CN108586577A - 一种多肽及其应用 - Google Patents

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范震
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多肽及其应用。该多肽对于降低细胞内Aβ的生成，促进细胞正常生长的保护作用。因老年性痴呆、帕金森、路易体痴呆、唐氏综合征、年龄相关性黄斑变性等疾病的发生和恶化均与Aβ的积累有直接关系，故此药在有关Aβ所致的疾病对老年性痴呆、帕金森、路易体痴呆、唐氏综合征、年龄相关性黄斑变性等神经退行性疾病起到预防和治疗作用。

Description

一种多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多肽及其应用。
背景技术
阿尔兹海默病(AD)，这种常见的神经***退行性疾病，主要表现为进行性记忆降低和认知能力减退，语言障碍和精神运动异常等症状。根据发病年龄及家族聚集性，AD分为早发性AD和迟发性AD及家族性(FAD)和散发性(SAD)。AD的神经组织病理学特征为：一是在大脑皮层和海马区出现由β淀粉样蛋白异常聚集形成的老年斑，二是Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。
AD这种神经退行性疾病，它的发病过程是不可逆的，因为已经死亡的神经细胞无法起死回生，所以研制可以减缓神经细胞死亡的药物成为主要的研究方向。
β淀粉样蛋白(Aβ)是一种小分子蛋白质，是蛋白酶水解β淀粉样蛋白前体而来的产物。APP先后经过β分泌酶、γ分泌酶的水解产生一系列长短不等的Aβ片段。在这些长短不等的片段中，有40个氨基酸Aβ40和42个氨基酸的Aβ42对神经细胞是具有损伤作用的，而且其中Aβ42对神经细胞具有较强的病理毒性，因为它更易形成神经炎块斑。Aβ的产生对应的便是对它的清除，主要通过胞外酶降解和受体介导的蛋白转运这两种途径实现。
Aβ的产生多于降解时，Aβ蛋白清除不及时将导致Aβ蛋白过多的在大脑皮层中沉积，而形成Aβ蛋白斑块。Aβ的过多积累会导致一系列级联反应的发生，如引起线粒体损伤、氧化应激和ca2+超载以及环氧酶CX-2的活性下降，激活神经胶质细胞释放细胞因子和炎症介质，导致Tau过度磷酸化，使得微管蛋白无法正确组装，从而引起神经纤维缠结，神经元细胞的功能发生紊乱而无法执行正常的生理活性，加速了AD发生的进程。
但是目前的治疗阿尔兹海默病的相关药物药效不显著且多有副作用，因此，提供一种有效预防和治疗阿尔兹海默病的药物具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种多肽及其应用。该多肽对于降低细胞内Aβ的生成，促进细胞正常生长的保护作用。因老年性痴呆、帕金森、、路易体痴呆、唐氏综合征、年龄相关性黄斑变性等疾病的发生和恶化均与Aβ的积累有直接关系，故此药在有关Aβ所致的疾病对老年性痴呆、帕金森、、路易体痴呆、唐氏综合征、年龄相关性黄斑变性等神经退行性疾病起到预防和治疗作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多肽，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个或3个氨基酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个或3个氨基酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述添加为添加1个、2个、3个、4个5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
在本发明的一些具体实施方案中，其还包括引导肽；所述引导肽的序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明还提供了所述的多肽在制备Aβ抑制剂中的应用。
本发明还提供了所述的多肽在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森、路易体痴呆、唐氏综合征或年龄相关性黄斑变性。
本发明还提供了一种所述多肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取蜂王浆与缓冲液混合后离心，收集上清液透析，收集不大于14KDa的透析液离心后取上清过滤，收集滤液；
步骤2：取步骤1制得的滤液纯化后酶解，收集酶解液；
步骤3：取步骤2获得的酶解液离心、过滤、超滤，收集不大于3KDa的滤液，经反相色谱分离，收集C峰，保留时间为24～28min(见图4)的组分。
本发明还提供了一种编码所述的多肽的DNA分子。
本发明还提供了一种重组载体，其含有所述的DNA分子。
本发明还提供了一种所述多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；
取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导所述转化体表达蛋白，经分离纯化，即得；
所述的(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述的(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为原核***宿主细胞或真核宿主细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，所述原核***宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种Aβ抑制剂，由所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
本发明还提供了一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，由所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
阿尔茨海默症是一种以Aβ级联假说为主要病因的老年性神经退行性疾病。蜂王浆是一种对大脑具有神经营养和神经保护作用的健康食品，其中含有的蜂王浆蛋白和蜂王浆多肽可以抗氧化和延缓衰老，对老年性疾病有独特的疗效。本发明主要以阿尔茨海默症的细胞模型为基础从天然蜂王浆中纯化分离并鉴定出一个可以对抑制Aβ生成具有明显作用的肽序列，这对于深入研究治疗阿尔兹海默症具有重要的意义。
本发明提供的多肽经测序所得的氨基酸序列：QVEIPH，如SEQ ID NO:1所示。实验证明此序列经人工合成为六肽后对于保护细胞，抑制Aβ的生成具有明显的功效。结合在六肽上可协助其进入血脑屏障的引导肽序列：YGRKKRRQRRR，如SEQ ID NO:2所示。结合在六肽上的最终序列为：YGRKKRRQRRR-QVEIPH，如SEQ ID NO:3所示。
通过以上的分离纯化方法得到的六肽在实验中证明了其对于降低细胞内Aβ的生成，促进细胞正常生长的保护作用。因老年性痴呆、帕金森、、路易体痴呆、唐氏综合征、年龄相关性黄斑变性等疾病的发生和恶化均与Aβ的积累有直接关系，故此药在有关Aβ所致的疾病对老年性痴呆、帕金森、、路易体痴呆、唐氏综合征、年龄相关性黄斑变性等神经退行性疾病起到预防和治疗作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示蜂王浆蛋白MRJP1的阴离交换层析图谱；其中，曲线为280纳米下的蛋白紫外吸收图谱；直线为盐离子浓度梯度曲线图，123456分别代表在123456个时刻收集的蛋白样品；
图2示SDS-PAGE显示蜂王浆蛋白MRJP1的离子交换层析分离纯化结果；其中，M:蛋白marker，1和2为取至A峰的洗脱样品，3、4、5、6为取至B峰的洗脱样品；
图3示MRJP1的质谱肽段碎片匹配情况；
图4示分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽的HPLCC-18反相色谱分析柱图谱；横坐标代表时间；纵坐标代表各多肽组分在220nm处的紫外吸收值；
图5示分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽的HPLCC-18反相色谱制备柱色谱图；横坐标代表时间；纵坐标代表各多肽组分在220nm处的紫外吸收值；
图6示Aβ-Elisa结果分析；其中，Group1代表Control组对照，即未给药组；Group2给药浓度为10pg/ml；Group3给药浓度为100pg/ml；Group4给药浓度为200pg/ml；(所给药成分即测序所得的六个氨基酸经人工合成后的样品)；
图7示Aβ-Elisa结果分析；其中，Group1代表Control组对照，即未给药组；Group2给药浓度为10pg/ml；Group3给药浓度为100pg/ml；Group4给药浓度为200pg/ml；(所给药成分即测序所得的六个氨基酸经人工合成后的样品)；
图8示对C组分鉴定测序结果；其中，虚线的信噪比低于阈值，强度比较低；实线的信号好一些；图8中只有一个信号比较好的强峰，其他的可忽略不计；
图9示对样品的主峰进行串联质谱检测结果；
图10示肽段对应蜂王浆水溶性蛋白1(WSRJ1)序列中的部分；
图11示Aβ-Elisa结果分析。
具体实施方式
本发明公开了一种多肽及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种多肽，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代为取代1个、2个或3个氨基酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述缺失为缺失1个、2个或3个氨基酸。
在本发明的一些具体实施方案中，所述添加为添加1个、2个、3个、4个5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
在本发明的一些具体实施方案中，其还包括引导肽；所述引导肽的序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明还提供了所述的多肽在制备Aβ抑制剂中的应用。
本发明还提供了所述的多肽在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森、路易体痴呆、唐氏综合征或年龄相关性黄斑变性。
本发明还提供了一种所述多肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取蜂王浆与缓冲液混合后离心，收集上清液透析，收集不大于14KDa的透析液离心后取上清过滤，收集滤液；
步骤2：取步骤1制得的滤液纯化后酶解，收集酶解液；
步骤3：取步骤2获得的酶解液离心、过滤、超滤，收集不大于3KDa的滤液，经反相色谱分离，收集C峰，保留时间为24～28min(见图4)的组分。
具体的，制备方法包括如下步骤：
水溶性蜂王浆蛋白(WSRJ)溶液的制备：
将新鲜的蜂王浆(购自北京农翼友蜜蜂养殖厂)与PH＝7.0的浓度为50mM的磷酸盐缓冲液以1:4的比例混合，低温下使用磁力搅拌器混合均匀，制备蜂王浆的稀释溶液。将上述蜂王浆的稀释溶液于4℃条件下10000rpm离心30min，弃掉不溶性沉淀，取淡黄色上清成分重复离心一次。使用截留分子量为14kDa的透析袋在PH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲液中4℃下透析48h，期间更换三次磷酸盐缓冲液。取透析袋中溶液，4℃，6000rpm离心30min除去沉淀颗粒，并过0.22um滤膜抽滤去除大颗粒杂质及细菌微生物。并将滤液于冷冻干燥机上冷冻干燥48h后，取冻干粉末进行后续实验。
蜂王浆蛋白MRJP1的亲和层析：
取水溶性蜂王浆蛋白干粉2g溶于100ml超纯水中，4℃条件下，利用BeaverBeADsTMIDA Nickel对蜂王浆蛋白MRJP1进行亲和层析分离，实验步骤如下：
①取适量的磁珠，先用10个柱体积的纯水孵育润洗，混合均匀，放于磁力架上约5min,磁性分离，去除上清。
②用5个柱体积的PH＝7.0的浓度为50mM的磷酸盐缓冲液孵育润洗磁珠10min，去除上清液。
③将上述水溶性蜂王浆蛋白溶液与磁珠混合，4℃冷库中，于混匀仪上孵育1h，于常温下再孵育0.5h，磁性分离，收集上清液，过0.22um滤膜，5％甘油-80℃保存。
④在装有磁珠的离心管中，使用50mM Tris-HCl缓冲液充分清洗磁珠。
⑤在装有磁珠的离心管中加入含1M Nacl、100mM咪唑的50mMTris-HCl缓冲液，上下翻转离心管数次，将磁珠悬浮，进行磁性分离，去除上清液。
⑥在装有磁珠的离心管中加入含1M Nacl、500mM咪唑的50m MTris-HCl缓冲液，上下翻转离心管数次，将磁珠悬浮，进行磁性分离，去除上清液。此步骤重复2次
⑦分别上述各步骤的蛋白样品10ul样品，加入2.5ul 5×loading buffer(含巯基乙醇)，金属浴处理5-10分钟，SDS-PAGE电泳。染色液染色2h，脱色至背景清晰可见。
⑧在离心管中加入超纯水，混合均匀，至磁珠悬浮，进行磁性分离，去除上清液，清洗柱上残留杂质。此步骤重复2次。
蜂王浆蛋白MRJP1的离子交换层析：
将于-80℃保存的上述亲和层析所得蛋白样品，放置于截留分子量为14kDa的透析袋中，在4℃冷库中于PH＝8.0的20mM Tris-HCl缓冲液中透析48h，更换三次缓冲液。收集透析袋中的蛋白样品，0.22um滤膜过滤除菌，于蛋白层析***Purifier 100，操作步骤如下：
Buffer A:20m M Tris-HCl PH8.0
Buffer B:20m M Tris-HCl 1M NaCl PH8.0
以上三种缓冲液经过0.22um滤膜过滤除菌，超声波除去气体
①取相应体积的Q-Sepharose High Performance填料于相应规格的柱壳中，利用相应泵压制备Q-Sepharose阴离子交换层析柱。
②于4℃冷库中，使用Q-Sepharose阴离子交换层析柱在蛋白层析***Purifier 100上进行阴离子交换层析。
③水平衡约一个柱体积，流速：5ml/min；柱压：0.4MPa。
④100％Buffer B冲洗阴离子交换柱约一个柱体积，冲净柱子本身带有的杂质，条件为：流速：5ml/min；柱压：0.4MPa。。
⑤100％Buffer A平衡阴离子交换柱约两个柱体积，平衡条件为：流速：5ml/min；柱压：0.4MPa。至基线稳定。
⑥取相应的蛋白样品，选择自动进样按钮，设置流速为2ml/min。
⑦100％Buffer A洗掉多余的蛋白样品；线性盐浓度洗脱，洗脱条件为:10％Buffer B-50％Buffer B 60min 4ml/min；100％Buffer B冲洗柱子一个柱体积，至紫外UV280回归基线。
⑧根据紫外UV280下的吸收峰收集目标蛋白，设定自动收集样品，每管收集样品体积为8ml。
⑨收集样品10ul，跑SDS-PAGE蛋白电泳初步测定蛋白纯度。
蜂王浆MRJP1的LC-MS/MS质谱鉴定：
SDS-PAGE蛋白胶经过染色脱色至条带清晰，无复杂背景时，将MRJP1对应的条带切下，LC-MS/MS质谱鉴定。相应的参数设置如下：
①色谱条件：Venusil×BPC，C18，5μm，150A(艾杰尔Agela Technologies公司)；流动相：乙腈(0.5‰TFA)水溶液(0.5‰TFA)；洗脱条件：5％-60％乙腈；洗脱时间：100min；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：1-2ul。
②质谱检测条件：正离子模式，一级扫描范围350-2000Da，一级扫描分辨率70000，二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择，二级碰撞能量(NCEs)28％，二级分辨率17500，毛细管温度360℃，离子源电压1800V，破裂模式HCD。
肽的制备：
1.蜂王浆MRJP1的胰蛋白酶酶解：
①取过阴离子交换层析后的蜂王浆蛋白MRJP1蛋白样品,BCA蛋白浓度检测试剂盒测蛋白浓度。
②配置胰蛋白酶溶液，用BCA蛋白浓度检测试剂盒测胰蛋白酶浓度
③胰蛋白酶：蜂王浆蛋白MRJP1蛋白样品＝1:1的质量比于37℃PH8.5条件下进行酶解反应。
④每隔15min收集一次酶解反应混合物，冰浴终止反应，跑SDS-PAGE蛋白胶观察酶解反应状态，进行总时为2h的酶解反应。
⑤同时观察酶解反应体系的PH值的变化，并使其维持在PH8.5左右，稳定反应体系。
⑥反应结束，冰浴终止反应，收集酶解液。
2.0-3kDa蜂王浆混合多肽的分离制备：
将上述酶解液，4℃条件下高速离心20min，取上清，按照三层滤纸、12um滤膜、8um滤膜、0.45um滤膜、0.22um滤膜的顺序抽滤去除大颗粒杂质，收集滤液。加入至3kDa 50ml体积的超滤管中，4℃条件下，6000rpm离心50min，收集流穿液，即0-3kDa的蜂王浆混合多肽组分。
3.0-3kDa蜂王浆混合多肽A、B、C、三个组份的制备
将蜂王浆混合多肽0-3kDa组份经过反相高压液相色谱仪进行分离、制备。
制备：YMC-PackODS-A；250×20mm.D.S-5um.12um
分析：AQ-c18；4.6×250mM.5um
操作步骤如下：
流动相A:超纯水(0.5‰TFA)
流动相B:乙腈(0.5‰TFA)
流动相C:甲醇
以上三种流动相经过0.22um滤膜过滤除菌，超声波除去气体。
①HPLC C-18反相色谱分析蜂王浆混合多肽0-3kDa组份
安装HPLCC-18反相色谱分析柱，80％流动相C低流速过夜冲洗色谱柱，直至基线稳定。设置洗脱程序：
流速：1ml/min
波长：220nm
平衡：5％流动相B平衡15min
洗脱：5％流动相B–60％流动相B 60min
冲洗：80％流动相C 20min
②HPLC C-18反相色谱半制备
安装HPLCC-18反相色谱半制备柱，80％流动相C低流速过夜冲洗色谱柱，直至基线稳定。设置洗脱程序，参照①。
③HPLC C-8反相色谱分析
安装HPLC C-18反相色谱半制备柱，80％流动相C低流速过夜冲洗色谱柱，直至基线稳定。设置洗脱程序，参照1中的设置程序。
样品进样后经过C-18柱时因粒子大小不同而分离，所以流入分析泵中呈像出峰的时间不同，进而达到了分离的目的。
将分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽进行高压液相色谱分析，经过HPLCC-18反相分析色谱柱后，观察到分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽中含有较多的肽段，如图4所示：
由图4得分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽的HPLCC-18反相色谱分析柱图谱显示，经过5％-60％乙腈洗脱，0-3kDa蜂王浆混合多肽中的多肽组分较为复杂。
随后将0-3kDa的蜂王浆混合多肽经过HPLCC-18反相色谱制备柱，观察到经过HPLCC-18反相色谱制备柱0-3kDa的蜂王浆混合多肽被大致分为三个组份，如图5所示：
将经过HPLC分离得到的A，B，C三个组分分别在细胞水平做MTT毒性试验证明C组分对细胞具有明显的保护作用。
2.取C组分进行AβElisa实验以验证其对降低Aβ的功效，确定了C组分能够明显的抑制Aβ的生成。
Aβ-Elisa实验过程：
N2a/APP695细胞接种于12孔细胞培养板，密度为5×104cells/mL，每孔1mL完全培养基，培养24小时后，更换无血清培养基，浓度梯度给药(0,10,100,200μg/mL)处理N2a/APP695细胞48小时。收集细胞外液，加入终浓度为1mM蛋白酶抑制剂AEBSF，4℃，2000rpm离心5min，吸取上清约500μL放置于冰上。去少量上清用BCA法测蛋白浓度。剩余样品检测Aβ40/42含量，检测方法如下：
①标准品及样品的准备：按照试剂盒提供的方法，溶解Aβ40/42标准品，使用标准稀释液(Standard Diluent Buffer)，将标准品梯度稀释。
Aβ1-40标准品：0，7.81，15.62，31.25，62.5，125，250，500pg/mL
Aβ1-42标准品：0，7.81，15.62，31.25，62.5，125，250，500pg/mL
②加样：所有试剂已经提前放置室温，使用前轻轻混匀。Aβ1-40和Aβ1-42分开检测。添加50μLAβ标准品，对照品和样品至每孔。
③加抗体：每孔加50μL Human Aβ检测抗体，盖上盖子，轻轻混匀，然后放置4℃冰箱孵育过夜。
④漂洗：取适量试剂盒中的25×Wash buffer，用去离子水稀释25倍。弃掉各孔溶液，向每孔加入350μL 1×Wash buffer，震荡30秒，弃掉漂洗液，在干净吸水纸上扣板除尽漂洗液，重复漂洗4次。
⑤加二抗：使用试剂盒中的二抗稀释液(HRP Diluent)将Anti-Rabbit IgG HRP(100×)二抗稀释100倍。向每孔中加入100μL 1×二抗工作液，置于水平摇床上，室温孵育30min。
⑥漂洗：操作同(4)。
⑦显色：向每孔中加入100μL显色液(Stabilized Chromogen)，室温避光显色10～30min。显色至各浓度的标准品孔呈现出不同深浅的蓝色为佳。
⑧终止反应：向每孔中加入100μL终止液(Stop Solution)。各孔中的颜色变为不同深浅的黄色。
⑨OD值检测：将孔板放置酶标仪下，在450nm波长下检测各孔吸光度值。根据Aβ标准品浓度及OD值，酶标仪自动生成标准曲线。根据标准曲线以及各样品孔的OD值，获得对应的Aβ浓度(pg/mL)此结果再除以各样品的蛋白浓度(mg/mL)，从而得出每mg蛋白样品中所含有的Aβ40与Aβ42的水平(pg/mg protein)。
Aβ40与Aβ42的实验图表结果证明两者具有一样的趋势，即随着给药浓度的升高，两者的量都出现了顺应的降低，以此证明在细胞水平上，这六个氨基酸序列合成的多肽具有抑制Aβ生成，保护细胞的作用。
3.对C组分鉴定测序，确定其氨基酸序列：QVEIPH。
样品一级制品检测，主要成分为m/z 722.421，其附近有部分小峰，丰度可忽略。如图8所示。
样品的主峰进行串联质谱检测，得到较好的碎片离子，经解析，其序列为QVEIPH，分子量偏差为0.046Da。如图9所示。
该肽段对应蜂王浆水溶性蛋白1(WSRJ1)序列中的部分，如图10所示。
设计六肽的引导肽的序列：
因上述人工合成的六肽无法直接穿过血脑屏障进入循环，故需设计一段引导肽，以连接在六肽上，协助其进入血脑屏障发挥药效。本实验设计采用的是：HIV-Tat的肽段，它是一段R rich序列：YGRKKRRQRRR。合成时连在6肽的N端。合成后序列为：YGRKKRRQRRR-QVEIPH。
本发明还提供了一种编码所述的多肽的DNA分子。
本发明还提供了一种重组载体，其含有所述的DNA分子。
本发明还提供了一种所述多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；
取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导所述转化体表达蛋白，经分离纯化，即得；
所述的(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述的(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为原核***宿主细胞或真核宿主细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，所述原核***宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种Aβ抑制剂，由所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
本发明还提供了一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，由所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
阿尔茨海默症是一种以Aβ级联假说为主要病因的老年性神经退行性疾病。蜂王浆是一种对大脑具有神经营养和神经保护作用的健康食品，其中含有的蜂王浆蛋白和蜂王浆多肽可以抗氧化和延缓衰老，对老年性疾病有独特的疗效。本发明主要以阿尔茨海默症的细胞模型为基础从天然蜂王浆中纯化分离并鉴定出一个可以对抑制Aβ生成具有明显作用的肽序列，这对于深入研究治疗阿尔兹海默症具有重要的意义。
本发明提供的多肽及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1水溶性蜂王浆蛋白(WSRJ)溶液的制备
将新鲜的蜂王浆(购自北京农翼友蜜蜂养殖厂)与PH＝7.0的浓度为50mM的磷酸盐缓冲液以1:4的比例混合，低温下使用磁力搅拌器混合均匀，制备蜂王浆的稀释溶液。将上述蜂王浆的稀释溶液于4℃条件下10000rpm离心30min，弃掉不溶性沉淀，取淡黄色上清成分重复离心一次。使用截留分子量为14kDa的透析袋在PH＝7.0的50mM磷酸盐缓冲液中4℃下透析48h，期间更换三次磷酸盐缓冲液。取透析袋中溶液，4℃，6000rpm离心30min除去沉淀颗粒，并过0.22um滤膜抽滤去除大颗粒杂质及细菌微生物。并将滤液于冷冻干燥机上冷冻干燥48h后，取冻干粉末进行后续实验。
实施例2蜂王浆蛋白MRJP1的亲和层析
取水溶性蜂王浆蛋白干粉2g溶于100ml超纯水中，4℃条件下，利用BeaverBeADsTMIDA Nickel对蜂王浆蛋白MRJP1进行亲和层析分离，实验步骤如下：
①取适量的磁珠，先用10个柱体积的纯水孵育润洗，混合均匀，放于磁力架上约5min,磁性分离，去除上清。
②用5个柱体积的PH＝7.0的浓度为50mM的磷酸盐缓冲液孵育润洗磁珠10min，去除上清液。
③将上述水溶性蜂王浆蛋白溶液与磁珠混合，4℃冷库中，于混匀仪上孵育1h，于常温下再孵育0.5h，磁性分离，收集上清液，过0.22um滤膜，5％甘油-80℃保存。
④在装有磁珠的离心管中，使用50mM Tris-HCl缓冲液充分清洗磁珠。
⑤在装有磁珠的离心管中加入含1M Nacl、100mM咪唑的50mMTris-HCl缓冲液，上下翻转离心管数次，将磁珠悬浮，进行磁性分离，去除上清液。
⑥在装有磁珠的离心管中加入含1M Nacl、500mM咪唑的50m MTris-HCl缓冲液，上下翻转离心管数次，将磁珠悬浮，进行磁性分离，去除上清液。此步骤重复2次
⑦分别上述各步骤的蛋白样品10ul样品，加入2.5ul 5×loading buffer(含巯基乙醇)，金属浴处理5-10分钟，SDS-PAGE电泳。染色液染色2h，脱色至背景清晰可见。
⑧在离心管中加入超纯水，混合均匀，至磁珠悬浮，进行磁性分离，去除上清液，清洗柱上残留杂质。此步骤重复2次。
实施例3蜂王浆蛋白MRJP1的离子交换层析
将于-80℃保存的上述亲和层析所得蛋白样品，放置于截留分子量为14kDa的透析袋中，在4℃冷库中于PH＝8.0的20mM Tris-HCl缓冲液中透析48h，更换三次缓冲液。收集透析袋中的蛋白样品，0.22um滤膜过滤除菌，于蛋白层析***Purifier 100，操作步骤如下：
Buffer A:20m M Tris-HCl PH8.0
Buffer B:20m M Tris-HCl 1M NaCl PH8.0
以上三种缓冲液经过0.22um滤膜过滤除菌，超声波除去气体
①取相应体积的Q-Sepharose High Performance填料于相应规格的柱壳中，利用相应泵压制备Q-Sepharose阴离子交换层析柱。
②于4℃冷库中，使用Q-Sepharose阴离子交换层析柱在蛋白层析***Purifier 100上进行阴离子交换层析。
③水平衡约一个柱体积，流速：5ml/min；柱压：0.4MPa。
④100％Buffer B冲洗阴离子交换柱约一个柱体积，冲净柱子本身带有的杂质，条件为：流速：5ml/min；柱压：0.4MPa。。
⑤100％Buffer A平衡阴离子交换柱约两个柱体积，平衡条件为：流速：5ml/min；柱压：0.4MPa。至基线稳定。
⑥取相应的蛋白样品，选择自动进样按钮，设置流速为2ml/min。
⑦100％Buffer A洗掉多余的蛋白样品；线性盐浓度洗脱，洗脱条件为:10％Buffer B-50％Buffer B 60min 4ml/min；100％Buffer B冲洗柱子一个柱体积，至紫外UV280回归基线。
⑧根据紫外UV280下的吸收峰收集目标蛋白，设定自动收集样品，每管收集样品体积为8ml。
⑨收集样品10ul，跑SDS-PAGE蛋白电泳初步测定蛋白纯度。
图1显示，经过阴离子交换层析后，混合蛋白样品被分离为两个较为明显的主峰，A和B，判断经过阴离子交换层析后MRJP1与MRJP2基本分离，为了进一步验证A和B与MRJP1和MRJP2的对应关系，将取至于A峰的1和2两个洗脱样品，和取至B峰的3、4、5、6四个洗脱样品，跑SDS-PAGE电泳。结果如图2所示：
离子交换层析分离纯化蜂王浆蛋白MRJP1的SDS-PAGE结果显示，A峰两个蛋白样品的蛋白条带显示，取至A峰的洗脱样品电泳图谱显示其大小约为55kDa，取至B峰的各洗脱样品，它们的分子量大致相似，大约为57kD，这符合蜂王浆蛋白MRJP1的分子量大小。以此判断A峰主要为蜂王浆MRJP1。因此可得到结论，阴离子交换层析将蜂王浆蛋白MRJP1与蜂王浆蛋白MRJP2分离纯化开。
实施例4蜂王浆MRJP1的LC-MS/MS质谱鉴定
SDS-PAGE蛋白胶经过染色脱色至条带清晰，无复杂背景时，将MRJP1对应的条带切下，LC-MS/MS质谱鉴定。相应的参数设置如下：
①色谱条件：Venusil×BPC，C18，5μm，150A(艾杰尔Agela Technologies公司)；流动相：乙腈(0.5‰TFA)水溶液(0.5‰TFA)；洗脱条件：5％-60％乙腈；洗脱时间：100min；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量：1-2ul。
②质谱检测条件：正离子模式，一级扫描范围350-2000Da，一级扫描分辨率70000，二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择，二级碰撞能量(NCEs)28％，二级分辨率17500，毛细管温度360℃，离子源电压1800V，破裂模式HCD。
采用的LC-MS/MS质谱对所纯化的蛋白进行验证，进一步确认经过亲和层析、离子交换层析分离纯化的蛋白是MRJPl。多肽片段通过mascot数据库检索与《Nature》中报道的蜂王浆蛋白MRJP1的序列进行匹配。
匹配结果如图3所示：
图3显示，MRJP1的质谱肽段与《Nature》中报道的蜂王浆蛋白MRJP1的序列的匹配后，其序列覆盖率为96.5％，可以判断水溶性蜂王浆蛋白MRJPs经过亲和层析、离子交换层析后得到的MRJP1与《Nature》中报道的MRJP1一致，分子量为57kDa。
实施例5肽的制备
1.蜂王浆MRJP1的胰蛋白酶酶解：
①取过阴离子交换层析后的蜂王浆蛋白MRJP1蛋白样品,BCA蛋白浓度检测试剂盒测蛋白浓度。
②配置胰蛋白酶溶液，用BCA蛋白浓度检测试剂盒测胰蛋白酶浓度
③胰蛋白酶：蜂王浆蛋白MRJP1蛋白样品＝1:1的质量比于37℃PH8.5条件下进行酶解反应。
④每隔15min收集一次酶解反应混合物，冰浴终止反应，跑SDS-PAGE蛋白胶观察酶解反应状态，进行总时为2h的酶解反应。
⑤同时观察酶解反应体系的PH值的变化，并使其维持在PH8.5左右，稳定反应体系。
⑥反应结束，冰浴终止反应，收集酶解液。
2.0-3kDa蜂王浆混合多肽的分离制备：
将上述酶解液，4℃条件下高速离心20min，取上清，按照三层滤纸、12um滤膜、8um滤膜、0.45um滤膜、0.22um滤膜的顺序抽滤去除大颗粒杂质，收集滤液。加入至3kDa 50ml体积的超滤管中，4℃条件下，6000rpm离心50min，收集流穿液，即0-3kDa的蜂王浆混合多肽组分。
3.0-3kDa蜂王浆混合多肽A、B、C、三个组份的制备
将蜂王浆混合多肽0-3kDa组份经过反相高压液相色谱仪进行分离、制备。
制备：YMC-PackODS-A；250×20mm.D.S-5um.12um
分析：AQ-c18；4.6×250mM.5um
操作步骤如下：
流动相A:超纯水(0.5‰TFA)
流动相B:乙腈(0.5‰TFA)
流动相C:甲醇
以上三种流动相经过0.22um滤膜过滤除菌，超声波除去气体。
①HPLC C-18反相色谱分析蜂王浆混合多肽0-3kDa组份
安装HPLCC-18反相色谱分析柱，80％流动相C低流速过夜冲洗色谱柱，直至基线稳定。设置洗脱程序：
流速：1ml/min
波长：220nm
平衡：5％流动相B平衡15min
洗脱：5％流动相B–60％流动相B 60min
冲洗：80％流动相C 20min
②HPLC C-18反相色谱半制备
安装HPLCC-18反相色谱半制备柱，80％流动相C低流速过夜冲洗色谱柱，直至基线稳定。设置洗脱程序，参照①。
③HPLC C-8反相色谱分析
安装HPLC C-18反相色谱半制备柱，80％流动相C低流速过夜冲洗色谱柱，直至基线稳定。设置洗脱程序，参照1中的设置程序。
实施例6
样品进样后经过C-18柱时因粒子大小不同而分离，所以流入分析泵中呈像出峰的时间不同，进而达到了分离的目的。
将分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽进行高压液相色谱分析，经过HPLCC-18反相分析色谱柱后，观察到分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽中含有较多的肽段，如图4所示：
由图4得分子量0-3kDa的蜂王浆混合多肽的HPLCC-18反相色谱分析柱图谱显示，经过5％-60％乙腈洗脱，0-3kDa蜂王浆混合多肽中的多肽组分较为复杂。
随后将0-3kDa的蜂王浆混合多肽经过HPLCC-18反相色谱制备柱，观察到经过HPLCC-18反相色谱制备柱0-3kDa的蜂王浆混合多肽被大致分为三个组份，如图5所示：
将经过HPLC分离得到的A，B，C三个组分分别在细胞水平做MTT毒性试验证明C组分对细胞具有明显的保护作用。见表1。
表1 MTT毒性试验结果分析
2.取C组分进行Aβ Elisa实验以验证其对降低Aβ的功效，确定了C组分能够明显的抑制Aβ的生成。
Aβ-Elisa实验过程：
N2a/APP695细胞接种于12孔细胞培养板，密度为5×104cells/mL，每孔1mL完全培养基，培养24小时后，更换无血清培养基，浓度梯度给药(0,10,100,200μg/mL)处理N2a/APP695细胞48小时。收集细胞外液，加入终浓度为1mM蛋白酶抑制剂AEBSF，4℃，2000rpm离心5min，吸取上清约500μL放置于冰上。去少量上清用BCA法测蛋白浓度。剩余样品检测Aβ40/42含量，检测方法如下：
①标准品及样品的准备：按照试剂盒提供的方法，溶解Aβ40/42标准品，使用标准稀释液(Standard Diluent Buffer)，将标准品梯度稀释。
Aβ1-40标准品：0，7.81，15.62，31.25，62.5，125，250，500pg/mL
Aβ1-42标准品：0，7.81，15.62，31.25，62.5，125，250，500pg/mL
②加样：所有试剂已经提前放置室温，使用前轻轻混匀。Aβ1-40和Aβ1-42分开检测。添加50μLAβ标准品，对照品和样品至每孔。
③加抗体：每孔加50μL Human Aβ检测抗体，盖上盖子，轻轻混匀，然后放置4℃冰箱孵育过夜。
④漂洗：取适量试剂盒中的25×Wash buffer，用去离子水稀释25倍。弃掉各孔溶液，向每孔加入350μL 1×Wash buffer，震荡30秒，弃掉漂洗液，在干净吸水纸上扣板除尽漂洗液，重复漂洗4次。
⑤加二抗：使用试剂盒中的二抗稀释液(HRP Diluent)将Anti-Rabbit IgG HRP(100×)二抗稀释100倍。向每孔中加入100μL 1×二抗工作液，置于水平摇床上，室温孵育30min。
⑥漂洗：操作同(4)。
⑦显色：向每孔中加入100μL显色液(Stabilized Chromogen)，室温避光显色10～30min。显色至各浓度的标准品孔呈现出不同深浅的蓝色为佳。
⑧终止反应：向每孔中加入100μL终止液(Stop Solution)。各孔中的颜色变为不同深浅的黄色。
⑨OD值检测：将孔板放置酶标仪下，在450nm波长下检测各孔吸光度值。根据Aβ标准品浓度及OD值，酶标仪自动生成标准曲线。根据标准曲线以及各样品孔的OD值，获得对应的Aβ浓度(pg/mL)此结果再除以各样品的蛋白浓度(mg/mL)，从而得出每mg蛋白样品中所含有的Aβ40与Aβ42的水平(pg/mg protein)。
Aβ-Elisa实验结果如图6、图7、表2、表3、图11所示：
表2
表3
结果分析：Aβ-Elisa结果分析：Group1代表Control组对照，即未给药组；Group2给药浓度为10pg/ml；Group3给药浓度为100pg/ml；Group4给药浓度为200pg/ml。(所给药成分即测序所得的六个氨基酸经人工合成后的样品)
Aβ40与Aβ42的实验图表结果证明两者具有一样的趋势，即随着给药浓度的升高，两者的量都出现了顺应的降低，以此证明在细胞水平上，这六个氨基酸序列合成的多肽具有抑制Aβ生成，保护细胞的作用。
3.对C组分鉴定测序，确定其氨基酸序列：QVEIPH。
样品一级制品检测，主要成分为m/z 722.421，其附近有部分小峰，丰度可忽略。如图8所示。
样品的主峰进行串联质谱检测，得到较好的碎片离子，经解析，其序列为QVEIPH，分子量偏差为0.046Da。如图9所示。
该肽段对应蜂王浆水溶性蛋白1(WSRJ1)序列中的部分，如图10所示。
4.设计六肽的引导肽的序列
因上述人工合成的六肽无法直接穿过血脑屏障进入循环，故需设计一段引导肽，以连接在六肽上，协助其进入血脑屏障发挥药效。本实验设计采用的是：HIV-Tat的肽段，它是一段R rich序列：YGRKKRRQRRR。合成时连在6肽的N端。合成后序列为：YGRKKRRQRRR-QVEIPH。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京师范大学
<120> 一种多肽及其应用
<130> MP1721854
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Glu Ile Pro His
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gln Val Glu Ile Pro
1 5 10 15
His

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，其还包括引导肽；所述引导肽的序列如SEQID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的多肽在制备Aβ抑制剂中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的多肽在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
5.一种如权利要求1或2所述多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取蜂王浆与缓冲液混合后离心，收集上清液透析，收集不大于14KDa的透析液离心后取上清过滤，收集滤液；
步骤2：取步骤1制得的滤液纯化后酶解，收集酶解液；
步骤3：取步骤2获得的酶解液离心、过滤、超滤，收集不大于3KDa的滤液，经反相色谱分离，收集保留时间为24～28min的峰。
6.一种编码如权利要求1或2所述的多肽的DNA分子。
7.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求10所述的DNA分子。
8.一种如权利要求1或2所述多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；
取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导所述转化体表达蛋白，经分离纯化，即得；
所述的(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
所述的(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
9.一种Aβ抑制剂，其特征在于，由如权利要求1或2所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
10.一种预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，其特征在于，由如权利要求1或2所述的多肽及药学上可接受的辅料组成。
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