CN108578766B - 一种骨组织替换材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于骨组织替换材料领域，具体涉及一种壳聚糖‑石墨烯‑羟基磷灰石复合材料作为骨组织替换材料的制法。本发明提供一种骨组织替换材料的制备方法，所述方法依次包括：配制羟基磷灰石/壳聚糖浆料、制备负载羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵、烧结成型、负载氧化石墨烯和氧化石墨烯的还原；所述制备负载羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵的方法为：将密胺海绵浸没羟基磷灰石/壳聚糖浆料中通过挤压密胺海绵将密胺海绵中的孔隙被浆料填满，然后取出进行真空干燥得负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖的密胺海绵；真空温度为40～80℃，真空度为60～90KPa。所得骨组织替换材料具有多孔结构，具有较高的机械强度和孔隙率，能够满足骨组织替换材料的要求。

Description

一种骨组织替换材料及其制备方法
技术领域
本发明属于骨组织替换材料领域，具体涉及一种壳聚糖(CS)-石墨烯(G)-羟基磷灰石(HA)三元复合材料作为骨组织替换材料及其制备方法。
背景技术
羟基磷灰石(HA)是人骨中无机物的主要成分，具有很好的生物相容性，生物可降解性。目前，商用的人工骨材料几乎都含有羟基磷灰石这种成分，它通过高温烧结可以得到强度高的羟基磷灰石陶瓷材料，常见的有羟基磷灰石生物陶瓷，珊瑚羟基磷灰石，但它们多少都存在难塑形，孔隙率低，空隙大小不够，和骨诱导能力差等缺点。
壳聚糖(CS)广泛存在于自然界中，它有很好的生物相容性，在体内能降解成为氨基葡萄糖，氨基葡萄糖呈中性或弱碱性，不会引起局部发炎，并可被人体完全吸收。并且CS还能促进骨细胞和成纤细胞的黏附，分化和增殖。CS和HA均都具有良好的生物相容性，适合用于制备骨修复材料。此外，壳聚糖还有一定的消炎作用，对患处的发炎也有很好的抑制作用。
石墨烯近年来受到广泛关注，其具有极大的比表面积，对细胞有很好的粘附作用，载药能力强，且有能促进骨细胞增殖，分化等优点。这些优点也使研究者们陆续将其运用于骨组织材料中。
目前可用于制备骨组织工程支架的技术和方法有很多种，如：静电纺丝法、相分离/冷冻干燥法、溶剂浇铸/粒子沥滤技术、快速成型技术及气体发泡技术制备支架材料，但是这些技术都存在制备的工艺复杂，生产成本高，孔隙率低，强度差等特点。
发明内容
本发明提供一种骨组织替换材料，所述骨组织替换材料以羟基磷灰石、壳聚糖和石墨烯为原料，采用特定的制备方法，所得骨组织替换材料具有多孔结构，具有较高的机械强度和孔隙率，能够满足骨组织替换材料的要求。
本发明的技术方案：
一种骨组织替换材料的制备方法，所述制备方法依次包括：配制纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料、制备负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵、空气中烧结成型得到多孔羟基磷灰石陶瓷、负载氧化石墨烯和氧化石墨烯的还原；其中，所述制备负载羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵的方法为：将密胺海绵浸没羟基磷灰石/壳聚糖浆料中通过挤压密胺海绵将密胺海绵中的孔隙被浆料填满，然后取出进行真空干燥得负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖的密胺海绵；其中，真空温度为40～80℃，真空度为60～90KPa。
进一步，所述配制羟基磷灰石/壳聚糖浆料的方法为：将纳米羟基磷灰石粉末在水溶液中分散均匀，后加入醋酸，然后边搅拌边加入壳聚糖粉末，再搅拌混匀得纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料；其中，纳米羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为：羟基磷灰石20～80重量份，壳聚糖0.5～4重量份。
优选的，所述配制羟基磷灰石/壳聚糖浆料的方法中，纳米羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为：羟基磷灰石60～80重量份，壳聚糖0.5～4重量份；更优选为：羟基磷灰石60重量份，壳聚糖0.3重量份。
进一步，所述配制羟基磷灰石/壳聚糖浆料的方法中，羟基磷灰石粉末为水溶液质量的20％-80％，优选60％；醋酸体积为水溶液体积的0.5％-3％，优选2％；壳聚糖质量为水溶液质量的0.5％-4％，优选3％。
进一步，所述负载氧化石墨烯的方法为：将多孔羟基磷灰石陶瓷浸没于氧化石墨烯的酒精溶液保持5～15min，然后取出烘干得负载氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷。
进一步，所述负载氧化石墨烯的方法中，所述氧化石墨烯酒精溶液的质量浓度为0.2～0.5％(即氧化石墨烯酒精溶液中氧化石墨烯的质量占比)。石墨烯酒精溶液的浓度如果太低，达不到石墨烯改性的效果，浓度太高石墨烯的片层会堵塞多孔材料的多孔结构，抑制细胞的长入。
进一步，所述氧化石墨烯的还原方法为：将负载氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷在惰性气体氛围中于900～1100℃进行热还原反应，冷却后得到骨组织替换材料。
进一步，所述密胺海绵空隙大小为100～300um，并为通孔。
进一步，所述烧结成型工艺为：先以5℃/min～15℃/min升温至330℃，保持1h后，再以5℃/min～15℃/min升温到1200～1350℃，保持2～4h后(使结构更加稳定)，自然降温到常温。
进一步，所述氧化石墨烯的还原方法中，所述热还原工艺为：先以5℃/min-15℃/min升温到900～1100℃，然后自然降温到常温。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种骨组织替换材料，所述骨组织替换材料由上述方法制备得到。
本发明的有益效果：
利用本发明方法制得的骨组织替换材料具有以下优点：
1)有较高的机械强度，能够满足骨组织替换材料的要求。
2)有很高的孔隙率，孔隙均一且为通孔，能满足成骨细胞对生长空间和环境的要求。
3)添加的石墨烯材料，有一定的骨诱导能力。
4)最终材料的主要成分为羟基磷灰石和少量的碳，有很好的生物相容性。
此外，密胺海绵是一种绿色环保安全的轻密度泡绵，有高开孔率，吸水性，空洞均一并且为通孔，便宜等特点，而且其在温度达到三百多度时会发生升华，本发明选用它作为模板，在后续的烧结过程中可以轻易的去除。
附图说明
图一a和图一b分别为实施例二所得多孔支架材料的电镜图及其局部放大图。
图二为实施例二的对比例二的电镜照片，可以看到由于浸入的酒精溶液中氧化石墨烯的浓度较高，氧化石墨烯片层会堵塞多孔羟基磷灰石支架中的孔洞，使得成骨细胞无法长入，所以需要适当的石墨烯添加量，既保证细胞能够更好的粘附，又能不堵塞支架中的通孔结构。
图三a，图三b分别为对比例二和对比例三的电镜图，可以看到在烘干或者没有加入CS的条件下不能形成如图一所示的均匀的多孔结构。
图四为在石墨烯膜表面上养骨髓间充质干细胞三周之后的结果，可以看到在石墨烯表面，细胞可以很好的进行粘附生长。
图五为培养液中碱性磷酸酶(ALP)含量的检测结果图，由图五可知，在没有引入石墨烯的对比例一中分化的骨细胞最少，而加入成骨诱导液的对比例一材料和引入石墨烯的实施例二都有相对较高的分化率；这就说明石墨烯的引入确实提高了成骨干细胞的成骨分化能力。
图六为实施例一，二，三，对比例二，三的孔隙率以及压缩模量图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种制备具有合适孔径大小，较高孔隙率，机械强度高，并有很好骨诱导能力的复合骨替换材料；纳米HA，GO均匀分散于CS溶液中，由于CS与密胺海绵良好的相容性，使得HA，GO很好的负载到海绵基体上，从而在后续的烧结过程中能得到均一性能优良的骨组织替换材料。
本发明通过密胺树脂作为软模板，将其中浸渍含有羟基磷灰石和壳聚糖的浆料，然后通过真空干燥的方法，得到了多孔的羟基磷灰石支架；再通过烧结可以得到多孔羟基磷灰石陶瓷，利用羟基磷灰石陶瓷表面大量的含氧基团，进一步将其泡入含有GO的酒精溶液中，让GO负载到多孔羟基磷灰石陶瓷中，烘干后再进行热还原(相当于二次烧结)，第二次烧结不仅可以还原GO得到rGO降低其在水溶液中的分散能力，使其在体内不会流失，还可以使羟基磷灰石再次重结晶与rGO相互结合，由于羟基磷灰石陶瓷和石墨烯之间良好的相容性，所以石墨烯被很好的负载到了多孔羟基磷灰石的支架中；最终得到了均匀负载石墨烯的多孔羟基磷灰石陶瓷支架。比起传统的骨组织替换材料，本发明所得复合材料的多孔结构更有利于骨细胞的增值和长入，并且由于石墨烯这种具有一定诱导成骨能力材料的引入，则更容易让成骨细胞在支架上附着并促进骨细胞的增殖和分化；因此该材料比起现有的商用材料具有更好的作为骨组织替换材料的潜力。
本发明实验过程中发现，采用烧结成型制备羟基磷灰石多孔陶瓷的过程中存在一个重要问题，即在纳米羟基磷灰石烧结成型的过程中纳米颗粒之间存在孔隙不能很好的烧结在一起进而不能提高材料的机械强度；但是如果通过压实后烧结的办法又无法得到多孔的结构；因此本发明通过引入CS这种传统的生物友好型的天然高分子，采用了真空干燥等方法得到了具有高强度，高孔隙率，并具有适合细胞生长孔径的多孔羟基磷灰石陶瓷，基于我们的多孔材料，后期我们还将石墨烯引入到我们的体系中，并讨论了石墨烯对成骨方面的影响。
本发明多孔支架的形成机理和石墨烯镶嵌在羟基磷灰石多孔支架上的机理为：吸附有HA和CS的浆料的密胺树脂在真空干燥的过程中，随着溶剂挥发，支架内部出现气孔，壳聚糖分子链收缩将HA纳米粒子沾粘到一起，由于真空吸力和密胺树脂内部有通孔的关系，最终形成图一的通孔结构；随后在其上载上GO，并对其进行热还原，在还原的过程中，由于纳米羟基磷灰石的重结晶，附着上的石墨烯便镶嵌在羟基磷灰石陶瓷表面。
本发明要骨组织替换材料的制备方法可采用如下步骤：
(1)配制羟基磷灰石/壳聚糖浆料：将羟基磷灰石粉末在水溶液中分散均匀(如可通过超声1h)，然后加入醋酸，边搅拌边加入壳聚糖粉末，再搅拌混匀(一般需搅拌2h)得羟基磷灰石/壳聚糖浆料；其中，羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为：羟基磷灰石20-80重量份，壳聚糖0.5-4重量份；
(2)制备负载羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵：将密胺海绵浸没于步骤(1)得到的羟基磷灰石/壳聚糖浆料中通过挤压密胺海绵将密胺海绵中的孔隙被浆料填满，然后取出进行真空干燥得负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖的密胺海绵，其中，真空温度为40-80℃(优选为60℃)，真空度为60-90KPa，优选为80-85kPa；
(3)烧结成型：将步骤(2)得到的干燥的负载羟基磷灰石/壳聚糖的密胺海绵在空气中进行烧结得到多孔羟基磷灰石陶瓷；
(4)负载氧化石墨烯：将步骤(3)得到的多孔羟基磷灰石陶瓷浸没于氧化石墨烯的酒精溶液保持5～15min(优选为10min)，然后取出烘干；
(5)氧化石墨烯的还原：将步骤(4)得到的负载氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷在惰性气体氛围中于900～1100℃(优选为1000℃)进行热还原反应，冷却后得到骨组织替换材料。
以下实施例只是几种典型的实施方式，并不能起到限制本发明的作用，本领域的技术人员可以参照实施例对技术方案进行合理的设计，同样能够获得本发明的结果。
实施例一
(1)配制CS/HA浆料：将3gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后置于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于质量浓度为0.3wt％的氧化石墨烯的酒精溶液(是指氧化石墨烯/酒精溶液中氧化石墨烯的质量占比为0.3％)中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
实施例二
(1)配制CS/HA浆料：将6gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后置于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于0.3％的氧化石墨烯的酒精溶液中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
实施例二的对比例一
(1)配制CS/HA浆料：将6gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后置于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于0.1％的氧化石墨烯的酒精溶液中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
实施例二的对比例二
(1)配制CS/HA浆料：将6gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后置于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于0.6％的氧化石墨烯的酒精溶液中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
实施例三
(1)配制CS/HA浆料：将8gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后至于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于0.3％的氧化石墨烯的酒精溶液中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
对比例一无石墨烯
(1)配制CS/HA浆料：将6gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后置于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温得到产品。
对比例二烘干
(1)配制CS/HA浆料：将6gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h后加入200ul醋酸，磁力搅拌10min后加入CS粉末0.3g再搅拌2h。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载CS/HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后至于60度真空烘箱中干燥(真空度为0)。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载CS/HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于0.3％的氧化石墨烯的酒精溶液中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
对比例三无CS
(1)配制HA浆料：将6gHA纳米羟基磷灰石粉末分散于10ml水溶液中，超声1h得到羟基磷灰石浆料。
(2)不同形状的密胺海绵的制备：将买来的密胺海绵用刀片切割成0.5cm*0.5cm*1cm的小长方体。
(3)制备负载HA浆料的密胺海绵：将(2)中得到的块状密胺海绵浸没于(1)中的浆料中通过挤压密胺海绵将浆料吸入海绵中，将其取出后置于60度真空烘箱中在真空度为80kPa的条件下干燥。
(4)烧结成型：将(3)中得到的干燥的负载HA的密胺海绵至于坩埚中并在空气的条件下下进行烧结，升温程序为以5℃/min升温至330℃，保持1h后，再以10℃/min升温到1200℃，保持2h后，在管式炉中自然降温到常温。
(5)氧化石墨烯的引入：将(4)中得到的羟基磷灰石多孔陶瓷浸没于0.3％的氧化石墨烯的酒精溶液中10min后取出烘干。
(6)氧化石墨烯的还原：将(5)中得到的负载有氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷置于管式炉中在高纯氮气保护下进行热还原反应，热还原升温程序为10℃/min升温到1000℃，随炉冷却后得到最终样品。
微观结构及性能测试：
图一a和图一b分别为实施例二所得多孔支架材料的电镜图及其局部放大图(图一b)，可以看到材料内部有很多孔洞的形成，这些孔洞为成骨干细胞的附着、增殖分化提供了合适的环境，并且由于通孔的存在，细胞可以长入材料中。最后，随着羟基磷灰石在体内的分解，骨细胞的生长，新生骨最终替换掉该材料。从右边的局部放大图中，我们看到，石墨烯贴合在羟基磷灰石表面，两者之间具有很好的相容性，石墨烯比起羟基磷灰石有更大的比表面积，更易于细胞的附着。且有研究报道石墨烯有诱导成骨分化的能力，所以这样附着有石墨烯的多孔羟基磷灰石支架对骨组织修复效果会优于纯羟基磷灰石多孔支架。
图二为实施例二的对比例二的电镜照片，可以看到由于浸入的酒精溶液中氧化石墨烯的浓度较高，氧化石墨烯片层会堵塞多孔羟基磷灰石支架中的孔洞，使得成骨细胞无法长入，所以需要适当的石墨烯添加量，既保证细胞能够更好的粘附，又能不堵塞支架中的通孔结构。
图三a，b分别为对比例二和对比例三的电镜图，可以看到在烘干或者没有加入CS的条件下不能形成如图一的均匀的多孔结构，对图一多孔支架的形成机理和石墨烯镶嵌在羟基磷灰石多孔支架上的机理进行了分析：吸附有HA和CS的浆料的密胺树脂在真空干燥的过程中，随着溶剂挥发，支架内部出现气孔，壳聚糖分子链收缩将HA纳米粒子沾粘到一起，由于真空吸力和密胺树脂内部有通孔的关系，最终形成图一的通孔结构；随后负载上GO，并对其进行热还原；在还原的过程中，由于纳米羟基磷灰石的重结晶，附着上的石墨烯便镶嵌在羟基磷灰石陶瓷表面。
为了解石墨烯的生物毒性以及细胞粘附能力，我们将纯的石墨烯膜浸没于模拟体液SBF溶液中，并将骨髓间充质干细胞放入SBF液中进行培养，三周后石墨烯膜表面细胞粘附情况如图四所示，可以看到在石墨烯表面，细胞可以很好的进行粘附生长；从而说明石墨烯对细胞没有生物毒性并能很好的促进其增殖分化。
为了进一步了解细胞的分化情况，本发明对培养液中碱性磷酸酶(ALP)含量进行了检测(ALP是成骨细胞的分泌产物，一般通过培养液中ALP含量来判断骨细胞的分化情况)；结果如图五所示，在没有引入石墨烯的对比例一中分化的骨细胞最少，而加入成骨诱导液的对比例一材料和引入石墨烯的实施例二都有相对较高的分化率；这就说明石墨烯的引入确实提高了成骨干细胞的成骨分化能力。
图六为实施例一，实施例二，实施例三，对比例二，对比例三的孔隙率以及压缩模量图，可以看到，随着羟基磷灰石含量的增加，压缩模量在不断增加，当加入6gHA的时候，增加幅度最大，但随着HA的增加，孔隙率在不断下降。实施例二的样品在保证高的孔隙率的前提下，强度还维持在一个较高的水平，在常压下烘干的和没有加入CS的样品即对比例二，三则并没有高的孔隙率和强度，这是由于在常压下烘干的和没有加入CS的情况下材料内部并没有均匀的通孔形成的原因。
尽管上面结合实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚，在不脱离权利要求的精神和范围的情况下，可以对上述实施例进行各种修改。

Claims (14)

1.一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法依次包括：配制纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料、制备负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵、空气中烧结成型得多孔羟基磷灰石陶瓷、负载氧化石墨烯和氧化石墨烯的还原；其中，所述制备负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料的密胺海绵的方法为：将密胺海绵浸没在纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料中通过挤压密胺海绵将密胺海绵中的孔隙被浆料填满，然后取出进行真空干燥得负载纳米羟基磷灰石/壳聚糖的密胺海绵；其中，真空温度为40～80℃，真空度为60～90KPa。
2.根据权利要求1所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述配制纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料的方法为：将纳米羟基磷灰石粉末在水溶液中分散均匀，后加入醋酸，然后边搅拌边加入壳聚糖粉末，再搅拌混匀得纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料；其中，纳米羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为：纳米羟基磷灰石：壳聚糖＝20～80：0.5～4。
3.根据权利要求2所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，纳米羟基磷灰石与壳聚糖的质量比为：纳米羟基磷灰石：壳聚糖＝60～80：0.5～4。
4.根据权利要求1或2所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述负载氧化石墨烯的方法为：将多孔羟基磷灰石陶瓷浸没于氧化石墨烯的酒精溶液保持5～15min，然后取出烘干得负载氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷。
5.根据权利要求4所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述负载氧化石墨烯的方法中，所述氧化石墨烯酒精溶液中氧化石墨烯的浓度为0.2wt％～0.5wt％。
6.根据权利要求2所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述配制纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料的方法中，纳米羟基磷灰石粉末为水溶液质量的20％～80％；醋酸体积为水溶液体积的0.5％～3％；壳聚糖质量为水溶液质量的0.5％～4％。
7.根据权利要求6所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述配制纳米羟基磷灰石/壳聚糖浆料的方法中，纳米羟基磷灰石粉末为水溶液质量的60％；醋酸体积为水溶液体积的2％；壳聚糖质量为水溶液质量的3％。
8.根据权利要求1或2所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述密胺海绵空隙大小为100um～300um，并为通孔。
9.根据权利要求4所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述密胺海绵空隙大小为100um～300um，并为通孔。
10.根据权利要求6所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述密胺海绵空隙大小为100um～300um，并为通孔。
11.根据权利要求1所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述烧结成型工艺为：先以5℃/min～15℃/min升温至330℃，保持1h后，再以5℃/min～15℃/min升温到1200～1350℃，保持2～4h后，自然降温到常温。
12.根据权利要求1所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯的还原方法为：将负载氧化石墨烯的羟基磷灰石多孔陶瓷在惰性气体氛围中于900～1100℃进行热还原反应，冷却后得到骨组织替换材料。
13.根据权利要求12所述的一种骨组织替换材料的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯的还原方法中，所述热还原工艺为：先以5℃/min～15℃/min升温到900～1100℃，然后自然降温到常温。
14.一种骨组织替换材料，其特征在于，所述骨组织替换材料由权利要求1～13任一项所述的方法制备得到。
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