactg ctgcacccgc tggtgatgtc 1680

gtcgtcccaa ctggcgatgt cgtcaccgcc gtggctgatg cataa 1725

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggactgggtg ctcaggtagt gg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggacggcg acgtaaacgg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggtttaggg ttaatggt 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cactggcaag ttagcaat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacggagca tagaggata 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cactggcaag ttagcaat 18

Claims (9)

1.一种筛选标记自主控制剔除转基因载体，其特征在于，以pEGAD载体为骨架载体，使用绿色荧光蛋白基因EGFP和异戊烯基转移酶IPT基因的融合基因替换所述pEGAD载体上的bar基因作为筛选标记；所述筛选标记的表达框整合在Cre/lox位点特异性重组***中，所述Cre/lox位点特异性重组***连接热激诱导型启动子，由热激诱导型启动子激活重组酶驱动位点特异性重组产生。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体的靶基因区域***花青素合成基因Rsc。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于，包括具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

4.权利要求1～3任意一项所述的载体在玉米无标记转基因育种中的应用，包括以下步骤：

1)通过农杆菌介导转化法将权利要求1～3任意一项所述的载体转入玉米胚性愈伤组织中，恢复培养、筛选获得有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；

2)热激处理所述有绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织后，恢复培养，筛选获得无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织；

3)将所述无绿色荧光表达的玉米胚性愈伤组织进行分化、生根培养，筛选获得正常生根且无丛生芽的转基因植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)和2)中所述恢复培养为暗培养；所述恢复培养的时间独立为28～32d；所述恢复培养的温度独立为26～30℃。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)或2)中所述筛选独立的在蓝光灯或荧光显微镜460～495nm激发光下进行。

7.根据权利要求4或6所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述筛选包括1～4轮。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述热激处理的温度为40～44℃。

9.根据权利要求4或8所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述热激处理的时间为1.5～2.5h。